Способ повышения чувствительности полимеразной цепной реакции в реальном времени при обнаружении ДНК патогенных бактерий

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам исследования в микробиологии, и предназначено для выявления патогенных бактерий, в том числе Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) и Treponema pallidum. В частности, изобретение относится к способам обнаружения ДНК патогенных бактерий с использованием методов амплификации нуклеиновых кислот, а именно - полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Изобретение может быть использовано для обнаружения М. leprae, MTBC и Т. pallidum в клинических образцах при проведении первичной диагностики соответствующих бактериальных инфекций, а также для оценки эффективности проводимых терапевтических мероприятий и контроля излеченности.

Из уровня техники [1 - Mullis К.В., Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalysed chain reaction. Method Enzymol. 1987, 155, 335] известен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), суть которого состоит в том, в исследуемый образец, предположительно содержащий тот или иной инфекционный агент, вносятся короткие нуклеотидные последовательности - праймеры (прямой и обратный), комплементарные специфическим фрагментам генома искомого возбудителя. При последующей температурной обработке достигается денатурация двухспиральной ДНК возбудителя, делающая ее доступной для взаимодействия с праймерами, комплементарными соответствующим участкам геномной ДНК. На следующем этапе в присутствии в реакционной смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов и ДНК-полимеразы происходит избирательное размножение (амплификация) участка ДНК определенного размера, который задается при выборе праймеров. Циклическое повторение денатурации и ренатурации ДНК ведет к нарастающему в геометрической прогрессии накоплению специфических фрагментов ДНК, доступных для визуальной регистрации в агарозном или акриламидном гелях. Усовершенствованные варианты данного метода используют термостабильную ДНК-полимеразу термофильного микроорганизма Thermus aquaticus [2 - US 4889818 A, Purified thermostable enzyme], позволяющую проводить ПЦР без добавления фермента в каждом цикле реакции, а также флуоресцентно-меченые зонды, позволяющие проводить измерение количества амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. В частности, наиболее распространенный метод детекции - применение линейных разрушаемых проб (TaqMan) основывается на использовании флуоресцентно-меченого олигонуклеотида, комплементарного внутренней последовательности амплифицируемого фрагмента ДНК возбудителя, с флуоресцентной меткой в 5'-положении и гасителем флуоресценции в 3'-положении [3 - US 20110300544 A1, Enhanced taqman probe based amplification].

На основе данного универсального принципа разработано и запатентовано множество способов выявления возбудителей бактериальных инфекций, различия между которыми заключаются в первичных нуклеотидных последовательностях используемых праймеров. При этом ключевым требованием является уникальность данной последовательности: (а) комплементарная ему последовательность (ген или фрагмент гена) должна присутствовать в геноме всех представителей детектируемого бактериального вида; (б) аналогичные последовательности должны отсутствовать в геномах других бактериальных видов. Соблюдение указанных требований обеспечивает реализуемым на их основе технологий ПЦР соответствие требованию «специфичность».

Для выявления М. leprae предложено использование праймеров 5'-CGGCTTCACGTCCAGTTTCTTC-3' и 5'-TAAGTGCCCTCGATGTAAGCGG-3' к фрагменту гена MntH, кодирующего Mn²⁺ - транспортный белок данного микроорганизма [4 - Cruz A.F., Furini R.B., Roselino A.M. Comparison between microsatellites and Ml MntH gene as targets to identify Mycobacterium leprae by PCR in leprosy. An Bras Dermatol. 2011 86 (4): 651-6.], праймеров 5'-GTGGTCGGCCTCTCGAT-3' и 5'-CGAGCCAGCATAGATGAACTGATC-3' к фрагменту гена fbp, кодирующего фибронектинсвязывающий белок [5 - Martinez et al., Evaluation of real-time and conventional PCR targeting complex 85 genes for detection of Mycobacterium leprae DNA in skin biopsy samples from patients diagnosed with leprosy. J Clin Microbiol. 2006 Sep; 44 (9): 3154-9.], a также иных праймеров ряду других видоспецифичных фрагментов генома данной бактерии - 16S rRNA, rpoB, sodA и др.

Известные решения задачи обнаружения ДНК МТВС основаны на использовании праймеров 5'-GCACCCGCGCCGAGTTAG-3' и 5'-GGCCAGCCGATCCAATACCC-3' к фрагменту гена recX, кодирующего специфический регуляторный белок [6 - Bhatter et al., Kinetics of recA and recX induction in drug-susceptible and MDR clinical strains of Mycobacterium tuberculosis. J Antimicrob Chemother, doi: 10.1093/jac/dku319.], 5'-CACGTAGGCG AACCCTGCCC AGGTC-3', 5'-GCGTAGGCGTCGGTCACAAA-3' к уникальной последовательности ДНК Mycobacterium tuberculosis [7 - US 20080160527 A1, One-tube nested PCR for detecting Mycobacterium tuberculosis], а также прймеров, комплементарных фрагментам генов rpoB, katG, gyrB, hupB и др.

В свою очередь для решения задачи обнаружения Т. pallidum предложено использование праймеров 5'-TGCGCGTGTGCGAATGGTGTGGTC-3' и 5'-CACAGTGTCCAAAAACGCCTGCACG-3' к уникальному региону в кодирующем ДНК-полимеразу I гене polA [8 - Liu Н., Rodes В., Chen C.Y., Steiner В. New tests for syphilis: rational design of a PCR method for detection of Treponema pallidum in clinical specimens using unique regions of the DNA polymerase I gene. J Clin Microbiol. 2001; 39 (5): 1941-1946], праймеров 5'-CGTGTGGTATCAACTATGG-3' и 5'-TCAACCGTGTACTCAGTGC-3' к специфичному для данной бактерии пенициллинсвязывающему белку tp47 [9 - Burstain, J. М., Grimprel, Е., Lukehart, S.A., Norgard, M.V. & Radolf, J.D. Sensitive detection of Treponema pallidum by using the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 1991; 29 (1); 62-69], а также праймеров к последовательностям генов tmpA, tmpC и др.

Однако, обеспечивая близкую к 100% специфичность детекции возбудителей бактериальных инфекций, использование перечисленных выше праймеров не ведет к достаточной чувствительности проводимого диагностического исследования. В частности, при выявлении М. leprae использование праймеров к генам sodA, 16S rRNA и Ag85B демонстрирует чувствительность детекции на уровне 59,7-66,1% [10 - Martinez A.N., Ribeiro-Alves М., Sarno E.N., Moraes M.O. Evaluation of qPCR-based assays for leprosy diagnosis directly in clinical specimens. PLoS Negl. Trop. Dis. 2011; 5 (10): e1354]. При детекции Т. pallidum аналогичные показатели чувствительности находятся в диапазоне 55.0-95.2% в зависимости от использованного для исследования клинического материала [11 - Gayet-Ageron A., Lautenschlager S., Ninet В., Perneger T.V., Combescure С. Sensitivity, specificity and likelihood ratios of PCR in the diagnosis of syphilis: a systematic review and meta-analysis. Sex Transm Infect. 2013; 89: 251-256].

В контексте заявляемого изобретения принципиально важно, что каждая бактериальная клетка «представляет» для взаимодействия с праймерами только два фрагмента своего генома (один для прямого и один для обратного праймеров), что ставит эффективность ПЦР в четкую зависимость от количественного присутствия детектируемых бактерий в анализируемой пробе. В этой связи в качестве основной причины, препятствующей получению положительного результата от использования указанных выше способов, представляется относительно низкая бактериальная обсемененность обследуемого материала и определяемое этим недостаточное количество участков геномной ДНК детектируемых бактерий, комплементарных вносимым в пробу праймерам. Кроме того, несмотря на то, что теоретически заявляемая чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-100 клеток в пробе, реально детектируемые количества (в присутствии остатков тема, антикоагулянтов и других химических соединений, снижающих эффективность амплификации) оказываются на 1-2 порядка выше.

В этой связи для повышения чувствительности детекции инфекционных агентов, кроме метода ПЦР (амплификации ДНК), предложены методы амплификации РНК, к которым относится транскрипционный метод амплификации NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplificaition) [12 - US 5130238 A, Enhanced nucleic acid amplification process]. Поскольку «мишенями» для связывания праймеров при использовании NASBA являются рибосомальные РНК бактерий, присутствующие в каждой клетке в количестве от нескольких сотен до десятков тысяч, этот метод позволяет существенно повысить чувствительность детекции и выявлять возбудителей бактериальных инфекций в тех случаях, когда их количество очень мало и недостаточно для выявления методом ПЦР. Однако существенным недостатком данного метода является низкая стабильность РНК (в отличие от ДНК), что определяет особые дополнительные и достаточно жесткие требования к процедуре забора, хранения и доставки исследуемого материала.

Иные методы и подходы к повышению чувствительности полимеразной цепной реакции при обнаружении ДНК патогенных бактерий с низким количественным содержанием в исследуемом материале из уровня техники не известны.

Основной задачей, на решение которой направлен заявляемый способ, является повышение чувствительности полимеразной цепной реакции при обнаружении ДНК патогенных бактерий (в том числе Mycobacterium leprae, MTBC и Treponema pallidum), типично характеризующихся низким количественным содержанием в исследуемом патологическом клиническом материале.

Сущностью заявляемого способа, сформулированной на уровне функционального обобщения и лежащей в его основе, является следующее:

- чувствительность полимеразной цепной реакции при обнаружении ДНК патогенных бактерий может быть повышена путем использования праймеров и ДНК-зондов к специфическим повторяющимся элементам их генома, присутствующим в бактериальной хромосоме в количестве двух и более (до нескольких десятков) копий.

Таким образом, оригинальным техническим решением является использование в качестве «мишеней» для связывания праймеров многокопийных участков бактериальных геномов при соблюдении требований специфичности составляющих их нуклеотидных последовательностей для определенного детектируемого бактериального вида.

Соответственно, при реализации заявляемого способа характеристика действий, порядок их выполнения и условия осуществления представляются следующим образом.

На предварительном этапе проводится анализ геномов детектируемых бактерий с целью поиска в них видоспецефичных повторяющихся (многокопийных) нуклеотидных последовательностей. Этот результат может достигаться следующими путями: (а) полногеномным секвенированием de novo; (б) ресеквенированием; (в) биоинформационным анализом полногеномных библиотек, ранее размещенных на доступных электронных ресурсах. При этом фрагменты генома, в дальнейшем используемые для амплификации, выбираются из высоко консервативных областей, а такие же сиквенсы близкородственных видов предпочтительно должны иметь как можно более существенные отличия в последовательности ДНК.

После выявления последовательностей проводится конструирование прямого и обратного праймеров в соответствии со следующими основными критериями: (а) специфичность с особым акцентом на нуклеотидную последовательность из 3'-концов, с которых начинается достройка комплементарной цепи с использованием ДНК-полимеразы; (б) исключение возможности образования праймерами димеров или петель, ведущих к ошибочному отжигу праймеров самих на себя или друг с другом. Конструирование ДНК-зонда (TaqMan пробы) проводится в соответствии со следующими основными критериями: (а) специфичность амплифицируемому участку ДНК; (б) повышенная доля G+C, обеспечивающая температуру плавления на 10°С выше, чем у используемых праймеров, (в) отсутствие автофлуоресценции гасителя; (г) перекрывание спектра гасителя со спектром флуоресцентного красителя.

В частности, в рамках настоящего изобретения предлагается использование следующих праймеров и ДНК-зондов:

- при обнаружении ДНК Mycobacterium leprae используют прямой 5'-GCAGCAGTATCGTGTTAGTGAA-3' и обратный 5'-CGCTAGAAGGTTGCCGTAT-3' праймеры, а также ДНК-зонд 5'-CGCCGACGGCCGGATCATCGA-3' к специфическому повторяющемуся элементу генома М. leprae (29 повторов в бактериальной хромосоме, отсутствие в геноме прочих видов рода Mycobacterium);

- при обнаружении ДНК МТВС используют прямой 5'-AGACGTTATCCАССАТАС-3', и обратный 5'-AGTGCATTGTCATAGGAG-3' праймеры, а также ДНК-зонд 5'-TCTCAGTACACATCGATCCGGT-3' к специфическому повторяющемуся элементу генома МТВС (от 5 до 20 повторов в бактериальной хромосоме, отсутствие в геноме прочих видов рода Mycobacterium);

- при обнаружении ДНК Treponema pallidum используют прямой 5'-СACTCCTGTGGGGAGTAGGA-3' и обратный 5'-GAGCTCCCCGTTGCCA-3' праймеры, а также ДНК-зонд 5'-CGATTACCTGCATCGGCAGGGTC-3' к специфическому повторяющемуся элементу генома Т. pallidum (4 повтора в бактериальной хромосоме, отсутствие в геноме прочих видов рода Treponema).

В завершении подготовительного этапа проводят синтез указанных праймеров и ДНК-зондов. При синтезе ДНК-зондов осуществляют ковалентное присоединение флуорофора (например, карбоксифлоресцеина -FAM) на 5'-конце и «гасителя» флуоресценции (например, BHQ1) на 3'-конце, спектр поглощения которого перекрывает спектр флуоресценции FAM. Данное действие обеспечивает возможность проведения последующей полимеразной цепной реакции с детекцией результата в режиме реального времени (по накоплению флуоресцентного сигнала).

На следующем (основном) этапе в микропробирках или лунках стрипов (0,2 мл) проводят смешивание анализируемых образцов (в объеме 10 мкл) и компонентов, необходимых для проведения амплификации, а именно:

- смеси праймеров (прямого и обратного) с концентрацией 10 мкМ каждый и ДНК-зонда с концентрацией 5 мкМ, соответствующих специфическому повторяющемуся фрагменту генома детектируемой бактерии - 1 мкл;

- ПЦР-смеси, содержащей Taq-полимеразу (5 ед./мкл), смесь нуклеотидтрифосфатов (по 0,2 мМ каждого), соли Mg²⁺ (3 мМ) - 5 мкл;

- деионизированной воды - 9 мкл.

Пробирки или лунки стрипов плотно закрывают и проводят ПЦР в термоциклере по программе: первоначальная денатурация - 95°С, 5 мин; 40 циклов - 95°С по 10 сек, 52°С по 35 сек; 72°С по 1 сек. Сутью этапа является амплификация специфических повторяющихся элементов бактериальных геномов, в процессе которого 5'-3'-экзонуклеазная активность Taq-полимеразы ведет к отщеплению от зонда флуорофора FAM, переходящего в раствор и при возбуждении при 492 нм излучающего при 520 нм с квантовым выходом ~0,8.

На завершающем этапе, по времени перекрывающем основной этап, проводят динамическую регистрацию флюоресценции (на каждом цикле амплификации), выражамой в относительных единицах флуоресценции (ОЕФ) и представляемой в виде графических зависимостей накопления флуоресцентного сигнала от количества циклов амплификации. Итоговый анализ результата ПЦР заключается в достижении (результат положительный) или недостижении (результат отрицательный) Ct (threshold cycle) - пересечения кривых накопления флуоресцентного сигнала с линией threshold line, задаваемой программным обеспечением прибора или определяемого исследователем самостоятельно.

Возможность получения требуемого технического результата при использовании указанных праймеров подтверждается следующим комплексом причинно-следственных связей.

1. Оценка результата ПЦР референсных образцов ДНК М. leprae, МТВС в сравнении с образцами ДНК близкородственных микроорганизмов (непатогенных представителей рода Mycobacterium), а также референсных образцов ДНК Т. pallidum в сравнении с образцами генетического материала других микроорганизмов - возбудителей инфекций, передающихся половым путем, потенциально присутствующих в исследуемом клиническом материале совместно с Т. pallidum, позволила констатировать высокую специфичность предложенных праймеров к повторяющимся элементам генома детектируемых бактерий. Из представленных на фиг. 1-3 графических зависимостей накопления флуоресцентного сигнала от количества циклов амплификации видно, что пересечение с линией threshold line достигнуто для M. leprae, M. tuberculosis и T. pallidum, в то время как в образцах сравнения подобный результат не зарегистрирован ни в одном случае.

На фиг. 1 представлены результаты накопления флуоресцентного сигнала для ДНК Mycobacterium leprae и отсутствие флуоресцентного сигнала для ДНК непатогенных представителей рода Mycobacterium.

На фиг. 2 представлены результаты накопления флуоресцентного сигнала для Mycobacterium tuberculosis и отсутствие флуоресцентного сигнала для ДНК непатогенных представителей рода Mycobacterium.

На фиг. 3 представлены результаты накопления флуоресцентного сигнала для Treponema pallidum и отсутствие флуоресцентного сигнала для ДНК возбудителей ИППП.

Основной причиной, ведущей к получению подобного положительного результата от использования изобретения, является комплементарность предложенных праймеров к специфическим повторяющимся нуклеотидным последовательностям генома М. leprae, МТВС и Т. pallidum при отсутствии их спаривания с нуклеотидными последовательностями ДНК прочих микроорганизмов.

2. Сравнение результата ПЦР референсных образцов ДНК M. leprae, МТВС и Tpallidum с использованием праймеров к повторяющимся элементам генома детектируемых бактерий, а также известных праймеров к видоспецифичным генам данных микроорганизмов, присутствующих в их геноме в количестве единичных копий, позволило констатировать высокую чувствительность заявляемого способа, заключающуюся в сокращении количества циклов амплификации, необходимых для пересечения с линией threshold line.

На фиг. 4 показано, что при тестировании референсных образцов ДНК М. leprae пересечение с линией threshold line с использованием прямого 5'-GCAGCAGTATCGTGTTAGTGAA-3', обратного 5'-CGCTAGAAGGTTGCCGTAT-3' праймеров и ДНК-зонда 5'-CGCCGACGGCCGGATCATCGA-3' (обозначение - ML-FRP) достигнуто на 20 цикле амплификации, в то время как использование праймеров к видоспецифичному генам MntH, rpoB и fbp позволило достичь аналогичного результата только на 36 цикле амплификации.

На фиг. 5 показано, что при тестировании референсного образца ДНК M. tuberculosis использование прямого 5'-AGACGTTATCCACCATAC-3', обратного 5'-AGTGCATTGTCATAGGAG-3' праймеров и ДНК-зонда 5'-ТСТСAGTACACATCGATCCGGT-3' (обозначение - MTBC-FRP) вело к пересечению линии threshold line на 27 цикле амплификации, в то время как использование праймеров к генам rpoB, katG и recX позволяло достичь аналогичного результата на 33 цикле амплификации.

На фиг. 6 показано, что при тестировании референсного образца ДНК T. pallidum с использованием прямого 5-CACTCCTGTGGGGAGTAGGA-3', обратного 5'-GAGCTCCCCGTTGCCA-3' праймеров и ДНК-зонда 5'-CGATTACCTGCATCGGCAGGGTC-3' (обозначение TP-FRP) вело к пересечению линии threshold line на 29 цикле амплификации, использование праймеров к гену polA приводило к аналогичному результату на 30 цикле, а праймеров к гену tp47 даже к 40-му циклу не позволяло достичь линии threshold line.

Основной причиной, ведущей к получению подобного положительного результата от использования изобретения, является множественная копийность (от 4 до 29 на один геном) специфических нуклеотидных последовательностей детектируемых бактерий, предоставляющих увеличенное количество участков для комплементарного связывания праймеров в процессе амплификации.

Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается следующими примерами.

Пример 1.

Пациентка Р. находилась на лечении в специализированном лечебно-профилактическом учреждении Российской Федерации. Клинический диагноз согласно выписке из истории болезни: «Лепра, лепроматозный тип (LLs), активная стадия». За период лечения отчетливого регресса клинических проявлений заболевания не достигнуто.

Для проведения контрольного исследования был использован следующий клинический биоматериал:

- биоптат кожи (бедро, ягодица);

- скарификат (мочка уха, надбровная дуга, предплечье, спина, ягодица, надколенная область);

- соскоб со слизистой носа.

С целью подтверждения присутствия М. leprae в анализируемых образцах было проведено ПЦР-исследование с использованием созданных в соответствии с заявляемым способом смеси праймеров и ДНК-зонда ML_FRP. Результаты проведенного ПНР-исследования показаны на фиг. 7, где отображены кривые накопления флуоресцентного сигнала для образцов ДНК клинического материала (биоптат, скарификаты, соскобы со слизистой носа). Полученные данные были сопоставлены с результатами исследования того же клинического материала с использованием коммерческого набора «Genesig Standard Kit» (Primerdesign Ltd, Великобритания), основанного на использовании смеси праймеров и ДНК-зонда к участку гена rpoB. Результаты ПЦР-исследования с использованием «Genesig Standard Kit» приведены на фиг. 8, где отображены кривые накопления флуоресцентного сигнала для образцов ДНК клинического материала (биоптат, скарификаты, соскобы со слизистой носа).

В результате применения смеси праймеров и ДНК-зонда ML_FRP положительный результат ПЦР получен при исследовании всех клинических образцов. При проведении исследования с использованием коммерческого набора на основе амплификации гена rpoB результаты ПЦР с образцами биоптатов и скарификатов также оказались положительными, однако результат анализа соскобов со слизистой оболочки носа был отрицательным. При использовании смеси праймеров и ДНК-зонда ML_FRP полученный диапазон Ct варьировал от 20 до 27 (для образцов биоптата и скарификатов) и Ct 30 (для образца соскоба со слизистой носа). Применение коммерческого набора на основе амплификации гена rpoB позволило получить Ct только от 30 до 38 (для образцов биоптата и скарификатов) при недостижении threshold line для образца соскоба со слизистой носа.

Таким образом, проведение ПЦР в соответствии с заявляемым способом (с использованием праймеров и ДНК-зонда к повторяющемуся элементу генома М. leprae) в сравнении с известным методом, основанным на использовании праймеров и ДНК-зонда к гену rpoB, представленному в геноме М. leprae в единичной копии, позволило повысить чувствительность проводимого исследования.

Пример 2.

При анализе контрольных образцов, предоставленных АСНП «Центр Внешнего Контроля Качества Клинических Лабораторных Исследований» (Россия), использование созданной на основе заявляемого способа смеси праймеров и ДНК-зонда MTBCFRP позволило получить положительный результат ПЦР для 10 из 12 исследуемых проб (выявлена ДНК микобактерий группы МТВС); реакция с 2 образцами оказалась отрицательной (отсутствие ДНК микобактерий группы МТВС). Полученные результаты приведены на фиг. 9, где отображено накопление флуоресцентного сигнала для 10 образцов ДНК Mycobacterium tuberculosis и отсутствие накопления флуоресцентного сигнала для ДНК Mycobacterium avium.

Сопоставление полученных данных с результатами тестирования тех же контрольных образцов с использование ДНК-чипа «ТБ-БИОЧИП», разработанного ФГБУ «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН, позволило констатировать совпадение присутствия ДНК Mycobacterium tuberculosis в 10 из 12 тестовых образцов, в то время как в 2-х ПЦР-отрицательных образцах была детектирована ДНК Mycobacterium avium.

Таким образом, проведение ПЦР в соответствии с заявляемым способом (с использованием праймеров и ДНК-зонда к повторяющемуся элементу генома МТВС) позволило достичь специфичного и чувствительного результата детекции.

Пример 3.

Пациент К. находился на обследовании в специализированном лечебно-профилактическом учреждении Российской Федерации. Клинический диагноз согласно выписке из истории болезни: «Первичный сифилис половых органов» (на основании клинического обследования), однако в связи с достаточно поздним сроком выявления данного заболевания исследование отделяемого шанкра было отрицательным.

Для проведения исследования был использован следующий клинический биоматериал:

- плазма крови.

С целью подтверждения диагноза было проведено исследование с использованием созданных на основе заявляемого способа смеси праймеров и ДНК-зонда TP_FRP. Полученные данные сопоставлены с результатами исследования того же клинического биоматериала с использованием коммерческого набора «АмплиСенс Treponema pallidum-FL», основанного на использовании смеси праймеров и ДНК-зонда к участку гена tp47, представленному в геноме T. pallidum в единичной копии.

При проведении ПЦР-анализа положительный результат получен с использованием как заявляемого, так и известного набора праймеров и ДНК-зонда, что позволило подтвердить клинический диагноз пациента К. Однако, как показано на фиг.10, полученные значения Ct 30 в случае применения смеси праймеров и ДНК-зонда TP_FRP в сравнении с Ct 32 при использовании коммерческого набора реагентов на основе амплификации гена tp47, позволяет сделать вывод о большей чувствительности ПЦР-анализа в соответствии с заявляемым способом.