СПОСОБ БИОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ РУБЦОВОЙ ЖИДКОСТИ IN VITRO

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано для определения токсичности рубцовой жидкости in vitro.

Способ предназначен для использования в лабораториях ветеринарного профиля, решающих вопросы оценки эффективности кормления сельскохозяйственных животных с целью выявления возможных нарушений и контроля эффективности соответствующих коррекционных мероприятий.

Сущностью изобретения является проведение оценки токсичности рубцовой жидкости in vitro по выраженности ингибирующего влияния рубцовой жидкости (РЖ) на интенсивность свечения Escherichia coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathi 54D10 по сравнению с контролем - интенсивностью свечения тех же люминесцирующих бактерий, не имевших контакта с РЖ, после чего рассчитывают значение токсичности рубцовой жидкости по формуле

где ТРЖ - токсичность рубцовой жидкости, %;

- уровень люминесценции контрольной пробы на 0 минуте;

- уровень люминесценции контрольной пробы на 0,5 минуте;

- уровень люминесценции опытной пробы на 0 минуте;

- уровень люминесценции опытной пробы на 0,5 минуте.

Критерием токсического действия является изменение интенсивности биолюминесценции тест-объекта в исследуемой пробе по сравнению с таковой для пробы с раствором, не содержащим токсических веществ. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.

Предлагаемый нами способ исключает необходимость применения питательных сред, позволяет быстро и достоверно оценить токсичность компонентов рациона или жидкости. Достигаемый технический результат заключается в упрощении, снижении продолжительности и трудоемкости способа биохемилюминесцентной оценки токсичности рубцовой жидкости in vitro.

Известен биохемилюминесцентный способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов, где в качестве объектов фагоцитоза используют рекомбинантные люминесцирующие бактерии, а именно микроорганизмы Escherichia coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathi 54D10 [1].

Известен способ определения биотоксичности наноуглерода путем исследования влияния на интенсивность свечения рекомбинантного люминесцирующего штамма Escherichia coli K12 с генами люминесцентной системы Photobacterium leiognathi [2].

Известен способ определения бактерицидной активности сыворотки крови по выраженности ее ингибирующего влияния на интенсивность свечения серочувствительных люминесцирующих бактерий [3].

Известные перечисленные выше способы применимы в медицине и токсикологии, отличаются высокой точностью и чувствительностью, но не характеризуют подходов по оценке токсичности рубцовой жидкости.

Состав корма оказывает прямое влияние на видовое разнообразие и сохранность микробиоты рубца, но в то же время может выступать в качестве токсиканта, оказывая угнетающее действие на микрофлору рубца и, как следствие, на организм животного.

Изучение влияния токсичности рубцовой жидкости при использовании различных типов кормов представляется актуальной задачей, поскольку именно бактериальное звено этого биоценоза первым вступает во взаимодействие с поступившим в рубец кормом. Один из возможных путей решения данной проблемы - это биотестирование, позволяющее осуществить определение степени токсичности окружающей среды по степени жизнеспособности биосенсоров.

При проведении исследований использовали рекомбинантный штамм E. coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathi 54D10 [5], выпускаемый в виде лиофилизированного препарата под коммерческим названием «Эколюм», выпускаемый НЕЮ «Иммунотех» (Москва).

В качестве базового оборудования для проведения исследований нами были использованы «Искусственный рубец» KPL-01 [5, 4], люминометр LM-01Т (Immunotech, Чехия), pH-метр-иономер Эксперт-001 (Эоникс-Эксперт, Россия), центрифуга лабораторная СМ-6М (Элми, Россия).

Объектами исследования являлись:

- рубцовая жидкость мясного крупного рогатого скота казахской белоголовой породы;

- модельная рубцовая жидкость, полученная на основе фосфатного буфера, пропионовой - 17-21%, молочной - 5%, масляной - 14-34%, уксусной кислот - 49-69%, глюкозы и 10-% раствора аммиака;

- трофические субстраты на основе пшеничных отрубей, экструдированных с добавлением Fe²⁺;

- фосфатный буфер (pH 7,0) путем смешивания 48,8 мл раствора 0,2 М KH₂PO₄ и 51,2 мл раствора 0,2 М Na₂HPO₄.

В каждый из контейнеров «искусственного рубца» вносили по 128 мл рубцовой и модельной жидкости и 500 мг трофического субстрата и инкубировали в течение 24 часов при 37°C. Временной интервал отбора проб составлял 3, 6, 12, 24 ч.

После 24 часов инкубации в условиях «искусственного рубца» отделяли рубцовую жидкость от субстрата и от бактерий центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин и отбирали надосадочную жидкость, в которой определяли возможное присутствие токсиканта.

Содержанием первого этапа является подготовка люминесцирующего бактериального биосенсора E. coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathi 54D10 с проверкой его светимости. При этом в настоящее время данная задача решается достаточно простыми средствами, так как существующие коммерческие тест-системы обычно содержат их в готовом к использованию лиофилизированном виде. В результате этого отпадает необходимость самостоятельного контроля плотности бактериальной популяции перед проведением каждого исследования, ныне осуществляемого еще на этапе производства биотестов, а также потребность поддержания постоянства характеристик люминесцирующих бактерий в музейных культурах. Последнее особенно актуально, так как нередко способность к люминесценции утрачивается спустя три года после выделения бактерий из природных экосистем и ряда пассажей на искусственных питательных средах.

Для изучения токсичности рубцовой жидкости процедуры выполняли согласно разработанному алгоритму (фиг. 1). Для этого препарат «Эколюм» восстанавливали из лиофилизированного состояния путем добавления 10 мл дистиллированной воды, после чего выдерживали флакон в течение 30 минут при 4°C. Затем формировали смесь в лунках планшета, состоящую из 100 мкл испытуемой рубцовой жидкости (опытная проба) или 100 мкл 0,9% раствора NaCl (контрольная проба), и 100 мкл бактерий. Наблюдалось резкое тушение свечения штамма E. coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathi 54D10 с первых секунд контакта, причем уровень свечения биосенсора в пробах с меньшей концентрацией рубцовой жидкости был выше, чем в пробах с большей концентрацией (фиг. 2), а пробы, содержащие менее 3,125% рубцовой жидкости, обеспечивали индукцию свечения.

Исходя из предварительных результатов эксперимента, было предположено, что вероятной причиной такого явления может быть влияние на бактериальную биолюминесценцию какого-либо одного или нескольких компонентов, входящих в состав рубцовой жидкости. Чтобы подтвердить или опровергнуть данное предположение, на следующем этапе работы была создана модельная смесь (модельная рубцовая жидкость), на основе фосфатного буфера, в состав которого входили пропионовая, молочная, масляная, уксусная кислота, глюкоза и 10% водный раствор аммиака, взятые в физиологических концентрациях, для того, чтобы в дальнейшем выяснить влияние отдельных компонентов реальной рубцовой жидкости на биосенсор «Эколюм».

В целом, полученные данные свидетельствуют, что реальная (нативная) рубцовая жидкость и модельная смесь давали сходные эффекты подавления уровня биолюминесценции в начале эксперимента (имели сходный характер), не проявляя, однако, токсического действия. Полученные результаты позволили нам судить о некоторой идентичности обеих жидкостей, и, следовательно, заняться изучением влияния отдельных компонентов на рекомбинантный штамм Е. coli.

Анализируя данные о влиянии отдельных компонентов модельной рубцовой жидкости на рекомбинантный штамм Е. coli, можно сделать предварительный вывод, что ни один из компонентов не оказал сколько-нибудь выраженного токсического действия на данный штамм (фиг. 3).

Пример конкретного исполнения: рубцовое пищеварение способствует увеличению эффективности использования питательных веществ корма, за счет эффективного энергетического, азотистого обменов, в то же время скармливание рационов с высокой долей зерновой части приводит к нарушению пищеварительных процессов. В этой связи были проведены исследования токсичности рубцовой жидкости при включении различных видов зернового корма.

При проведении исследований использован рекомбинантный штамм E. coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathi 54D10. Объектами исследования явилась рубцовая жидкость крупного рогатого скота; трофические субстраты - измельченное зерно ячменя (Hordeum vulgare), пшеницы (Triticum aestivum), ржи (Secale cereale). Схема эксперимента предусматривала приготовление навесок: ячмень (Н) - 100 мг, рожь (S) - 100 мг, пшеница (Т) - 100 мг). Далее навески были помещены в пробирки, в которые внесено по 1 мл рубцовой жидкости, одна из которых являлась контрольной. Полученные смеси инкубировали в термостате при 37°C с единичным встряхиванием в течение 3 часов. Для изучения токсичности (активности) рубцовой жидкости использовали люминесцирующий штамм «Эколюм», который восстанавливали из лиофилизированного состояния путем добавления 10 мл дистиллированной воды, после чего выдерживали флакон в течение 30 минут при 4°C. В лунках планшета были серийно разведены физиологическим раствором инкубированные образцы (лунки 2-11, при этом в 11 лунке - максимальная 100% концентрация), лунка 1 содержала только 0,9% раствора NaCl. Объем жидкости в каждой лунке составил 100 мкл. Во все лунки внесено по 100 мкл восстановленного биосенсора «Эколюм», таким образом, соотношение анализируемой жидкости и биосенсора составило 1:1.

Свечение измеряли на 0,5 минуте на люминометре. В качестве базового оборудования для проведения исследований были использованы «Искусственный рубец» KPL-01, люминометр LM-01T (Immunotech, Чехия), pH-метр-иономер Эксперт-001 (Эоникс-Эксперт, Россия), центрифуга лабораторная СМ-6М (Элми, Россия).

По результатам исследований установлено, что все образцы оказались высокотоксичными.

Итоговый расчет проводят по формуле

где ТРЖ- токсичность рубцовой жидкости, %;

- уровень люминесценции контрольной пробы на 0 минуте;

- уровень люминесценции контрольной пробы на 0,5 минуте;

- уровень люминесценции опытной пробы на 0 минуте;

- уровень люминесценции опытной пробы на 0,5 минуте,

и при значении ТРЖ менее 5% образец считается нетоксичным, от 5 до 19% малотоксичным, от 20 до 49% среднетоксичным, от 50 до 100% высокотоксичным.

Источники информации

1. Патент на изобретение РФ №2366953. Биохемилюминесцентный способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов // Д.Г. Дерябин, И.Ф. Каримов. Опубликовано 27.04.2009. Бюл. №25.

2. Патент на изобретение РФ №2437938. Способ определения биотоксичности наноуглерода // Д.Г. Дерябин, Е.Г. Алешина. Опубликовано 20.08.2011. Бюл. №36.

3. Патент на изобретение РФ №2247987. Способ определения бактерицидной активности сыворотки крови // Д.Г. Дерябин, В.А. Гриценко, Е.Г. Поляков. Опубликовано 22.01.2003. Бюл. №7.

4. Патент на полезную модель РФ №106956. Устройство для исследований in vitro // К.Г. Логачев, С.А. Мирошников, А.Г. Мещеряков. Опубликовано 27.07.2011 г.

5. Попов В.В., Рыбина Е.Т. Методика определения переваримости сухого вещества «in vitro» // Животноводство. - 1983. - №8. - С. 37-39.