ПРИМЕНЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ 1,3-ДИГИДРОКСИБЕНЗОЛА В КАЧЕСТВЕ СЕНСИБИЛИЗАТОРОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК К ПОВРЕЖДАЮЩЕМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ СОЕДИНЕНИЙ УГЛЕРОДА

Изобретение относится к области дезинфектологии, санитарии и гигиены, а именно к способам обеззараживания различных сред и поверхностей с использованием химических соединений и их композиций. В частности, изобретение предназначено для повышения чувствительности бактериальных клеток к последующему повреждающему действию дезинфектантов на основе наноструктурированных соединений углерода.

Актуальность обеззараживания объектов окружающей среды определяется необходимостью прерывания основных путей передачи бактериальных инфекций (в том числе имеющих водный механизм передачи). Для достижения этой цели в настоящее время применяются две основные группы способов: безреагентные (физические) и реагентные (химические). При этом безреагентные способы обеззараживания в основном включают в себя ультрафиолетовую обработку [Патент РФ №2472712, опубл. 20.01.2013], а к реагентным относят обработку окислителями или специально отобранными химическими соединениями [Патент РФ №2499771, опубл. 27.11.2013]. Однако с течением времени микроорганизмы вырабатывают защитные механизмы к подобным повреждающим воздействиям: только за последние 20 лет устойчивость бактерий к ультрафиолету возросла в 4 раза, а к окислителям (хлору) в 6 раз [Huang J.J., Hu H.Y., Wu Y.H., Wei В., Lu Y. Effect of chlorination and ultraviolet disinfection on tetA-mediated tetracycline resistance of Escherichia coli // Chemosphere. 2013. 90(8); Р. 2247-2253].

Решение обозначенной проблемы представляется возможным с использованием двух основных подходов: 1) путем сенсибилизации (повышения чувствительности) микроорганизмов к уже известным дезинфектантам; 2) путем разработки новых дезинфектанов, реализующих ранее неизвестные механизмы антибактериальной активности.

Известные способы сенсибилизации представлены использованием кватернизованных фталоцианинов цинка или алюминия [Патент РФ №2281953, опубл. 20.08.2006], а также композиций, в состав которых кроме названных соединений входят красители акридинового, родаминового или фенотиазинового ряда [Патент РФ №2235688, опубл. 10.09.2004]. При этом положительный эффект от их использования определяется первичным взаимодействием кватернизованных фталоцианинов цинка или алюминия с поверхностью бактериальных клеток, в отношении которых они выступают как фотосенсибилизаторы и при освещении ведут к образованию синглетного кислорода. Однако синглетный кислород является недостаточно сильным окислителем, в связи с чем продолжение подобного поиска было связано с разработкой модифицированного фталоцианинового сенсибилизатора, под действием света активирующего образование гидроксильных радикалов, обладающих более выраженными антибактериальными свойствами [Патент РФ №2375371, опубл. 10.12.2009]. Другим существенным недостатком подобных способов является необходимость удаления сенсибилизаторов из обеззараженной воды, т.к. подобные соединения способны оказать неблагоприятное воздействие не только на бактерии, но и на организм человека или животных. Для устранения этого недостатка синтезированы гетерогенные сенсибилизаторы, содержащие химическую прививку фталоцианинов к твердофазным аминопропилированным силикагелям [Патент РФ №2447027, опубл. 03.11.2010], а также предложен способ обеззараживания воды с использованием нерастворимых в воде гетерогенных сенсибилизаторов, в структуре активной фазы которых содержатся фталоцианины алюминия и цинка [Патент РФ №2520857, опубл. 27.06.2014]. Таким образом, сенсибилизация микроорганизмов к известным дезинфицирующим воздействиям имеет целый ряд недостатков, устранение которых делает вновь предлагаемые способы все более технически сложными и материально затратными.

Альтернативное решение обсуждаемой проблемы лежит в сфере поиска принципиально новых дезинфектантов, в том числе наночастиц и наноматериалов. Важным аргументом в пользу подобного поиска является принципиальная невозможность формирования у микроорганизмов устойчивости к нанодезинфектантам в связи с отсутствием аналогичных факторов в естественной среде их обитания. При этом спектр нанодезинфектантов принципиально может быть разделен на две основные группы: 1) наночастицы металлов и их оксидов; 2) углеродные наноматериалы.

Большинство известных из научно-технической и патентной литературы способов дезинфекции с использованием наночастиц металлов и их оксидов связано с использованием наночастицами серебра (Ag) и диоксида титана (TiO₂). Так известны способы получения и использования антибактериальных композиций на основе дисперсии наночастиц Ag, стабилизированных хлоридом бензилдиметил [3-(миристоиламино) - пропил] аммония и другими четвертичными аммониевыми соединениями [Патенты РФ №2419439, опубл. 27.05.2011; №2427380, опубл. 27.08.2011], которые при совместном применении взаимно усиливают (до 20 раз) свое антибактериальное действие в отношении патогенных бактерий и грибов. Однако широкое применение подобных способов сдерживается, в основном, достаточно высокой стоимостью исходного драгоценного металла. В свою очередь, использование наночастиц диоксида титана основано на их способности к фотогенерации окисляющих агентов (в подобном контексте они выступают как «фотосенсибилизаторы») и преимущественно касается различных антимикробных покрытий на основе TiO₂ [Патенты US 6235351 В1, опубл. 22.05.2001; US 7288232 В2, опубл. 30.10.2007; US 2004/0224145 А1, опубл. 11.11.2004; WO 2008/097778 А1, опубл. 14.08.2008]. Однако их существенными недостатками являются очень жесткие требования к обрабатываемой поверхности, необходимость термической обработки фотокаталитического покрытия при температурах до 350°С, а также достаточно большая продолжительность последующего облучения, требующегося для достижения 99,9%-ного дезинфицирующего эффекта.

Среди разнообразных аллотропных соединений углерода применение для целей дезинфекции получили углеродные нанотрубки и фуллерены. При этом ключевым (инициальным) этапом действия частиц наноуглерода является их физический контакт с поверхностью бактериальных клеток-мишеней, запускающий глубокие нарушения ассоциированных с клеточными мембранами метаболических процессов. Так известны способы удаления бактерий из водной среды путем внесения в нее многостенных углеродных нанотрубок до концентрации 0,002 г на 100 мл водного раствора. При этом в целях увеличения антимикробной активности углеродные нанотрубки функционализируются карбоновыми, фенольными, октадеканольными [Патент US 20120213663 А1, опубл. 23.08.2012] или додециламинными группами [Патент US 8754041 В2, опубл. 17.06.2014]. Известные из уровня техники примеры использования фуллеренов также предусматривают их ковалентную функционализацию различными химическими группировками (аддендами), попутно увеличивающими растворимость данных соединений в водной среде [Патент РФ №2501785, опубл. 20.12.2013].

В целом, анализ открытых источников позволяет констатировать, что нанодезинфектанты на основе углеродных наноматериалов экономически эффективны, стабильны в процессе хранения, а также реализуют ранее неизвестный антибактериальный механизм, устойчивость к которому у бактерий отсутствует и предположительно не может сформироваться. В то же время не полностью решенной задачей является обеспечение быстрого и выраженного антибактериального эффекта подобных нанодезинфектантов: в большинстве случаев углеродные нанотрубки и фуллерены по этим параметрам пока еще уступают ряду наиболее совершенных традиционных дезинфектантов.

С точки зрения заявителей, возможным путем усиления антибактериальной активности углеродных наноматериалов может стать сочетание описанных выше подходов, а именно предварительная сенсибилизация клеток-мишеней с последующим воздействием на них нанодезинфектантов. Из уровня техники подобные способы очистки сред и поверхностей от бактериального загрязнения не известны, в связи с чем заявляемое изобретение соответствует требованию новизны.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности (сенсибилизация) бактериальных клеток к повреждающему действию наноструктурированных соединений углерода (нанотрубок и фуллеренов).

Задача решается применением в качестве сенсибилизаторов бактериальных клеток к повреждающему воздействию наноструктурированных соединений углерода производных 1,3-дигидроксибензола общей формулы

где каждый Ra, Rb, Rc и Rd независимо выбирают из группы, состоящей из: водорода; алкильной группы, такой как метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, гептил, октил, нонил, децил и тому подобное, и где по меньшей мере два из Ra, Rc, и Rd представляют собой водород; а также способом сенсибилизации, заключающимся во внесении соединений общей формулы (1) в обеззараживаемые среды или нанесении их на обеззараживаемые поверхности в виде сухих порошков или растворов (с содержанием 0,00001-0,0001 масс. %), инкубации в течение 60 мин и последующем воздействии наноструктурированных соединений углерода в объеме и количестве, необходимом для развития достаточного дезинфицирующего эффекта.

В данном изобретении раскрывается структурная формула соединений общей формулы (1), дается обоснование их применения для сенсибилизации бактериальных клеток к повреждающему действию наноуглерода, а также приводятся примеры практического использования указанных соединений для усиления антимикробной (дезинфицирующей) активности углеродных нанотрубок и фуллеренов.

По сравнению с известными соединениями, составляющими сущность известных патентов [Патенты РФ №2419439, опубл. 27.05.2011; №2501785, опубл. 20.12.2013], заявляемое соединение общей формулы (1) имеет ряд существенных отличий, а именно:

1) в отличие от четвертичных аммониевых соединений заявляемые соединения общей формулы (1) проявляют сенсибилизирующую активность в отношении широкого круга как грамотрицательных, так и грамположительных микроорганизмов;

2) в отличие от четвертичных аммониевых соединений у микроорганизмов не известны генетические детерминанты устойчивости к соединениям общей формулы (1), потенциально способные снизить или предотвратить вызываемый ими эффект сенсибилизации.

В основе сенсибилизирующего эффекта соединений общей формулы (1) лежит их амфифильный характер и определяемая этим мембранотропная активность. В свою очередь, результативным проявлением воздействия данных соединений является изменение свойств бактериальной поверхности, существенно повышающей сродство к присутствующим в среде углеродным материалам - нанотрубкам и фуллеренам. Таким образом, структурные особенности соединений общей формулы (1) позволяют им функционировать в качестве своеобразных «склеивающих» агентов (англ. - cross-linker), повышающих вероятность физического контакта между бактериальными клетками-мишенями и частицами наноуглерода. В свою очередь, итоговым результатом подобной сенсибилизации является более выраженное и более быстрое развитие антимикробного эффекта, механизм которого определяется таковым у конкретного использованного углеродного нанодезинфектанта. Дополнительным положительным результатом от использования изобретения является агрегация бактериальных клеток и воздействующих на них частиц наноуглерода, облегчающая их последующее удаление из обеззараживаемых сред или поверхностей.

Общий принцип применения соединений общей формулы (1) для заявленных целей включает их внесение в обеззараживаемые среды или нанесение на обеззараживаемые поверхности в виде сухих порошков или растворов (с содержанием 0,00001-0,0001 масс. %); инкубацию в течение 60 мин для достижения эффекта сенсибилизации; последующее внесение (нанесение) углеродного нанодезинфектанта в объеме и количестве, необходимом для развития дезинфицирующего эффекта.

На фиг. 1 в части А изображена кинетика биолюминесценции Е. coli К12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами природного морского люминесцирующего микроорганизма P. leiognathi при воздействии различных концентраций углеродных нанотрубок (мг/мл). По оси абсцисс - время, с; по оси ординат - интенсивность биолюминесценции, отн. ед., в части Б - концентрационные зависимости, описывающие эффект сенсибилизации клеток Е. coli К12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами природного морского люминесцирующего микроорганизма Р. leiognathi 1,3-дигидрокси-4-гексилбензолом в концентрациях 0,0001%, 0,00005% и 0,00001% относительно контроля (К) к воздействию углеродных нанотрубок (по оси абсцисс - мг/мл); по оси ординат - значения индекса биолюминесценции, отн. ед.

На фиг. 2 изображены фазовые АСМ-изображения клеток Escherichia coli K12 TG1 в контроле (А) после контакта с производным С60-фуллерена Ф1 (Б) и после сенсибилизации 1,3-дигадрокси-4-гексилбензолом и последующим взаимодействием с Ф1 (В).

Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Использование 1,3-дигидрокси-4-гексилбензола для сенсибилизации клеток Escherichia coli к воздействию углеродных нанотрубок.

Влияние соединения общей формулы (1), а именно 1,3-дигидрокси-4-гексилбензола, на чувствительность бактериальных клеток к повреждающему действию модифицированных аминогруппами укороченных одностенных углеродных нанотрубок было оценено в тесте ингибирования биолюминесценции сенсорного штамма Escherichia coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами морского люминесцирующего микроорганизма Photobacterium leiognathi. Использование данного тест-объекта позволило в режиме реального времени через параметр бактериальной биолюминесценции оценить развитие антибактериального эффекта (Фиг. 1А), а также количественно охарактеризовать его величинами ЕС50 - концентрациями углеродных нанотрубок, вызывающими подавление интенсивности биолюминесценции на 50% от контрольных значений (Фиг. 1Б).

При проведении исследований водный раствор 1,3-дигидрокси-4-гексилбензола с концентрациями 0,00001 масс. %; 0,00005 масс. % и 0,0001 масс. % в равных объемах вносили в суспензию бактериальных клеток (10⁸ КОЕ/мл), после чего выдерживали в течение 60 мин при 25°С для достижения эффекта сенсибилизации. В контрольные пробы вносили идентичные объемы растворителя (воды) и инкубировали в тех же условиях. После этого в опытные и контрольные пробы вносили водную суспензию углеродных нанотрубок с содержанием действующего агента от 4 мг/мл до 0,004 мг/мл, после чего образцы помещали в измерительный блок микропланшетного биолюминометра LM-01T («Immunotech», Чехия), с использованием которого в течение 60 минут динамически измеряли интенсивность биолюминесценции, прямо отражающую развитие антибактериального эффекта.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что 1,3-дигидрокси-4-гексилбензол в использованном диапазоне концентраций не влияет на биолюминесценцию/жизнеспособность бактериальных клеток-мишеней, но по мере роста концентраций прогрессивно увеличивает их чувствительность к последующему повреждающему воздействию углеродных нанотрубок. Так увеличение концентрации сенсибилизатора с 0,00001 до 0,00005 и далее до 0,0001 масс. % прогрессивно снижало значения ЕС50 для углеродных нанотрубок от 1,5 мг/мл (контроль) до 0,77, 0,45 и 0,05 мг/мл, соответственно.

Таким образом, положительный эффект от использования изобретения заключается в том, что для достижения одинаково выраженного антибактериального эффекта после сенсибилизации 1,3-дигидрокси-4-гексилбензолом требуется меньшее количество нанодезинфектанта (углеродных нанотрубок), а при сохранении равных концентраций в варианте сенсибилизации нанотрубки оказывают в 1,1-32 раз более быстрый и в 1,9-30 раз более выраженный антибактериальный эффект. Дополнительным положительным результатом от использования изобретения в данном случае является агрегация бактериальных клеток и углеродных нанотрубок, ведущая к их быстрой седиментации в обеззараживаемой водной среде.

Пример 2. Использование 1,3-дигидрокси-4-гексилбензола для сенсибилизации клеток Escherichia coli к воздействию фуллеренов.

Влияние соединения общей формулы (1), а именно 1,3-дигидрокси-4-гексилбензола, на степень сродства бактериальной поверхности к производным С60-фуллерена (Ф1, Ф2, Ф3), ковалентно модифицированным 4-5 группировками различного химического состава, представленным в таблице 1, было оценено методом атомно-силовой микроскопии (ACM), а развитие обусловленного этим антибактериального эффекта контролировалось в тесте ингибирования биолюминесценции сенсорного штамма Escherichia coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами морского люминесцирующего микроорганизма Photobacterium leiognathi (как описано в Примере 1).

При проведении исследований водный раствор 1,3-дигидрокси-4-гексилбензола в концентрациях 0,00001 масс. %, 0,00005 масс. % и 0,0001 масс. % в равных объемах вносили в суспензию бактериальных клеток 10⁸ КОЕ/мл), после чего выдерживали в течение 60 мин при 25°С для достижения эффекта сенсибилизации. В контрольные пробы вносили идентичные объемы растворителя (воды) и инкубировали в тех же условиях. После этого в опытные и контрольные пробы вносили водную суспензию производных С60-фуллерена (Ф1, Ф2 или Ф3) с содержанием действующих агентов от 0,6 мг/мл до 0,006 мг/мл.

Влияние 1,3-дигидрокси-4-гексилбензола на изменение сродства бактериальной поверхности к производным С60-фуллерена было оценено методом АСМ (Фиг. 2). При этом интактные клетки Escherichia coli характеризовались типичными для данного вида формой и размером, а также не имели на своей поверхности каких либо включений (Фиг. 2А). Контрольное воздействие фуллерена Ф1 сопровождалось визуализацией в образцах ряда округлых образований диаметром от 70 до 350 нм, представляющих собой ассоциаты данного соединения наноуглерода, неравномерно распределенные по поверхности бактериальных клеток и на подложке. Так последующий статистический анализ свидетельствовал об установлении физического контакта бактериальной поверхности с 18% наночастиц фуллерена Ф1, в то время как остальные 82% были визуализированы вне связи с бактериальными клетками (Фиг. 2Б). В свою очередь, предварительная сенсибилизация бактериальных клеток 1,3-дигидрокси-4-гексилбензолом существенно повышала сродство их поверхности к производным С60-фуллерена: доля наночастиц фуллерена Ф1, установивших физический контакт с бактериальной поверхностью, возрастала в 4,1 раза (до 74%), в то время как в свободном состоянии оставалось не более 26% наночастиц (Фиг. 2В).

Итоговым результатом проведенной сенсибилизации явилось более выраженное развитие антимикробного эффекта, оцененное по величине ЕС50 (мг/мл) при воздействии производных С60-фуллерена Ф1, Ф2, Ф3 в тесте ингибирования биолюминесценции сенсорного штамма Escherichia coli K12 TG1 с клонированными luxCDABE-генами морского люминесцирующего микроорганизма Photobacterium leiognathi, представленное в таблице 2. Так в случае предобработки бактериальных клеток 1,3-дигидрокси-4-гексилбензолом в концентрации 0,0001 масс. % с последующим воздействием производных С60-фуллерена антибактериальная активность возрастала в 1,9-2,3 раза.

Таким образом, положительный эффект от использования изобретения заключается в том, что для достижения одинаково выраженного антибактериального эффекта после сенсибилизации 1,3-дигидрокси-4-гексилбензолом требуется меньшее количество нанодезинфектанта (производных С60-фуллерена), а при сохранении его действующих концентраций в обеззараживаемой среде выраженность антибактериального действия усиливается.