Способ прогнозирования преэклампсии у беременных при носительстве мутации гена фактор V Лейден 1691 генотип G/A и А/А

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования преэклампсии (ПЭ) при беременности у женщин, носительниц мутации гена фактора V Лейден (FVL) 1691, генотип G/A и А/А по определению АПС-резистентности для формирования группы риска, нуждающихся в проведении антикоагулянтной терапии.

Морфологическим субстратом ПЭ является нарушение процессов инвазии ворсинчатого трофобласта в спиральные сосуды матки, которое клинически реализуется после 20 недель гестации в виде материнских и плодовых симптомов. ПЭ остается одной из основных причин перинатальной смертности (18-30%) и заболеваемости (64-78%) и занимает 2-3 место в структуре причин материнской смертности [Ghulmiyah L., Sibai В. Maternal mortality from preeclampsia/eclampsia. Semin. Perinatol. 2012; 36(1): 56-9; Байбарина E.H., Филиппов O.C., Гусева E.B. Модернизация службы охраны материнства и детства в Российской федерации: результаты и перспективы. Акушерство и гинекология. 2013; 12:4-9]. Мнения различных авторов по вопросам этиопатогенеза ПЭ разноречивы, а порой и полностью противоположны, что является основной причиной, инициирующей поиск новых маркеров, прогнозирующих развитие данной патологии до срока клинической реализации процесса.

В настоящее время нет точных и объективных лабораторных критериев для отбора беременных женщин с мутацией гена FVL 1691, генотип G/A и А/А в группу риска развития ПЭ, нуждающихся в дифференцированной гепаринотерапии для улучшения исходов беременности.

Известен способ прогнозирования возникновения ПЭ у беременных (Патент РФ №2478960, 10.04.2013), включающий исследование сыворотки крови иммуноферментным анализом в сроки 16-18 недель гестации, определение содержания неоптерина и возникновение ПЭ прогнозируют при уровне неоптерина выше 8,1 нмоль/л.

Недостатком известного способа является его трудоемкость, т.к. требуется специальное импортное дорогостоящее оборудование и реактивы. Кроме того, содержание неоптерина - маркера активности клеточного иммунитета, индикатора развития воспалительного процесса, изменяется при ряде патологических состояний (Свиридов Е.А., Телегина Т.А. Неоптерин и его восстановленные формы: биологическая роль и участие в клеточном иммунитете // Успехи биологической химии. - 2005. - Т. 45. - С. 355-390).

Известен способ (Патент РФ №2481578) прогноза развития тяжелой ПЭ с помощью анализа крови, заключающийся с том, что у беременной во втором триместре рассчитывают лейкоцитарный индекс интоксикации и при его значении выше 1,6 прогнозируют развитие тяжелой ПЭ.

Недостатком известного способа является позднее определение прогностического показателя, только во втором триместре, повышение которого выше нормативных величин в этот период рассматривают как риск развития только тяжелой ПЭ. Кроме того, по известному способу прогнозируют развитие только тяжелой степени преэклампсии.

Наиболее близким по достигаемому техническому результату (прототипом) является способ прогнозирования ПЭ во втором триместре беременности (Патент РФ №2552931, 2015) путем исследования крови, заключающейся в том, что в сыворотке крови женщин в 7-8 недель беременности определяют активность кислых и нейтральных протеиназ и при значении активности кислых протеиназ выше 5,6 мкмоль/л и активности нейтральных протеиназ выше 3,9 мкмоль/л прогнозируют развитие ПЭ во втором триместре беременности.

Известный способ обладает низкой точностью, так как не позволяет осуществлять стратификацию пациентов, не уточняется тип определяемых протеаз. Например, активность кислых протеаз обусловлена активностью отдельных протеаз данной группы (Катепсин D, ренин), усиливая образование ренина, уменьшая почечный кровоток, и может повышаться при поражении паренхимы почек, носительстве аномальных аллелей гена АСЕ (I/D), приеме таких лекарственных препаратов как диуретики, кортикостероиды, простагландины, эстрогены, что, безусловно, влияет на прогностическую ценность теста и требует проведения стратификации пациентов.

Авторы предлагают простой, доступный способ прогнозирования ПЭ, обладающий высокой точностью у беременных с носительством мутации гена FVL 1691, генотип G/A и А/А, что позволяет сформировать группу риска по развитию ПЭ задолго до появления первых клинических симптомов и позволяет назначить дифференцированную медикаментозную профилактику для уменьшения материнских и перинатальных осложнений.

Техническим результатом заявляемого способа является повышение точности прогноза развития ПЭ у беременных при носительстве мутации гена FVL 1691, генотип G/A и А/А на основе установленной авторами резистентности фактора Va к активированному протеину С (АПС-резистентность) по нормализованному отношению с целью выбора тактики их ведения, включающего принятие решения о проведении антитромботической терапии.

Технический результат достигается тем, что, определяют резистентность фактора Va к активированному протеину С (АПС-резистентность) по нормализованному отношению (НО) по формуле:

,

где

С(1) - время свертывания контрольной плазмы с дистиллированной водой;

Б(2) - время свертывания плазмы пациента с активатором протеина С;

Б(1) - время свертывания плазмы пациента с дистиллированной водой;

С(2) - время свертывания контрольной плазмы с активатором протеина С и при его значении 0,49 и ниже прогнозируют риск развития ПЭ.

Способ осуществляют следующим образом.

Заявляемый способ проиллюстрирован чертежом в виде таблицы, отражающей прогностическую ценность.

В заявляемом способе используют отечественный диагностический набор «Фактор V-PC-тест», ООО фирмы «Технология-Стандарт», каталожный номер набора 200.

Состав набора:

1. Активатор протеина С (лиофильно высушенный)

2. АПТВ-реагент (смесь фосфолипидов и эллаговой кислоты, лиофильно высушенная)

3. Дефицитная по фактору V плазма (лиофильно высушенная)

4. Кальция хлорид (концентрированный 20:1 раствор, 0,5 М)

3. Дефицитная по фактору V плазма (лиофильно высушенная)

4. Кальция хлорид (концентрированный 20:1 раствор, 0,5 М)

Приготовление образцов плазмы для проведения исследования.

Кровь для исследования забирают утром, натощак, из локтевой вены в пробирки "VACUETTE" 9 мл, содержащие забуференный раствор цитрата натрия 3,2%, соотношение объемов крови и цитрата натрия - 9:1. Кровь центрифугируют при 3000-4000 об/мин (1200 g) в течение 15 минут, в результате получают бедную тромбоцитами плазму.

Приготовление реагентов и проведение анализа.

Разведение активатора протеина С.

Активатор протеина С разводят дистиллированной водой в объеме согласно паспорту к набору, и растворяют при комнатной температуре от +18 до +25°C в течение 1 мин.

Разведение АПТВ-реагента.

Во флакон с лиофильно высушенным АПТВ-реагентом вносят 2,0 мл дистиллированной воды и растворяют содержимое при комнатной температуре в течение 2 мин. Непосредственно перед применением разведенный АПТВ-реагент встряхнуть.

Приготовление рабочего раствора кальция хлорида.

Концентрированный раствор кальция хлорида разводят дистиллированной водой в 20 раз (1 объем концентрированного раствора +19 объемов воды).

Разведение дефицитной по фактору V плазмы.

Во флакон с дефицитной по фактору V плазмы вносят 1,0 мл дистиллированной воды и растворяют содержимое при комнатной температуре от +18 до+25°С покачиванием в течение 3 мин.

Подготовка контрольной плазмы.

Смешивают (в равных объемах) 3-4 образца свежеприготовленной бедной тромбоцитами плазмы здоровых людей.

Проведение анализа.

Исследование плазмы крови выполняют на коагулометрах с механическим принципом регистрации результатов.

Разведение образцов плазмы.

Перед проведением исследования контрольную плазму и исследуемые образцы плазмы разводят физиологическим (0,9%) раствором хлорида натрия (1+3): смешивают 0,1 мл плазмы с 0,3 мл физиологического раствора.

Исследование контрольной плазмы.

А) 1. К 0,05 мл дефицитной по фактору V плазмы добавляют 0,05 мл дистиллированной воды.

2. Инкубируют содержимое кюветы в термостате коагулометра при +37°C 4 мин.

3. Через 4 мин инкубации в кювету последовательно добавляют 0,1 мл разведенной контрольной плазмы и 0,1 мл АПТВ-реагента.

4. Инкубируют содержимое кюветы в термостате коагулометра при +37°C 3 мин.

5. Через 3 мин инкубации в кювету добавляют 0,1 мл рабочего раствора кальция хлорида, имеющего температуру +37°C, и регистрируют время свертывания. Результат обозначают как С(1).

Б) 1. К 0,05 мл дефицитной по фактору V плазмы добавляют 0,05 мл активатора протеина С.

2. Инкубируют содержимого кюветы в термостате коагулометра при +37°C 4 мин.

3. Через 4 мин инкубации в кювету последовательно добавить 0,1 мл разведенной контрольной плазмы и 0,1 мл АПТВ-реагента.

4. Инкубируют содержимое кюветы в термостате коагулометра при +37°C 3 мин.

5. Через 3 мин инкубации в кювету добавить 0,1 мл рабочего раствора кальция хлорида, имеющего температуру +37°C, и регистрируют время свертывания. Результат обозначают как С(2).

Исследование плазмы больного.

Выполняют аналогично исследованию контрольной плазмы: время свертывания плазмы пациента с дистиллированной водой обозначают Б(1), время свертывания плазмы пациента с активатором протеина С-Б(2).

Оценка полученных результатов.

По полученным данным рассчитывают нормализованное отношение (НО) по формуле:

,

где

С(1) - время свертывания контрольной плазмы с дистиллированной водой;

Б(2) - время свертывания плазмы пациента с активатором протеина С;

Б(1) - время свертывания плазмы пациента с дистиллированной водой;

С(2) - время свертывания контрольной плазмы с активатором протеина С.

В контрольной плазме время свертывания контрольной плазмы с дистиллированной водой С(1) составляет 45-80 с, время свертывания контрольной плазмы с активатором протеина С-С(2) превышает 100 с.

Нормализованное отношение у здоровых пациентов, без носительства мутации гена FVL (1691), генотип G/A и А/А превышает 0,8.

Апробация заявляемого способа прогнозирования ПЭ у беременных при носительстве мутации гена FVL (1691), генотип G/A и А/А.

Апробация заявляемого способа проведена на 81 беременной женщине, с установленным носительством мутации гена FVL 1691, генотип G/A и А/А. На сроке беременности 7-8 недель определена резистентность Va фактора к активированному протеину С (АПС-резистентность) и по показателю нормализованного отношения пациентки были разделены на 2 группы. Первая группа - 47 обследованных беременных, у которых АПС - резистентность по нормализованному отношению была выше 0,49. Из этой группы у 2 беременных течение беременности осложнилось развитием умеренной преэклампсии при сроке беременности 37, у 45 пациенток беременность завершилась срочными родами в 39-40 недель. Вторая группа - 34 пациентки, у которых АПС-резистентность по нормализованному отношению была достоверно ниже 0,49 (р=0,028). В этой группе у 31 из 34 женщин течение беременности осложнилось развитием преэклампсии, и лишь у 3 из них отмечалось физиологическое течение беременности, которая закончилась родами на сроке 39-40 недель. Анализ полученных показателей нормализованного отношения и течения беременности показал, что истинно положительный результат имел место в 31 случае, ложноположительный - в 2 случаях, истинно отрицательный результат был в 45 случаях, ложноотрицательный - в 3 наблюдениях (чертеж).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что заявляемый способ прогнозирования ПЭ у беременных при носительстве мутации гена FVL (1691), генотип G/A и А/А, определяемый по АПС-резистентности, показал, что при показателе нормализованного отношения выше 0,49, развитие умеренной преэклампсии наступало 4,25%, тогда как при значении нормализованного отношения 0,49 и ниже течение беременности осложнялось ПЭ в 91,2%.

Клинические примеры

1. Пациентка Г.И.Г., 34 года. Наблюдалась в городском центре планирования семьи и репродукции на специализированном приеме по невынашиванию беременности. Настоящая беременность - 3, наступила самостоятельно. В анамнезе две неразвивающиеся беременности при сроке гестации 7-8 недель. На этапе планирования беременности при обследовании выявлено носительством мутации гена FVL 1691G/A (гетерозиготный генотип). При наступлении беременности на сроке 7-8 недель обследована в объеме, регламентированном приказом 572-Н, включая исследование показателей системы гемостаза. Показатель нормализованного отношения АПС-резистентности составил 0,46. Остальные параметры системы гемостаза соответствовали гестационному сроку. Показаний для проведения антитромботической терапии по результатам обследования не было. До 33 недель беременность протекала без осложнений, дополнительно у гематолога не наблюдалась и не обследовалась. С 33 недель беременности зафиксировано повышение артериального давления до 160/100, умеренная протеинурия. При исследовании показателей системы гемостаза нормализованное отношение АПС-резистентности составило 0,41, фибринолитическая активность плазмы по XIIa-зависимому фибринолизу снижена - 22 мин; маркеры тромбинемии по равстворимому фибрину в плазме (РФМК) повышены РФМК - 25,0 мг/100 мл. Пациентка госпитализирована в стационар с диагнозом: беременность 33-34 недели, умеренная преэклампсия. Проводилась лечение: магнезиальная терапия, повышенные профилактические дозы низкомолекулярных гепаринов. В 36 недель беременности в связи с отслойкой нормально расположенной плаценты проведено экстренное родоразрешение абдоминальным путем. Родился мальчик, вес 2430 г., с оценкой по Апгар 7 баллов.

2. Пациентка Ч.О.Н., 32 года. Наблюдалась в центре сохранения и восстановления репродуктивной функции Алтайской краевой клинической больницы с диагнозом: Первичное бесплодие в течение 8 лет. На этапе планирования беременности при обследовании выявлено носительством мутации гена FVL 1691 G/A (гетерозиготный генотип). Настоящая беременность первая, наступила в естественном цикле самостоятельно. При сроке беременности 7-8 недель обследована в объеме, регламентированном приказом 572-Н, включая исследование показателей системы гемостаза. Нормализованное отношение АПС-резистентности составило 0,45. Остальные показатели системы гемостаза соответствовали физиологическому течению беременности. С 34 недель беременности зафиксировано повышение цифр артериального давления до 150/100, в анализе мочи умеренная протеинурия. Пациентка госпитализирована в отделение патологии беременности краевого перинатального центра с диагнозом: беременность 34-35 недели, умеренная преэклампсия. Проводилось лечение: магнезиальная терапия, гепаринопрофилактика низкомолекулярными гепаринами в повышенных профилактических дозах. Гемодинамика стабилизировалось. При сроке беременности 37 недель, учитывая нарастающие показатели протеинурии (до 3 г/сутки), нестабильную гемодинамику (АД до 150/100), нарушение плодово-плацентарного кровообращения 1Б типа по данным доплерометрии, проведено родоразрешение путем кесарева сечения. Родился мальчик, вес 2320, с оценкой по Апгар 7 баллов.

3. Пациентка В.Ю.А., 28 лет. Наблюдалась у гематолога в Алтайском филиале Гематологического научного центра МЗ РФ. В анамнезе одни преждевременные роды в 33-34 недели, вторичное бесплодие 2 года. На этапе планирования беременности при обследовании выявлено носительством мутации гена FVL 1691G/A (гетерозиготный генотип). Настоящая беременность наступила самостоятельно в естественном цикле. В настоящую беременность при сроке беременности 7-8 недель обследована в объеме, регламентированном приказом 572-Н, включая исследование показателей системы гемостаза. Нормализованное отношение резистентности фактора Va к активированному протеину С (АПС-резистентность) составило 0,46. Маркеры тромбинемии по растворимому фибрину в плазме повышены - 21,0 мг/100 мл, уровень Д-димеров 560 нг/мл при норме до 500 нг/мл. С целью профилактики акушерских и венозных тромбоэмболических осложнений назначена тромбопрофилактика низкомолекулярными гепаринами в повышенных профилактических дозах в течение 14 дней. В течение всей беременности проводилось динамическое исследование показателей системы гемостаза, маркеров тромбинемии, по результатам которых проводились повторные курсы НМГ. Показатель АПС-резистентности по нормализованному отношению при динамическом наблюдении колебался в диапазоне 0,53-0,5 (>0,49). Ведение беременности проводилось совместно с акушером и гематологом. Осложнений гестации не выявлено. На сроке беременности 39-40 недель произошли роды через естественные родовые пути. Родился мальчик, вес 2960 с оценкой по шкале Апгар 8 баллов.

Таким образом, заявляемый способ прогнозирования ПЭ у беременных при носительстве мутации гена FVL 1691, генотип G/A и А/А по определению АПС-резистентности обладает высокой точностью, является высокоинформативным и позволяет формировать группу риска по развитию ПЭ для проведения персонифицированной медикаментозной профилактики и терапии во время беременности для уменьшения материнских и перинатальных осложнений.