СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ СВОБОДНОЙ ГИББЕРЕЛЛОВОЙ КИСЛОТЫ В ВЕГЕТАТИВНЫХ ОРГАНАХ РАСТЕНИЙ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Изобретение относится к аналитической химии дитерпеноидов флуоренового ряда, в частности к способу определения содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК₃) в вегетативных органах растений.

Гиббереллины активируют рост стеблей растений, вызывают прорастание покоящихся семян и нарушают период покоя у растений, стимулируют цветение фотопериодически чувствительных растений, способствуют образованию партенокарпических плодов, стимулируют образование и лигнификацию вторичной ксилемы клеток (число лигнифицированных клеток возрастает с увеличением дозы гибберелловой кислоты) [Г.-В. Хелдт. Биохимия растений. - М.: БИНОМ, 2011. - 471 с.].

Известно, что для выделения и изучения гиббереллинов, в том числе гибберелловой кислоты (ГК₃), используют различные методы, в том числе хроматографию, а для определения их содержания - метод биотестов.

Метод биологических проб (биотестов) применяют для определения активности эндогенных биологически активных веществ, химическая природа которых еще не известна. Метод основан на подсчете числа проросших семян салата в опытных вариантах к числу проросших семян в контрольном варианте. Уровень активации прорастания семян характеризует содержание гиббереллинов в исследуемом материале [Методические рекомендации по определению фитогормонов. Киев: Институт ботаники АН УССР, 1988 - 78 с.]. Недостатками этого метода являются длительность его проведения (не менее 2 суток), относительные показатели содержания гиббереллинов в исследуемом материале и отсутствие требуемой точности количественного анализа.

Наиболее близким к заявляемому способу техническим решением является способ количественного выделения гиббереллинов из растительного материала 80%-ным этанолом в течение 48 часов, концентрирование экстракта до водного остатка упариванием спиртового раствора при 40°C, удаление белков и пигментов вымораживанием в течение 24 часов при -24°C, отделение осадка центрифугированием, доведение рН водного остатка до 2,5 с помощью 1н. соляной кислоты и трехкратная экстракция свободных гиббереллинов из подкисленного супернатанта этилацетатом в соотношении 1:3, упаривание этилацетатной фракции до сухого остатка [Методические рекомендации по определению фитогормонов. Киев: Институт ботаники АН УССР, 1988 - 78 с.].

Недостатки способа: совместная экстракция как свободных, так и связанных гиббереллинов, сложная методика очистки экстракта, большая длительность проведения анализа. При анализе сложных по составу биологических проб методом капиллярного электрофореза происходит быстрое загрязнение разделяющего капилляра.

Задачей изобретения является экспрессный анализ, включающий выделение свободной гибберелловой кислоты (ГК₃) из растительного материала, эффективное разделение и определение содержания свободной гибберелловой кислоты методом высокоэффективного капиллярного электрофореза, обеспечение экспрессных и достоверных количественных результатов при минимальных затратах на пробоподготовку и выполнение анализа.

Техническим результатом при использовании предлагаемого изобретения является экспрессность и достоверность количественного определения содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК₃) методом капиллярного электрофореза.

Технический результат достигают за счет того, что способ определения содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК₃) предусматривает экстракцию пробы биологического материала этилацетатом, с последующей фильтрацией экстракта, выпаривание его до сухого остатка, растворение сухого остатка в 60%-ном водном ацетоне и количественное определение содержания свободной гибберелловой кислоты на системе капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм с использованием водного раствора ведущего электролита, содержащего 0,33% масс., борной кислоты, 0,05% масс. тетрабората натрия, 0,5% об. изопропанола (pH 9,3) при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм.

Способ отличается тем, что, с целью обеспечения экспрессности и достоверности анализа содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК₃), для ее выделения из растительного материала используют этилацетат с последующей фильтрацией экстракта, упариванием его до сухого остатка, растворением сухого остатка в 60%-ном водном ацетоне и количественном определении содержания свободной гибберелловой кислоты на системе капиллярного электрофореза 105М в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, с использованием водного раствора ведущего электролита, содержащего 0,33% масс. борной кислоты, 0,05% масс. тетрабората натрия, 0,5% об. изопропанола (pH 9,3) при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм.

Поставленная задача решается за счет того, что использование этилацетата позволяет выделить из растительного материала свободную гибберелловую кислоту (ГК₃), свойства ведущего электролита позволяют исключить из процесса анализа многостадийную пробоподготовку и обеспечить эффективное разделение анализируемого компонента при длине волны детектирования 254 нм.

В результате проведенных исследований и сравнения с аналогом установлено, что предлагаемый способ количественного определения содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК₃) в вегетативных органах растений, включающий экстракцию пробы биологического материала с использованием этилацетата, фильтрацию экстракта, упаривание его до сухого остатка, растворение сухого остатка в 60%-ном водном ацетоне и количественное определение свободной гибберелловой кислоты на системе капиллярного электрофореза 105М в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, с использованием водного раствора ведущего электролита, содержащего 0,33% масс. борной кислоты, 0,05% масс. тетрабората натрия, 0,5% об. изопропанола (pH 9,3) при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм, позволяет достичь объективного, экспрессного определения массового содержания свободной гибберелловой кислоты как в градуировочных растворах, так и в биологических пробах.

Преимущества заявляемого способа заключаются в выделении свободной формы гибберелловой кислоты, в экспрессности, использовании доступных реактивов при осуществлении анализа на системах капиллярного электрофореза, например серии «Капель», обеспечении объективности и достоверности анализа реальных проб, стабильности во времени ведущего электролита, позволяющего исключить из процесса анализа многостадийную пробоподготовку и обеспечить эффективное разделение анализируемого компонента. Контролем служило определение гибберелловой кислоты в этой же пробе согласно способа-прототипа.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК₃) методом капиллярного электрофореза в листьях яблони при стандартной и упрощенной пробоподготовке

При стандартной подготовке для извлечения суммарного количества гиббереллинов (свободных и связанных) пробу листьев яблони сорта Айдаред массой 1,00 г гомогенизировали с 80%-ным этанолом в соотношении 1:3 и оставляли для экстракции в течение 48 часов. Операцию повторяли еще дважды. Все порции экстракта объединяли, фильтровали через стеклянный фильтр и упаривали при 40°C до водной фазы. Водный остаток промораживали в течение суток при температуре -24°C, центрифугировали в течение 10 мин при 10000 об/мин. Супернатант подкисляли 1 н. HCl до pH 2,5.

Извлечение свободной гибберелловой кислоты из супернатанта проводили путем экстракции трижды равными объемами этилацетата в соотношении 1:3. Объединенные этилацетатные экстракты высушивали безводным сульфатом натрия и упаривали досуха в токе холодного воздуха при температуре 40°C. Сухой остаток растворяли в 2 см³ 60%-ного водного ацетона.

Содержание свободной гибберелловой кислоты в полученном растворе определяли на системе капиллярного электрофореза 105М в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, с использованием водного ведущего электролита, содержащего 0,33% масс. борной кислоты, 0,05% масс. тетрабората натрия, 0,5% об. изопропанола (pH 9,3) при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм.

Осуществляли подготовку пробы упрощенным способом.

При упрощенной пробоподготовке для выделения свободной гибберелловой кислоты пробу листьев яблони сорта Айдаред массой 1,00 г заливали этилацетатом, в соотношении 1:10, и растирали в смеси с кварцевым песком, фильтровали через стеклянный фильтр. Эфирный экстракт переносили в стаканы и выпаривали досуха в токе холодного воздуха. Полученный сухой остаток, содержащий анализируемое вещество, растворяли в 2 см³ 60%-ного водного ацетона. Количественно содержание свободной гибберелловой кислоты определяли на системе капиллярного электрофореза в кварцевом капилляре, эффективной длиной 0,5 м, внутренним диаметром 75 мкм, с использованием водного ведущего электролита, содержащего 0,33% масс. борной кислоты, 0,05% масс. тетрабората натрия, 0,5% об. изопропанола (pH 9,3) при положительной полярности напряжения и длине волны детектирования - 254 нм. Контролем служило определение содержания свободной гибберелловой кислоты в этой же пробе, согласно способа-прототипа.

Полученные результаты приведены в таблице.

Электрофореграмма количественного определения содержания свободной гибберелловой кислоты в экстракте листьев яблони методом капиллярного электрофореза при стандартной пробоподготовке приведена на фигуре 1; в экстракте листьев яблони при упрощенной пробоподготовке - на фигуре 2. Пример идентификации свободной гибберелловой кислоты методом капиллярного электрофореза при упрощенной пробоподготовке методом добавки показан на фигуре 3.

Пример 2. Определение содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК₃) в листьях винограда методом капиллярного электрофореза при стандартной и упрощенной пробоподготовке

Аналогично примеру 1, кроме того, что пробоподготовке подвергали листья винограда сорта Бианка. Полученные результаты приведены в таблице.

Пример 3. Определение содержания свободной гибберелловой кислоты (ГК₃) в проростках озимой пшеницы сорта Краснодарская 99 методом капиллярного электрофореза при стандартной и упрощенной пробоподготовке

Аналогично примеру 1, кроме того, что пробоподготовке подвергали проростки озимой пшеницы сорта Краснодарская 99. Полученные результаты приведены в таблице.

Анализ полученных результатов показал, что в случае анализа листьев яблони, винограда, проростков озимой пшеницы содержание свободной гибберелловой кислоты, выделенной по стандартной процедуре подготовки пробы, согласно прототипа, снижается на 47,6 - 77,8 - 101,1% (примеры 1-3) в сравнении с результатами предлагаемого способа.

Применение стандартной процедуры (способа-прототипа) подготовки пробы (примеры 1-3), увеличивающей продолжительность анализа в несколько раз, оказалось неприемлемым, так как результат искажался в 1,5-2 раза, что связано с быстрым загрязнением капилляра и, соответственно, ухудшением качества разделения компонентов.

Таблица - Результаты определения гибберелловой кислоты, мг/кг, в исследуемых объектах при стандартной и упрощенной пробоподготовке

Применение заявляемого способа позволило получить воспроизводимый результат в случае упрощенной подготовки пробы для объектов примеров 1-3.

Для проверки надежности метода упрощенной подготовки пробы, реализованного в примере №1, использовали метод добавки свободной гибберелловой кислоты в пробу биологического материала и проводили экстракционную подготовку.

Установлено, что степень извлечения гибберелловой кислоты для анализируемого образца составила 102-104%.

Эти данные свидетельствуют о возможности корректного определения свободной гибберелловой кислоты согласно примеру №1 (упрощенная пробоподготовка).

Предлагаемый способ практически лишен таких недостатков, как необходимость длительной очистки проб для корректного анализа, влияние мешающих веществ биологической пробы - фенольных соединений, аминокислот, анионов, органических кислот; водный раствор ведущего электролита стабилен во времени и не загрязняет внутреннюю поверхность капилляра.

При реализации способа получены количественные результаты определения массовой концентрации гибберелловой кислоты, превосходящие по своему качеству прототип.