Результат интеллектуальной деятельности: Способ прогноза развития постперикардиотомного синдрома у больных ИБС, перенесших аортокоронарное шунтирование

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к кардиохирургии, и может быть использовано в отделениях интенсивной терапии и кардиологии.

Известен способ прогнозирования риска возникновения сердечно-сосудистых патологий на основе определения активности первой изоформы параоксоназы (PON1).

(См. US 20090208992 А1 - WO 2009105622, publ. 2009-08-27; МПК А61В 5/145) /1/.

При таком подходе активность PON1 коррелирует с ее полиморфизмом. Данный способ позволяет получить прогноз о развитии кардиопатологий как для пациентов, еще не перенесших оперативное вмешательство, так и для пациентов после реваскуляризации миокарда. Аналог представлен однокомпонентной моделью (прогноз зависит только от активности PON1 и ее полиморфизма), что существенно снижает точность результата. Данный способ охватывает широкий спектр возможных патологий, при этом изменения активности PON1 отличаются низкой специфичностью.

Известен также способ коррекции ишемических нарушений, возникших в результате реперфузионной травмы печени (RU 2479872, опубл. 20.04.2013, МПК G09B 23/28) /2/. Ключевым компонентом данного метода является блокатор аргиназы - L-норвалин. Применение L-норвалина позволяет избежать неблагоприятных последствий, сопряженных с механизмом ишемии-реперфузии. Механизм ишемии-реперфузии - основной триггер, запускающий системный воспалительный процесс и инициирующий развитие постперикардиотомного синдрома (ПКТС) (Накацева и др., 2010) /3/. Поэтому активность аргиназы, принимающей непосредственной участие в формировании эндотелиальной дисфункции, является важнейшим фактором для оценки риска развития постоперационных осложнений, в частности ПКТС.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в повышении точности, специфичности и чувствительности прогностического метода, позволяющего выделить группу риска на раннем этапе и выбрать адекватную терапию для таких пациентов.

Поставленная задача решается следующим образом: способ прогнозирования постперикардиотомного синдрома (ПКТС) у больных ИБС после аортокоронарного шунтирования характеризуется тем, что у пациентов через сутки после операции определяют активность аргиназы в эритроцитах и арилэстеразную активность параоксоназы (PON) в плазме крови. Затем рассчитывают коэффициент К = аргиназа/PON, характеризующий соотношение активности аргиназы к арилэстеразной активности PON и определяемый как предиктор развития ПКТС. При значении коэффициента К, равном 0,39 и более, у пациента с вероятностью 67% прогнозируют развитие ПКТС. Точность данного способа составляет 75%, специфичность - 69,2% и чувствительность - 75%.

Настоящий способ, основанный на определении соотношения активностей аргиназы и PON, отличается простотой в исполнении и не требует дополнительного оборудования помимо того, чем оснащены современные лаборатории (спектрофотометр, термостат и центрифуга). Двухкомпонентность модели повышает точность прогноза. Выполнение теста не занимает много времени. К преимуществам также можно отнести относительно высокие уровни чувствительности и специфичности изобретения.

ПКТС - это специфическая форма травматического перикардита, развивающаяся в рамках системной воспалительной реакции организма (Chien, Shen, 2006; Игольникова, Никулина, 2012) /4, 5/. Несмотря на многолетний опыт ведения больных с ПКТС и продолжающееся активное изучение патогенетических механизмов его развития, методов профилактики и коррекции данного состояния, до настоящего времени нет четко обозначенных диагностических критериев этого синдрома. Клинические проявления ПКТС неспецифичны, и диагноз, как правило, устанавливается после исключения клинических состояний со сходной симптоматикой (Игольникова, Никулина, 2012) /5/. Отсутствие специфических клинических критериев диагностики ПКТС повышает ценность дополнительных методов обследования.

Аргиназа (КФ 3.5.3.1.) - марганецсодержащий фермент, катализирующий гидролиз L-аргинина до L-орнитина и мочевины (Ash, 2004) /6/. У человека имеется две изоформы аргиназы (1 и 2), кодирующиеся различными генами. Аргиназа-1 - цитозольный фермент и экспрессируется в печени, а также в эндотелии, гладкомышечных клетках сосудов, кардиомиоцитах и эритроцитах (Pernow, Yung, 2013) /7/. В отличие от первой изоформы, вторая имеет митохондриальную локализацию и экспрессируется в основном в почках, однако также может содержаться в мозге, кишечнике, поджелудочной железе и индуцироваться в других органах и клетках, в том числе в макрофагах и эндотелии сосудов. L-аргинин является также субстратом и для другого фермента - эндотелиальной NO-синтазы. Поэтому чрезмерная активация обеих изоформ зачастую приводит к снижению биодоступности L-аргинина для синтеза NO, что впоследствии становится причиной развития эндотелиальной дисфункции. Кроме того, регуляция экспрессии и активности аргиназы-1 сопряжена с воспалительными процессами и находится под контролем цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-13, TGFβ) и толл-подобных рецепторов (Yang, Ming, 2013) /8/.

Вместе с тем в плазме крови и биологических жидкостях присутствует ассоциированный с липопротеинами высокой плотности (ЛПВП) фермент, обладающий антивоспалительным и антиатерогенным эффектами - параоксоназа (Huang et al., 2013) 191. Семейство параоксоназ подразделяется на 3 изоформы PON1, 2 и 3. PON1 способна подавлять свободно радикальные процессы в эндотелиальных клетках человека, клетках гладкой мускулатуры сосудов и фибробластах. PON1 также предотвращает окисление ЛПВП и повышает биодоступность NO, опосредуя активацию эндотелиальной NO-синтазы ( et al., 2014) /10/. В то же время PON2 имеет возможность переключать фенотип макрофагов с провоспалительного (M1) на противовоспалительный (М2) (Koren-Gluzer et al., 2015) /11/. Известно, что активность параоксоназы обратно корреллирует с системной воспалительной реакцией и развитием атерогенеза (Mackness, Mackness, 2013; Zhou et al., 2013) /12, 13/. Все вышеизложенное определило актуальность и цель работы.

Цель работы: оценить возможность использования соотношения активности аргиназы и арилэстеразной активности параоксоназы в качестве биомаркера для прогнозирования развития ПКТС у пациентов с ИБС, перенесших аортокоронарное шунтирование.

Материал и методы. Обследовано 76 больных ИБС в возрасте 41-75 лет (средний возраст 58±1,5), которые перенесли аортокоронарное шунтирование (АКШ) в отделении кардиохирургии РОСТГМУ, г. Ростов-на-Дону. Больные были разделены на 2 группы:

1 группа - больные ИБС (66 человек), у которых ПКТС не был обнаружен в результате клинических исследований;

2 группа - больные ИБС (10 человек, 15%), у которых в результате клинических исследований был установлен ПКТС.

Биохимические показатели исследованы в динамике: на 1-е, 3-е, 5-е, 7-е и 10-е сутки послеоперационного периода. В качестве контроля использовали кровь 20 практически здоровых людей доноров обоего пола в возрасте от 35 до 52 лет (средний возраст 46,2±0,7).

Исследована динамика активностей аргиназы и PON в эритроцитах и плазме крови в течение 10 суток со дня операции. Статистическая обработка полученных результатов основывалась на U-критерии Манна-Уитни и t-критерии Стьюдента и осуществлялась при использовании пакета программ SPSS Statistics 17.0 и Statistica 10.0. Различия считали достоверными при р<0,05. Результаты представляли в виде медианы (Me) с интерквартильным размахом (25-75-й процентиль).

Полученные результаты свидетельствуют о повышении активности аргиназы в эритроцитах крови больных ИБС, перенесших АКШ, во все исследованные сроки. Но максимальный прирост во второй группе наблюдается уже в 1-е послеоперационные сутки - 1,91 (1,78-2,01) МЕ/г Hb, что на 220% (р<0,00001) больше по сравнению с донорами. Причем у больных с ПКТС активность аргиназы выше, чем у пациентов без синдрома на 71% (р<0,05).

Арилэстеразная активность PON в плазме крови больных с ПКТС и без синдрома характеризуется противоположной динамикой. Так, активность PON во второй группе пациентов максимально снижается уже на первые сутки 4,8 (1,0-6,3) МЕ/г белка, что на 85% (р<0,001) ниже по сравнению с донорами. Между группами в плазме крови достоверных отличий не обнаружено.

Была обнаружена высокая обратная корреляционная зависимость между активностями ферментов, коэффициент корреляции Спирмена составил -1,0 (р<0,01).

Исходя из полученных результатов, было решено для расчета соотношения активностей аргиназы и PON использовать данные по 1-м суткам послеоперационного периода в эритроцитах и в плазме крови.

Для оценки эффективности прогностического метода был построен график ROC-кривой.

Предлагаемое изобретение проиллюстрировано рисунком.

На фиг. 1. представлено: ROC-кривая теста, предназначенного для прогнозирования ПКТС в плазме.

Оптимальный коэффициент аргиназа/PON равен 0,39. Чувствительность описанного способа для плазмы равна 75%, специфичность - 69,2%, общая точность - 75%. Таким образом, если у пациента в первые сутки послеоперационного периода данный коэффициент превышает 0,39, тогда с вероятностью 67% возможно развитие ПКТС после перенесенной реваскуляризации миокарда.

Судить о качестве теста можно по экспертной шкале для значений AUC (Area Under Curve, площадь под ROC-кривой) (таб. 1) (Simundic, 2012) /14/.

Величина AUC для теста, предназначенного для прогнозирования в плазме, составила 0,779 (95% ДИ 0,579-0,981). Установленные значения AUC свидетельствуют о высоком качестве описываемого способа.

Положительный эффект: прогнозирование постперикардиотомного синдрома расширит меры по снижению послеоперационных осложнений и смертности, сократит медицинские расходы, а также повысит качество жизни пациента. Известно, что ранняя противовоспалительная терапия заметно снижает частоту возникновения постперикардиотомного синдрома. Однако «слепое» применение лекарственных средств чревато рядом побочных эффектов, значительно осложняющих постоперационный период. Описываемый способ позволит существенно сократить сроки прогнозирования ПКТС и выделить группу риска для целенаправленной терапии.

Осуществление изобретения

Исследование активности аргиназы основано на спектрофотометрическом методе определения (Колб, Камышников, 1982) /15/. Об активности аргиназы судят по приросту мочевины - продукта катализируемой реакции. Содержание мочевины оценивают по реакции с диацетилмонооксимом.

Ход работы включает в себя следующие этапы.

1. В контрольные пробирки добавляют 0,5 мл 30% трихлоруксусной кислоты, 0,5 мл 1% гемолизата эритроцитов крови, 0,5 мл 0,1 М глицинового буфера (рН 9,5), 0,5 мл 2,4 мкМ раствора MnCl₂ и 0,5 мл 20,1 мкМ раствора аргинина.

Опытные пробирки содержат 0,5 мл 1% гемолизата эритроцитов крови, 0,5 мл 0,1 М глицинового буфера (рН 9,5), 0,5 мл 2,4 мкМ раствора MnCl₂ и 0,5 мл 20,1 мкМ раствора аргинина.

2. Пробы инкубируют при 37°С 60 минут.

3. После инкубации реакцию в опытных пробах останавливают внесением 0,5 мл 30% ТХУ.

4. Все пробы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

5. В чистых пробирках к 0,5 мл надосадочной жидкости добавляют 2 мл цветного реактива с раствором (2,5 г/л) диацетилмонооксима.

6. Пробы перемешивают, закрывают фольгой и помещают в кипящую водяную баню на 10 мин, после чего охлаждают в токе холодной воды.

7. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 540 нм.

, где

16,65 - содержание мочевины в калибровочном растворе, ммоль/л.;

Е_оп - оптическая плотность опытной пробы;

Е_к - оптическая плотность контрольной пробы;

Е_калиб - оптическая плотность стандартного раствора мочевины;

С - концентрация гемоглобина в 1% гемолизате.

Активность аргиназы выражают в международных единицах на г гемоглобина (МЕ/г Hb).

Принцип метода для определения уровня мочевины заключается в следующем: мочевина образует с диацетилмонооксимом в присутствии тиосемикарбазида и солей железа в кислой среде окрашенные соединения, интенсивность окраски которых пропорциональна содержанию мочевины (Меньшиков В.В., 1987) /16/.

Ход работы включает в себя следующие этапы.

1. В опытные пробирки добавляют 0,5 мл 1% гемолизата эритроцитов и 0,5 мл 30% трихлоруксусной кислоты.

2. Контрольные пробирки содержат 0,5 мл disH₂O.

3. Стандартная проба содержит 0,01 мл калибратора.

4. Через 15-20 мин опытные пробы центрифугируют при 3000 об/мин.

5. В чистую пробирку вносят 0,5 мл надосадочной жидкости и 2 мл цветного реактива.

6. Пробирку выдерживают в кипящей водяной бане 10 мин, затем охлаждают в течение 2-5 мин под водопроводной водой.

7. Измерение оптической плотности проводят на спектрофотометре при длине волны 540 нм.

, где

Е_оп - оптическая плотность опытной пробы;

Е_к - оптическая плотность контрольной пробы;

Е_калиб - оптическая плотность стандартного раствора;

С - концентрация гемоглобина в 1% гемолизате.

Уровень мочевины выражают в ммоль на г гемоглобина (моль/г Hb).

Исследование функционального состояния параоксоназы основано на определении ее арилэстеразной активности (Kilic S. et al, 2005) /17/. Принцип метода: параоксоназа катализирует гидролиз фенилацетата, расщепляющегося до фенола. Скорость образования фенола определяют, измеряя оптическую плотность исследуемого образца при λ=270 нм.

Ход работы предполагает следующие этапы.

1. В опытные пробирки вносят 1,5 мл 1 мМ CaCl₂, в контрольную пробирку - 1,75 мл 1 мМ CaCl₂.

2. В опытные пробирки добавляют 250 мкл биосубстрата.

3. Запускают реакцию внесением 250 мкл 12 мМ фенилацетата.

4. Проводят измерение оптической плотности при λ=270, затем пробы инкубируют при 37°С 7 минут на водяной бане и снова измеряют оптическую плотность.

Арилэстеразную активность параоксоназы рассчитывают по формуле:

, где

Е_оп1 - оптическая плотность опытной пробы до инкубации,

Е_оп2 - оптическая плотность опытной пробы после инкубации,

Е_к1 - оптическая плотность контрольной пробы до инкубации,

Е_к2 - оптическая плотность контрольной пробы после инкубации,

Е_м - коэффициент молярной экстинкции, 1310 М^-1 см^-1,

С - концентрация общего белка в плазме или перикардиальной жидкости

d - толщины кюветы,

TV - общий объем пробы,

SV - объем образца.

Арилэстеразную активность параоксоназы выражают в международных единицах на мг белка (МЕ/мг белка).

Рассчитывают коэффициент, характеризующий соотношение активностей обоих ферментов (аргиназа/PON).

Предлагаемое изобретение проиллюстрировано клиническими примерами:

1. Пациенту, 65 лет, мужчине, страдающему ишемической болезнью сердца, выполнено аортокоронарное шунтирование в отделении кардиохирургии Ростовского государственного медицинского университета.

Коэффициент аргиназа/PON через сутки после оперативного вмешательства составил 0,76. Согласно критерию прогнозирования по заявленному способу данное соотношение было больше 0,39. Сделано заключение о высоком риске развития ПКТС. Данный прогноз подтвердился. У пациента на 5-е сутки послеоперационного периода развился ПКТС.

2. Пациенту, 59 лет, мужчине, страдающему ишемической болезнью сердца, выполнено аортокоронарное шунтирование в отделении кардиохирургии Ростовского государственного медицинского университета.

Коэффициент аргиназа/PON через сутки после оперативного вмешательства составил 0,17. Согласно критерию прогнозирования по заявленному способу данное соотношение было меньше 0,39. Сделано заключение о минимальном риске развития ПКТС. Данный прогноз подтвердился. В течение всего периода наблюдения у пациента развития ПКТС не произошло.

Источники информации

1. US 20090208992 A1 - WO 2009105622, publ. 2009-08-27; МПК A61B 5/145.

2. RU 2479872, публ. 20.04.2013; МПК G09B 23/28.

3. Накацева Е.В., Мартынова М.Г., Титаренко О.Т. и др. Современные принципы диагностики лечения постперикардиотомного синдрома // Бюллетень федерального центра сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова. 2010; 5:95-102.

4. Chien N.-C., Shen Т.-С. Chronic Postpericardiotomy Syndrome and Cardiac Tamponade Lasting for Two Years after Open Heart Surgery // Acta Cardiol Sin. 2006; 22:170-174.

5. Игольникова Л.Н., Никулина Е.Г. Постперикардиотомный синдром: клинико-лабораторная диагностика, лечение (обзор литературы) // Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. 2012; 1:42-46.

6. Ash D.E. Structure and Function of Arginases // The Journal of Nutrition. 2004; 134:2760-2764.

7. Pernow J., Jung C, 2013. Arginase as a potential target in the treatment of cardiovascular disease: reversal of arginine steal? // Cardiovasc. Res. 2013; 98:334-343.

8. Yang Z., Ming X.-F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation // Frontiers in immunology. 2013; 4 (149):1-11.

9. Huang Y, Wu Z., Riwanto M. et al. Myeloperoxidase, paraoxonase-1, and HDL form a functional ternary complex // The Journal of Clinical Investigation. 2013; 123(9):3815-3828.

10. G., Penno G., Pucci L. et al. Q192R Paraoxonase (PON)1 Polymorphism, Insulin Sensitivity, and Endothelial Function in Essential Hypertensive Men // Clinical Medicine Insights: Cardiology. 2014; 8:57-62.

11. Koren-Gluzer M., Rosenblat M., Hayek T. Paraoxonase 2 Induces a Phenotypic Switch in Macrophage Polarization Favoring an M2 Anti-Inflammatory State // International Journal of Endocrinology. 2015; 8:1-9.

12. Mackness M., Mackness B. Targeting paraoxonase-1 in atherosclerosis // Expert Opinion on Therapeutic Targets. 2013; 7: 829-837.

13. Zhou C, Cao J., Shang L. et al. Reduced Paraoxonase 1 Activity as a Marker for Severe Coronary Artery Disease // Disease Markers. 2013; 35 (2):97-103.

14. A.-M. Diagnostic Accuracy—Part 1: Basic Concepts: Sensitivity and Specificity, ROC Analysis, STARD Statement // The Journal of Near-Patient Testing & Technology. 2012; 11(1):6-8.

15. Колб В.Г., Камышников B.C. Справочник по клинической химии. Минск: Беларусь. - 1982 - 311 с.

16. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина. - 1987. - 368 с.

17. Kilic S.S., Aydin S., Kilic N. et al. Serum arylesterase and paraoxonase activity in patients with chronic hepatitis // World Journal of Gastroenterology. 2005; 11(46):7351-7354.