Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения комбинированного ферментного препарата бета-галактозидаз

Изобретение относится к биотехнологии и касается микробиологических методов получения ферментных препаратов бета-галактозидазы.

β-Галактозидаза (бета-галактозидаза, лактаза, КФ 3.2.1.23) относится к классу гидролаз, которые действуют на О-гликозильные соединения и отщепляют концевой нередуцированный остаток β-D галактозы в β-галактозидах, включая лактозу, с образованием свободных моносахаридов, либо переносят остаток β-D-галактозы на молекулу лактозы или других β-D-галактозидов с образованием галактоолигосахаридов. Свойство β-галактозидазы предпочтительно катализировать ту или иную из указанных реакций и обусловливает два основных направления ее использования. Традиционно фермент применяется для производства из молока и отходов его переработки продуктов функционального питания и кормов с пониженным содержанием лактозы и глюкозо- галактозных сиропов, галактоолигосахаридов, а также лекарственных препаратов для компенсации лактазной недостаточности.

Известен способ получения β-галактозидазы (патент ЕР №1283876, европейский классификационный индекс C12N 9/24 A8, дата публикации 24.01.2007), с использованием в качестве продуцента Bifidobacteria bifidum. Из клетки продуцента извлекают ген, кодирующий синтез β-галактозидазы, и трансплантируют его в клетку Е. coli. Недостатком данного способа относится сложность технологии и ее аппаратурного оформления, в том числе для глубокой очистки продукта. Все это существенно повышает стоимость готового продукта.

Запатентован способ получения β-галактозидазы (патент ЕР 2725098 международная классификация C12N 1/16, C12P 21/02, C12P 19/02, C12P 7/06, C07K 14/39, дата публикации 30.04.2014), в котором в качестве продуцента применяются дрожжи K. lactis. В патенте для увеличения выхода и активности фермента клетки продуцента подвергают трансформации, концентрируя в них ген, отвечающий за синтез β-галактозидазы. К недостаткам данного способа относится сложность технологии и ее аппаратурного оформления, высокая стоимость готового продукта.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ получения β-галактозидазы с использованием одного из штаммов вида дрожжей Kluyveromyces fragilis [патент CN 102851220 международная классификация C12P 19/14, C12N 1/16, C12N 9/38, C12R 1/645, дата публикации 16.10.2013]. Процесс пучения фермента проходит в следующей последовательности: подготовка питательной среды, в составе которой дрожжевой экстракт 10 г/л, пептоны 20 г/л, глюкоза 20 г/л, культивирование дрожжей при pH 6,5 и температуре 30°C с аэрацией в течение 30 часов, далее происходит выделение клеток Kluyveromyces fragilis центрифугированием. После выделения клеток из культуральной жидкости суспензию клеток подвергают гомогенизации с добавлением фосфатного буфера, гомогенизация происходит при 55 МРа, после чего полученный гомогенизат подвергают ультрафильтрации. К недостаткам данного способа относится использование сложной питательной среды, затраты на длительное культивирование и гомогенизацию для разрушения клеток и извлечения фермента, что приводит к удорожанию готового продукта, а также узкий температурный и pH диапазоны действия ферментного препарата дрожжевого происхождения.

Технический результат предлагаемого способа заключается в получении комбинированного ферментного препарата β-галактозидаз разного происхождения (дрожжевого и бактериального), имеющего расширенный pH и температурный диапазон действия, с низкой стоимостью за счет применения дешевого вторичного молочного лактозосодержащего сырья, интенсификации процессов культивирования и исключения энергоемкого процесса гомогенизации. Для достижения этого результата, предлагается в качестве продуцентов ферментов использовать лактозосбраживающие дрожжи и термофильные молочнокислые бактерии, применяющиеся в производстве пищевых продуктов и способные синтезировать β-галактозидазы с разными температурными и pH диапазонами действия. Кроме того, эти микроорганизмы на первом этапе культивирования в лактозосодержащих средах стимулируют развитие друг друга, за счет чего достигается интенсификация процесса культивирования, а на втором - создают условия для лизиса клеток и извлечения ферментов, что позволяет исключить гомогенизацию. Благодаря тому, что в технологии используются заквасочные микроорганизмы с доказанной безопасностью, не требуется сложной очистки продукта от токсичных продуктов их метаболизма.

Предлагается способ получения комбинированного ферментного препарата бета-галактозидаз, включающий подготовку лактозосодержащего сырья, культивирование микроорганизмов, извлечение ферментов, их очистку методом ультрафильтрации и концентрирование, при этом согласно изобретению в лактозосодержащем сырье с массовой долей лактозы 3-15% культивируют одновременно лактозосбраживающие дрожжи и термофильные молочнокислые бактерии при температуре (30±2)°C в течение 7-16 ч, а извлечение ферментов проводят путем автолиза при температуре (50±5)°C в течение 6-12 часов.

Способ заключается в следующем.

В качестве сырья и питательной среды для культивирования микроорганизмов используется вторичное молочное сырье (например, молочная сыворотка), содержащее лактозу, азотистые и минеральные вещества, необходимые для развития лактозосбраживающих дрожжей и молочнокислых микроорганизмов. При использовании молочной сыворотки, как правило, ее очищают от остатков молочного жира и казеиновой пыли на специальных сепараторах. Температурная обработка сырья проводится при 72-76°C, продолжительностью 15-20 секунд, для уничтожения микроорганизмов, которые могут влиять на качество готового продукта. Эти режимы обработки вторичного молочного сырья являются традиционными и не являются отличительными признаками изобретения.

Важным для данного способа является то, что массовая доля лактозы в исходном растворе должна составлять от 3 до 15%. 3% - это минимальное содержание лактозы в натуральной творожной сыворотке, кроме того, если в среде будет меньше 3% лактозы, то микроорганизмы-продуценты бета-галактозидазы будут плохо развиваться из-за недостатка углеводов. Повышение массовой доли лактозы может достигаться путем подсгущения или растворения сухого сырья, причем концентрация лактозы свыше 15% будет способствовать подавлению развития дрожжей и молочнокислых микроорганизмов.

В подготовленную лактозосодержащую среду вносятся закваски заранее активированных микроорганизмов лактозосбраживающих дрожжей молочнокислых бактерий от исходного объема. Культивирование проходит при (30±2)°C, это оптимальная температура развития дрожжей, при более низкой или высокой они развиваются медленнее. При этой температуре термофильные молочнокислые бактерии сначала развиваются медленно, подкисляя среду, что стимулирует рост дрожжей. Повышение температуры культивирования приведет к ускоренному росту термофильных молочнокислых бактерий, кислотность быстро нарастет, что может подавлять развитие дрожжей. На втором этапе культивирования продукты жизнедеятельности дрожжей, такие как витамины и аминокислоты, будут стимулировать рост молочнокислых микроорганизмов, что позволит достичь достаточно высокой концентрации клеток и кислотности среды, которая в дальнейшем будет необходима для автолиза. Культивирование проводят в течение 7-16 ч, время зависит от аэрации среды: при аэрации дрожжи растут быстрее и требуется меньшее время культивирования для достижения стационарной фазы (7-12 часов), проведение процесса возможно и в отсутствие аэрации, в этом случае потребуется 10-16 часов. При культивировании менее 7 часов количество клеток дрожжей не достигнет максимума на уровне (10⁵-10⁶) КОЕ/см³ (стационарной фазы), и количество молочнокислых микроорганизмов не достигнет необходимого уровня (10⁸-10⁹) КОЕ/см³. Культивирование более 16 часов не целесообразно с точки зрения затрат.

В предлагаемом способе могут использоваться любые лактозосбраживающие дрожжи и термофильные молочнокислые бактерии, применяющиеся в пищевой промышленности и способные продуцировать фермент бета-галактозидазу, например, применяющиеся в молочной промышленности для производства ферментированных напитков (кефир, айран, кумыс и др.) дрожжи Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces lactis, Saccharomyces kefyr, Candida kefyr, Kluyveromyces lactis, и молочнокислые термофильные микроорганизмы Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helviticus, Streptococcus thermophilus и другие.

После культивирования проводится извлечение ферментов из клеток дрожжей и молочнокислых микроорганизмов. Процесс извлечения ферментов из биомассы проводится путем автолиза клеток при температуре (50±5)°C в течение 6-12 часов. Процесс автолиза клеток микроорганизмов при указанных температурах протекает эффективно благодаря кислой среде, которая образовалась в результате молочнокислого брожения. При температуре ниже 45°C скорость автолиза резко снижается, при температурах выше 55°C может происходить снижение активности ферментов. Время автолиза менее 6 часов недостаточно для разрушения оболочки клеток микроорганизмов, особенно молочнокислых, что необходимо для извлечения ферментов. Увеличение времени автолиза более 12 часов не приведет к увеличению концентрации ферментов и не целесообразно из-за дополнительных затрат.

Очистка суспензии от остатков клеток микроорганизмов и белков лактозосодержащего сырья осуществляется при помощи ультрафильтрации. Концентрирование очищенного раствора ферментов может быть осуществлено методами низкотемпературного сгущения или сушки, позволяющими сохранить свойства ферментов. Процессы ультрафильтрации и концентрирования используются в известных способах получения ферментов и не являются отличительным признаком изобретения.

Процесс может быть проведен на существующем и широко использующемся в молочной промышленности и биотехнологии оборудовании, при этом используются заквасочные микроорганизмы, что уменьшает затраты на очистку продукта от токсичных продуктов метаболизма, а следовательно и себестоимость продукта.

В результате вышеописанных операций получается недорогой комбинированный ферментный препарат бета-галактозидаз, имеющий расширенный диапазон действия (pH от 5 до 7,5 и температура от 30 до 55°C) за счет наличия бета-галактозидаз двух типов - дрожжей и молочнокислых микроорганизмов.

Полученный препарат может быть использован для гидролиза лактозы в молочном сырье, в частности, для получения низколактозных молочных продуктов и глюкозо-галактозных сиропов пищевого назначения из вторичного молочного сырья.

Возможность реализации предлагаемого способа подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Молочную творожную сыворотку, очищенную от жира и казеиновой пыли, с массовой долей лактозы 3% принимают по массе и качеству, после чего проводится температурная обработка при 72°C, продолжительностью 20 секунд. Далее сыворотка охлаждается до 28°C, и в нее вносится суспензия лактозосбраживающих дрожжей Candida kefyr и закваска термофильного стрептококка Streptococcus thermophilus. Культивирование проводится при температуре 28°C, в течение 7 ч с аэрацией среды. После этого проводят извлечение ферментов из клеток микроорганизмов при температуре 45°C в течение 6 часов. По окончании автолиза смесь подвергают очистке от остатков клеток микроорганизмов и белков лактозосодержащего сырья на ультрафильтрационной установке, после чего отправляют на вакуум-сгущение, которое проводится при температуре 55°C. Получают комбинированный ферментный препарат бета-галактозидаз в сгущенном виде, имеющий диапазон действия в области pH от 5 до 7,5 и температур от 30 до 55°C.

Пример 2. Сухую молочную подсырную сыворотку, очищенную от жира и казеиновой пыли, растворяют в горячей воде исходя из достижения массовой доли лактозы в растворе 15%. Далее сыворотка охлаждается до 32°C, и в нее вносится суспензия лактозосбраживающих дрожжей Kluyveromyces marxianus и закваска болгарской палочки Lactobacillus bulgaricus. Культивирование проводится при температуре 32°C, в течение 16 ч без аэрации среды. После этого проводят извлечение ферментов из клеток микроорганизмов при температуре 55°C в течение 12 часов. По окончании автолиза смесь подвергают очистке от остатков клеток микроорганизмов и белков лактозосодержащего сырья на ультрафильтрационной установке, после чего отправляют на сублимационную сушку. Получают комбинированный ферментный препарат бета-галактозидаз в сухом виде, имеющий диапазон действия в области pH от 5 до 7,5 и температур от 30 до 55°C.