Результат интеллектуальной деятельности: ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОРИН-ЗАВИСИМЫХ МЕХАНИЗМОВ УСТОЙЧИВОСТИ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS AERUGINOSA К БЕТА-ЛАКТАМНЫМ АНТИБИОТИКАМ

Изобретение относится к медицине, а именно иммунологическим препаратам, для исследования антибиотикорезистентности бактерий. Изобретение может быть использовано в диагностических целях в клинической микробиологии.

Искусственные питательные среды являются субстанциями, которые предназначаются для решения важных микробиологических задач. В зависимости от назначения питательные среды подразделяются на несколько типов: 1) основные, 2) элективные, 3) консервирующие и транспортные, 3) дифференциально-диагностические [Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской микробиологии. - Санкт-Петербург: НИЦФ. 2002; 80 с.]. Основные питательные среды предназначены для воспроизведения роста и размножения микроорганизмов и накопления их биомассы в микробиологии и биотехнологических процессах. Консервирующие и транспортные питательные среды предназначены для длительного сохранения жизнеспособности микроорганизмов, находящихся в этих средах. Дифференциально-диагностические среды предназначены для определения таксономической принадлежности микроорганизмов и изучения свойств микроорганизмов [Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской микробиологии. - Санкт-Петербург: НИЦФ. 2002; 80 с.]. Свойства микроорганизмов, изучаемые при помощи дифференциально-диагностических сред, определяются на основе возможности микроорганизма воздействовать на тот или иной субстрат (сахар, аминокислоту, спирт, белок и др.), трансформируя (ферментация, окисление) или ассимилируя его.

Одним из самых распространенных и опасных бактериальных возбудителей в современной медицине является синегнойная палочка Pseudomonas aeruginosa [Руднов В. А., Бельский Д.В., Дехнич А.В. Инфекции в ОРИТ России: результаты национального многоцентрового исследования // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2011. - Т. 13. - №. 4. - С. 294-304; Rice L. В. Federal funding for the study of antimicrobial resistance in nosocomial pathogens: no ESKAPE. Journal of Infectious Diseases. - 2008. - Vol. 197. - №8. - Р. 1079-1081]. Лечение тяжелой синегнойной инфекции является неэффективным, если антибиотики назначаются без предварительного исследования устойчивости (резистентности) к антибиотикам у изолированного из патологического локуса штамма Pseudomonas aeruginosa [Лазарева А.В., Чеботарь И.В., Крыжановская О.А., Чеботарь В.И., Маянский НА. Pseudomonas aeruginosa: патогенность, патогенез и патология. - Клин микробиол антимикроб химиотер. - 2015. - Т. 17. №3. - С. 170-186]. Полное исследование антибиотикорезистентности должно включать в себя не только выявление факта резистентности, но и определение механизмов ее формирования [EUCAST Expert rules in antimicrobial susceptibility testing. Данные с сайта «The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST); режим доступа:http:www.eucast.org»]. Самые важные механизмы резистентности бактерий к антибиотикам, в том числе и Pseudomonas aeruginosa, возникают за счет: 1) фермент-зависимого разрушения антибиотика, 2) нарушения транспорта антибиотика внутрь клетки через мембранные порины или порин-зависимой резистентности, 3) активации выведения (эффлюкс) препарата из клетки во внешнюю среду [Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии / под ред. Л.С. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова. - Смоленск: НИИАХ СГМА, 2002. - 586 с.]. Особенно значимым является определение уровня и механизмов резистентности Pseudomonas aeruginosa к β-лактамным антибиотикам [Livermore D.М. Role of beta-lactamase and impermeability in the resistance of Pseudomonas aeruginosa // Antibiotics and chemotherapy. - 1989. - T. 42. - C. 257-263].

Для оценки антибиотикорезистентности бактерий Pseudomonas aeruginosa in vitro применяются различные варианты питательных сред:

1. К наиболее известной группе относятся обычные питательные среды, на которых подавление роста бактерий осуществляется под воздействием антибиотика, который диффундирует в питательные среду из внешнего объекта. Самым известным и распространенным является способ определения антибиотикорезистентности, основанный на диффузии антибиотика в плотную питательную среду из предварительно обработанных антибиотиком дисков. При помощи таких сред реализуется диско-диффузионный способ оценки антибиотикорезистентности [Клинические рекомендации «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам». Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации. Москва, Ноябрь 2014]. Способ заключается в том, что на поверхность плотной питательной среды (например, агар Мюллера-Хинтона) в чашке Петри наносят бактериальную суспензию тестируемого микроорганизма определенной плотности, затем на поверхность этой питательной среды помещают диски, содержащие антибиотик. Диффузия антибиотика в плотную питательную среду приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. Результат учитывается по величине диаметра зоны подавления роста вокруг диска, измеренной в миллиметрах. Результат интерпретируется согласно принятым нормативным документам [Клинические рекомендации «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам». Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации. Москва, Ноябрь 2014; EUCAST Clinical breakpoints - bacteria. Данные с сайта «The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)»; режим доступа: http://www.eucast.org]. Указанные питательные среды позволяют количественно оценить резистентность изучаемой бактерии к какому-либо антибиотику, но имеют существенный недостаток, который заключается в том, что их использование не позволяет вскрыть ни один из механизмов антибиотикорезистентности конкретной бактерии.

2. Другим известным примером сред для определения антибиотикорезистентности, являются среды, в состав которых добавлен антибиотик. При помощи таких сред осуществляется способ последовательных (серийных) разведений [ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010. Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro. Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам. Часть 1. Референтный метод лабораторного исследования активности антимикробных агентов против быстрорастущих аэробных бактерий, вызывающих инфекционные болезни]. Способ основан на определении минимальной концентрации (МПК) антибиотика, подавляющего размножение бактерий изучаемого штамма путем тестирования двукратных разведений антибиотика в питательной среде в диапазоне концентраций от 512 до 0,125 мкг/мл. Способ последовательных (серийных) разведений выполняется в двух вариантах - на плотных питательных средах (агарах) и на жидких питательных средах (бульонах). Результаты учитываются на основе визуальной либо аппаратной оценки микробного роста и интерпретируется согласно принятым нормативным документам [ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010. Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro. Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам. Часть 1. Референтный метод лабораторного исследования активности антимикробных агентов против быстрорастущих аэробных бактерий, вызывающих инфекционные болезни; Клинические рекомендации «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам». Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации. Москва, Ноябрь 2014; EUCAST Clinical breakpoints - bacteria. Данные с сайта «The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)»; режим доступа: http://www.eucast.org]. Указанные питательные среды позволяют количественно оценить резистентность изучаемой бактерии к какому-либо антибиотику, но имеют существенный недостаток, который заключается в том, что их использование не позволяет вскрыть ни один из механизмов антибиотикорезистентности конкретной бактерии.

3. Известно использование сред с антибиотиком серии Uro-Quick, производимых компанией Alifax и предложенных к использованию для быстрого определения анти-биотикорезистентности [Pezzati Е., Marengo S., Roveta S., Cassanelli С., Maioli E., Cavallini F., Cagnacci S., Gualco L., Marchese A., Debbia E. A. Evaluation of the Uro-Quick system for antibiotic susceptibility tests of strains collected from intensive care units // Annals of microbiology. - 2006. - T. 56. - №. 2. - C. 179-183]. Каждая среда состоит из помещенного в стеклянный флакон бульона Мюллера-Хинтона (2 мл) и добавленного в него антибиотика. В качестве антибиотиков используются ампициллин, амоксициллин, пиперациллин-тазобактам, цефотаксим, цефтриаксон, цефуроксим, цефтазидим, имипенем, азтреонам, гентамицин, амикацин, ципрафлоксацин и др. Исследуемая бактериальная культура инокулируется во флакон со средой, и при помощи лазерного углового светорассеяния учитывается размножение бактерий во флаконах с разными антибиотиками. Задержка роста говорит о чувствительности бактерий к исследуемому антибиотику, отсутствие задержки роста говорят о резистентности бактерий к конкретному антибиотику, находящемуся во флаконе со средой. Питательные среды серии Uro-Quick позволяют количественно оценить резистентность изучаемой бактерии к какому-либо антибиотику, но имеют существенный недостаток, который заключается в том, что их использование не позволяет вскрыть ни один из механизмов антибиотикорезистентности конкретной бактерии.

4. Известна питательная среда, в которую вносят антибиотик совместно со специальными добавками, нейтрализующими действие факторов, за счет которых формируется тот или иной вид резистентности. Таким образом, получают данные, которые позволяют оценить резистентность микробов к конкретному антибиотику и дают возможность определить некоторые механизмы резистентности. В частности, известно применение питательной среды со специальными добавками для изучения антибиотикорезистентности, включающее определение роли эффлюкс-механизмов и участия металло-β-лактамаз в формировании антибиотикорезистентности, при котором проводится одновременное определение МПК антибиотика способом последовательных разведений (см. выше) и определение снижения МПК под воздействием ингибитора эффлюкса либо под воздействием ингибитора металло-β-лактамаз [Zhao, W. Н., Hu, Z., Chen, G., Ito, R., & Hu, Z. Q. Contributions of IMP-10 metalloo-β-lactamase, the outer membrane barrier and the MexAB-OprM efflux system to high-level carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa // Chemotherapy. - 2009. - T. 55. - №. 3. - C. 168-174]. В качестве ингибитора эффлюкса используют карбонил-цианид-3-хлорфенилгидразон, который добавляется в питательную среду до конечной концентрации 0,25-0,5 мМ. В качестве ингибиторов металло-β-лактамаз используют этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), который добавляется в питательную среду до конечной концентрации 0,25-1,0 мМ, либо натрия меркаптоацетат, который добавляется в питательную среду до конечной концентрации 0,25-1,0 мМ. На жидкую питательную среду (бульон Мюллера-Хинтона), содержащую антибиотик в двукратных последовательных разведениях (см. выше) и один из перечисленных ингибиторов либо их сочетания, производят посев изучаемой бактерии (Pseudomonas aeruginosa), инкубируют 24 часа при температуре 35°C. В контроле используют аналогичные бульоны без антибиотика либо без перечисленных ингибиторов. Затем визуально оценивают рост бактерий, одновременно определяя МПК антибиотика в отсутствие ингибиторов и уровень снижения МПК под воздействием каждого ингибитора. Штаммы, для которых карбонил-цианид-β-хлорфенилгидразон вызывает снижение МПК антибиотика, расцениваются как штаммы с формированием антибиотикорезистентности с участием эффлюкс-механизмов. Штаммы, для которых ЭДТА или натрия меркаптоацетат вызывает снижение МПК β-лактамных антибиотиков, расцениваются как штаммы с формированием антибиотикорезистентности к β-лактамным антибиотикам с участием металло-β-лактамаз. Указанный тип питательных сред позволяет количественно оценить резистентность изучаемой бактерии к какому-либо антибиотику и определить вклад металло-β-лактамаз и эффлюкс-механизмов в формирование резистентности, но имеют существенный недостаток, который заключается в том, что использование сред в указанном способе не позволяет оценить роль другого важного механизма антибиотикорезистентности, а именно - порин-зависимой резистентности.

Таким образом, недостатком всех типов известных питательных сред, применяемых для изучения микробной резистентности, является то, что ни одна из них не может быть использована для определения механизма резистентности, возникающего за счет нарушения транспорта антибиотика внутрь клетки через мембранные порины - порин-зависимой резистентности.

Задачей предлагаемого изобретения является создание новой эффективной дифференциально-диагностической питательной среды для выявления важного типа резистентности к β-лактамным антибиотикам у Pseudomonas aeruginosa, возникающего за счет нарушения транспорта β-лактамных антибиотиков внутрь клетки через мембранные порины.

Технический результат изобретения заключается:

- в достижении эффекта роста/размножения на предлагаемой питательной среде чувствительных к β-лактамамным антибиотикам штаммов Pseudomonas aeruginosa, у которых сохраняется способность проникновения β-лактамных антибиотиков внутрь клетки через мембранные порины;

- в отсутствии роста/размножения на предлагаемой питательной среде резистентных (устойчивых) к β-лактамамным антибиотикам штаммов, у которых способность проникновения β-лактамных антибиотиков внутрь клетки нарушена.

Задача решается путем использования следующего состава дифференциально-диагностической питательной среды:

- жидкая питательная среда, включающая в свой состав: 1) от 0,25% до 4,0% аланина, 2) 0,9% натрия хлорида, 3) дистиллированной воды до 100%.

Эффективность от использования предлагаемой дифференциально-диагностической питательной среды подтверждена следующим примером.

Пример 1

Для определения порин-зависимой резистентности штаммов Pseudomonas aeruginosa к β-лактамным антибиотикам были использованы 6 вариантов жидкой питательной среды:

1. Жидкая питательная среда с 0,2% аланина, включающая в свой состав: 1) 0,2% аланина, 2) 0,9% натрия хлорида, 3) дистиллированной воды до 100%.

2. Жидкая питательная среда с 0,25% аланина, включающая в свой состав: 1) 0,25% аланина, 2) 0,9% натрия хлорида, 3) дистиллированной воды до 100%.

3. Жидкая питательная среда с 1,0% аланина, включающая в свой состав: 1) 1,0% аланина, 2) 0,9% натрия хлорида, 3) дистиллированной воды до 100%.

4. Жидкая питательная среда с 2,0% аланина, включающая в свой состав: 1) 2,0% аланина, 2) 0,9% натрия хлорида, 3) дистиллированной воды до 100%.

5. Жидкая питательная среда с 4,0% аланина, включающая в свой состав: 1) 4,0% аланина, 2) 0,9% натрия хлорида, 3) дистиллированной воды до 100%.

6. Жидкая питательная среда с 4,5% аланина, включающая в свой состав: 1) 4,5% аланина, 2) 0,9% натрия хлорида, 3) дистиллированной воды до 100%.

В качестве бактерий, для которых должна быть определена порин-зависимая резистентность к антибиотикам, при помощи предлагаемого способа были использованы музейные (референсные) штаммы Pseudomonas aeruginosa двух типов: 1) штаммы с нормальной, ненарушенной мембранной проницаемостью для β-лактамных антибиотиков - чувствительные к β-лактамам штаммы Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Pseudomonas aeruginosa 48-1558, Pseudomonas aeruginosa 48-1330; 2) мутантные штаммы с нарушенной мембранной проницаемостью для β-лактамных антибиотиков - резистентные (устойчивые) β-лактамам штаммы Pseudomonas aeruginosa 46-3109, Pseudomonas aeruginosa 46-306, Pseudomonas aeruginosa 58-348. В экспериментах были использованы суточные культуры указанных штаммов, культивированные на триптиказо-соевом агаре при 37°С; из бактерий были получены взвеси в 0,9%-ном растворе натрия хлорида и стандартизованы по концентрации до 0,5 ед. по МакФарланду общепринятым методом денситометрии. 0,05 мл полученной взвеси было инокулировано в 0,25 мл предлагаемой жидкой дифференциально-диагностической среды для определения порин-зависимых механизмов устойчивости к β-лактамным антибиотикам. Эксперименты выполнялись в 96-луночных плоскодонных планшетах Costar производства Corning-Costar. В качестве положительного контроля вместо предлагаемой жидкой дифференциально-диагностической среды для определения порин-зависимых механизмов устойчивости к β-лактамным антибиотикам использовали бульон Мюллера-Хинтона. В качестве отрицательного контроля использовали 0,9%-ный раствор натрия хлорида в дистиллированной воде. Каждая проба выполнялась в трех повторениях, результаты по каждой пробе усреднялись. Пробы инкубировались 300 мин при 37°С. После инкубации спектрофотометрически (светопоглощение при длине волны 600 нм) учитывалась интенсивность роста и размножения бактерий на спектрофлуориметре Infinite F200 (Tecan). Учет и интерпретация результатов были основаны на известном факте положительной корреляции между количеством бактерий в среде и уровнем светопоглощения этой среды. Полученные результаты отражены в Таблице 1. Результаты показывают, что на предлагаемой питательной среде наблюдается рост чувствительных к β-лактамным антибиотикам штаммов Pseudomonas aeruginosa с нормальной мембранной проницаемостью в случаях, когда среда содержит от 0,25% до 4,5% аланина. На предлагаемой питательной среде отсутствует рост резистентных штаммов Pseudomonas aeruginosa с нарушенной для β-лактамных антибиотиков проницаемостью в случаях, когда среда содержит от 0,2% до 4% аланина (или от 2,5 до 40 г аланина на 1 кг среды), при концентрации аланина в среде 4,5% резистентные к β-лактамам штаммы Pseudomonas aeruginosa с нарушенной для β-лактамных антибиотиков проницаемостью начинают демонстрировать размножение. На бульоне Мюллера-Хинтона (положительный контроль) наблюдался рост всех штаммов Pseudomonas aeruginosa, в 0,9%-ном растворе натрия хлорида в дистиллированной воде (отрицательный контроль) не размножался ни один из исследованных штаммов.

Таким образом, при использовании жидкой дифференциально-диагностической среды для определения порин-зависимых механизмов устойчивости к β-лактамным антибиотикам при содержании аланина от 0,2% до 4% достигнут эффект, который заключается в том, что в этой среде наблюдается рост/размножение чувствительных к β-лактамным антибиотикам штаммов Pseudomonas aeruginosa, у которых сохраняется способность проникновения β-лактамных антибиотиков внутрь клетки через мембранные порины, и отсутствует рост/размножение резистентных (устойчивых) к β-лактамным антибиотикам штаммов Pseudomonas aeruginosa, у которых способность проникновения β-лактамных антибиотиков внутрь клетки нарушена. Таким образом, при помощи предлагаемой жидкой дифференциально-диагностической среды может быть определено наличие порин-зависимых механизмов устойчивости к β-лактамным антибиотикам у бактерий вида Pseudomonas aeruginosa.

Изготовление предлагаемой среды технически достижимо как при единичном изготовлении, так и при массовом производстве.

Среда может быть стерилизована общепринятыми методами, например, фильтрацией, имеет достаточный срок хранения без потери полезных свойств и не требует особых условий утилизации после использования.