Результат интеллектуальной деятельности: КРЕМНИЙБОРСОДЕРЖАЩИЙ ГЛИЦЕРОГИДРОГЕЛЬ, ОБЛАДАЮЩИЙ РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕЙ, РЕГЕНЕРИРУЮЩЕЙ И АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к фармацевтической химии и медицине, а именно к новому биологически активному химическому веществу - кремнийборсодержащему глицерогидрогелю, который может найти применение в качестве лекарственного средства для местного применения, обладающего ранозаживляющей, регенерирующей и антимикробной активностью.

Известны глицераты (глицеролаты) кремния, обладающие транскутанной проводимостью медикаментозных добавок, состав которых в избытке глицерина отвечает формуле Si(С₃Н₇О₃)₄·xC₃H₈O₃, где 3≤x≤10, и глицерогидрогели на их основе, полученные путем добавления к ним водного раствора электролита при температуре 80°С и перемешивании (Пат. RU 2255939, C07F 7/04, A61K 47/30, 2005).

Глицеролаты кремния, а также глицерогидрогели на их основе, являясь физиологически активными веществами, нетоксичны, обладают не только транскутанной, но и ранозаживляющей и регенерирующей активностью (Хонина Т.Г., Шадрина Е.В., Бойко А.А. и др. Синтез гидрогелей на основе полиолатов кремния // Изв. АН. Сер. хим. 2010, №1, 76-81). Они рекомендованы, в основном, для использования в качестве основ местных фармацевтических композиций широкого спектра действия, обладающих высокой пенетрирующей активностью в ткани, что приводит к снижению дозы лекарственных добавок при сохранении эффективности их действия (Пат. RU 2326667, A61K 31/496, A61P 31/04, 2008).

Однако известные вещества не обладают явно выраженной антибактериальной активностью и не оказывают противогрибкового (фунгистатического) действия.

Известен комплексный бисглицеролат бора НВ(C₃H₆O₃)₂, проявляющий кислотные свойства, полученный при растворении (взаимодействии) борной кислоты в глицерине (C. Chiappe, F. Signori, G. Valentini et al. Novel (Glycerol)borate-Based Ionic Liquids: an Experimental and Theoretical Study // J. Phys. Chem. B. 2010, №114, 5082-5088). 10%-й раствор борной кислоты в глицерине (глицероборная кислота) проявляет более выраженные кислотные свойства, чем борная кислота, и обладает антисептическим действием. Средство используют в медицинской практике для смазывания пораженных участков кожи при опрелостях, а также при кольпитах (Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая Волна, 2012, с. 942).

К недостаткам известного средства можно отнести вероятность токсического действия при его передозировке или длительном употреблении, особенно при нарушениях функции почек. Кроме того, средство обладает узким спектром применения и не проявляет регенерирующего эффекта.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является кремнийцинксодержащий глицерогидрогель, обладающий ранозаживляющей, регенерирующей и антибактериальной активностью, состав которого отвечает формуле kSi(С₃Н₇О₃)₄·ZnC₃H₆O₃·xC₃H₈O₃·yH₂O, где 1≤k≤4, 7≤x≤26, 20≤y≤100, полученный взаимодействием тетраглицеролата кремния в избытке глицерина Si(С₃Н₇О₃)₄·xC₃H₈O₃, где 0,5≤x≤10, моноглицеролата цинка в избытке глицерина ZnC₃H₆O₃·6C₃H₈O₃ и воды в мольном соотношении Si(C₃H₇O₃)₄:ZnC₃H₃O₃:С₃Н₈О₃:H₂O, равном (1÷4):1:(7÷26):(20÷100), при температуре 20-40°С и перемешивании (Пат. RU 2520969, C07F 71/18, C07F 3/06, A61K 31/695, 2014). Кремнийцинксодержащий глицерогидрогель обладает выраженной ранозаживляющей, регенерирующей активностью, оказывает умеренное антибактериальное действие, охватывая аэробные бактериальные формы ряда грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Гель нетоксичен, прост в получении, является удобной формой для местного применения и рекомендован для использования в медицинской практике.

Однако известный глицерогидрогель не обладает достаточно широким спектром антимикробной активности.

Таким образом, перед авторами стояла задача - расширение арсенала лекарственных средств - получение нового биологически активного химического вещества в форме геля, сочетающего на молекулярном уровне атомы Si и В.

Технический результат, который будет достигнут от использования заявляемого изобретения, заключается в том, что полученный кремнийборсодержащий глицерогидрогель проявляет антимикробное, ранозаживляющее и регенерирующее действие, улучшает морфофункциональное состояние кожи, является удобной формой для местного применения, а также является нетоксичным, простым в получении и хорошо воспроизводим в способе получения при использовании доступного сырья, а также стабильным при хранении и удобным для практического применения.

Технический результат достигается путем получения кремнийборсодержащего глицерогидрогеля, обладающего ранозаживляющей, регенерирующей и антимикробной активностью, состав которого отвечает формуле kSi(C₃H₇O₃)₄·НВ(С₃Н₃О₃)₂·xC₃H₈O₃·yH₂O, где 0,5≤k≤2, 2,5≤x≤12, 20≤y≤100, полученного взаимодействием тетраглицеролата кремния в избытке глицерина Si(С₃Н₇О₃)₄·xC₃H₈O₃, где 2,5≤x≤14, бисглицеролата бора НВ(С₃Н₆О₃)₂ и воды в мольном соотношении Si(C₃H₇O₃)₄:НВ(C₃H₆O₃)₂:C₃H₈O₃:H₂O, равном (0,5÷2):1:(2,5÷12):(20÷100), при температуре 80°С и перемешивании.

Сущность изобретения заключается в получении нового биологически активного химического вещества в форме геля, сочетающего в своем составе на молекулярном уровне атомы Si и В и обладающего ранозаживляющей, регенерирующей и антимикробной активностью.

Кремний и бор являются микроэлементами, необходимыми для нормального функционирования организма человека.

Кремний присутствует практически во всех органах и тканях организма, особенно богата кремнием соединительная ткань, он является структурным компонентом в составе мукополисахаридов и их белковых комплексов, образующих остов соединительной ткани и определяющих ее механическую прочность, эластичность и упругость. Кремний обеспечивает рост и упрочнение соединительной ткани как в период эмбрионального развития, так и при заживлении ран; способствует биосинтезу коллагена и образованию костной ткани; играет существенную роль в метаболических и ферментативных процессах (М.Г. Воронков, Г.И. Зельчан, Э.Я. Лукевиц. Кремний и жизнь. Биохимия, фармакология и токсикология соединений кремния. Рига: Зинатне, 1978, 586 с.).

Бор, как и кремний, участвует в ферментативных процессах; кроме того, регулирует активность паратиреоидного гормона (гормона паращитовидных желез), влияет на функции щитовидной и половых желез, способствует переходу витамина D в активную форму, влияет на всасывание и обмен макроэлементов, в частности кальция и фосфора, участвует в регуляции активности центральной нервной системы (А.П. Авцын, А.А. Жаворонков, М.А. Риш, Л.С. Строчкова. Микроэлементозы человека. М.: Медицина, 1991, 496 с.).

Таким образом, создание лекарственных препаратов на основе соединений кремния и бора имеет под собой совершенно определенную как биохимическую, так и фармакологическую основу.

Формула состава заявляемого глицерогидрогеля - kSi(C₃H₇O₃)₄·НВ(С₃Н₆О₃)₂·xC₃H₈O₃·yH₂O, где 0,5≤k≤2, 2,5≤x≤12, 20≤y≤100 с использованием символа " · " является условной, отражающей только мольное соотношение исходных компонентов, участвующих в процессе образования геля. Образование кремнийборсодержащего глицерогидрогеля соответствует золь-гель процессу, включающему химические реакции гидролиза глицеролатов кремния и бора (прекурсоров) и последующей (со)конденсации образующихся продуктов. Полученный глицерогидрогель представляет собой физически и химически сложную многокомпонентную систему, состоящую из: а) пространственного полимерного каркаса - твердой фазы, образующейся в результате гидролитической (со)конденсации прекурсоров и лишающей систему текучести, и б) жидкой водно-глицериновой среды, содержащей не вошедшие в трехмерную фазу прекурсоры и/или низкомолекулярные продукты их гидролитической конденсации в биологически активной и биологически доступной форме.

Сочетание на молекулярном уровне двух микроэлементов, кремния и бора, обеспечивает синергитический эффект в плане фармакологической активности. При этом, являясь комплексообразователем-стабилизатором, глицерин, находясь в равновесной смеси, препятствует процессам полного гидролиза прекурсоров, в частности наиболее реакционноспособных глицеролатов кремния - до кремниевой кислоты, и, таким образом, оказывает стабилизирующее влияние на структуру (и свойства) образующегося полимерного кремнийборсодержащего глицерогидрогеля.

Гель характеризуется не только отсутствием текучести, но и остаточной деформации, то есть гель деформируется обратимо. Сплошность геля может быть нарушена, но каждый отдельный фрагмент сохраняет его свойства. При диспергировании гель легко переходит в мазеподобное состояние, хорошо распределяется на коже и слизистой оболочке.

Авторами были проведены экспериментальные исследования по оптимизации мольного соотношения тетраглицеролата кремния, бисглицеролата бора, глицерина и воды для получения в оптимальных условиях глицерогидрогеля, обладающего необходимыми фармакотехнологическими характеристиками. Так, мольное содержание глицеролатов кремния и бора должно соответствовать их оптимальному соотношению, позволяющему получать фармакологически активный гель, устойчивый к синерезису и обладающий приемлемой консистенцией для практического использования. При содержании тетраглицеролата кремния (относительно 1-мольного содержания бис(глицеролата) бора) менее предлагаемого (k<0,5) образование глицерогидрогеля не происходит; более предлагаемого (k>2) - полученный глицерогидрогель не обладает явно выраженной антимикробной активностью. При содержании глицерина и воды более предлагаемого (x>12 и y>100) глицерогидрогель подвергается синерезису, кроме того, избыток глицерина придает гелю «жирную» консистенцию и может оказать отрицательное воздействие на кожу; при содержании глицерина и воды менее предлагаемого (x<2,5 и y<20) образуется твердый, хрупкий, растрескивающийся при хранении и малоудобный в применении гель.

Из анализа научно-технической и патентной литературы в настоящее время биологически активный кремнийборсодержащий глицерогидрогель, обладающий ранозаживляющей, регенерирующей и антимикробной активностью, не обнаружен, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Кроме того, это вещество отвечает критерию «промышленная применимость», т.к. оно нетоксично, просто в получении и хорошо воспроизводимо в способе получения при использовании доступного сырья, стабильно при хранении и удобно для практического применения.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Кремнийборсодержащий глицерогидрогель, состав которого отвечает формуле kSi(C₃H₇O₃)₄·НВ(С₃Н₆О₃)₂·xC₃H₈O₃·yH₂O, где 0,5≤k≤2, 2,5≤x≤12, 20≤y≤100, получают следующим образом. Тетраглицеролат кремния в избытке глицерина Si(C₃H₇O₃)₄·xC₃H₈O₃, где 2,5≤x≤14, в виде прозрачного вязкого раствора и бисглицеролат бора НВ(C₃H₆O₃)₂ в виде прозрачной вязкой жидкости смешивают при комнатной температуре до гомогенизации с последующим добавлением воды в мольном соотношении Si(C₃H₇O₃)₄:НВ(C₃H₆O₃)₂:C₃H₈O₃:H₂O, равном (0,5÷2):1:(2,5÷12):(20÷100). Полученный раствор нагревают до 80°С и перемешивают до потери в системе текучести, сопровождающейся образованием однородного прозрачного геля. Продукт охарактеризован данными элементного анализа, рефрактометрии, ИК спектроскопии.

Следующие примеры характеризуют способ получения и состав кремнийборсодержащего глицерогидрогеля, определение его токсического действия, а также исследование ранозаживляющей, регенерирующей активности (на экспериментальных животных in vivo) и антимикробных свойств (in vitro).

Пример 1. Синтез кремнийборсодержащего глицерогидрогеля Si(C₃H₇O₃)₄·НВ(C₃H₆O₃)₂·2,5C₃H₈O₃·20Н₂О.

52,99 г (0,085 моль) тетраглицеролата кремния в избытке глицерина Si(C₃H₇O₃)₄·2,5C₃H₈O₃, 16,34 г (0,085 моль) бислицеролата бора НВ(C₃H₆O₃)₂ и 30,67 г (1,700 моль) воды (мольное соотношение компонентов Si(C₃H₇O₃)₄:НВ(C₃H₆O₃)₂:C₃H₈O₃:H₂O = 1:1:2,5:20) смешивают при комнатной температуре до полной гомогенизации. Полученный раствор нагревают до 80°С и перемешивают до образования прозрачного бесцветного геля в количестве 100 г (n_D ²⁰=1,4354).

Состав полученного продукта отвечает формуле Si(C₃H₇O₃)₄·НВ(C₃H₆O₃)₂·2,5C₃H₈O₃·20Н₂О.

Найдено (%): С 26,03; Н 8,75; Si 2,41; В 0,90. C_25,5H₁₀₁O_45,5SiB.

Вычислено (%): С 26,07; Н 8,67; Si 2,39; В 0,92.

ИК-спектр, ν/см^-1: 3275 (ОН); 2939, 2882 (C-H); 1644 (Н-О-Н); 1410, 1330, 1290 (С-Н, В-О); 1204 (Si-O-B); 1105 (C-О в C-О-Н втор.); 1033, 991 (С-O в С-О-Н нерв., Si-O-C).

Пример 2. Синтез кремнийборсодержащего глицерогидрогеля Si(C₃H₇O₃)₄·НВ(C₃H₆O₃)₂·2,5C₃H₈O₃·100Н₂О.

23,80 г (0,038 моль) тетраглицеролата кремния в избытке глицерина Si(C₃H₇O₃)₄·2,5C₃H₈O₃, 7,34 г (0,038 моль) бисглицеролата бора НВ(C₃H₆O₃)₂ и 68,86 г (3,800 моль) воды (мольное соотношение компонентов Si(C₃H₇O₃)4:НВ(C₃H₆O₃)₂:C₃H₈O₃:H₂O = 1:1:2,5:100) смешивают при комнатной температуре до полной гомогенизации. Полученный раствор нагревают до 80°С и перемешивают до образования прозрачного бесцветного геля в количестве 100 г (n_D ²⁰=1,3774).

Состав полученного продукта отвечает формуле Si(C₃H₇O₃)₄·НВ(C₃H₆O₃)₂·2,5C₃H₈O₃·100Н₂О.

Найдено (%): С 11,68; Н 10,12; Si 1,08; В 0,39. C_25,5H₂₆₁O_125,5SiB.

Вычислено (%): С 11,71; Н 10,06; Si 1,07; В 0,41.

ИК-спектр, ν/см^-1: 3271 (ОН); 2938, 2880 (С-Н); 1643 (Н-О-Н); 1410, 1332, 1290 (С-Н, В-О); 1205 (Si-O-B); 1103 (C-О в С-О-Н втор.); 1030, 992 (С-O в С-О-Н перв., Si-O-C).

Пример 3. Синтез кремнийборсодержащего глицерогидрогеля Si(C₃H₇O₃)₄·НВ(C₃H₆O₃)₂·12C₃H₈O₃·20Н₂О.

73,05 г (0,049 моль) тетраглицеролата кремния в избытке глицерина Si(C₃H₇O₃)₄·12C₃H₈O₃, 9,37 г (0,049 моль) бисглицеролата бора НВ(C₃H₆O₃)₂ и 17,58 г (0,980 моль) воды (мольное соотношение компонентов Si(C₃H₇O₃)₄:НВ(C₃H₆O₃)₂:C₃H₈O₃:H₂O = 1:1:12:20) смешивают при комнатной температуре до полной гомогенизации. Полученный раствор нагревают до 80°С и перемешивают до образования прозрачного бесцветного геля в количестве 100 г (n_D ²⁰=1,4514).

Состав полученного продукта отвечает формуле Si(C₃H₇O₃)₄·НВ(C₃H₆O₃)₂·12C₃H₈O₃·20Н₂О.

Найдено (%): С 31,56; Н 8,81; Si 1,33; В 0,51. C₅₄H₁₇₇O₇₄SiB.

Вычислено (%): С 31,64; Н 8,70; Si 1,37; В 0,53.

ИК-спектр, ν/см^-1: 3280 (ОН); 2936, 2880 (С-Н); 1645 (Н-О-Н); 1412, 1330, 1291 (С-Н, В-О); 1205 (Si-O-B); 1105 (С-O в С-О-Н втор.); 1030, 993 (С-O в С-О-Н перв., Si-O-C).

Пример 4. Синтез кремнийборсодержащего глицерогидрогеля Si(C₃H₇O₃)₄·НВ(C₃H₆O₃)₂·12C₃H₈O₃·100Н₂О.

42,90 г (0,029 моль) тетраглицеролата кремния в избытке глицерина Si(C₃H₇O₃)₄·12C₃H₈O₃, 5,50 г (0,029 моль) бисглицеролата бора НВ(C₃H₆O₃)₂ и 51,60 г (2,900 моль) воды (мольное соотношение компонентов Si(C3H₇O₃)₄:НВ(C₃H₆O₃)₂:C₃H₈O₃:H₂O = 1:1:12:100) смешивают при комнатной температуре до полной гомогенизации. Полученный раствор нагревают до 80°С и перемешивают до образования прозрачного бесцветного геля в количестве 100 г (n_D ²⁰=1,3994).

Состав полученного продукта отвечает формуле Si(C₃H₇O₃)₄·НВ(C₃H₆O₃)₂·12C₃H₈O₃·100Н₂О.

Найдено (%): С 18,52; Н 9,88; Si 0,85; В 0,29. C₅₄H₃₃₇O₁₅₄SiB.

Вычислено (%): С 18,58; Н 9,73; Si 0,81; В 0,31.

ИК-спектр, ν/см^-1: 3270 (ОН); 2935, 2886 (С-Н); 16443 (Н-О-Н); 1411, 1329, 1294 (С-Н, В-О); 1203 (Si-O-B); 1106 (С-O в С-О-Н втор.); 1036, 993 (С-O в С-О-Н перв., Si-O-C).

Пример 5. Синтез кремнийборсодержащего глицерогидрогеля 0,5Si(C₃H₇O₃)₄·НВ(C₃H₆O₃)₂·7C₃H₈O₃·60Н₂О.

39,79 г (0,024 моль) тетраглицеролата кремния в избытке глицерина Si(C₃H₇O₃)₄·14C₃H₈O₃, 9,08 г (0,047 моль) бисглицеролата бора НВ(C₃H₆O₃)₂ и 51,13 г (2,820 моль) воды (мольное соотношение компонентов Si(C₃H₇O₃)₄:НВ(C₃H₆O₃)₂:C₃H₈O₃:H₂O = 0,5:1:7:60) смешивают при комнатной температуре до полной гомогенизации. Полученный раствор нагревают до 80°С и перемешивают до образования прозрачного бесцветного геля в количестве 100 г (n_D ²⁰=1,4004).

Состав полученного продукта отвечает формуле 0,5Si(C₃H₇O₃)₄·НВ(C₃H₆O₃)₂·7C₃H₈O₃·60Н₂О.

Найдено (%): С 18,71; Н 9,75; Si 0,67; В 0,48. C₃₃H₂₀₃O₉₃Si_0,5B.

Вычислено (%): С 18,75; Н 9,68; Si 0,66; В 0,51.

ИК-спектр, ν/см^-1: 3277 (ОН); 2939, 2880 (С-Н); 1644 (Н-О-Н); 1410, 1333, 1294 (С-Н, В-О); 1203 (Si-O-B); 1105 (С-O в С-О-Н втор.); 1030, 990 (С-O в С-О-Н перв., Si-O-C).

Пример 6. Синтез кремнийборсодержащего глицерогидрогеля 2Si(C₃H₇O₃)₄·НВ(C₃H₆O₃)₂·10С₃Н₈О₃·70Н₂О.

54,00 г (0,064 моль) тетраглицеролата кремния в избытке глицерина Si(C₃H₇O₃)₄·5C₃H₈O₃, 6,08 г (0,032 моль) бисглицеролата бора НВ(C₃H₆O₃)₂ и 39,92 г (2,240 моль) воды (мольное соотношение компонентов Si(C₃H₇O₃)₄:НВ(C₃H₆O₃)₂:C₃H₈O₃:H₂O = 2:1:10:70) смешивают при комнатной температуре до полной гомогенизации. Полученный раствор нагревают до 80°С и перемешивают до образования прозрачного бесцветного геля в количестве 100 г (n_D ²⁰=1,4181).

Состав полученного продукта отвечает формуле 2Si(C₃H₇O₃)₄·НВ(C₃H₆O₃)₂·10С₃Н₈О₃·70Н₂О.

Найдено (%): С 22,76; Н 9,31; Si 1,75; В 0,36. C₆₀H₂₈₉O₁₃₀Si₂B.

Вычислено (%): С 22,81; Н 9,22; Si 1,78; В 0,34.

ИК-спектр, ν/см^-1: 3270 (ОН); 2940, 2881 (С-Н); 1641 (Н-О-Н); 1410, 1336, 1293 (С-Н, В-О); 1202 (Si-O-B); 1107 (С-O в С-О-Н втор.); 1033, 994 (С-O в С-О-Н перв., Si-O-C).

Пример 7. Синтез кремнийборсодержащего глицерогидрогеля Si(C₃H₇O₃)₄·НВ(C₃H₆O₃)₂·8C₃H₈O₃·28H₂O.

61,85 г (0,055 моль) тетраглицеролата кремния в избытке глицерина Si(C₃H₇O₃)₄·8C₃H₈O₃, 10,52 г (0,055 моль) диглицеролата бора НВ(C₃H₆O₃)₂ и 27,63 г (1,534 моль) воды (мольное соотношение компонентов Si(C₃H₇O₃)₄:НВ(C₃H₆O₃)₂:C₃H₈O₃:H₂O = 1:1:8:28) смешивают при температуре 20°С до полной гомогенизации. Полученный раствор нагревают до 80°С и перемешивают до образования прозрачного бесцветного геля в количестве 100 г (n_D ²⁰=1,4394).

Состав полученного продукта отвечает формуле Si(C₃H₇O₃)₄·НВ(C₃H₆O₃)₂·8C₃H₈O₃·28H₂O.

Найдено (%): С 27,59; Н 9,05; Si 1,50; В 0,58. C₄₂H₁₆₁O₇₀SiB.

Вычислено (%): С 27,63; Н 8,89; Si 1,54; В 0,59.

ИК-спектр, ν/см^-1: 3271 (ОН); 2939, 2881 (С-Н); 1638 (Н-О-Н); 1412, 1335, 1289 (С-Н, В-О); 1200 (Si-O-B); 1108 (С-O в С-О-Н втор.); 1028, 997 (С-O в С-О-Н перв., Si-O-C).

Микробиологические исследования заявляемого средства Исследования выполнены в ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Екатеринбург). Оценку антимикробных свойств (бактерицидную и противогрибковую активность) кремнийборсодержащего глицерогидрогеля проводили на примере состава Si(C₃H₇O₃)₄·НВ(C₃H₆O₃)₂·8C₃H₈O₃·28H₂O (пример 7) согласно методическим рекомендациям по экспериментальному (доклиническому) изучению лекарственных препаратов для местного лечения гнойных ран [Доценко Б.М., Бирюкова СВ., Тамм Т.И. и др. 1989. - М.: МЗ СССР: 48 с.] методом диффузии в агар антибиотических веществ (метод лунок) и методом серийных разведений в жидкой среде для дерматофитов и дрожжевых грибов [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ // под общ. ред. чл-корр. РАМН, проф. Хабриева Р.У, - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО "Издательство "Медицина", 2005, - 832 с.].

Бактерицидную активность исследовали в отношении следующих тест-штаммов микроорганизмов: Escherichia coli АТСС 8739, Staphylococcus aureus АТСС 25923, Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, а также клинических штаммов Staphylococcus aureus (2 штамма MRSA с разной антибиотикочувствительностью), Streptococcus pyogenes, выделенных с кожи больных с дерматозами, осложненных вторичной инфекцией (Таблица 1).

Использовали суточные культуры бактерий. Исследуемый гель массой 50 мг вносили в лунки, вырезанные в агаре Мюллера-Хинтон (диаметром 10 мм), чашки со средой предварительно засевали газоном тест-культурой микроорганизма. Микробная нагрузка составляла 0,5 по МакФарланду, что соответствует 1,5*10⁹ КОЕ/мл (оптическая плотность, измеренная по денситометру, составляла 0,64-0,67).

Оценка антимикробной активности проводили по следующим критериям [Блатун Л.А., Терехова Р.П., Страдомский Б.В., Лыкова Е.О., Солодунов Ю.Ю. 2008. Стелланин-ПЭГ мазь 3%: сравнительная антимикробная активность в отношении возбудителей хирургической инфекции // Антибиотики и химиотерапия. 53, №11-12: 16-18]:

- зона задержки роста микроорганизмов диаметром до 10 мм указывала на отсутствие активности препарата в отношении данного тест-штамма;

- зона задержки роста микроорганизмов диаметром 11-16 мм указывала на низкую активность препарата в отношении данного тест-штамма;

- зона задержки роста микроорганизмов диаметром 17-20 мм рассматривалась как умеренная активность препарата;

- зона задержки роста микроорганизмов диаметром более 20 мм свидетельствовала о высокой активности препарата.

Как следует из таблицы, кремнийборсодержащий глицерогидрогель in vitro проявляет высокую бактерицидную активность в отношении наиболее частых возбудителей пиодермий (S. aureus как тест-штамма, так и клинических резистентных штаммов, и S. pyogenes); в том числе клинических штаммов S. Aureus, демонстрирующих устойчивость к метициллину (MRSA) и являющихся эпидемиологически опасными и полирезистентными к широко применяемым антимикробным препаратам; низкую активность в отношении тест-штамма P. aeruginosa и Е. coli.

Противогрибковую (фунгистатическую) активность исследовали в отношении следующих тест-штаммов грибов из Российской коллекции патогенных грибов:

1. Trichophyton rubrum РКПГ_F -1408

2. Trichophyton mentagrophytes РКПГ_F - 1425

3. Trichophyton tonsurans РКПГ_F - 1458

4. Trichophiton violaceum РКПГ_F - 1393

5. Trichophyton interdigitale РКПГ_F - 1229

6. Trichophyton schoenleinii РКПГ_F - 235/25

7. Epidermophyton floccosum РКПГ_F - 1174

8. Microsporum canis РКПГ_F - 1403

9. Candida albicans РКПГУ - 401/NCTC-885-653

В пробирки с жидкой средой Сабуро засевали соответствующую культуру гриба. Культуры дерматофитов (2-недельные) растирали в стерильной ступке с жидкой средой Сабуро. Готовили взвесь по стандарту мутности - 10⁸ КОЕ/мл. В каждую пробирку с разведенным исследуемым кремнийборсодержащим глицерогидрогелем вносили по 0,04 мл взвеси культуры гриба, включая контрольную. Засеянные пробирки помещали в термостат при 27°С на 14 дней. Чувствительность к препарату определяли по его минимальной дозе, при которой рост гриба не наблюдается.

Установлено, что образец геля в разведении 1:10 проявляет фунгистатическую (противогрибковую) активность в отношении тест-культур Trichophyton rubrum и Trichophiton violaceum.

Токсикологические исследования заявляемого средства

Исследования кремнийборсодержащего глицерогидрогеля, состав которого отвечает формуле Si(С₃Н₇О₃)₄·НВ(С₃Н₆О₃)₂·8C₃H₈O₃·28H₂O (пример 7) выполнены на кафедре фармакологии и клинической Фармакологии ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России (г. Екатеринбург) согласно «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств» под редакцией А.Н. Миронова (ч. 1. М.: Гриф и К, 2012 г., 944 с.), с соблюдением требований Европейской конвенции по защите лабораторных животных.

Исследование острой токсичности проводили на белых беспородных мышах массой 17-21 г обоего пола и на белых крысах популяции линии Wistar массой 180-280 г обоего пола. Экспериментальные животные содержались в виварии при температуре 18-20°С в условиях естественного светового цикла на стандартной диете при свободном доступе к пище и воде.

Было сформировано четыре группы экспериментальных животных по 20 особей в каждой группе: две группы мышей и две группы крыс. Исследуемый гель вводили в желудок через зонд и внутрибрюшинно однократно в виде 50%-ной водной суспензии в объеме 0,5 мл (мыши) и 5 мл (крысы).

После введения исследуемого вещества наблюдение за животными в первые сутки осуществляли через каждый час. В последующие 13 суток - ежедневно. В течение всего срока наблюдения у животных опытных групп не было отмечено существенных особенностей в их поведении, интенсивности и характере двигательной активности, координации движений, тонус скелетных мышц также не отличался от показателей интактных животных.

Однако после внутрибрюшинного введения исследуемого вещества при регистрации общей двигательной активности было обращено внимание на некоторую нервно-мышечную возбудимость мышей и крыс, что проявлялось во втяжении боковых стенок брюшной полости в первые два часа. После указанного времени животные опытных групп по поведению не отличались от интактных животных.

В конечном итоге, летальных исходов обнаружено не было. Таким образом, исследуемый кремнийборсодержащий глицерогидрогель (согласно ГОСТ 12.1.007-76) относится к малотоксичным веществам (IV класс опасности).

Изучение местного раздражающего действия кремнийборсодержащего глицерогидрогеля на кожу и слизистые проводили на 6 кроликах обоего пола породы Шиншилла массой 2,7-3,8 кг. На обработанный от шерсти боковой участок кожи слева (4×6 см) ежедневно в течение 30 дней наносили нативный образец геля в дозе 300 мг, который равномерно распределяли на указанном участке. Параллельно с этим экспериментом 3 кроликам за веко правого глаза закапывали по две капли 50%-ной суспензии геля один раз в сутки в течение 10 дней, а следующим 3 кроликам на слизистые ротовой полости наносили образец геля в дозе 300 мг. За период эксперимента ни в одном случае не было отмечено раздражающего действия: не наблюдалось возникновения эритемы или отека кожи и слизистой ротовой полости, а также изменения склеры, конъюнктивы, слезного протока (слезоточения).

Таким образом, заявляемый кремнийборсодержащий глицерогидрогель по степени выраженности раздражающего действия на кожу, слизистые глаз и ротовой полости относится к «0» классу веществ по пятибалльной системе Алексеевой О.Г., Петкевич А.И. (Алексеева О.Г., Петкевич А.И. К методике определения аллергенных свойств химических веществ // Гигиена и санитария, 1972, №3, 64-67).

Исследование сенсибилизирующего действия кремнийборсодержащего глицерогидрогеля было проведено на 6 кроликах обоего пола. Опытным животным на обработанный от шерсти боковой участок кожи размером 4×6 см наносили испытуемый нативный образец геля в дозе 300 мг, равномерно распределяя на указанном участке. Аппликации проводили ежедневно в одно и то же время (утренние часы). Для оценки проявления сенсибилизирующих свойств на 3 сутки была проведена разрешающая проба путем нанесения изучаемого вещества на подобный участок кожи противоположного бока кролика. Реакция гиперемии при этом не проявилась, что потребовало продолжить подобную манипуляцию на 7-, 14-, 21- и 28-е сутки. При этом также не было отмечено каких-либо видимых изменений на коже в области воздействия, поэтому следует считать, что у кремнийборсодержащего глицерогидрогеля отсутствуют сенсибилизирующее действие.

Изучение влияния на функциональное состояние сердечной деятельности и системы внешнего дыхания кремнийборсодержащего глицерогидрогеля проводили параллельно с проведением вышеуказанного исследования (сенсибилизации), при этом у опытных и интактных кроликов записывали электрокардиограммы и частоту дыхательных движений. В процессе эксперимента не удалось выявить особенностей как частоты сердечных сокращений, их структуры, так и частоты дыхательных движений.

Таким образом, изучаемый кремнийборсодержащий глицерогидрогель при местном применении не оказывает отрицательного влияния на организм экспериментальных животных и является безопасным в применении.

Исследования ранозаживляющей и регенерирующей активности заявляемого средства

Исследование проводили на модели термической травмы кожи боковой поверхности крыс обоего пола популяции линии Wistar массой 180-280 г. Крысы были разделены на 3 группы по 10 особей в каждой. Крысам 1-й (опытной) и 2-й (контрольной) групп под эфирным рауш-наркозом наносили термический ожог с помощью нагретой до 98-100°С металлической пластинки (6×2 см) при 40-секундном контакте с предварительно обработанной от шерсти боковой поверхностью кожи; 3-я группа оставалась интактной, контрольная - лечения не получала.

Лечение крыс опытной группы начинали через сутки после создания термического ожога и проводили открытым способом, нанося тонкий слой кремнийборсодержащего глицерогидрогеля, состав которого отвечает формуле Si(C₃H₇O₃)₄·НВ(C₃H₆O₃)₂·8C₃H₈O₃·28H₂O (пример 7), в дозе 300 мг непосредственно на место поражения один раз в сутки в утренние часы до полного заживления ран.

До нанесения ожогов и в процессе лечения исследовали поведенческие реакции крыс (методика «открытое поле»). В исследовании «открытое поле» оценивали вертикальную и горизонтальную активность крыс по следующим показателям: время ухода с круга, количество пройденных квадратов, число вставаний, умываний и заглядываний в «норы».

После курса лечения у крыс проводили общие и биохимические анализы крови, а также морфологические исследования висцеральных органов и кожи. Гистологические препараты готовили после фиксации тканей (сердца, легких, печени, почек, надпочечников, селезенки, кожи) 10%-ным раствором формалина и заливали парафином. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином по Ван-Гизону.

Наблюдения показали, что на фоне лечения кремнийборсодержащим глицерогидрогелем формирование струпа осуществлялось более благоприятно и в короткие сроки. У крыс опытной группы струп раневой поверхности отошел полностью уже на 9-е сутки, у крыс контрольной группы - только на 12-14-е сутки. При этом у опытных крыс опытной группы шерстистый покров на раневой поверхности начал восстанавливаться на 12-13-е сутки, а у крыс контрольной группы - лишь на 24-26-е. Следует отметить, что отека, воспаления и склонных к инфицированию термических ожогов не наблюдалось.

При исследовании поведенческих реакций было установлено, что наибольшее снижение активности по всем показателям наблюдалось в контрольной группе; в опытной группе активность приближалась к исходному уровню. В общем и биохимическом анализах крови достоверных изменений после лечения выявлено не было; показатели крыс в опытной группе значимо не отличались от показателей интактных крыс.

В результате морфологических исследований выявлено, что у крыс в контрольной группе повреждение кожи характеризуется большей глубиной и степенью дистрофических изменений эпидермиса; в дерме наблюдались субэпителиальные полости на фоне выраженного отека с деструкцией коллагеновых волокон сосочкового слоя, инфильтрация СЯЛ (сегментоядерных лейкоцитов), отек подкожно-жировой клетчатки.

На фоне применения кремнийборсодержащего глицерогидрогеля, эпидермис полностью восстанавливается на всем протяжении очага повреждения с признаками пролиферативной активности эпителиоцитов базального слоя. В дерме сохраняется умеренно выраженная диффузная лимфогистиоцитарная инфильтрация. Зафиксирована более выраженная пролиферативная активность клеток многослойного плоского ороговевшего эпителия над зоной повреждения. Исследуемые органы - без проявлений структурных изменений.

Таким образом, авторами предложен кремнийборсодержащий глицерогидрогель, который является физиологически активным веществом, нетоксичен, проявляет антимикробное, ранозаживляющее и регенерирующее действие, улучшает морфофункциональное состояние кожи, является удобной формой для местного применения, расширяет арсенал лекарственных средств и может быть рекомендован для использования в медицинской практике.