Результат интеллектуальной деятельности: ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ, КОПИРУЮЩИХ АКТУАЛЬНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ gp120 ВИЧ1

Изобретение относится к медицине, а именно, к препаратам для создания кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД.

Считается, что эффективная вакцина способна остановить распространение ВИЧ-инфекции. Существующая на сегодняшний день специфическая антиретровирусная терапия не удаляет полностью вирус из организма, а лишь способствует замедлению развития заболевания. Классический подход к разработке вакцин - это аттенуация или инактивация возбудителя.

В случае ВИЧ/СПИД эти методы не могут быть использованы по соображениям безопасности. В качестве антигенной субстанции кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД используются рекомбинантные белки и синтетические пептиды, копирующие актуальные детерминанты ВИЧ, а также бактериальные или вирусные векторы и ДНК-вакцины, кодирующие заданные последовательности эпитопов ВИЧ.

Механизм действия большинства лицензированных вакцин против различных возбудителей основан на их способности вызывать образование нейтрализующих антител. (Adv Immunol. 2001; V. 79 p. 1-53. Neutralizing antiviral antibody responses. Zinkernagel RM1, LaMarre A, Ciurea A, Hunziker L, Ochsenbein AF, McCoy KD, Fehr T, Bachmann MF, Kalinke U, Hengartner H.)

Эти антитела, связываясь с вирусом, затрудняют или предотвращают его проникновение в клетку. При инфицировании ВИЧ первые антитела определяются уже через 10 дней после заражения, но они не обладают нейтрализующей активностью. Нейтрализующие антитела образуются примерно через 2-3 месяца после заражения. За это время вирус успевает встроиться в геном клетки и становится невидимым для иммунной системы человека (Nat Rev Immunol. 2010 Jan V. 10 №1 p. 11-23. The immune response during acute HIV-1 infection: clues for vaccine development. McMichael AJ1, Borrow P, Tomaras GD, Goonetilleke N, Haynes BF.) (N Engl J Med. 2011 May 19 V. 364 №20 p. 1943-54. Acute HIV-1 Infection. Cohen MS1, Shaw GM, McMichael AJ, Haynes BF). Обол очечные белки вируса (gp120 и gp41) содержат эпитопы для нейтрализующих антител. Однако иммунизация лабораторных животных и добровольцев, участвующих в клинических испытаниях рекомбинантными антигенами, копирующими полноразмерные gp120 или gp41, индуцировала слабый иммунный ответ, направленный, в основном, на непротективные эпитопы. Вероятно, это связано с тем, что эпитопы, ответственные за индукцию нейтрализующих антител, являются слабыми иммуногенами и скрыты для распознавания иммунной системой.

Помимо вирусной нейтрализации, другим механизмом защитных свойств антител является антитело-зависимая клеточная цитотоксичность и антитело-зависимое ингибирование вирусной инфекции.

Другой особенностью ВИЧ - является его высокая изменчивость. Кроме того, вирусы, относящиеся к различным субтипам, могут рекомбинировать и образовывать, так называемые, циркулирующие рекомбинантные формы. Поэтому создание универсальной вакцины, которая бы вызывала протективный иммунный ответ против различных вариантов ВИЧ, циркулирующих в различных регионах, представляет определенную трудность. 90% всех вариантов ВИЧ объединены в группу M. Liao et al. на основе анализа последовательностей вирусов, входящих в эту группу, создали так называемую консенсусная последовательность. (Virology. 2006 Sep. 30 V. 353 №2 p. 268-82. A group M consensus envelope glycoprotein induces antibodies that neutralize subsets of subtype В and С HIV-1 primary viruses. Liao HX, Sutherland LL, Xia SM, Brock ME, Scearce RM, Vanleeuwen S, Alam SM, McAdams M, Weaver EA, Camacho Z, Ma BJ, Li Y, Decker JM, Nabel GJ, Montefiori DC, Hahn BH, Korber ВТ, Gao F, Haynes BF).

Разработка вакцинных препаратов на основе такого типа последовательностей позволило бы расширить спектр иммунного ответа.

Большинство нейтрализающих эпитопов ВИЧ были выявлены при исследовании специфичности моноклональных антител, обладающих широким спектром нейтрализующей активности. Эти эпитопы находятся на оболочечном (gp120) и трансмембранном (gp41) белках ВИЧ. Наибольшей интерес представляет участок, расположенный на оболочечном белке gp120, V3-петля. Он ответственен за связывание вируса с хемокиновыми рецепторами клетки CCR5/CXCR4. Удаление V3-петли у вируса делает его неинфекционным. Антитела, к этому эпитопу, обнаруживаются почти во всех сыворотках ВИЧ-инфицированных людей. Удаление анти-V3-антител из сыворотки ВИЧ-инфицированных людей приводила к потери ею нейтрализующей активности против лабораторных, но не первичных, штаммов ВИЧ (Differential role of V3-specific antibodies in neutralization assays involving primary and laboratory-adapted isolates of HIV type 1. Vancott TC, Polonis VR, Loomis LD, Michael NL, Nara PL, Birx DL. AIDS Res Hum Retroviruses. 1995 Nov V. 11 №11 p. 1379-1391) Используя В-лимфоциты ВИЧ-инфицированных людей, к V3-петле получено ряд нейтрализующих моноклональных антител, такие как, например, 447-52В и HGN194. Данные антитела эффективно нейтрализуют панель гомологичных и чувствительных к нейтрализации вариантов ВИЧ (Tier 1) и часть (11%) гетерологичных вариантов (Tier 2) (PLoS One. 2010 Jan 20 V. 5 №1, e8805. Analysis of memory В cell responses and isolation of novel monoclonal antibodies with neutralizing breadth from HIV-1-infected individuals. Corti D1, Langedijk JP, Hinz A, Seaman MS, Vanzetta F, Fernandez-Rodriguez BM, Silacci C, Pinna D, Jarrossay D, Baila-Jhagjhoorsingh S, Willems В, Zekveld MJ, Dreja H, O′Sullivan Ε, Pade С, Orkin С, Jeffs SA, Montefiori DC, Davis D, Weissenhorn W, McKnight A, Heeney JL, Sallusto F, Sattentau QJ, Weiss RA, Lanzavecchia A.)

V1/V2-петля gp120 также является эпитопом для нейтрализующих антител. Аутологичные нейтрализующие антитела, направленные к этому региону, часто выявляются в первые месяцы после заражения. Два моноклональных антитела PG9 и PG16 с широким спектром нейтрализующей активности, специфичные к V1/V2 региону, были изолированы из ВИЧ-инфицированных. (J Transl Med. 2011 Jan 27 V. 9 Suppl 1:S2. HIV-1 envelope, integrins and co-receptor use in mucosal transmission of HIV. Cicala C, Arthos J, Fauci AS.) V1/V2 регион принимает участие в формировании сайта связывания белка gp120 как с хемокиновым рецептором клетки CCR5/CXCR4, так и с интегриновым рецептором клетки α4β7. (Structure-function relationships of HIV-1 envelope sequence-variable regions refocus vaccine design. Zolla-Pazner S, Cardozo T. Nat Rev Immunol. 2010 Jul V. 10 №7 p. 527-35.)

После ряда неудач, определенный прорыв был отмечен в клинических испытаниях RV 144, проводимых в Таиланде, где впервые была выявлена эффективность вакцинного препарата против ВИЧ/СПИД. Для иммунизации использовалась комбинация двух препаратов: сначала вводился рекомбинатный вирус оспы канареек (ALVAC vCP1521), а затем рекомбинантный белок, копирующий оболочечный белок ВИЧ gp120 (AIDSVAX В/Е). У иммунизированных людей процент заражения был на 31,2% ниже, по сравнению с группой, получавшей плацебо. Хотя иммунизация не давала 100% защиты от инфицирования, считается, что это первые достоверные результаты вакцин-индуцированного протективного иммунного ответа, полученные в клинических испытаниях на людях. Исследование иммунных коррелятов протективного действия вакцины показало, что наличие антител к V1/V2-региону оболочечного белка gp120, связано с пониженным риском инфицирования. Эти антитела не обладали нейтрализующей активностью, но они принимали участие в механизме развития антитело-зависимой клеточной цитотоксичности. (Clin Vaccine Immunol. 2014 Aug V. 21 №8 p. 1023-1036. Nonneutralizing functional antibodies: a new "old" paradigm for HIV vaccines. Excler JL, Ake J, Robb ML, Kim JH, Plotkin SA).

Синтетические пептиды, копирующие актуальные эпитопы ВИЧ, как и рекомбинантные белки, являются хорошей основной для вакцины против ВИЧ. Они безопасны, хорошо переносимы и могут повторять только тот эпитоп, который вызывает протективный ответ.

Известен пептид, копирующий фрагмент V2-петли gp120 ВИЧ (патент WO 2013040040). Этот пептид специфически связывается с антителами добровольцев, принимавших участие в клинических испытаниях RV144. Он входит в состав полипептида, содержащего также субъединицу В холерного токсина (scaffold protein) или эндотоксин E. coli.

Известен рекомбинантный белок, копирующий V1/V2-домен оболочечного белка gp120 ВИЧ, штамма Case-A2 (субтип В), а также белок gp70 MuLV (патент US 20030105282). Данный белок представлял эпитоп, который распознавался антителами, способными нейтрализовать первичные изоляты ВИЧ. Иммунизация лабораторных животных (крыс) этим белком вызывала образование антител, способных нейтрализовать ряд первичных изолятов (М-тропных) ВИЧ. Однако большая часть антител индуцировалась на белок gp70 (63%).

Также известен ряд белков, копирующих последовательности V1/V2 - петли белка gp120 субтипов АЕ, и содержащих лидерную последовательность Ig (патент WO 2013085550). Данные белки также распознавались моноклональными антителами, обладающими широким спектром нейтрализующей активности. Однако, не исследована способность этого белка вызывать антитела широкой нейтрализующей активности.

Известны антигены, повторяющие V1/V2-петли gp120 (WO 2014039775) различных структурных конфигураций. Данные конфигурации возникают за счет образования альтернативных дисульфидных связей. Образование различных изоформ белка влияет на иммуногенность антигенов и их способности связываться со специфическими антителами.

Известна рекомбинантная ДНК, копирующая оболочечный белок gp120, в котором последовательности V1/V2- и V4-петли заменены на консесуные последовательности V3-петли, относящихся к разным субтипам (A1, В, С) (WO 2008005929). Данный подход позволил расширить специфичность иммунного ответа. Иммунизация лабораторных животных (кроликов) этой вакциной (прайм) и соответствующим рекомбинантным белком (буст), вызывала образование нейтрализующих антител широкой специфичности. Однако, иммунизация лабораторных животных только рекомбинантной ДНК, не приводила к индукции нейтрализующих антител.

Задачей данного изобретения является создание иммунногенной композиции с широким спектром иммунного ответа.

Таким образом, технический результат, получаемый при реализации описываемого изобретения, состоит в создании иммунногенной композиции на основе синтетических пептидов, повторяющих актуальные антигенные детерминанты вируса.

Указанный технический результат достигается тем, что иммуногенная композиция включает синтетические пептиды, повторяющие консенсусную последовательность группы M V1-, V2-, V3 - петли и V3 - петлю российского изолята RUA022a2 оболочечного белка gp120 ВИЧ1.

Иммуногенная композиция может дополнительно содержать иммуноадъювант для введения млекопитающему.

Иммуногенная композиция может содержать комбинацию пептидов, повторяющих V1-, V2-, V3 - петли любых последовательностей.

Композиция была разработана, исходя из теоретических предположений на основе приведенного выше анализа известных технических решений, и проверена на опытах.

Иммуногенная композиция включает пептиды, копирующие антигенные детерминанты ВИЧ, ответственные за индукцию как нейтрализующих антител, так и антител, принимающих участие в реакции антитело-зависимой клеточной цитотоксичности. Данные антигенные детерминанты представляют собой вариабельные участки оболочечного белка gp120 ВИЧ1, так называемые V1-, V2-, V3 - петля.

Данные пептиды (V1-, V2-, V3 - петля) повторяют как консесуную последовательность группы М, так и последовательность российского изолята RUA022a2 (V3-петля) (субтип A1) (http://vyww.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/HQ616082).

Предлагаемая композиция позволит расширить специфичность иммунного ответа.

Ниже указана последовательность пептидов:

1. Аминокислотная последовательность V1-петли консенсусной CTNVNVTNTTNNTEEKGEIKNC

2. Аминокислотная последовательность V2-петли консенсусной TTEIRDKKQKVYALFYRLDWPIDDNNNNSSNYRL

3. Аминокислотная последовательность V3-петли российского изолята RUA022a2 (субтип A1)

CIRPGNNTRTSIRIGPGQAFYATGEIIGDTRKAHC

4. Аминокислотная последовательность V3-петли консенсусной NCTRPNNNTRKSIRIGPGQAFYATGDIIGDIRQAHCN

Сходство данных пептидов с вирусным прототипом проверялось по их способности распознаваться антителами ВИЧ-инфицированных людей в иммуноферментном анализе (ИФА) (пример 1). Антитела, полученные в результате естественной инфекции, специфически взаимодействовали с синтетическими пептидами в ИФА.

Иммунизация смесью пептидов вызывала иммунный ответ у лабораторных животных (мышей) (пример 2). Антитела индуцировались на каждый пептид, входящий в состав композиции. Помимо, образования специфических антител класса IgG, иммунизация вызывала продукцию специфических IgM антител. Т.к. пептиды являются слабыми иммуногенами, то для усиления иммунного ответа в составе композиции могут быть использованы различные иммуноадъюванты. Иммуноадъюванты не только усиливают иммунный ответ, но и способны сдвигать его направленность (Th1 или Th2). Так введение в состав композиции полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) значительно увеличило титр антител. Таким образом, данная композиция может вводиться с любыми разрешенными к использованию в клинической практике иммуноадъювантами.

Другим важным моментом является способ доставки композиции. Помимо внутримышечного и подкожного введения, данная композиция может быть введена нагруженными пептидами дендридными клетками.

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приведены примеры его осуществления.

Пример 1. Исследование иммунорективности синтетических пептидов, копирующих эпитопы ВИЧ1 V1-, V2-, V3- петлю белка gp120 консенсусной последовательности группы M и V3- петлю белка gp120 российского изолята.

Определение проводили с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). В качестве ВИЧ-позитивных образцов применяли сыворотки ВИЧ-инфицированных людей, подтвержденных в иммуноблоте. В качестве ВИЧ-негативных образцов использовали сыворотки крови человека, не содержащих антител к ВИЧ-1.

Пептиды сорбировали на твердую фазу (полистироловые планшеты Greiner, Германия) в концентрации 10 мкг/мл в расчете на антиген. После окончания инкубации содержимое лунок стряхивали. Сыворотки разводили 1:10 в 0,01 M фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,05% раствора Твин-20 (ФСБ-Т) и 0,02% бычьего сывороточного альбумина (ФСБ-АТ). Образцы вносили в лунку в трех параллелях, и выдерживали 60 мин при 37°С.

По окончании инкубации, лунки пятикратно отмывали ФСБ-Т для удаления не связавшихся антител. В качестве детектирующего реагента использовали конъюгат пероксидазы хрена с моноклональными антителами мыши против IgG человека. Конъюгат в рабочем разведении на ФСБ-АТ вносили в лунку. Инкубировали 60 мин при 37°С. После этого лунки вновь промывали пятикратно ФСБ-Т. Реакцию проявляли внесением в каждую лунку 0,2% раствора ортофенилендиамина в субстратном буфере.

Развитие цветной ферментативной реакции останавливали после 15-минутной инкубации в темноте, внося в каждую лунку 50 мкл 10% раствора серной кислоты. Учет реакции производили с помощью спектрофотометра-ридера при длине волны 492 нм.

Результаты проведенного опыта представлены в виде отношения оптической плотности сыворотки, содержащей антитела к ВИЧ (ОП иссл), к оптической плотности негативной сыворотки (ОП негативная).

Исследование специфической активности пептидов с сыворотками ВИЧ-инфицированных людей показало, что пептиды, копирующие V3-петлю (консенсусную последовательность и российского изолята), распознаются почти всеми сыворотками ВИЧ инфицированных людей (31 из 32). Пептид, копирующий V1-петлю узнавали только 2 образца из 32, V2 - 4 из 32. Это объясняется тем, что V3 - петля является иммунодоминантным эпитопом, в отличие от V1-, V2- петли, антитела к которым индуцируются только у 25-40% ВИЧ-инфицированных (AIDS. 1997 Jan V. 11 №1 р. 128-30. Prevalence of a V2 epitope in clade В primary isolates and its recognition by sera from HIV-1-infected individuals.Israel ZR, Gorny MK, Palmer C, McKeating JA, Zolla-Pazner S.)

Пример 2. Изучение иммуногенности смеси пептидов, копирующих V1-, V2-, V3-петлю белка gp120 консенсусной последовательности группы М и V3-петлю белка gp120 российского изолята.

Для изучения иммуногенных свойств пептидов, копирующих V1-, V2-, V3-петлю белка gp120 консенсусной последовательности группы М и V3- петлю белка gp120 российского изолята, животных (мыши-гибридов (CBAxC57BL/6)F1 массой 16-18 г.) иммунизировали внутрибрюшинно смесью пептидов три раза, с интервалом две недели. Иммунизирующая доза составляла 100 мкг каждого антигена, входящего в состав в композиции, на животное. Антигены вводили как в смеси с ПАФ, так и без использования иммуноадъювантов (в фосфатно-солевом буфере). Кровь собирали через 7 дней после третьей иммунизации, затем получали сыворотки.

Титр антител (IgG и IgM) определяли для каждого антигена, входящего в состав иммуногенной смеси (таблица 2). Определение проводили с помощью твердофазного непрямого иммуноферментного анализа (ИФА). В качестве твердофазного иммуносорбента использовали каждый пептид по отдельности, сорбированный на твердой фазе (в лунках полистиролового планшета). Пептид в концентрации 10 мкг/мл сорбировали на полистироловых планшетах фирмы «Greiner» (Германия) в 0,05 M растворе карбонантно-бикарбонантного буфера pH 9,5, внося по 100 мкл раствора антигена в лунку. Выдерживали 24 часа при комнатной температуре во влажной камере.

После окончания инкубации содержимое лунок стряхивали. Готовили ряд последовательных двоичных разведений сывороток на 0,01 M фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,05% раствора Твин-20 (ФСБ-Т) и 0,02% бычьего сывороточного альбумина (ФСБ-АТ). Образцы вносили в лунку в трех параллелях для каждого разведения, и выдерживали 60 мин при 37°С.

По окончании инкубации, лунки пятикратно отмывали ФСБ-Т для удаления не связавшихся антител. В качестве детектирующего реагента использовали конъюгат пероксидазы хрена с антителами кролика против молекулы IgG мыши или IgM. Конъюгат в рабочем разведении на ФСБ-АТ вносили в лунку. Инкубировали 60 мин при 37°С. После этого лунки вновь промывали пятикратно ФСБ-Т. Реакцию проявляли внесением в каждую лунку 0,2% раствора ортофенилендиамина в субстратном буфере. Развитие цветной ферментативной реакции останавливали после 15-минутной инкубации в темноте, внося в каждую лунку 50 мкл 10% раствора серной кислоты. Учет реакции производили с помощью спектрофотометра-ридера при длине волны 492 нм.

Результат считали положительным, если ОП (оптическая плотность) в анализируемой лунке превышала ОП крит., рассчитанную по формуле:

ОПкрит.=ср.знач.ОП К(-)+0,2,

где 0,2 - коэффициент, определяемый методом статистической обработки результатов постановки ИФА,

ОП К(-) - оптическая плотность сыворотки интактной мыши, в рабочем разведении 1:10.

Иммунизация смесью синтетических пептидов вызывала ответ на каждый антиген иммуногенной композиции. Показано, что пептиды индуцировали различный по силе иммунный ответ. Наименьшие титры антител образовывались на пептид, копирующий VI-петлю. Титры IgG антител на V2- и V3-петлю значительно не отличались. Наличие иммуноадъювантов в составе иммуногенной композиции значительно усиливает ответ. Так титр IgG антител в группе, где пептиды вводились без адъювантов, составлял 1:10-1:20, а в группах, где использовался ПАФ 1:2580-20480. Кроме того, были выявлены специфические антитела класса IgM. Отличие в титрах антител можно объяснить разной длиной пептидов и, соответственно, разностью в молекулярном весе. Чем меньше молекулярная масса антигена, тем меньше его иммуногенность.

Перечень последовательностей

<110> ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА

<120> Иммуногенная композиция на основе синтетических пептидов, копирующих актуальные детерминанты gp120 ВИЧ1

<160> NUMBER OF SEQ ID NOS: 4

<210> SEQ ID NO 1

<211>

<212>

<213>

<400> SEQUENCE 1

<210> SEQ ID NO 2

<211>

<212>

<213>

<400> SEQUENCE 2

<210> SEQ ID NO 3

<211>

<212>

<213>

<400> SEQUENCE 3

<210> SEQ ID NO 4

<211>

<212>

<213>

<400> SEQUENCE 4