СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛОЖИТЕЛЬНОГО КОНТРОЛЯ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИКОМПЛЕМЕНТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ЧЕЛОВЕКА, И СТАНДАРТНЫЙ ОБРАЗЕЦ ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИКОМПЛЕМЕНТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения контролей стандартного образца иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов человека; а также к стандартным образцам иммуноглобулина человека, предназначенным для определения антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов человека.

Изобретение может быть использовано для определения антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов человека в процессе производства для оценки качества как при выпуске, так и в ходе их исследований с целью подтверждения соответствия требованиям нормативной документации (сертификационные испытания).

Иммуноглобулины человека представляют собой лекарственные средства, содержащие концентрированный раствор иммунологически активной белковой фракции, выделенной фракционированием этиловым спиртом при температуре ниже 0°C из плазмы крови здоровых доноров. Одним из проявлений побочного действия препаратов иммуноглобулинов при внутривенном введении является спонтанная активация системы комплемента на Fc-участке агрегированных и поврежденных при фракционировании молекул иммуноглобулина, что приводит в свою очередь к активации макрофагов и высвобождению вазоактивных субстанций и соответствующих клинических проявлений [1]. Показателем качества, характеризующим указанное свойство, является «Антикомплементарная активность».

Критическими параметрами, влияющими на конечный результат определения антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов человека, являются:

- источник получения комплемента морских свинок;

- активность применяемой гемолитической сыворотки;

- партия эритроцитов барана и их пробоподготовка;

- состав используемого буферного раствора, его температура и pH.

Вариабельность перечисленных параметров указывает на необходимость использования стандартного образца при определении антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов человека. Положительный и отрицательный контроли стандартного образца подтверждают достоверность полученных результатов в различных диапазонах значений антикомплементарной активности.

Аналогов разработанному авторами способу получения положительного контроля стандартного образца иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов человека на уровне техники не выявлено.

Ближайшим к заявляемому стандартному образцу является «Стандарт иммуноглобулина человека (антикомплементарная активность и молекулярные параметры), биологический референс-препарат, серия 1» [«Human immunoglobulin (АСА and molecular size), BRP batch 1»], утвержденный Европейским директоратом по качеству лекарственных средств и здравоохранения (European Directorate for the Quality of Medicines, EDQM) в 2011 г. В настоящее время он используется при определении антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов человека [2]. Перед использованием данный стандартный образец растворяют в заданном объеме (105,4 мл) воды для инъекций. В результате получают раствор с содержанием иммуноглобулина примерно 50 мг/мл, при этом возникает необходимость подтверждения содержания белка в полученном растворе. Отрицательный и положительный контроли формируются путем изменения количества исходного раствора стандартного образца иммуноглобулина: 0,2 мл и 0,6 мл для отрицательного и положительного контролей, соответственно. Известный стандартный образец характеризуется нестабильностью аттестованных характеристик, подтверждаемой значительным коэффициентом вариации: для отрицательного контроля - 33%, для положительного контроля - 15% [3]. Его использование не может быть рациональным, так как при растворении лиофилизата получают более 105,4 мл раствора с ограниченным сроком хранения (не более 14 суток), а его расход на одно исследование не превышает 0,8 мл. При хранении полученного раствора стандартного образца возможна его контаминация микроорганизмами и изменение значений аттестованных характеристик.

Задачей изобретения является повышение стабильности аттестуемых характеристик стандартного образца, а также повышение эффективности его использования, упрощение пробоподготовки и улучшение воспроизводимости результатов определения антикомплементарной активности иммуноглобулина человека.

Поставленная задача решается благодаря тому, что для определения антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов человека используется положительный контроль стандартного образца иммуноглобулина человека, полученный по способу, включающему следующие стадии:

- термическая обработка образца иммуноглобулина человека на водяной бане при температуре (56±1)°C;

- охлаждение термически обработанного образца иммуноглобулина человека при температуре (22±3)°C;

- определение антикомплементарной активности образца положительного контроля, при этом значения определяемой активности должны находиться в диапазоне от 60 до 95%.

Стандартный образец иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности содержит положительный контроль, полученный по способу, описанному выше, и отрицательный контроль с антикомплементарной активностью, находящейся в диапазоне 10-45%.

Заявляемый стандартный образец иммуноглобулина человека, используемый для определения антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов человека, включает две ампулы из прозрачного нейтрального стекла, содержащие раствор иммуноглобулина человека, имеющие маркировку на внешней поверхности, отражающую информацию о названии стандартного образца, наименовании контроля с указанием значения антикомплементарной активности, изготовителе, дате изготовления, сроке годности, условии хранения, инструкцию по применению, и упакован в тару для хранения и транспортировки.

Между совокупностью существенных признаков заявленного стандартного образца и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь, а именно использование двух компонентов с аттестованным содержанием белка: раствор иммуноглобулина человека с антикомплементарной активностью в диапазоне 60-95% для положительного контроля, и раствор иммуноглобулина человека с антикомплементарной активностью в диапазоне 10-45% для отрицательного контроля, позволяет повысить стабильность аттестуемых характеристик, исключить дополнительные стадии пробоподготовки, оказывающие влияние на погрешность определения целевого значения; при этом более удобная форма выпуска (ампула) позволяет более рационально хранить и использовать заявляемый стандартный образец.

Для стадии термической обработки и охлаждения в способе получения положительного контроля продолжительность воздействия температуры определяется объемом раствора иммуноглобулина человека, помещенного в контейнер, и может составлять 5 мин и более.

Для отрицательного контроля стандартного образца иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности используется образец иммуноглобулина человека, не прошедший термическую обработку.

Дополнительно стандартный образец иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности аттестован по содержанию белка. Количество белка определяется технологией получения препаратов иммуноглобулинов человека.

Благодаря решению таких задач, как повышение стабильности аттестованных характеристик стандартного образца иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности и более рациональное его использование, изобретение позволяет повысить достоверность получаемых результатов определения антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов человека в различных диапазонах.

Краткое описание чертежей и графических материалов

Фиг. 1. Приготовление проб с положительным и отрицательным контролем заявляемого стандартного образца иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности и контроля комплемента.

Фиг. 2. Порядок подготовки проб для определения остаточной активности комплемента.

Фиг. 3. Среднее значение аттестуемых характеристик антикомплементарной активности в стандартном образце иммуноглобулина человека.

Фиг. 4. Изучение стабильности стандартного образца иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. Приготовление желатин-солевого раствора/желатин-барбиталового буферного раствора

1. Желатин-солевой раствор (ЖСР)

1 г желатина помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, добавляют примерно 200 мл воды очищенной и оставляют набухать. Смесь нагревают при температуре (45±3)°C до полного растворения. Полученный прозрачный раствор охлаждают до комнатной температуры.

В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 8,5 г натрия хлорида, 0,1 г кальция хлорида безводного, 0,04 г магния хлорида 6-водного, растворяют в небольшом количестве воды очищенной и добавляют приготовленный раствор желатина. Общий объем раствора доводят водой очищенной до метки и перемешивают. pH раствора доводят до 7,2-7,3 0,1 М раствором натрия гидроксида. Раствор используют свежеприготовленным.

2. Желатин-барбиталовый буферный раствор

2.1. Приготовление исходного раствора кальция и магния

4,412 г кальция хлорида дигидрата и 20,332 г магния хлорида 6-водного растворяют в небольшом количестве воды очищенной в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят при температуре (5±3)°C в течение 1 мес.

2.2. Приготовление исходного барбиталового буферного раствора pH 7,3

83,0 г натрия хлорида и 10,192 г барбитала натрия растворяют в 1700 мл воды очищенной в мерной колбе вместимостью 2000 мл, постоянно перемешивая. Показатель pH доводят до 7,3 1 М раствором хлористоводородной кислоты. Добавляют 5 мл исходного раствора кальция и магния, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят при температуре (5±3)°C в течение 1 мес.

2.3. Приготовление раствора желатина

В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 1,25 г желатина, прибавляют 500 мл воды очищенной и тщательно перемешивают. Полученную смесь нагревают при температуре (45±3)°C до полного растворения желатина. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора до метки водой очищенной и перемешивают. Используют только свежеприготовленный раствор.

2.4. Приготовление желатин-барбиталового буферного раствора

Прибавляют 4 части раствора желатина к 1 части исходного барбиталового буферного раствора, тщательно перемешивают и доводят pH до 7,2-7,3 с помощью 1 М раствора натрия гидроксида или 1 М раствора хлористоводородной кислоты. Раствор используют свежеприготовленным.

Оборот барбитала и его натриевой соли в России ограничен, т.к. данные вещества входят в Список психотропных веществ, оборот которых в Российской Федерации ограничен и в отношении которых допускается исключение некоторых мер контроля в соответствии с законодательством Российской Федерации и международными договорами Российской Федерации (список III); для его использования необходимо наличие лицензии. Ввиду ужесточения требований за оборотом барбитала и его натриевой соли необходимо использовать в качестве альтернативы желатин-солевой раствор.

Пример 2. Приготовление эритроцитов барана

Кровь барана можно использовать не ранее чем через 7 дней после взятия и использовать в течение 21 дня.

Стабилизированная в цитратном растворе кровь барана: берут один объем крови в один объем цитратного раствора и перемешивают. Хранят при температуре (5±3)°C.

Приготовление цитратного раствора:

20,5 г глюкозы, 8,0 г натрия лимоннокислого трехзамещенного и 4,2 г натрия хлорида растворяют в 750 мл воды очищенной, pH раствора доводят до 6,1 раствором лимонной кислоты (100 г/л), объем раствора доводят до 1000 мл водой очищенной. Стерилизуют текучим паром в течение 30 мин при температуре 100°C. Хранят при температуре (5±3)°C в течение 1 мес.

Пример 3. Приготовление гемолитической системы (суспензии сенсибилизированных эритроцитов барана)

Предварительно оттитрованную согласно методике, изложенной в Европейской фармакопее [4], гемолитическую сыворотку разводят до 2 МГЕ/мл и добавляют к 5% суспензии эритроцитов барана, приготовленной согласно методике, изложенной в Европейской фармакопее [4], в соотношении 1:1. Инкубируют в термостате при температуре (37±0,5)°C в течение 15 минут, используют в течение 6 ч после приготовления, хранят при температуре (5±3)°C.

Пример 4. Приготовление комплемента морских свинок

Готовят пул сыворотки из крови не менее 10 морских свинок. Сыворотку отделяют от сгустка крови центрифугированием при температуре (5±3)°C. Сыворотку хранят в небольших количествах при температуре ниже минус 70°C.

Определение исходной активности комплемента проводят согласно методике, изложенной в Европейской фармакопее [4]. После определения исходной активности комплемента готовят раствор комплемента, содержащий 100 CH₅₀/мл, т.е. 1 мл раствора комплемента разбавляют ЖСР в N раз.

Пример 5. Способ получения положительного контроля стандартного образца иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности

Применяемые материалы и оборудование:

- баня водяная Julabo ED-19M (Julabo Labortechnik GmbH, Германия);

- термометр технический стеклянный ТТМ (диапазон измерений от 0 до 100°C, ОАО «Термоприбор», Россия);

- вода очищенная.

Способ осуществляют следующим образом. Для получения положительного контроля стандартного образца ампулы по 1,5 мл с образцом иммуноглобулина человека подвергают термической обработке на водяной бане при следующих параметрах:

- температура воды (56±1)°C;

- время термической обработки 5 минут.

При этом изменение формы выпуска образца иммуноглобулина человека приводит к изменению продолжительности прогревания.

В результате получают образцы иммуноглобулина человека, имеющие высокую антикомплементарную активность.

Охлаждают термически обработанные образцы иммуноглобулина человека при следующих параметрах:

- температура (22±3)°C;

- время охлаждения 15 минут.

Пример 6. Способ получения положительного контроля стандартного образца иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности

Аналогично примеру 5 возможно использовать для получения положительного контроля стандартного образца флаконы по 25 мл с образцом иммуноглобулина человека, при этом время термической обработки на водяной бане составляет 15 минут, а время охлаждения - 20 минут.

Пример 7. Способ получения положительного контроля стандартного образца иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности

Аналогично примеру 5 возможно использовать для получения положительного контроля стандартного образца ампулы по 3 мл с образцом иммуноглобулина человека, при этом время термической обработки на водяной бане составляет 7 минут, а время охлаждения - 15 минут.

Пример 8. Определение аттестуемой характеристики антикомплементарной активности

В полученном согласно примеру 5 готовом положительном контроле стандартного образца иммуноглобулина человека и отрицательном контроле, представляющем собой раствор иммуноглобулина человека, не прошедший термическую обработку, определяют аттестуемые характеристики следующим образом.

Приготовление проб с положительным и отрицательным контролем заявляемого стандартного образца и контроля комплемента приведено в Фиг. 1.

Приготовление проб с положительным контролем заявляемого стандартного образца по примерам 6, 7 и проб с отрицательным контролем, представляющем собой раствор иммуноглобулина человека, не прошедший термическую обработку, проводят в зависимости от аттестованного значения содержания белка в растворе иммуноглобулина человека, указанного в паспорте на стандартный образец.

Подготовленные пробы инкубируют в термостате при температуре (37±0,5)°C в течение 60 мин. По истечении времени инкубации готовят разведение 1:50 для пробы с контролем комплемента и разведение 1:20 для проб отрицательного и положительного контроля. После чего проводят определение остаточной активности комплемента (в двух повторностях) в соответствии с Фиг. 2.

Для приготовления контрольных проб без гемолиза в три пробирки вносят по 1,3 мл БР.

Для приготовления контрольных проб с полным гемолизом в три пробирки вносят по 1,3 мл воды очищенной.

Затем в каждую пробирку (пробирки 1-12 и пробирки с контрольными пробами) добавляют по 0,2 мл гемолитической системы, тщательно перемешивают и инкубируют в термостате при температуре (37±0,5)°C в течение 60 мин, затем охлаждают 10 мин при температуре (5±3)°C и центрифугируют при 1000 g в течение 5 мин.

Измеряют оптическую плотность надосадочной жидкости на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 541 нм. Раствор сравнения - ЖСР. Рассчитывают степень гемолиза (Y) по формуле 1:

где:

Ап - среднее значение оптической плотности испытуемой пробы;

Ао - среднее значение оптической плотности контрольной пробы без гемолиза;

Ак - среднее значение оптической плотности контрольной пробы с полным гемолизом;

На миллиметровой бумаге с логарифмическим масштабом по обеим осям или с использованием программного обеспечения строят график со значениями Y/(1-Y) на оси абсцисс и количеством разведенного комплемента в мл на оси ординат. Строят оптимизированную кривую (при построении графика учитывают значения степени гемолиза, находящиеся в диапазоне от 0,15 до 0,85; значения, находящиеся за пределами указанного диапазона не учитывают), соответствующую нанесенным точкам, и определяют ординату для дозы комплемента, приводящей к 50% гемолизу, т.е. Y/(1-Y)=1.

Если центрифугирование и/или считывание результатов не может быть сделано немедленно, пробирки хранят при температуре (5±3)°C не более 1 ч.

Вычисляют активность комплемента в гемолитических единицах (СН₅₀/мл) по формуле 2:

где:

В - величина, обратная степени разведения комплемента;

С - объем разведенного комплемента (мл), вызывающий 50% гемолиз (Y/(1-Y)=1);

5 - множитель для учета количества эритроцитов.

Результат титрования комплемента считают достоверным при условии, что наклон прямой составляет от 0,15 до 0,40, предпочтительно в интервале 0,18-0,30.

Вычисляют антикомплементарную активность (в процентах) в отрицательном и положительном контролях по отношению к контролю комплемента, принятому за 100%, по формуле 3:

где:

b - значение СН₅₀/мл для контроля комплемента, рассчитанное по формуле 2;

а - значение СН₅₀/мл для отрицательного, положительного контроля и испытуемого образца, рассчитанное по формуле 2.

Результаты теста считают достоверными, если:

1. значения антикомплементарной активности отрицательного и положительного контроля находятся в пределах 10-45% и 60-95% соответственно;

2. активность комплемента в контроле комплемента находится в пределах от 80 до 120 СН₅₀/мл.

В противном случае проводят повторный анализ.

Результаты определения антикомплементарной активности в стандартном образце иммуноглобулина человека представлены на Фиг. 3.

Из данных, представленных на Фиг. 1, следует, что отсутствует необходимость растворения стандартного образца и подтверждения содержания белка, при этом наблюдаются следующие положительные моменты:

- упрощение пробоподготовки.

Из данных, представленных на Фиг. 3, следует, что аттестуемое значение антикомплементарной активности положительного контроля стандартного образца, приготовленного по предлагаемому способу, соответствует заявленным требованиям: антикомплементарная активность в диапазоне 60-95%, аттестуемое значение антикомплементарной активности отрицательного контроля укладывается в диапазон 10-45%, также стандартный образец имеет коэффициент вариации для отрицательного контроля - 5,7%, для положительного контроля - 3,6%, при этом наблюдаются следующие положительные моменты:

- повышенная стабильность аттестуемых характеристик стандартного образца.

Пример 9. Изучение стабильности стандартного образца иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности

Для изучения стабильности образцы полученного стандартного образца иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности хранят при температуре (5±3)°C и определяют контролируемые параметры в момент закладки на хранение, далее каждый месяц в течение первых трех месяцев, далее с интервалом в 3 месяца до 15 месяцев. Контролируемые параметры: антикомплементарная активность и содержание белка. Результаты изучения стабильности представлены на Фиг. 4. Для установления окончательного срока хранения наблюдения продолжаются.

Пример 10. Набор, содержащий стандартный образец иммуноглобулина человека для определения антикомплементарной активности

Набор содержит положительный контроль (ампула 1,5 мл), полученный в примере 5, и отрицательный контроль (ампула 1,5 мл), представляющий собой раствор иммуноглобулина человека, не прошедший термическую обработку, аттестованные по методике, изложенной в примере 8. Набор упаковывают в пачку картонную и прикладывают инструкцию по применению и паспорт на стандартный образец.

Пример 11. Хранение и транспортирование стандартного образца

Упакованные наборы стандартного образца хранят при температуре (5±3)°C в защищенном от света месте. Транспортирование осуществляют всеми видами крытого транспорта согласно СП 3.3.2.1248-03 при температуре (5±3)°C.

Аналогичным образом, с учетом раскрытия изобретения в описании специалистом в данной области могут быть получены, выполнены другие варианты изобретения, которые охватываются формулой изобретения, приводимой ниже.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Buchacher A., Schluga P., Mullner J., Schreiner М. Anticomplementary activity of IVIG concentrates - important assay parameters and impact of IgG polymers //Vox sanguinis. 2010. V. 98. N 3p1. P. e209-e218.

2. Лист-вкладыш к стандартному образцу иммуноглобулина человека BRP. [Электронный ресурс] URL: http://crs.edqm.eu/db/4DCGI/db/4DCGI/ leaflet?leaflet=Y0001504_1 (дата обращения: 21.03.2014).

3. Sandberg Е., Costanzo A., Daas A., Buchheit К.-Н. Calibration of the human immunoglobulin BRPs for АСА and molecular size (batch 1) and for Fc function and molecular size (batchs 1&2)// Pharmeuropa Bio&SN. 2012. P. 1-15. [Электронный ресурс] URL: http://pharmeuropa.edqm.eu/PharmeuropaBioSN/ (дата обращения: 21.03.2014).

4. European Pharmacopoeia 8.1, 01/2010:20617 corrected 7.6 «Test for anticomplementary activity of immunoglobulin)). [Электронный ресурс] URL: http://online6.edqm.eu/ep801/# (дата обращения: 21.03.2014).