Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРОГО ГЕРПЕТИЧЕСКОГО СТОМАТИТА У ДЕТЕЙ

Изобретение относится к медицине, а именно к детской стоматологии и биохимии, и может быть использовано для оценки эффективности лечения острого герпетического стоматита у детей до трехлетнего возраста.

Проблема воспалительных заболеваний слизистой оболочки полости рта у детей занимает одно из важнейших мест в стоматологии. Особое место здесь занимает острый герпетический стоматит, так как на его долю приходится более 80% всех заболеваний слизистой оболочки полости рта у детей (Дроботько Л.Н., Страхова СЮ. Острый герпетический стоматит у детей. - Российская стоматология, 2009. - N 1. - С. 26-29.; Леонтьев В.К., Пахомов Г.Н. Профилактика стоматологических заболеваний. - М., 2006. - 416 с.). Острый герпетический стоматит занимает не только первое место среди всех поражений слизистой оболочки полости рта, но и входит в лидирующую группу среди всех инфекционных заболеваний детского возраста. В 70-90% случаев острый герпетический стоматит распространен у детей в возрасте от 1 года до 3 лет. Лечение острого герпетического стоматита затруднено, так как в основном пациентами становятся дети ясельного возраста. Несмотря на применение в детской стоматологии новых противовирусных препаратов, у каждого 7-10-го ребенка острый герпетический стоматит рано переходит в хронический рецидивирующий герпетический стоматит с преобладанием тяжелой формы заболевания. Поэтому актуальной задачей является разработка способа, позволяющего оценить эффективность лечения этого заболевания у детей.

Известны некоторые аналоги, которые были ранее предложены для оценки эффективности лечения острого герпетического стоматита. Для контроля за эффективностью проводимой терапии предлагалось использовать следующие клинические критерии: нормализация общего состояния, температуры тела, уменьшение острых воспалительных явлений, болезненности при приеме пищи, эпителизация элементов поражения (Персии Л.С., Елизарова В.М., Дьякова C.B. Стоматология детского возраста. - 5-e изд., перераб. и доп. - М.; Медицина, 2003. - 640 с.).

Недостатки данного способа оценки эффективности лечения детей при герпетическом стоматите, особенно в дошкольном возрасте, связаны со следующими причинами:

- субъективность оценки врачом клинической картины заболевания;

- невозможность оценить эффективность лечения у неконтактных детей и детей с отклонениями в нервно-психическом развитии.

Прототипом способа оценки эффективности лечения острого герпетического стоматита у детей является рост числа HLA-DR+ клеток в крови, уменьшение соотношения аэробной и анаэробной микрофлоры на слизистой оболочке переходной складки полости рта (Белоусова Л.Г. Иммунопатогенетическое обоснование комплексного лечения острого герпетического стоматита у детей до трех лет: Автореф. дис.на соиск. учен, степ. к.м.н.: Спец. 14.00.21: Спец. 14.00.36. - Самара: 2003).

Недостатками данного способа оценки эффективности лечения детей при герпетическом стоматите являются:

- определение числа HLA-DR+ клеток, микробиологические и иммунологические исследования требуют дорогостоящего оборудования, достаточно длительны во времени и малодоступны для рядовых лабораторий;

- возросшее в последние годы количество заболеваний, передающихся парентеральным путем (в том числе, группа вирусных гепатитов, синдром приобретенного иммунодефицита человека), и болезненность процедуры взятия крови ведет к отказу от инвазивных анализов (особенно у детей дошкольного возраста).

Технический результат изобретения - разработка простого, атравматичного, быстрого, экономически эффективного способа оценки эффективности лечения острого герпетического стоматита у детей.

Указанный результат по оценке эффективности лечения острого герпетического стоматита у детей достигается путем определения в ротовой жидкости детей содержания кальция и меди спектрофотометрическим методом. Предложен коэффициент соотношения содержания Cu/Ca в ротовой жидкости детей. При величине этого коэффициента свыше 45 лечение острого герпетического стоматита у детей можно считать эффективным. Определение содержания кальция и меди в биологических жидкостях входит в число стандартных показателей работы рядовых биохимических лабораторий, занимают небольшой интервал времени для исследования, а их экономическая эффективность в несколько раз выше иммунологических показателей.

Способ осуществляется следующим образом.

Объектом исследования является ротовая жидкость. За 12 часов до сбора ротовой жидкости у ребенка исключают прием пищи и лекарственных препаратов для того, чтобы избежать разведения ротовой жидкости и влияния медикаментов на секрецию и биохимический состав слюны. Ротовую жидкость собирают утром натощак путем сплевывания в чистые сухие пробирки или отсасывают со дна полости рта одноразовыми атравматичными пипетками в контейнер в количестве 0,5-1 мл. Непосредственно перед сбором слюны рот следует прополоскать водой без использования раздражающих средств и ополаскивателей. Ротовую жидкость центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут, в надосадочной жидкости определяют содержание меди и кальция.

Содержание меди в ротовой жидкости детей определяют спектрофотометрически по методу Landers J.W., Zak В. (Landers J.W., Zak В. Determination of serum copper and iron in a single small sample // Am. J. Clin. Path. - 1958. - V. 29, №6. - P. 590-592) и кальция по методу Barnett R.N. et al. (Baraett R.N., Skodon S.B., Goldberg, M.H. et al. Performance of «kits» used for clinical chemical analysis of calcium in serum // Am. J. Clin. http://Path.-1973.-Vol. 59, №6. - P. 836-845).

Принцип метода определения меди основан на способности батокупроина образовывать с ионами одновалентной меди устойчивый комплекс оранжевого цвета, пригодный для фотометрического определения.

Используемые реактивы (например, набор реактивов фирмы «PLIVA-Lachema», Чехия).

1. Стандартный раствор меди сернокислой 3 ммоль/л

2. Батокупроин: 2,9-диметил-4,7-дифенил-1,10-фенантролин-3,6-дисульфокислоты натриевая соль 0,44 ммоль/л, ацетат натрия 2 моль/л

3. Восстанавливающий реактив гидроксиламин сернокислый 1,25 г

4. Реактив для осаждения белков: трихлоруксусная кислота 0,6 моль/л, соляная кислота 2 моль/л

В контрольную, стандартную и опытную пробирки добавляют по 0,5 мл раствора, содержащего 12,5 мг восстанавливающего реактива гидроксиламина сернокислого в 0,6 моль/л трихлоруксусной кислоте и 2 моль/л соляной кислоте. Дополнительно в контрольную пробу добавляют 0,5 мл дистиллированной воды, в стандартную - 0,5 мл 3 ммоль/л раствор сернокислой меди, содержащей 30 мкмоль Cu²⁺/л, в опытную пробирку - 0,5 мл ротовой жидкости.

Пробы перемешивают и через 30 минут центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость в количестве 0,5 мл перемешивают с 0,5 мл 2 моль/л раствора 2,9-диметил-4,7-дифенил-1,10-фенантролин-3,6-дисульфокислоты натриевой соли и в интервале времени от 5 до 90 минут измеряют оптическую плотность пробы (A₁) и стандарта (A₂) против контрольного раствора при длине волны 480 нм (от 460 до 500 нм) в кювете с толщиной оптического слоя 1 см.

В состав реакционной смеси входят: батокупроин 0,22 ммоль/л, трихлоруксусная кислота 0,15 моль/л, соляная кислота 0,50 моль/л, ацетат натрия 1,0 моль/л, гидроксиламин сернокислый 0,04 моль/л. Объемное соотношение ротовая жидкость/реакционная смесь = 1/2.

Расчет содержания меди производят по формуле:

A=30·(E₁/E₂),

где A - содержание меди, мкмоль/л;

E₁ - оптическая плотность опытной пробы;

E₂ - оптическая плотность стандартной пробы;

30 - коэффициент пересчета.

Принцип метода определения кальция основан на способности кальция в щелочной среде образовывать окрашенный комплекс с о-крезолфталеинкомплексоном. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации кальция в пробе.

Используемые реактивы (например, набор реактивов фирмы «Ольвекс диагностикум», Санкт-Петербург, Россия).

1. 1M 2-амино-2-метилпропаноловый буфер, pH 10,7

2. O-крезолфталеинкомплексон - 0,026 М, 8-гидроксихинолин - 9 мМ, детергенты, стабилизаторы

3. Калибратор - 2,5 ммоль/л (10 мг/100 мл)

Все реактивы стабильны в течение 6 месяцев в темноте при комнатной температуре в плотно закрытой посуде.

В контрольную, опытную и калибровочную пробу вносят по 1 мл 1 M 2-амино-2-метилпропанового буфера (pH 10,7) и по 1 мл 0,026 M о-крезолфталеинкомплексона. Затем добавляют по 0,05 мл ротовой жидкости в опытную пробу, калибратора с концентрацией кальция 2,5 ммоль/л - в калибровочную и бидистиллированной воды - в контрольную пробу. Реакционные смеси перемешивают и инкубируют в течение 5 минут при температуре 18-25°C. Измеряют оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы при длине волны 570 нм.

Расчет содержания кальция производят по формуле:

A=(E_пр/E_к)×2,5,

где A - содержание кальция в пробе, ммоль/л;

E_пр - оптическая плотность опытной пробы

E_к - оптическая плотность калибровочной пробы

2,5 ммоль/л - концентрация кальция в растворе калибратора.

Рассчитывают коэффициент соотношения содержания в ротовой жидкости меди к уровню кальция. У здоровых детей коэффициент соотношения этих минеральных веществ в ротовой жидкости равен 94-99. В разгар острого герпетического кератита средней степени тяжести коэффициент Cu/Ca меньше 30, а при тяжелом герпетическом стоматите - меньше 10. Лечение острого герпетического стоматита может считаться эффективным при величине коэффициента Cu/Ca выше 45.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Больная С., 1 год 4 мес. Диагноз: Острый герпетический стоматит легкой степени тяжести. После проведенного лечения при выписке содержание в ротовой жидкости меди - 16 мкмоль/л, кальция - 0,44 ммоль/л. Значение коэффициента Cu/Ca равно 36. Проведенное лечение неэффективно, лечение следует продолжать.

Пример 2. Больной Ж., 2 года 4 мес. Диагноз: Острый герпетический стоматит легкой степени тяжести. После проведенного лечения при выписке содержание в ротовой жидкости меди - 11 мкмоль/л, кальция - 0,15 ммоль/л. Значение коэффициента Cu/Ca равно 73. Проведенное лечение следует считать эффективным.

Пример 3. Больной В., 2 года. Диагноз: Острый герпетический стоматит средней степени тяжести. После проведенного лечения при выписке содержание в ротовой жидкости меди - 14 мкмоль/л, кальция - 0,21 ммоль/л. Значение коэффициента Cu/Ca равно 67. Проведенное лечение следует считать эффективным.

Пример 4. Больной О., 2 года. Диагноз: Острый герпетический стоматит средней степени тяжести. После проведенного лечения при выписке содержание в ротовой жидкости меди - 15 мкмоль/л, кальция - 0,34 ммоль/л. Значение коэффициента Cu/Ca равно 44. Проведенное лечение следует считать неэффективным.

Пример 5. Больной Б., 1 год 11 мес. Диагноз: Тяжелый острый герпетический стоматит. После проведенного лечения при выписке содержание меди в ротовой жидкости - 14 мкмоль/л, кальция - 0,78 ммоль/л. Значение коэффициента Cu/Ca равно 18. Проведенное лечение следует считать неэффективным.

Положительный эффект

При воспалении тканей полости рта неинвазивное исследование слюны является альтернативой анализу крови, что особенно актуально в педиатрической практике. Исследуемый параметр - содержание меди и кальция в ротовой жидкости здоровых детей - стабильный показатель. Метаболические процессы ротовой жидкости тесно связаны с обменными процессами слизистой оболочки полости рта. У детей при остром герпетическом стоматите нарушается целостность тканей и происходит цитолиз клеток слизистой оболочки полости рта, а следовательно, увеличивается содержание кальция в ротовой жидкости. Подобные изменения обусловлены морфологической незрелостью гистогематических барьеров, тонким эпителиальным покровом и низкой дифференцировкой структур соединительной ткани слизистой оболочки полости рта у детей младшего возраста. Содержание меди в ротовой жидкости при средней степени тяжести и легкой форме стоматита увеличивается почти в 2-3 раза, тогда как при тяжелом остром герпетическом стоматите достоверно снижается в 1,5-2 раза по сравнению с контролем. После лечения содержание меди при всех формах заболевания достоверно не отличается от контроля, а уровень кальция, в целом, нормализуется только в ротовой жидкости после перенесенного острого герпетического стоматита легкой степени.

Предложенный коэффициент соотношения уровня Cu/Ca ротовой жидкости после лечения острого герпетического стоматита у детей при значении, равном и ниже 45, свидетельствует о неэффективной терапии и дает возможность предположить раннее рецидивирование герпетического стоматита. При значении коэффициента соотношения уровня Cu/Ca ротовой жидкости выше 45 исследуемые биохимические параметры ротовой жидкости детей после лечения острого герпетического стоматита достоверно не отличаются от этих показателей у здоровых детей, что позволяет считать проведенное лечение эффективным.