Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЫСОКОГО ТРОМБОГЕННОГО РИСКА ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ГЕПАРИНОПРОФИЛАКТИКИ

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения высокого тромбогенного риска у женщин во время беременности, нуждающихся в гепаринопрофилактике.

Одной из актуальных проблем современной медицины является риск возникновения тромбозов у женщин во время беременности, в связи с тем, что она сопровождается усилением коагуляционных свойств крови, необходимым для снижения кровопотери в родах. Тем не менее, вынашивание беременности и ближайший (до 6 месяцев) послеродовой период входят в число основных факторов риска венозных тромбоэмболических осложнений (ВТЭО), не связанных с травмой и операцией (Савельев B.C., Чазов Е.И., Гусев Е.И., Кириенко А.И., Акчурин Р.С, Андрияшкин В.В., Арутюнов Г.П., Бицадзе В.О. и др. Российские клинические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике венозных тромбоэмболических осложнений. Флебология. 2010; 4(1):2-37). Для снижения риска венозных тромбоэмболических осложнений во время беременности рекомендуется применение низкомолекулярных гепаринов (НМГ) в профилактических и промежуточных дозах в виде подкожных инъекций. Однако в настоящее время решение о назначении НМГ беременным женщинам принимается лишь на основании наличия тромботического анамнеза или при выявлении той или иной тромбофилии (мутации фактор V Лейден, мутации протромбина, дефицита антитромбина, носительства антифосфолипидных антител и др.). Эти показания для назначения НМГ субъективны, поскольку они не основываются на точных лабораторных данных измерения избыточной (тромбоопасной) активации свертывания крови в разные сроки беременности. Соответственно, использование этих показаний приводит к неоправданно широкому применению гепаринов во время беременности. В то же время имеются рекомендации, обосновывающие назначение инъекционных форм гепаринов увеличением в крови маркеров тромбинемии - растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК), D-димеров, тромбин-антитромбинового комплекса и ряда других (Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. - М: Ньюдиамед, издание 3-е. - 292 с.).

Известен способ выбора применения гепарина для профилактики тромботических осложнений (Патент №2408288 от 10.01.2011), заключающийся в определении выбора применения гепарина для профилактики тромботических осложнений. В основе его лежит определение уровня РФМК в плазме крови по ортофенантролиновому тесту.

Недостатком известного способа является низкая информативность из-за отсутствия диапазона его допустимых значений для разных сроков беременности, что затрудняет интерпретацию полученных результатов с позиции «норма» или «патология». Кроме того, методика определения РФМК по ортофенантролиновому тесту выполняется мануально, она не стандартизована и не имеет адаптации для воспроизведения на современных приборах, использующихся для лабораторного исследования системы гемостаза.

Наиболее близким по достигаемому техническому результату является способ определения высокого тромбогенного риска на основе оценки количественного содержания D-димеров - продуктов растворения стабилизированного фибрина (Гильманов А.Ж. D-димер: что? Как? У кого? С какой целью? Клинико-лабораторный консилиум. 2009; 6(31):38-46).

Уровень этого маркера тромбогенного риска при беременности значительно повышается, а именно в 3-4 раза к конце беременности, по сравнению с его значениями у не беременных женщин (Момот А.П., Цывкина Л.П., Тараненко И.А. и др. Современные методы распознавания состояния тромботической готовности: монография. Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2011. - 138 с.).

D-димеры определяются иммунохимическими методами с использованием ряда моноклональных антител к этому белку, а оценка их количества может производиться в плазме крови, в цельной крови или в сыворотке с помощью различных методических подходов.

Недостатком известного способа является низкая информативность вследствие несопоставимости результатов различных методов определения уровня D-димеров в одних и тех же образцах плазмы крови и отсутствие рекомендаций диапазонам его допустимых значений для разных сроков беременности при использовании тест-систем различных производителей.

Авторы предлагают способ определения высокого тромбогенного риска при беременности для проведения гепаринопрофилактики, позволяющий уменьшить частоту возникновения тромбоэмболических осложнений и улучшить исходы беременности.

Техническим результатом заявляемого способа является повышение информативности для выделения женщин с высоким тромбогенным риском на разных сроках беременности.

Технический результат достигается тем, что осуществляют определение пиковой концентрации тромбина (ПКТ) и эндогенного тромбинового потенциала в тесте генерации тромбина и при увеличении одного из показателей свыше 367,9 нмоль/л и 2164,5 нмоль/мин на 6-8 неделе беременности; 444,8 нмоль/л и 2444,1 нмоль/мин на 12-13 неделе беременности; 479,7 нмоль/л и 3072,3 нмоль/мин на 22-24 неделе беременности; 488,1 нмоль/л и 2849,6 нмоль/мин на 34-36 неделе беременности проводят гепаринопрофилактику.

Способ осуществляют следующим образом.

Информативность заявляемого способа представлена фигурами 1, 2 в виде таблиц.

На фиг.1 представлены допустимые диапазоны пиковой концентрации тромбина (ПКТ) и эндогенного тромбинового потенциала (ЭТП) в тесте генерации тромбина на разных сроках беременности.

На фиг.2 дана оценка результатов проведенной гепаринопрофилактики у женщин с высоким тромбогенным риском во время беременности по показателям теста генерации тромбина.

Взятие венозной крови осуществляют из локтевой вены в пробирки VACUETTE с буферным раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 (9NC Coagulation sodium citrate 3,2%). Стабилизированную кровь до центрифугирования (в том числе и в процессе транспортировки) хранят при комнатной температуре (+18…+25°) не более 1 ч. Стабилизированную кровь центрифугируют на центрифуге, например «Eppendorf 581R», Германия, при 1000 об/мин (140-160 g) в течение 5-7 мин. Богатую тромбоцитами плазму с помощью пипетки переносят в другую пробирку, в которой ее дополнительно центрифугируют при 3000-4000 об/мин (1200-1400 g) в течение 15 мин, в результате получают бедную тромбоцитами плазму (БТП).

Материал для исследования и реактивы.

БТП замораживают при температуре минус 40°-70°C на срок от 1 суток. Размораживают плазму на водяной бане при +37°C, после чего проводят исследование.

Исследование плазмы крови выполняют на планшетном флюориметре Fluoroskan Ascent «ThermoFisher SCIENTIFIC)) (Финляндия), оснащенном диспенсером, с программным обеспечением «Thrombinoscope 3.0.0.26». В лунки 96-луночного планшета добавляют 20 мкл тканевого фактора (5 pM), 20 мкл калибратора тромбина и 80 мкл исследуемой плазмы крови. Затем смесь инкубируют 10 мин. После инкубации смеси при температуре +37°C в лунки вносят 1000 мкл буфера, содержащий ионизированный кальций и флуорогенный субстрат. Образующийся тромбин расщепляет субстрат, в результате чего высвобождается флуорофор. Его излучение автоматически регистрируется через равные промежутки времени, причем интенсивность свечения пропорциональна концентрации образовавшегося тромбина. По данной кривой автоматически рассчитывается пик тромбина (пиковая концентрация тромбина, нмоль/л) - максимальная концентрация тромбина в единицу времени и эндогенный тромбиновый потенциал (нмоль/мин).

Апробация заявляемого способа включала в себя 2 этапа.

На первом этапе у 250 женщин определяли динамику тромбогенности по концентрации пика тромбина и эндогенному тромбиновому потенциалу. Обследование проводилось по следующим контрольным точкам: прегравидарный период (вне беременности) - 54 женщины (средний возраст (±SD) - 25,85 (±4,03)), 6-8 недель - 54 женщины (средний возраст (±SD) - 27,02 (±4,44)), 12-13 недель - 43 женщины (средний возраст (±SD) - 27,21 (±3,76)), 22-24 недели - 59 женщин (средний возраст (±SD) - 26,64 (±3,69)) и 34-36 недели беременности - 40 женщин (средний возраст (±SD) - 27,20 (±4,44)). Проводилось исследование крови фенотипически здоровых женщин, но исключались случаи с отягощенным личным и семейным тромботическим и/или геморрагическим анамнезом, ожирением 2-3 степени, наличием острых воспалительных заболеваний, артериальной гипертензией 2-3 степени, проявлениями мезенхимальной дисплазии, печеночной и почечной патологией, носительством мутации фактор V Лейден (1961 G>A) и мутации протромбина (20210 G>A). Не допускалось наличие суррогатного материнства, приема комбинированных оральных контрацептивов до гестационного периода, отягощенного акушерского анамнеза, эндометриоза, эндометрита, сальпингоофорита, апоплексии яичника или бесплодия в анамнезе. К текущей беременности предъявлялись следующие требования: одноплодная беременность, отсутствие признаков отслойки плаценты, первичной фетоплацентарной недостаточности, преэклампсии 2-3 степени тяжести и гестационной гликемии.

Результаты первого этапа позволили определить референтные интервалы для пиковой концентрации тромбина (ПКТ) и эндогенного тромбинового потенциала (ЭТП) у женщин вне беременности и на разных сроках физиологически протекающей беременности (фиг.1).

На втором этапе были отобраны 17 беременных пациенток с высоким тромбогенным риском (средний возраст (±SD) - 32,1±3,9), у которых на сроке 6-8 недель было выявлено повышение показателей теста генерации тромбина. У 5 из них превышала норму только ПКТ (верхний предел значений до 367,9 нмоль/л), у 4 пациенток был повышен только ЕТП (верхний предел значений до 2164,5 нмоль/мин), у 8 женщин отмечалось повышение ПКТ и ЕТП. Апробация заявляемого способа проведена на этих 17 пациентках, которым в связи с повышением ПКТ и/или ЕТП было проведено профилактическое лечение низкомолекулярным гепарином (фраксипарин по 0,3 мл 2 раза в день подкожно в течение 14 дней). После проведенной гепаринопрофилактики на 12-13 неделе беременности у 14 женщин (82%) наблюдалась нормализация показателей теста генерации тромбина. У 3 (18%) пациенток уровень ПКТ и ЕТП уменьшились, но были выше верхней границы нормы для данного срока беременности (верхний предел значений ПКТ до 444,8 нмоль/л, ЕТП до 2444,1 нмоль/мин), в результате чего было продолжено лечение фраксипарином по 0,3 мл два раза в сутки в течение двух недель (фиг.2). На сроке 22-24 недели показатели теста генерации тромбина у этих трех пациенток соответствовали норме (верхний предел значений ПКТ до 479,7 нмоль/л, ЕТП до 3072,3 нмоль/мин).

Клинический пример

Пациентка Ч.Н., 35 лет, обратилась 02.07.2013 г. в лабораторию патологии гемостаза КГБУЗ «Краевая клиническая больница» по поводу угрозы прерывания беременности на сроке 6-7 недель. Для исследования системы гемостаза оценивались показатели теста генерации тромбина. Обследование проводилось в динамике, в образцах плазмы крови, полученных на 6-7, 12-13, 22-23 и 34 неделях беременности. Анализы выполнялись на планшетном флюориметре Fluoroskan Ascent «ThermoFisher SCIENTIFIC)).

На 6-7 неделе беременности пиковая концентрация тромбина у женщины составила 521,9 нмоль/л (верхний предел значений до 367,9 нмоль/л), эндогенный тромбиновый потенциал - 2513,5 нмоль/мин (верхний предел значений до 2164,5 нмоль/мин). С учетом полученных данных пациентке был назначен курс лечения фраксипарином по 0,3 мл ×2 раза в день в течение двух недель.

На 12-13 недели беременности показатель ПКТ составил 421,6 нмоль/л (верхний предел значений до 444,84 нмоль/л), ЭТП был равен 1939,5 нмоль/мин (верхний предел значений до 2444,1 нмоль/мин), что не требовало дальнейшего лечения низкомолекулярным гепарином.

На 22-23/34-35 неделях беременности показатели теста генерации тромбина также соответствовали пределам нормальных колебаний: ПКТ - 435,3/428,4 нмоль/л (верхний предел значений до 479,7/488,06 нмоль/л), ЭПТ - 2270,5/2648,0 нмоль/мин (верхний предел значений до 3072,3/2849,6 нмоль/мин), что сопровождалось отсутствием осложнений беременности и успешным ее завершением.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что предложенный способ выявления высокого тромбогенного риска на разных сроках беременности, определяемый по уровню пика тромбина и эндогенному тромбиновому потенциалу в тесте генерации тромбина показал, что при ПКТ свыше 367,91 нмоль/л на 6-8 неделях; 444,84 нмоль/л на 12-13 неделях; 479,74 нмоль/л на 22-24 неделях и 488,06 нмоль/л на 34-36 неделях беременности и/или ЭТП более 2164,53 нмоль/мин на 6-8 неделях; 2444,15 нмоль/мин на 12-13 неделях; 3072,34 нмоль/мин на 22-24 неделях и 2849,63 нмоль/мин на 34-36 неделях беременности необходимо проведение гепаринопрофилактики для снижения частоты тромбоэмболических осложнений во время беременности.

Заявляемый способ позволяет выявлять женщин с высоким тромбогенным риском и на основе объективных данных решать вопрос о необходимости проведения гепаринопрофилактики на разных сроках беременности и найдет широкое применение в практическом здравоохранении.