СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКОЙ АУТОИММУНИЗАЦИИ ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ГЛАЗ

Изобретение относится к офтальмологии и может быть использовано для прогнозирования органоспецифической аутоиммунизации при воспалительных заболеваниях глаз.

Исследование нарушений органоспецифического аутоиммунитета имеет важное практическое значение при заболеваниях глаз различной природы, включая как собственно аутоиммунные формы, так и посттравматические, инфекционные процессы [Слепова О.С. Органоспецифический аутоиммунитет при воспалительной патологии сетчатки и увеального тракта // Дисс.…докт. биол. наук, 1991, с.121-179]. Известно, что при таких классических проявлениях аутоиммунной офтальмопатологии, как экспериментальный аутоиммунный увеит и симпатическая офтальмия, а также при развитии реакции отторжения кератотрансплантата, ведущая роль принадлежит клеточному иммунному ответу на аутоантигены глаза [Chan С.С., Mochizuki М., Nussenblatt R.B. et al. T-lymphocyte subsets in experimental autoimmune uveitis // Clin. Immunol. Immunopathol. 1985. Vol. 35. N1. P.103-110; Chan C.C., Li Q Immunopathology of uveitis // Br. J. Ophthal. 1998. P. 91-96; Bycker M.D., Adamus G., Rosenbaum J.T. The role of T-cells in autoimmune uveitis // Ocul. Immunol. Inflam., 2000. V.8, N2, P.93-100; Архипова Л.Т. Симпатическая офтальмия. M., 2006, с.84-122]. Патогенетическое значение гуморального иммунного ответа не столь очевидно: органоспецифические аутоантитела, как правило, накапливаются значительно позже или не обнаруживаются [Илуридзе С.Л. Значение реакций клеточного и гуморального иммунитета при кератопластике в клинике // Дисс.…канд. мед. наук, М., 1981, с.31-35, 38-52; Слепова О.С., Макаров П.В., Катаргина Л.А., Денисова Е.В., Круглова Т.Е., Куликова И.Г., Петровская М.С., Грачева В.В., Илуридзе С.Л. Иммунологические тесты при аутоиммунных заболеваниях глаз // Материалы конференции «Аллергология и клиническая иммунология-практическому здравоохранению», М., 2010, с.39-41].

В настоящее время для выявления (in vitro) клеточного иммунного ответа на различные антигены, в частности антигены тканей глаза, в лабораторной практике успешно применяется реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) [Кожушный А.П. Разработка экспресс-тестов для оценки ранних реакций клеточного иммунитета. Дисс.…канд. биол. наук, М., 2010, с.56-63; Куликова И.Г., Слепова О.С., Илуридзе С.Л. Модификация тестов, направленных на выявление аутоиммунных реакций при заболеваниях глаз // РОЖ, 2013, т.6, №1, с.69-72; Суслов А.П., Головин В.П., Скворцов В.Т, Коронцвит Т.А. Скрининговый тест клеточной миграции (СТКМ) из микрокультур in vitro // Иммунология, 1989, №2, с.73-76; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. М.: ГЕОТАР-Медиа, 2009, с.150-157, 158-191]. Различные модификации этой реакции используются как в эксперименте, так и в клинике, с целью подтверждения аутоиммунной природы офтальмопатологии или выявления «аутоиммунного компонента» при заболеваниях глаз другой этиологии [Куликова И.Г., Слепова О.С., Илуридзе С.Л. Совершенствование методов диагностики аутоиммунных реакций при заболеваниях глаз // Материалы конференции IV РООФ, 2011, т.2, с.319-322]. Однако РТМЛ имеет целый ряд ограничений. Прежде всего, отсутствие стандартных, коммерческих диагностикумов: необходимые антигенные препараты готовятся непосредственно в лаборатории, как правило, из тканей глаз крупного рогатого скота (гомология с тканями человеческого глаза - порядка 80-90%), что сопряжено с определенными организационными трудностями и высокими трудозатратами. Кроме того, данный тест является подтверждающим и не позволяет прогнозировать органоспецифическую аутоиммунизацию.

Вместе с тем, показано, что «аутоиммунный компонент» может стать важнейшим патогенетическим звеном воспалительных заболеваний глаз, пусковым фактором которых явились вирусы или другие микробы [Слепова О.С. Реакция бласттрансформации лимфоцитов и торможения миграции лейкоцитов в патогенезе и дифференциальной диагностике герпетической болезни глаз. Дисс.…канд. биол. наук, 1980, с.41-43, 61-68; Ковалева Л.А., Слепова О.С., Куликова И.Г., Миронкова Е.А. Роль аутоиммунного компонента при центральных язвах роговицы // РОЖ, 2013, т.6, №2, с.29-31]. При этом развитие аутоиммунных реакций может происходить постепенно, в разные сроки после воздействия пусковых факторов (вирус, травма и т.д.) и начала заболевания.

Своевременное прогнозирование аутоиммунизации имеет важное значение в связи с необходимостью коррекции лечебной тактики.

Ближайшим аналогом предлагаемого способа является способ прогнозирования органоспецифической аутоиммунизации при воспалительных заболеваниях глаз, основанный на исследовании основных иммунорегуляторных субпопуляций Т-клеток крови (хелперов и цитотоксических лимфоцитов). Показано, что усиление системного клеточного иммунного ответа на антигены тканей глаза ассоциируется с повышением иммунорегуляторного индекса (ИРИ) (CD4+/CD8+) за счет уменьшения субпопуляции CD3+CD4-CD8+, особенно при сохранении субпопуляции CD3+CD4+CD8- (Куликова И.Г., Слепова О.С., Миронкова Е.А., Макаров П.В., Кугушева А.Э., Ковалева Л.А. Роль (суб)популяционного дисбаланса лимфоцитов крови в развитии системной органоспецифической сенсибилизации при воспалительной и посттравматической патологии глаз [РОЖ, 2013, т.6, №4, с.71-75]. Однако этот способ ориентирован на выявление выраженных нарушений в общей системе иммунорегуляции, на уровне всего организма (тест-проба - кровь), тогда как предлагаемый способ максимально ориентирован на локальные иммунологические сдвиги - на уровне глаза как шокового органа (тест-проба - влага передней камеры глаза), что имеет важное значение при прогнозировании органоспецифической аутоиммунизации.

Задачей предлагаемого способа является прогнозирование органоспецифической аутоиммунизации при воспалительных заболеваниях глаз, что важно для своевременного определения или коррекции лечебной тактики.

Техническим результатом способа является раннее выявление аутоиммунного компонента (или процесса) при воспалительных заболеваниях глаз с повышением точности диагностики и выбора адекватной тактики лечения.

Технический результат достигается за счет определения во влаге передней камеры (ВПК) глаза уровня трансформирующего ростового фактора бета (Transforming growth factor betal TGFβ1).

Согласно современным представлениям, развитие системного иммунного ответа на антигены тканей глаза сопряжено с нарушением иммунной привилегированности глаза и нормального состояния органоспецифического аутоиммунитета. Одним из ключевых звеньев, обеспечивающих иммунную привилегированность органа зрения, является, как известно, феномен «иммунного отклонения, связанный с передней камерой глаза» (ИОПК или ACAID - anterior chamber associated immune deviation), который проявляется при попадании растворимых антигенов в переднюю камеру глаза [Stein-Streilein J., Streilein J.W. Anterior chamber associated immune deviation (ACAID): regulation, biological relevance, and implications for therapy // Int. Rev. Immunol. 2002. 21: 123-52; Kitaichi N., Namba K., Taylor A.W. Inducible immune regulation following autoimmune disease in the immune-privileged eye // J. Leukoc. Biol. 2005. 77: 496-502; Dart D.A., Dana R., D′Amore P., Niederkorn J.Y. Immunology, inflammation and diseases of the eye. Academic Press. 2013. P. 50-57, 38-42]. Реализация ИОПК (путем цепи сигнальных «цитокиновых» эффектов, проходящих через фильтрующую зону трабекулы и достигающих селезенки) приводит к селективной антиген-специфической супрессии системного Th1-клеточного иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа (ГЧЗТ).

Результаты фундаментальных экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что в норме ИОПК обеспечивается целым комплексом «пассивных» (морфоструктурных) и «активных» (растворимых) факторов, среди которых важнейшую роль играют вещества, присутствующие во влаге передней камеры и обладающие «иммуносупрессивными» свойствами, в частности - TGFβ [Sugita S., Horie S., Nakamura O., Futagami Y., Takase H., Keino H., Aburatani H., Katunuma N., Ishidoh K., Yamamoto Y., Mochizuki M. Retinal pigment epithelium-derived CTLA-2alpha induces TGFbeta-producing T regulatory cells // J. Immunol. 2008. 181: 7525-36; Horie S., Sugita S., Futagami Y., Kawaguchi Т., Kamoi K., Shirato S., Mochizuki M. Human iris pigment epithelium suppresses activation of bystander T cells via TGFbeta-TGFbeta receptor interaction // Exp Eye Res. 2009. 88: 1033-42; Denniston A.K., Kottoor S.H., Khan I., Oswal K., Williams G.P., Abbott J., Wallace G.R., Salmon M., Rauz S., Murray P.I., Curnow S.J. Endogenous cortisol and TGF-beta in human aqueous humor contribute to ocular immune privilege by regulating dendritic cell function // J Immunol. 2011. 186 (1): 305-11].

Трансформирующий ростовой фактор бета (Transforming growth factor beta) принадлежит к семейству димерных полипептидов с молекулярной массой 25 кДа, и представлен следующими изоформами TGF-β (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3). Все эти три фактора роста секретируются большей частью типов клеток организма обычно в неактивной форме и требуют активирующих стимулов (антигены, стрессы и др.) для проявления биологической активности (Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакций воспаления и иммунитета // Иммунология. 1995. Т.3. С.30-44).

TGF-β является цитокином, обладающим супрессорным влиянием на динамику иммунного ответа, противовоспалительным эффектом, защищающим организм от избыточной продукции макрофагами и другими клетками воспаления цитотоксических соединений. Однако конечный эффект TGF-β зависит от типа клетки-мишени, стадии ее дифференцировки, состояния внеклеточного матрикса, концентрации других цитокинов. Двойственный эффект TGF-β обусловлен тем, что он действует как на покоящиеся, так и на активированные клетки. Покоящиеся, незрелые клетки TGF-β стимулирует, в то время как та же самая популяция клеток, но активированных, им угнетается. Некоторые авторы утверждают, что локально TGF-β усиливает воспаление, в то время как системно - ингибирует его [Wahl S.M. Transforming growth factor: the good, the bad and the ugly // J. of experim. medicine. 1994. V.180. N7. P.1587-90]. Возможно, этот эффект обусловлен влиянием на эндотелиальные клетки, на которых он, ингибируя экспрессию Е-селектина, блокирует адгезию лейкоцитов и их проникновение в очаг воспаления.

Таким образом, эффект TGF-β может быть как провоспалительным, так и противовоспалительным, иммуносупрессивным. Последний, как правило, превалирует, что является важным фактором в защите организма от избыточной продукции клетками воспаления цитотоксических соединений.

Мы исходили из предположения, что уменьшение концентрации TGFβ1 во влаге передней камеры (ВПК) у пациентов с воспалительными заболеваниями глаз может явиться предпосылкой развития системного клеточного иммунного ответа на антигены тканей глаза, свидетельствующего об органоспецифической аутоиммунизации.

Патогенетическим обоснованием предлагаемого способа послужили данные, полученные при изучении связи между концентрацией различных цитокинов во влаге передней камеры глаза (ВПК) и развития системного клеточного иммунного ответа на антигены тканей глаза, рассматриваемого в аспекте нарушения феномена ИОПК. Исследования проводились параллельно с помощью мультиплексного анализа цитокинов (использовался проточный питометр) и РТМЛ. Обследовано 23 пациента с различными формами воспалительной офтальмопатологии (увеиты - 18, кератоувеиты - 3, постувеальная глаукома - 2).

Всем 23 пациентам были проведены хирургические вмешательства на глазах (экстракция катаракты - 21 или антиглаукомная операция - 2), во время которых производили забор влаги передней камеры глаза (ВПК). Непосредственно перед операцией проводили забор крови из локтевой вены в стерильные пробирки Vacuette с EDTA.

Во ВПК определяли одновременно содержание 16 цитокинов различного биологического действия: интерлейкины (IL1β, IL2, IL4, IL5, IL6, IL8, IL10, IL12, IL17, IL18), факторы некроза опухоли (TNFα, TNFβ), интерфероны (IFNα, IFNγ), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF-A); трансформирующий фактор роста (TGFβ1). Исследование проводили с помощью мультиплексного анализа на проточном цитофлуорометре FACS Canto II («Bector Dickinson», США) в программе BD FACS Diva с использованием наборов CBA (Th1/Th2 Cytokines Multiplex Kit, BD Biosciences, США); обработка данных - в программе FCAP Array (SoftFlow, США).

Системный иммунный ответ на антигены тканей глаза (роговица, хрусталик, увеальная ткань, S-антиген сетчатки) оценивали с помощью РТМЛ в 96-луночных микропланшетах. Количественный учет результатов РТМЛ производили на инвертированном микроскопе и оценивали по индексу миграции (ИМ) - соотношение площадей миграции лейкоцитов в опыте (реакция с антигеном) и контроле (среда RPMI 1640 «Sigma» без антигена). При оценке результатов за норму принимали интервал ИМ от 0,80 до 1,20. Показатели ниже 0,80 и выше 1,20 считали положительной реакцией, отражавшей системный клеточный иммунный ответ на органоспецифические антигены глаза.

Статистическую обработку результатов проводили в программе «BIOSTATD» (t-критерий Стьюдента, критерий Фишера). Показатель статистической значимости: р<0,05.

Мультиплексный анализ показал, что из 16 исследованных цитокинов в ВПК обнаруживались всего 10, с разной частотой: от 13-27% (IL2, IL10, TNFα, IFNγ) до 46-77% (IL1β, IL6, IL8, IL18,VEGF-A) и 100% (TGFβ1); практически отсутствовали IL4, IL5, IL12, IL17 и TNFβ, а уровни IFNα не превышали чувствительности теста.

Для выявления возможной связи между количественным содержанием какого-либо из цитокинов, присутствующих во ВПК больных глаз, и признаками системной органоспецифической аутосенсибилизации больные были разделены на две группы в зависимости от результатов РТМЛ: I группа (7 чел.) - положительный ответ хотя бы на один тканевой антиген; II группа (16 чел.) - отсутствие ответа на все антигены.

Наиболее существенные, статистически подтвержденные различия были выявлены при исследовании TGFβ1. Содержание его во ВПК «сенсибилизированных» больных (I группа) оказалось значительно ниже, чем у «несенсибилизированных» (II группа), что подтверждалось сравнением средних групповых уровней (1366±290 и 2134±179 пг/мл, соответственно, р=0,031) и результатами индивидуального анализа (Табл. 1. Содержание TGFβ1 во ВПК у «сенсибилизированных» и «несенсибилизированных» антигенами тканей глаза больных). Последний показал, что при уровнях TGFβ1 во ВПК ниже 1000 пг/мл «положительная» РТМЛ выявлялась достоверно чаще (5 из 8 случаев; 62,2%), чем при более высокой концентрации TGFβ1 - от 1010 до 3225 пг/мл (2 из 15 случаев; 13,3%; р=0,026).

Таким образом, результаты проведенного клинико-иммунологического исследования выявили связь между падением ниже определенного уровня концентрации TGFβ1 (важнейшего иммунорегуляторного медиатора) во ВПК и развитием клеточного иммунного ответа на антигены тканей глаза, свидетельствующим о системной органоспецифической аутосенсибилизации. Выявленные конкретные, количественные показатели сдвигов в локальном цитокиновом статусе - снижение концентрации TGFβ1, могут служить критериями раннего прогнозирования (или подтверждения) нарушений аутоиммунитета, что важно для клинической практики, в частности - для определения тактики лечения.

Способ осуществляют следующим образом. Забирают пробу ВПК и определяют в ней содержание TGFβ1. В случаях, когда концентрация его составляет менее 1000 пг/мл, прогнозируют развитие органоспецифической аутосенсибилизации.

Клинические примеры.

Пример 1. Больной Е., 13 лет поступил в отделение патологии глаз у детей МНИИ ГБ им. Гельмгольца с диагнозом: увеит передний обоих глаз неясной этиологии вялотекущий, частичная осложненная катаракта.

При поступлении в обоих глазах: умеренная инъекция конъюнктивы глазного яблока, дистрофия роговицы у лимба, небольшая «запотелость» эндотелия роговицы и сероватые преципитаты в нижнем отделе, передняя камера средней глубины, клетки 1,0+, радужка субатрофичная, зрачок округлый, круговые задние синехии, прехрусталиковая фиброзная пленка, помутнение вещества и задней капсулы хрусталика, глубжележащие структуры не просматриваются.

При сборе анамнеза установлено, что ребенок болен в течение 9 лет, а на протяжении последних 3 лет увеит носил непрерывно рецидивирующий характер, на фоне чего отмечалось прогрессирование катаракты.

Пациенту проведен курс противовоспалительной терапии и после купирования активности увеита сделана операция на левом глазу - удаление катаракты с имплантацией интраокулярной линзы. Во время операции произведен забор ВПК. Непосредственно перед операцией взята кровь из локтевой вены.

При исследовании ВПК левого глаза выявлен уровень TGFβ1=934 пг/мл.

Результаты РТМЛ с антигенами роговицы ИМ=0,80; хрусталика ИМ=1,60; увеа ИМ=1,29.

Данный пример показывает, что низкий уровень TGFβ1 во ВПК увеального глаза сочетался с выраженным системным ответом тканевые антигены глаза, что свидетельствует о наличии органоспецифической аутосенсибилизации. Пациенту была назначена системная иммуносупрессивная терапия циклоспорином и на протяжении последующих 9 мес (срок наблюдения) обострений увеита выявлено не было.

Пример 2. Больной Г., 16 лет. Поступил в отделение патологии глаз у детей МНИИ ГБ им. Гельмгольца с диагнозом: увеит периферический обоих глаз неясной этиологии, ремиссия, частичная осложненная катаракта, вторичная оперированная компенсированная глаукома. Ремиссия увеита в течение 1 года.

При поступлении оба глаза спокойные, передний отрезок без патологии - помутнение в веществе и под задней капсулой хрусталика, полуфиксированные помутнения и старые клетки в стекловидном теле, глазное дно за флером из-за помутнения сред, диск зрительного нерва не изменен, видимая периферия - без патологии.

Проведена операция на левом глазу - удаление катаракты с имплантацией интраокулярной линзы. Во время операции произведен забор ВПК. Непосредственно перед операцией взята кровь из локтевой вены.

При исследовании ВПК OS выявлен уровень TGFβ1=1815 пг/мл.

Результаты РТМЛ с антигенами: хрусталика ИМ=1,19; увеа ИМ=0,96.

Данный пример показывает, что при относительно «умеренном» уровне TGFβ1 во ВПК признаков системной органоспецифической аутосенсибилизации антигенами пораженных структур глаза не выявлено, чему сопутствовала стойкая ремиссия воспалительного процесса.

Пример 3. Больной К., 7 лет поступил в отделение патологии глаз у детей МНИИ ГБ им. Гельмгольца с диагнозом: увеит передний ревматоидный обоих глаз субактивный, частичная осложненная катаракта.

При поступлении: оба глаза спокойные, дистрофия роговицы у лимба на 3 и 9 ч, небольшая «запотелость» эндотелия, влага передней камеры прозрачная, радужка спокойная, круговые задние синехии, прехрусталиковая фиброзная пленка, помутнение вещества и задней капсулы хрусталика, глубжележащие структуры не просматриваются.

В течение 5 лет получает системную терапию метипредом и метотрексатом и инсталляции кортикостероидов. Выраженных обострений увеита зарегистрировано не было.

Проведена операция на левом глазу - удаление катаракты с имплантацией интраокулярной линзы. Во время операции произведен забор ВПК. Непосредственно перед операцией взята кровь из локтевой вены.

При исследовании ВПК левого глаза выявлен уровень TGFβ1=2753 пг/мл.

Результаты РТМЛ с антигенами: хрусталика ИМ=1,14; увеа ИМ=0,86; сетчатка ИМ=1,0.

Данный пример показывает, что при относительно «высоком» уровне TGFβ1 во ВПК признаков системной органоспецифической аутосенсибилизации антигенами пораженных структур глаза не выявлено, что ассоциировалось с минимальной активностью увеита на фоне проводимой системной и местной иммуносупрессивной терапии.

Таким образом, способ позволяет прогнозировать нарушение состояния органоспецифического аутоиммунитета и является индикатором развития аутоиммунного компонента (или процесса) при воспалительных заболеваниях глаз. Это способствует обеспечению точности диагностики, своевременному выбору патогенетически ориентированной терапии и повышению эффективности лечения.