Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ КОНЕЧНОСТИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Изобретение относится к медицине, а именно к сосудистой хирургии, и может быть использовано при лечении хронических облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей.

Наиболее близким к заявленному решению является способ имплантации аутологичных костномозговых клеток, заключающийся во введении в точки, расположенные на ишемической мышце бедра пораженной конечности (Takafumi Ueno, Toyoaki Murohara, Keith Allen Robinson et all. ″Therapeutic angiogenesis by bone marrow-derived cell transplantation in myocardial ischemic tissue and skeletal muscle ischemic tissue″, US 7799349 B2). В известной методике костномозговые клетки приготовлены с удалением эритроцитов. Результаты исследования после проведенной процедуры имплантации костномозговых клеток показали, что ангиогенез был индуцирован в ишемизированной мышце бедра. Лазерный допплер показал возрастание кровотока. Однако данный метод все-таки не обеспечивает достаточной эффективности лечения, так как костномозговые клетки имплантируются в пораженную мышцу бедра инфильтрационно из шести различных точек, что без достаточного коллатерального кровотока на уровне бедренной и подколенной артерий не нивелирует экспериментальную ишемию конечности, но даже усугубляет ее за счет повышения внутритканевого давления.

Техническим результатом изобретения является повышение эффективности лечения экспериментальной ишемии конечности за счет стимуляции развития коллатерального кровотока в ишемизированной конечности и улучшение таким образом артериального притока крови из проксимальных отделов конечности в дистальные.

Технический результат достигается тем, что на фоне моделирования ишемии конечности в эксперименте у крысы-самца породы Вистар путем иссечения магистрального сосуда, включающего бедренную артерию, подколенную артерию и начальные отделы артерий голени под наркозом хлоралгидратом в дозе 250-300 мг/кг проводится коррекция патологии введением мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга 4×10⁶ клеток в объеме 200 мкл в ишемизированную конечность из двух точек, в каждую из которых по 100 мкл: 1) забрюшинно непосредственно под паховую связку в ее средней трети паравазально в зону анатомического расположения коллатералей внутренней подвздошной артерии и ее ветвей; 2) интрамускулярно в икроножную мышцу переднелатеральной поверхности средней трети голени. Это приводит к выраженной коррекции нарушений микроциркуляции в ишемизированной конечности, что подтверждается методом лазерной допплеровской флоуметрии.

Способ осуществляется следующим образом.

Опыты проводят на 100 крысах-самцах линии Вистар массой тела 300-350 г. Животные были разделены на две серии: контрольную и опытную. В контрольную серию было включено 40 крыс, которые были разделены на четыре группы, в каждую из групп вошло по 10 животных, в том числе интактную группу составили 10 крыс, у которых оценен нормальный уровень микроциркуляции. Опытная серия была разделена на 2 группы по 30 животных в каждой. 1 группу составили крысы, которым мононуклеары костного мозга имплантировали в пораженную мышцу бедра инфильтрационно из шести различных точек, как представлено в известном способе. 2 группу составили животные, которым мононуклеары костного мозга имплантировали в пораженную ишемизированную конечность из двух точек: забрюшинно непосредственно под паховую связку в ее средней трети паравазально в зону анатомического расположения коллатералей внутренней подвздошной артерии и ее ветвей и интрамускулярно в икроножную мышцу переднелатеральной поверхности средней трети голени Каждую из групп опытной серии разделили на 3 подгруппы по 10 крыс в каждой.

У животных обеих серий изучали динамику уровня микроциркуляции в ишемизированной конечности без и на фоне лечения экспериментальной ишемии мононуклеарами костного мозга на сроках 10, 21 и 28 сутки. Хроническую ишемию задней конечности моделировали по методике М. Sugano et al. (2004), S. Takeshita et al. (1998) путем иссечения магистрального сосуда, включающего бедренную артерию, подколенную артерию и начальные отделы артерий голени.

Оценка уровня микроциркуляции в мышцах бедра и голени крыс выполнялась методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ). Исследование осуществляли при помощи аппарата - лазер-допплеровского флоуметра «Biopac-systems MP-100» и датчика «TSD-144». Запись и обработка данных производилась при помощи программы AcqKnowledge 38. Исследование выполняли под наркозом хлоралгидратом в дозе 250-300 мг/кг, который вводили внутрибрюшинно в виде водного раствора. После наступления наркотического сна иссекали участок кожи на переднелатеральной поверхности правого бедра и голени задней конечности. Животное укладывали на противоположную сторону. Датчик вплотную приставляли к мышце бедра, затем голени и проводили флоуметрию. Уровень микроциркуляции регистрировали в пяти точках: 1) середина длины мышцы; точки на 3-4 мм 2) выше, 3) ниже, 4) латеральнее и 5) медиальнее от первой (патент №2353977 от 27.04.2009). Запись кривой уровня микроциркуляции проводили в течение 30 сек в каждой точке. Из полученных пяти значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в мышцах бедра и голени у данного животного. Из 10 полученных значений выводили среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в данной группе животных на данном сроке исследования.

У животных контрольной серии первой группы - интактных - оценивали уровень микроциркуляции в мышцах бедра и голени правой задней конечности методом ЛДФ. Полученные средние значения уровня микроциркуляции в этой группе животных были приняты за «норму» и составили 588,74±19,28 п.е. (перфузионных единиц) в мышце бедра и 535,22±17,53 п.е. в мышце голени.

Животные контрольной серии лечения не получали. У крыс опытной серии лечение начинали на седьмые сутки после операции. Для этого, непосредственно перед введением, суспензию костного мозга выделяли из бедренных костей животных следующим образом. У крысы, перенесшей операцию моделирования ишемии правой задней конечности, под наркозом хлоралгидратом в дозе 250-300 мг/кг, на противоположной конечности пальпировали бедренно-большеберцовый сустав, образованный латеральными и медиальными мыщелками бедренной и большеберцовой костей, фиксировали его одной рукой в положении флексии, а другой брали иглу диаметром 20G, соединенную со шприцем, содержащим 2500 Ед гепарина, разбавленного с 0,9% раствором NaCl в соотношении 1:1 в объеме 1 мл, и после санации 70% этиловым спиртом перкутанно через хрящевые суставные мениски под надколенником осуществляли пункцию костномозговой полости. Костный мозг аспирировался в шприц путем поступательных движений иглы в полости вперед и назад в объеме от 1 до 1,5 мл. Затем мононуклеарную фракцию костного мозга выделяли по методу Boyum (Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow //Scand. J. Clin. Lab. Investig. - 1968. - Vol. 21 - Suppl. 97. p. 1-9), принцип которого основан на различии в плавучей плотности форменных элементов. Смесь полисахарида фиколла и рентгеноконтрастного вещества верографин создает градиент с такой плотностью, которая позволяет при центрифугировании разделить клетки костного мозга на мононуклеарную фракцию (МФ), в которую входят лимфоциты, субпопуляция моноцитов и бластные гемопоэтические клетки, и фракцию, содержащую гранулоциты и эритроциты. Мононуклеарная фракция обладает меньшей, чем градиент, плотностью и располагаются над градиентом. Плотность гранулоцитов и эритроцитов больше, чем плотность градиента, они проходят через градиент, опускаясь на дно пробирки.

Методика выделения мононуклеарной фракции из гепаринизированного костного мозга.

Костный мозг разводят физиологическим раствором (pH 7,2 )в соотношении 1:5; центрифугируют в градиенте плотности фиколл-верографин при 400g в течение 30 мин. Полученную мононуклеарную фракцию трижды отмывают в ЗФФР (физиологический раствор, забуференный с помощью фосфатно-солевого буфера) и ресуспендируют в среде RPMI-1640 в концентрации 106 клеток в мл. Жизнеспособность клеток, определяемая по методу окрашивания с трипановым синим, превышает 96%.

Полученную мононуклеарную фракцию аутологичного костного мозга 4×10⁶ клеток в объеме 200 мкл в первой группе вводят в ишемизированную конечность бедра инфильтрационно из шести различных точек по ранее известной методике, наиболее близкой к заявленному способу, а во второй группе - из двух точек, в каждую из которых по 100 мкл: 1) забрюшинно непосредственно под паховую связку в ее средней трети в зону анатомического расположения коллатералей внутренней подвздошной артерии и ее ветвей; 2) интрамускулярно в икроножную мышцу переднелатеральной поверхности средней трети голени.

Животные выводились из эксперимента путем передозировки наркоза на 10, 21 и 28 сутки. Перед выведением из эксперимента у крыс контрольной и опытной серий оценивали динамику клинических и флоуметрических показателей при моделировании ишемии конечности на разных сроках. Полученные данные обработаны статистически: рассчитаны средние значения сдвигов (М), средняя ошибка средней арифметической (±m) и вероятность возможной ошибки (p). Различия оценивали как достоверные при p<0,05.

При клиническом обследовании у большинства животных зарегистрировано наличие болевого синдрома, гиперемия кожи голени и стопы, симптом «перемежающей хромоты», ограниченное участие конечности в передвижении.

Динамика оценки уровня микроциркуляции с помощью лазерной допплеровской флоуметрии у животных опытной серии (2 группы) в сравнении с контрольными и интактной группами отражена в таблице 1.

Как видно из данных таблицы 1, после операции уровень микроциркуляции резко и быстро снижается, а затем медленно восстанавливается, однако до 28 суток включительно остается достоверно ниже нормального значения, зафиксированного в группе интактных крыс. Прежних значений уровень микроциркуляции достигает только через 3 месяца после операции. По сравнению с группой интактных животных уровень микроциркуляции в 1 группе крыс, пролеченных по известной методике, на 28 сутки на уровне бедра был выше в 1,2 раза, на уровне голени - в 1,1 раза; по сравнению с контрольной - на уровне бедра был выше на 10 сутки - в 1,6 раза, на 21 сутки - в 1,4 раза, на 28 сутки - в 1,7 раза; на уровне голени уровень микроциркуляции возрастает в 1,5 раза, в 1,3 раза и в 1,7 раза соответственно на тех же сроках.

По сравнению с группой интактных животных уровень микроциркуляции во 2 группе крыс, пролеченных по заявленному способу, был выше в 1,2 раза на уровне бедра и в 1,1 раза на уровне голени уже на 21 сутки, на 28 сутки на уровне бедра - в 1,5 раза, а на уровне голени - в 1,4 раза, а по сравнению с контрольной на уровне бедра на 10 сутки возрастает в 1,8 раза, на 21 сутки - в 2 раза и на 28 сутки - в 2,1 раза; на уровне голени уровень микроциркуляции увеличивается в 1,7 раза, в 1,8 раза и в 2 раза соответственно на тех же сроках.

При сопоставлении данных показателей между 1 и 2 группами оказалось, что уровень микроциркуляции на уровне и бедра, и голени на 10 сутки выше в 1,1 раза, на 21 сутки - в 1,4 раза и на 28 сутки - в 1,2 раза, что свидетельствует о том, что сущность изобретения выражается в совокупности значимых признаков, достаточных для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Крысам опытной серии в группе №1 в эксперименте вводили мононуклеарную фракцию костного мозга на 7 сутки после моделирования хронической ишемии конечности по известной методике инфильтрационно из шести различных точек в пораженную мышцу бедра в дозе 4×10⁶ клеток в объеме 200 мкл, что приводило к увеличению микроциркуляции в ишемизированной конечности на 10 сутки на уровне бедра до 366,86±17,7 п.е. и на уровне голени до 310,31±15,39 п.е.; на 21 сутки на уровне бедра до 496,92±26,93 п.е. и на уровне голени до 423,41±23,42 п.е.; на 28 сутки на уровне бедра до 717,46±37,11 п.е. и на уровне голени до 615,18±32,27 п.е.

Крысам опытной серии в группе №2 после моделирования хронической ишемии конечности на 7 сутки мононуклеарную фракцию костного мозга в дозе 4×10⁶ клеток в объеме 200 мкл вводили по предложенной методике из двух точек, в каждую из которых по 100 мкл: забрюшинно непосредственно под паховую связку в ее средней трети в зону анатомического расположения коллатералей внутренней подвздошной артерии и ее ветвей и интрамускулярно в икроножную мышцу переднелатеральной поверхности средней трети голени. Это приводило к достоверному повышению уровня микроциркуляции в ишемизированной конечности на 10 сутки на уровне бедра до 420,28±22,86 п.е. и на уровне голени до 350,23±19,05 п.е.; на 21 сутки на уровне бедра до 695,47±46,6 п.е. и на уровне голени до 579,56±38.83 п.е.; на 28 сутки на уровне бедра до 873,98±43,72 п.е. и на уровне голени до 728,32±36,43 п.е., что выше по сравнению с 1 группой как на уровне бедра, так и на уровне голени на 10 сутки в 1,1 раза, на 21 сутки - в 1,4 раза и на 28 сутки - в 1,2 раза.

Таким образом, результаты экспериментального исследования свидетельствуют о том, что предложенный метод более эффективный при лечении ишемии конечности по сравнению с известным за счет стимуляции развития коллатерального кровотока в ишемизированной конечности и улучшения таким образом артериального притока крови из проксимальных отделов конечности в дистальные.