Результат интеллектуальной деятельности: КАССЕТНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ ДВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ siPHK, ЭФФЕКТИВНО АТАКУЮЩИЕ ТРАНСКРИПТЫ ВИЧ-1 СУБТИПА А У БОЛЬНЫХ В РОССИИ, И ОДНУ siPHK, НАПРАВЛЕННУЮ НА мРНК ГЕНА CCR5

Изобретение относится к областям медицинской и молекулярной генетики, а также к генотерапии и связано с использованием ранее выявленных нами двух мишеней для РНК-интерференции в вирусе иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) субтипа А для создания кассетной генетической конструкции. На основе детального анализа последовательности нуклеотидов в двух мишенях с помощью глубокого секвенирования генома ВИЧ-1 субтипа А у больных в России предложены последовательности соответствующих siPHK, предназначенные для эффективного подавления продукции данных клинических вариантов ВИЧ-1 в клетках человека.

Данная кассета экспрессирует две биологически активных анти-ВИЧ-1 siPHK, что приводит к атаке двух мишеней в транскриптах вируса и мощному ингибированию его репродукции в клетках человека. Указанная кассетная генетическая конструкция экспрессирует шпильки РНК, которые in vivo процессируются в биологически активные siPHK. Последние эффективно доставляются в белковые комплексы, осуществляющие разрезание транскриптов вируса, чем и достигается ингибирование его репродукции. Кроме того, данная кассета экспрессирует и биологически активную siPHK, атакующую мРНК гена CCR5 человека. Указанные ген кодирует ко-рецептор, облегчающий проникновение вируса в Т-лимфоциты человека. Такая генетическая конструкция может быть использована в медицине для генотерапии СПИДа и ВИЧ-инфекции, а также в научных исследованиях для мощного подавления продукции ВИЧ-1 субтипа А.

В настоящее время основным подходом лечения СПИДа и ВИЧ-инфекции является назначение пациентам противовирусной химиотерапии, включающей препараты, действующие на ключевые ферменты ВИЧ-1 - обратную транскриптазу, интегразу, протеазу. Однако, несмотря на большое количество разработанных препаратов, существует проблема эффективности применяемой противовирусной терапии. Основная причина, объясняющая неэффективность лечения - адаптивный мутагенез вируса, приводящий к появлению вариантов вируса, обладающих устойчивостью к противовирусным препаратам. Серьезными проблемами являются также токсичность и высокая стоимость применяемых лекарственных средств.

Известно применение рибозимов и антисмысловых РНК для терапии ВИЧ-инфекции [Dorman N. And Lever A.M. (2001) RNA-based gene therapy for HIV infection. HIV Med., 2, 114-122; Michienzi A., Conti L., Varano В., Prislei S., Gessani S., and Bozzoni I. (1998) Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by nuclear chimeric anti-HIVribozymes in a human Т lymphoblastoid cell line. Hum. Gene Ther., 9., 621-628; Veres G., Junker U., Baker J., Barske C., Kalfoglou C., Ilves H., Escaich S., Kaneshima H., and Bohnlein E. (1998) Comparative analysis of intracellularly expressed antisense RNAs as inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 replication. J. Virol., 72, 1894-1901.], которые блокируют несколько генов ВИЧ, что снижает его активность.

Наиболее близким к данному изобретению являются генетические конструкции, обеспечивающие экспрессию siPHK внутри ВИЧ-инфицированных клеток организма (Патент РФ 2425150, "Кассетная генетическая конструкция, экспрессирующая три биологически активные siPHK, эффективно атакующие транскрипты вируса иммунодефицита человека и гена CCR5 с помощью РНК-интерференции").

Настоящее изобретение отличается тем, что в настоящей генетической конструкции экспрессируются две siPHK, которые нацелены на мишени в вариантах ВИЧ-1 субтипа А у больных в России, а одна нацелена на мРНК гена CCR5 человека, кодирующего клеточный ко-рецептор, вовлеченный в проникновение вируса в Т-лимфоциты. Данные о мишенях ВИЧ-1 субтипа А получены с помощью глубокого секвенирования мишеней РНК-интерференции в клинических вариантах вируса, выделенных у больных в России.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является использование двух ранее выявленных мишеней РНК-интреференции в ВИЧ-1 (патент РФ 2385939) и одной мишени в мРНК CCR5 (Патент РФ 2425150) для подавления продукции вариантов вируса у больных в России. Данная кассетная генетическая конструкция, содержит три палиндрома, предназначенные для образования "шпилек РНК". Экспрессия такой конструкции в клетках человека приводит к образованию трех интерферирующих РНК (siPHK). Предлагаемая генетическая конструкция кодирует биологически активные siPHK, которые были отобраны с помощью невирусной тест-системы с использованием культур клеток человека.

Представленный технический результат достигается путем создания кассетной генетической конструкции на базе вектора GeneClip™U1 Neomycin (Ac. number AY745746), http://www.promega.com/pnotes/89/12416_21/12416_21.pdf.

Созданная генетическая конструкция длиной 207 bp содержат вставку ДНК, указанную в Таблице 1:

Таблица 1   Кассетная генетическая конструкция, экспрессирующая три биологически активные siPHK

В таблице 1 указаны 19-30-нуклеотидные последовательности, соответствующие транскриптам вируса или мРНК CCR5. Строчными буквами жирным шрифтом в следующем порядке указаны области соответствующие: смысловой цепи мРНК обратной транскриптазы вируса, ее антисмысловой цепи; смысловой цепи мРНК Р17 вируса, ее антисмысловой цепи; смысловой цепи мРНК гена CCR5, ее антисмысловой цепи. Последовательности ДНК представлены в ориентации 5′-3′. Строчными буквами показаны тексты петель и спейсеров, содержащих искусственные сайты для рестриктаз EcoRI или BamHI (жирные строчные буквы). Петли образуются в транскрипте после отжига комплементарных областей палиндромов. Тексты генетической конструкции соответствуют мишеням в штаммах ВИЧ-1 субтипа А, выделенных у больных в России. Нумерация области гена CCR5 указана по последовательности GenBank - U54994. Указанная конструкция предназначена для поражения двух областей мРНК, кодирующих консервативные области обратной транскриптазы (RT) и белка Р17 вируса и 5′ области мРНК гена CCR5 человека в области первых кодонов.

В таблице 2 представлены отличия в мишенях вируса из базы данных - HIV-1 subtype А, номер последовательности в GenBank - AF316544, изолят ВИЧ-1 субтипа А из Конго; и в клинических вариантах вируса субтипа А, выделенных у больных в России.

Таблица 2   Кассетная генетическая конструкция, экспрессирующая три биологически активные siPHK

В обеих мишенях выявлены отличия, характерные для генома вируса у больных в России (затенением указаны по две позиции нуклеотидных замен). Известно, что даже единичные отличия между мишенью и siPHK могут существенно ослабить эффективность РНК-интерференции. Следовательно, знание последовательности нуклеотидов в мишенях клинических вариантов ВИЧ-1 субтипа А позволяет создать генетические конструкции, эффективно поражающие транскрипты вируса и его продукцию у больных.

Указанную генетическую конструкцию тестировали с помощью невирусной системы. Данная система предназначена для количественной оценки биологической активности siPHK, которые образуются in vivo при экспрессии генетических конструкций. Она создана на базе вектора psiCHECK™-2 (Promega, номер последовательности в GenBank AY535007). Вектор содержит ген люциферазы светлячка и ген люциферазы коралла (Renilla). Указанные люциферазы вызывают свечение разной длины волны и их экспрессию можно измерять с помощью люминометра. В 3′ концевую некодирующую область гена Renilla вставляли короткие области генома вируса (домены), соответствующие выбранным мишеням РНК-интерференции в транскриптах вируса. Домены получали с помощью химического синтеза олигонуклеотидов ДНК. В таблице 2 представлены тексты доменов, которые клонировали в векторе psiCHECK™-2 по сайтам рестриктаз XhoI и NotI.

Таблица 3   Мишени РНК-интерференции, клонированные в векторе psiCHECK-2 для тестирования ее эффективности в невирусной системе

В таблице 3 строчными буквами показаны области, содержащие сайты рестрикции эндонуклеаз XhoI и NotI, а также два спейсера между фрагментами генома HIV-1 (мишени HIV-1R и HIV-6R) и кДНК CCR5. Жирным шрифтом показаны области генома клинических вариантов вируса в России и кДНК CCR5, которые соответствуют мишеням РНК-интерференции.

Тестирование биологической активности кассеты проводят в экспериментах по ко-трансфекции культуральных клеток человека. При этом используют два препарата ДНК: кассетной генетической конструкции, содержащей промотор U1 РНК полимеразы II и кодирующую кодирующей три siPHK, а также ДНК - плазмиды, созданной на базе вектора psi-CHECK-2, содержащей три клонированных домена, соответствующих данным siPHK (мишеням РНК-интерференции) (Таблица 3). В клетках человека на генетических конструкциях экспрессируется вставка, содержащая палиндромы. Синтезированная РНК образует шпильки, которые являются природным субстратом Дайсера, фермента, вырезающего 21 нуклеодидные дуплексы РНК из шпильки. Если Дайсер работает на дуплексе РНК длиной более 19 пар нуклеотидов (природный субстрат), то далее он, оставаясь связанным с двуспиральной siPHK, активно участвуют также и в ее "загрузке" в белковый комплекс RISC. В данном комплексе происходит "раскручивание" цепей siPHK и освобождение его от одной из них (от так называемой "passenger"-цепи). Если в комплексе остается антисмысловая siPHK, то она используется как "наводчик", узнающий комплементарную мишень в транскриптах клетки. После связывания комплекса с соответствующей мРНК происходит ее разрезание одним из его белков, что приводит к выключению экспрессии соответствующего гена вируса и нарушает его размножение в клетке-хозяине. В трансфецированных клетках мРНК Renilla, содержащая в 3′-некодирующей области испытываемую мишень РНК-интерференции, разрезается, что приводит к резкому снижению голубого свечения, вызываемого данной люциферазой (478 nm). Желто-зеленое свечение, вызываемое люциферазой светлячка Photinus pyralis (557 nm), кодируемой той же ДНК psiCHECK-2, служит внутренним контролем.

В настоящем исследовании использовали одиннадцать критериев для отбора последовательностей мишеней РНК-интерференции в мРНК гена CCR5. Они важны для того, чтобы именно антисмысловая цепь siPHK оставалась в комплексе RISC. Каждая из приведенных в Таблице 1 вставок в генетических конструкциях соответствует, по крайней мере, десяти из одиннадцати ниже перечисленных критериев, которые использовались для отбора коровых 19-нуклеотидних последовательностей siPHK:

- состав G/C 30-52%

- не менее 3 A/U в позициях 15-19 смысловой цепи

- отсутствие внутренних повторов

- А в позиции 19 смысловой цепи

- А в позиции 3 смысловой цепи

- U в позиции 10 смысловой цепи

- отсутствие G/C в позиции 19 смысловой цепи

- отсутствие G в позиции 13 смысловой цепи

- отсутствие гомополимерных трактов (А)_4-5 или (T)_4-5 в смысловой цепи

- локализация мишени в консервативном районе генома вируса

- отсутствие гомологии с известными транскриптами генома человека.

Часть вышеперечисленных критериев отбора биологически активных siPHK опубликована [Reynolds A., Leake D., Boese Q., Scaringe S., Marshall W.S., Khvorova A. (2004) Rational siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnol. 22, 326-330] и представлена на сайте http://www.dharmacon.com.

Приведенная в таблице 1 кассетная генетическая конструкция обеспечивает целенаправленное воздействие на мРНК вариантов вируса в России с помощью соответствующих двух siPHK, а также на мРНК CCR5. Терапевтическим результатом такого воздействия является подавление репродукции вариантов ВИЧ-1 субтипа А у больных в России.

Для вируса иммунодефицита человека первого типа характерно быстрое возникновение и отбор мутантных вариантов, обладающих резистентностью к различным противовирусным препаратам. Для решения проблемы вирусной изменчивости получена кассетная генетическая конструкция, атакующая разные мишени и, поэтому в значительной степени не зависящая от изменчивости вируса.

На рис.1 приведена физическая карта вектора GeneClipU1-neo.

На рис.2 приведена физическая карта вектора psiCHECK-2.

На рис.3 представлены результаты проверки эффективности РНК-интерференции, вызываемой созданной кассетной генетической конструкцией на невирусной тест-системе.

Пример 1. Описание генетической конструкции и способа ее получения

Вектор GeneClipU1-neo зарегистрирован в GenBank (Accession # AC AY745746), имеет размер 4,758 kb (kilobases - тысяча пар оснований) и характеризуется тем, что содержит:

старт-сайт РНК полимеразы Т7: 1

U1 промотор РНК полимеразы II человека: 46-438

10 bp спейсер: 439-448

U1 терминатор: 449-465

промотор РНК полимеразы SP6: 527-546

ранний энхансер/промотор вируса SV40: 798-1216

сигнал начала репликации вируса SV40: 1114-1179

ген neo: 1251-2045

синтетический поли(А): 2080-2128

ген β-лактамазы: 3080-3940

промотор РНК полимеразы Т7: 4742-3.

В данный вектор, который поставляется Promega в линейной форме, вставляют химически синтезированные олигонуклеотиды ДНК, которые соответствуют генетическим конструкциям, продуцирующим шпильки РНК (Таблица 1).

Вектор psiCHECK-2 зарегистрирован в GenBank (Accession # AY535007), имеет размер 6,27 kb и характеризуется тем, что содержит:

ранний энхансер/промотор вируса SV40: 7-425

химерный интрон: 489-621

промотор РНК полимеразы Т7: 666-684

ген люциферазы Relilla: 694-1629

полилинкер: 1636-1680

синтетический поли(А): 1688-1736

промотор HSK-TK: 1744-2496

ген люциферазы светлячка: 2532-4184

поздний сигнал поли(А) SV40: 4219-4440

ген β-лактамазы: 4587-5447.

В данном векторе в сайты XhoI и NotI полилинкера вставляют химически синтезированные олигонуклеотиды ДНК, которые соответствуют выбранным мишеням РНК-интерференции (Таблица 2).

Пример 2. Оценка эффективности РНК-интерференции, вызываемой созданными генетическими конструкциями в невирусной системе

Накануне проведения ко-трансфекции (за 18-20 часов) клетки НЕК293 рассевают в лунки 24-луночного планшета Nunc - по 50 тыс. клеток в 500 мкл культуральной среды DMEM (ПанЭко), содержащей глютамин и сыворотку (полная среда), на лунку. В день эксперимента готовят пробы ДНК для ко-трансфекции при комнатной температуре следующим образом (на одну экспериментальную точку). В 200 мкл среды DMEM, не содержащей сыворотки (SFM), добавляют 100 ng ДНК генетической конструкции в векторе GeneClip-U1-neo (см. Таблицу 1) и 10 ng ДНК плазмиды, содержащий соответствующие клонированные домены в векторе psiCHECK-2 (см. Таблицу 2). После перемешивания добавляют 1 мкл свежеразмороженного реагента TransFast (Promega), встряхивают смесь и инкубируют ее 15 мин. Затем отсасывают среду из лунок с "сидящими" клетками, встряхивают пробирку со смесью ДНК-TransFast и сразу добавляют смесь в лунки с клетками. После инкубации 1 час при 37°С в СО₂-инкубаторе добавляют в лунки по 600 мкл среды с сывороткой, перемешивают и икубируют планшет 48-72 час.

Для измерения экспрессии люцифераз среду над клетками в лунках планшета отсасывают, добавляют 100 мкл раствора трипсина-ЭДТА (ПанЭко) на лунку, после 10 мин инкубации при 37°С в СО₂-инкубаторе добавляют по 100 мкл полной среды, переносят полностью суспензию клеток в пробирку эппердорф на 0.5 мл, осаждают центрифугированием при комнатной температуре в центрифуге Eppendorf (5 мин - 2000 rpm), надосадочную жидкость отсасывают, суспендируют клетки в 70 мкл 1×PBS и проводят измерение свечения люцифераз светлячка и Renilla согласно рекомендациям к набору Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) на люминометре Reporter Microplate Luminometer (Turner BioSystems). На рис.3 показаны результаты испытания генетических конструкций на невирусной системе. Видно, что генетические конструкции специфически подавляют экспрессию мишеней на 60-96%.