Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА И ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ У БОЛЬНЫХ С СИНДРОМОМ ДИСЛИПИДЕМИИ

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике во внутренних болезнях, может быть использовано для дифференциальной диагностики хронического вирусного гепатита и жировой болезни печени у больных с синдромом дислипидемии.

Известный лабораторный способ дифференциальной диагностики хронического вирусного гепатита и жировой болезни печени заключается в прижизненном морфологическом исследовании биоптатов печени (Ghany М., Doo Е. Assessment of liver fibrosis: palpate, poke or pulse? Hepatology, 2005, V. 42 (4), P. 759-761; The role of liver biopsy in chronic hepatitis C. Saadeh S., Cammell G., Corey W.D. et al. Hepatology, 2001, V. 33, P. 196-200; Nainon O., Xiq G., Vanghan G. Diagnosis of hepatitis a virus infection: a molecular approach. Clin. Microbiol. Rev., 2006, V. 19 (1), P. 63-79.); Roussele M.C. Sources of variability in histological scoring of chronic viral hepatitis. Hepatology, 2005, V. 41 (2), P. 257-264; Павлов Ч.С., Ивашкин В.Т. Биопсия печени: методология и практика сегодня. Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. 2006, Т. 16. №4, С.65-78; Павлов Ч.С., Золоторевский В.Б., Ивашкин В.Т. Современные методы ранней диагностики фиброза печени. Клиническая медицина, 2005, Т. 83, №12, С.58-60; Ивашкин В.Т., Шульпекова Ю.О. Неалкогольный стеатогепатит. Русский медицинский журнал, 2000, Т.2, С.41-45; Подымова С.Д. Жировой гепатоз, неалкогольный стеатогепатит. Клинико-морфологические особенности. Прогноз. Лечение. Русский медицинский журнал, 2005, №2, С.61-66).

Недостатки способа диагностики: несмотря на высокую информативность, метод пункционной биопсии печени является трудоемким, достаточно травматичным, имеется техническая сложность получения материала и значительная вероятность развития тяжелых осложнений.

Технический результат: снижение травматичности, повышение доступности и простоты исполнения при высокой чувствительности, специфичности и эффективности.

Способ дифференциальной диагностики заключается в следующем: у больных в сыворотке крови спектрофотометрически определяют активность фермента антиоксидантной системы супероксиддисмутазы (СОД) методом Mistra Н. и Fridovich J. на спектрофотометре КФК-3-«ЗОМЗ» (Россия, г. Сергиев-Посад) с целью оценки наличия и степени окислительного стресса (Mistra Н., Fridovich J.M. J. Biol. Chem., 1983, V. 247 (10), P. 3170-3175).

У пациентов с синдромом дислипидемии при значении СОД менее или равно 23 Ед/мг белка диагностируют жировую болезнь печени, при концентрации СОД более 23 Ед/мг белка - хронический вирусный гепатит.

Способ забора крови для определения активности СОД осуществляют следующим образом: кровь из локтевой вены в количестве 5 мл забирают в вакуумную пробирку с активатором свертывания и центрифугируют для получения сыворотки 10 мин при 1500 об/мин.

Метод определения активности фермента СОД основан на способности фермента тормозить автоокисление адреналина при pH - 10,2. Экстинция регистрируется при 480 нм. Ввиду нестабильности субстрата за 1 условную единицу активности фермента принимают такое количество СОД, которое необходимо для ингибирования начальной скорости автоокисления адреналина на 50%.

Реагенты.

1. 0,15 М натрий-карбонатный буфер, содержащий 3·10^-4 М ЭДТА, pH - 10,2 (производитель ООО «Биотех», г. Пермь).

2. 2,25·10^-3 М водного раствора адреналина, pH - 2,5 (производитель ОАО «Фармакон», Россия).

3. 0,005 М раствор калий-фосфатного буфера с добавлением 1·10^-5 ЭДТА, pH - 7,8 (производитель ООО «Биотех», г. Пермь).

Ход определения. Для измерения активности СОД в кювету спектрофотометра вносят компоненты в следующей последовательности:

1) 1 мл 0,15 М раствора натрий-карбонатного буфера с добавлением 3·10^-4 М ЭДТА, pH - 10,2;

2) 0,5 мл исследуемой сыворотки крови, которую необходимо предварительно развести дистиллированной водой в соотношении 1:10;

3) 0,7 мл 0,005 М раствор калий-фосфатного буфера с добавлением 1·10^-5 ЭДТА, pH - 7,8;

4) 0,4 мл 2,25·10^-3 М водного раствора адреналина, pH - 2,5. Готовят ex tempore в день постановки реакции. Перед постановкой реакции приготовленный раствор адреналина необходимо прогреть 1 час при температуре 37°С;

5) В контрольную пробу вместо сыворотки вносят 0,5 мл дистиллированной воды. Реакцию начинают добавлением адреналина и быстрым перемешиванием содержимого кюветы. Измерение активности СОД проводят в кювете с длиной оптического пути 10 мм на спектрофотометре при длине волны 480 нм против воды. Сначала записывают начальную скорость свободного, не ингибированного автоокислителя адреналина в адренохром (контрольная проба). Затем определяют начальную скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемых проб, при этом исследовании жидкость перед внесением в кювету необходимо разводить в 2,5 раза 0,005 М раствором калий-фосфатным буфером pH - 7,8. Время реакции 1 минута. Активность СОД (в Е/мг белка в крови) определяется по формуле:

((А-(Е/А)*100:(100-(А-Е)*100/А))*(2*N)/С, где

А - скорость автоокисления контрольного раствора адреналина (контрольная проба);

Е - скорость окисления адреналина в присутствии СОД (опытная проба);

N - разведение (N-2,5);

С - концентрация белка крови.

При значении СОД менее или равно 23 Ед/мг белка диагностируют жировую болезнь печени, при концентрации СОД более 23 Ед/мг белка - хронический вирусный гепатит.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Больная С. 39 лет, рост 168 см, вес 96 кг, индекс массы тела 34. Синдром дислипидемии. Жалобы на слабость, снижение аппетита и тяжесть в правом подреберье. Объективно - печень +1,0 см, безболезненная, гладкая. Биохимическое исследование: АЛТ - 44 Ед/л, ACT - 34 Ед/л, общий билирубин - 10,2 мкмоль. По данным УЗИ - диффузные изменения в печени. Показатели липидного обмена в сыворотке крови: триглицериды (ТЕ) - 2,23 ммоль/л, общий холестерин (ОХ) - 6,85 ммоль/л, липопротеиды высокой плотности (ЛПВП) - 1,24 ммоль/л, липопротеиды низкой плотности (ЛПНП) - 4,09 ммоль/л. Уровень СОД в сыворотке крови 49,8 Ед/мг белка. Диагноз хронического вирусного гепатита подтвержден.

Пример 2. Больной П. 50 лет, рост 176 см, вес 85 кг, индекс массы тела 27,5. Синдром дислипидемии. Жалобы на слабость и снижение аппетита. Объективно - печень +2,0 см, безболезненная, гладкая. Биохимическое исследование: АЛТ - 40,1 Ед/л, ACT - 38.3 Ед/л, общий билирубин - 23,5 мкмоль/л. По данным УЗИ - незначительные диффузные изменения в печени. Показатели липидного обмена в сыворотке крови: ТГ - 1,71 ммоль/л, ОХ - 5,95 ммоль/л, ЛПВП - 1,05 ммоль/л, ЛПНП - 3.6 ммоль/л. Уровень СОД в сыворотке крови 44 Ед/мг белка. Диагноз хронического вирусного гепатита подтвержден.

Пример 3. Больная М. 55 лет, рост 162 см, вес 90 кг, индекс массы тела 35,5. Синдром дислипидемии. Жалобы на тупые боли в верхних отделах живота, явления диспепсии. Объективно - печень +1,0 см, безболезненная, гладкая. Биохимическое исследование: АЛТ - 139 Ед/л, ACT - 53 Ед/л, общий билирубин - 6,05 мкмоль/л. По данным УЗИ - диффузные изменения печени. Параметры липидного обмена сыворотки крови: ТГ - 3,85 ммоль/л, ОХ - 7,4 ммоль/л, ЛПВП - 1,68 ммоль/л. ЛПНП - 4,63 ммоль/л. Уровень СОД в сыворотке крови 10,1 Ед/мг белка. Диагноз жировой болезни печени подтвержден.

Пример 4. Больной В. 30 лет, рост 170 см, вес 100 кг, индекс массы тела 34,6. Синдром дислипидемии. Жалобы на слабость, снижение аппетита и тяжесть в правом подреберье. Объективно - печень +1,0 см, безболезненная, гладкая. Биохимическое исследование: АЛТ - 137 Ед/л, ACT - 23 Ед/л, общий билирубин - 22,4 мкмоль/л. По данным УЗИ - диффузные изменения печени. Показатели липидного спектра в сыворотке крови: ТГ - 1,59 ммоль/л, ОХ - 6,13 ммоль/л, ЛПВП - 1,06 ммоль/л, ЛПНП - 3,85 ммоль/л. Уровень СОД в сыворотке крови 22 Ед/мг белка. Диагноз жировой болезни печени подтвержден.

Данные статистики определения активности фермента СОД в сыворотке крови больных хроническим вирусным гепатитом (ХВГ) и жировой болезнью печени (ЖБП) с синдромом дислипидемии в сравнении с группой практически здоровых лиц представлены в таблице.

Операционные характеристики лабораторного теста определения активности СОД в сыворотке крови больных с синдромом дислипидемии и поражением печени с целью дифференциации хронического вирусного гепатита и жировой болезни печени по степени окислительного стресса: диагностическая чувствительность (ДЧ) составила 92%, диагностическая специфичность (ДС) - 88%, диагностическая эффективность - 91%. Точка разделения для больных хроническим вирусным гепатитом и жировой болезнью печени с синдромом дислипидемии по активности СОД при построении кумулятивных кривых зарегистрирована на уровне 23 Ед/мг белка. Соответственно при уровне СОД менее или равно 23 Ед/мг белка у больных с синдромом дислипидемии диагностируют жировую болезнь печени, при уровне СОД более 23 Ед/мг белка - хронический вирусный гепатит.

Положительный эффект от использования предлагаемого способа дифференциальной диагностики хронического вирусного гепатита и жировой болезни печени по активности антиоксидантного фермента СОД с целью оценки степени окислительного стресса заключается в его простоте, доступности, нетравматичности, отсутствии осложнений, информативности, чувствительности и специфичности.