ПРОТОЧНАЯ МУЛЬТИСЕНСОРНАЯ ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКАЯ ЯЧЕЙКА ДЛЯ АНАЛИЗА МАЛЫХ ОБЪЕМОВ ЖИДКИХ ОБРАЗЦОВ

Изобретение относится к области электроаналитической химии, а именно - потенциометрии, и может быть использовано в качестве аналитического элемента приборов, с помощью которых измеряют концентрации ионов в жидких образцах различных типов малых объемов.

Потенциометрические ячейки - это гальванические элементы, включающие ионоселективные электроды (ИСЭ), предназначенные для измерения концентраций (точнее - активностей) ионов в жидких (преимущественно водных) образцах различных типов. Этими образцами могут быть природные, промышленные, сточные воды, почвы и почвенные вытяжки, продукция сельского хозяйства, растворы, используемые в практике научно-исследовательских лабораторий. В отличие от других методов анализа (атомно-абсорбционная спектроскопия, масс-спектрометрия, традиционные методы), потенциометрия дает возможность измерений не общей концентрации тех или иных компонентов, а концентраций их конкретных ионных форм, что обуславливает преимущество потенциометрии с ИСЭ в сравнении с другими методами анализа.

Важная область применения потенциометрии с ИСЭ - это анализ медико-биологических образцов, таких как цельная кровь, сыворотка и плазма, слюна, моча, лимфа и другие биологические жидкости. Для этой области применения характерны небольшие объемы образцов (менее 1 мл) и необходимость определения в каждом образце содержания сразу нескольких ионов.

Для анализа медико-биологических образцов по большому набору параметров при малых объемах самого образца применяют клинические анализаторы. Это полностью автоматизированные устройства, в которых с помощью системы насосов анализируемая проба прокачивается через т.н. электродный блок: проточную ячейку, снабженную набором ИСЭ. Такая схема позволяет резко сократить объем образца и, вместе с тем, получить сведения о концентрации целого набора ионов. Клинические анализаторы выпускаются рядом компаний, например, анализатор Konelab компании Thermo-Fisher, такие анализаторы выпускаются также компаниями Hitachi, Radiometer, Frezenius, Roche AVL, NOVA Biomedical и рядом других.

Известна непроточная потенциометрическая ячейка, представляющая себой многолуночный планшет, на дне лунок которого располагается ионоселективная мембрана (US 2009/0321255 A1 Jun. 27, 2008). Данная конструкция имеет недостатки. Мультисенсорность обеспечивается за счет числа лунок с ионоселективной мембраной, то есть число ионов, содержание которых необходимо проверить, задает число лунок с различными ионоселективными мембранами, которые необходимо заполнить образцом. В результате требуется значительное количество образца. Конструкция многокомпонентная, и, соответственно, дорогостоящая. Кроме того, ячейка непроточная, поэтому необходимо дополнительное устройство для помещения образца в лунки.

Известен блочный датчик, включающий две монтажные подложки, каждая содержит две поверхности и хотя бы один аналитический сенсор, контактирующий с одним или более точками для электрического контакта, сформированный на первой поверхности, а также спейсер, имеющий сквозную выборку; все элементы конструкции образуют слоистую структуру, в которой первая поверхность первой подложки замыкает первое отверстие спейсера, а первая поверхность второй подложки замыкает второе отверстие спейсера, таким образом формируя измерительную ячейку, с которой контактируют хотя бы один сенсор от каждой подложки (WO 2008131767, 27.04.2007). Достоинством этой ячейки является малое число элементов конструкции, которых всего три: две подложки и спейсер, который, если изготовлен из уплотняющего материала, одновременно служит уплотнителем для снижения нежелательных эффектов, а именно утечек калибровочных растворов и анализируемых образцов из ячейки в окружающую среду и подсоса воздуха в ячейку из окружающей среды. Однако это достоинство порождает также серьезные недостатки данной ячейки. С целью повышения эффективности спейсера как уплотнителя по крайней мере одна из подложек изготавливается из твердого керамического материала, чтобы можно было плотно сжать все три элемента слоистой конструкции. Однако адгезия сенсорных полимерных мембран к керамике крайне низкая. Это приводит к утечкам между мембранами сенсоров и подложкой, что снижает достоверность анализа и сокращает срок службы ячейки. Кроме того, большая площадь контакта монтажных подложек со спейсером неизбежно снижает его эффективность как уплотнителя, что приводит к утечкам жидкостей и подсосу воздуха, пузырьки которого блокируют сенсоры и препятствуют измерениям.

Близкими аналогами предлагаемого изобретения являются проточные ячейки - электродные блоки - клинических анализаторов, производимые компаниями Hitachi (например, Hitachi K⁺ Electrode Catalog #: E-310), Roche AVL (например, AVL Ca⁺⁺ Electrode,Catalog #: Е-210), Bayer (например, Bayer Ca⁺⁺ Electrode Catalog #: Е-170), Medica (например, Medica Ca⁺⁺ Electrode Catalog #: E-250). Конструкции проточных ячеек (электродных блоков) этих производителей несколько различаются, но общий принцип их построения один и тот же: ячейка составлена из отдельных элементов, каждый из которых представляет собой индивидуальный ИСЭ. Такое построение позволяет снизить площадь каждого из межэлементных контактов по сравнению с ячейкой по патенту WO 2008131767. Однако при этом количество межэлементных соединений возрастает пропорционально числу индивидуальных сенсоров (ИСЭ). В результате эти ячейки также подвержены как утечкам жидкостей, так и подсосу воздуха. Кроме того, конструкция индивидуальных сенсоров данных ячеек оказывается весьма сложной.

В связи с этим недостатками данных устройств являются погрешности измерений из-за блокирования ячейки пузырьком воздуха, короткий срок службы (2-3 месяца), сложность и высокая стоимость изготовления индивидуальных сенсоров, в особенности формирования мембраны, высокая степень выбраковки части изделий.

Прототипом предложенной ячейки является проточная ячейка клинического анализатора KONELAB Prime 60 компании Thermo-Fisher, изображенная на Фиг.1, в правой части чертежа приведен общий вид такой ячейки с 6-ю ИСЭ и электродом сравнения и проводами для подключения к измерительному прибору, в левой - схема проточной ячейки с 4-мя ИСЭ, элементы конструкции обозначены цифрами. Горизонтальный проточный канал (1 на Фиг.1), сквозь который проходит анализируемый образец, образован каналами корпусов индивидуальных электродов (сенсоров) (2 на Фиг.1), соединенных в проточную ячейку с помощью соответствующих направляющих стержней (3 на Фиг.1) и содержащих уплотнительные кольца (4 на Фиг.1) в местах сочленений сенсоров для снижения вероятности подсоса воздуха и/или утечки растворов через эти соединения. Перпендикулярно этому каналу в каждом корпусе выфрезерована вертикальная цилиндрическая емкость для внутреннего раствора соответствующего ИСЭ (5 на Фиг.1) и внутреннего (обычно - хлорсеребряного) электрода (6 на Фиг.1). Эта емкость соединяется с горизонтальным каналом пробы через короткий вертикальный канал, который при изготовлении ИСЭ заполняется материалом ионоселективной мембраны (7 на Фиг.1). В устройство подается калибратор или анализируемый образец (8 на Фиг.1), который заполняет проточный канал (1 на Фиг.1) и затем попадает на электрод сравнения и в слив (9 на Фиг.1).

Устройство, принятое в качестве прототипа, обладает следующими недостатками:

1. Невысокая достоверность результатов анализа из-за погрешностей измерений, вызванных блокированием ячейки пузырьком воздуха за счет подсоса воздуха через межэлементные соединения в процессе анализа образца, а также утечкой растворов через межэлементные соединения. При прокачке анализируемых образцов и стандартных калибровочных растворов (калибраторов) имеется тенденция подсоса воздуха из окружающей среды в ячейку через межэлементные соединения. При этом образуются воздушные пузыри, которые перекрывают канал, препятствуя измерениям. Вероятность появления воздушного пузыря пропорциональна числу соединений, т.е. числу электродов, из которых состоит канал.

2. Короткий срок службы ячейки за счет быстрого выхода сенсоров из строя.

Для визуального контроля состояния ячейки и отдельных электродов их корпуса необходимо изготавливать из прозрачного полимерного материала, поддающегося токарной обработке. В качестве такого материала применяют полиметилметакрилат. Однако адгезия ионоселективных мембран к полиметилметакрилату недостаточно надежна. Происходит постепенное отслоение мембран от корпусов, что приводит к преждевременному выходу сенсора из строя. В результате ячейка-прототип служит в течение 2-3 месяцев.

3. Сложность и высокая стоимость изготовления сенсоров, в особенности формирования мембраны. Процедура изготовления индивидуальных сенсоров представляет собой сложную и дорогостоящую токарно-фрезерную работу с последующим не менее сложным процессом формирования мембраны путем внесения мембранной композиции в соответствующую емкость. При изготовлении прототипа часто происходит только частичное заполнение мембранным материалом соответствующей емкости с образованием воздушных пазух либо, наоборот, частичное или полное блокирование канала пробы материалом мембраны, что приводит к выбраковке части изделий.

Заявленное изобретение свободно от этих недостатков.

Технический результат от использования полученной конструкции (ячейки) выражается в следующем:

- увеличении достоверности результатов анализа и, соответственно, уменьшении количества необходимых измерений за счет исключения погрешностей, вызванных подсосом воздуха или утечкой растворов через межэлементные соединения, благодаря целостности ячейки;

- уменьшении требуемого для анализа объема исследуемой пробы за счет исключения погрешностей анализа, вызванных вышеперечисленными последствиями наличия межэлементных (межсенсорных) соединений, благодаря бесшовному соединению сенсоров;

- упрощении и удешевлении изготовления ячейки из-за исключения проблем, связанных с формированием сложно организованной конструкции из материалов разного сродства;

- увеличении срока ее использования за счет увеличения срока ее службы до 6 месяцев и более благодаря единству материала сенсорных мембран и корпуса проточной ячейки, что предупреждает отслоение мембраны от корпуса ячейки.

Сущность изобретения

Трубчатая проточная мультисенсорная потенциометрическая ячейка для анализа малых объемов жидких образцов представляет собой отрезок поливинилхлоридной трубки, отдельные участки которой содержат те или иные ионофоры и мембранные пластификаторы, внесенные путем диффузионного допирования в стенки трубки, предварительно обработанной летучим растворителем для удаления нативного пластификатора (если присутствовал) и набухания. Эти допированные участки являются сенсорными зонами для потенциометрического определения концентрации ионов в жидком образце, а участки катетера между ними представляют собой чистый поливинилхлорид и служат изоляторами между сенсорными участками. Изолирующие участки препятствуют взаимному загрязнению соседних сенсорных участков ионофорами и пластификаторами, тем самым обеспечивая длительный срок службы проточной ячейки. На внешнюю поверхность сенсорных участков (ионоселективных мембран) нанесен полимерный композит, обладающий электронной проводимостью, с помощью которого на них зафиксированы проводники для подключения сенсоров к измерительному прибору. Ионоселективная сенсорная мембрана в совокупности с полимерным электронопроводящим композитом и проводником для подключения к измерительному прибору представляет собой ионоселективный сенсор. Будучи сформированными (как указано выше) в единой полимерной трубке, чувствительные элементы (сенсоры), в количестве не менее двух, и отделяющие их друг от друга изолирующие участки (длиной не менее 2 мм) оказываются расположенными в ряд без швов, образуя корпус ячейки. Внутренний объем поливинилхлоридной трубки, обработанной, как указано выше, представляет собой емкость для анализируемых образцов. К выходному концу трубки подсоединен электрод сравнения.

Таким образом, получается проточная мультисенсорная потенциометрическая ячейка для анализа малых объемов жидких образцов, содержащая корпус из полимерного материала, представленный расположенными в ряд ионоселективными сенсорами в количестве не менее двух, каждый сенсор имеет чувствительный элемент, выполненный в виде сенсорной мембраны из поливинилхлорида и пластификатора с ионофорами, и снабжен проводником для подключения к измерительному прибору с расстоянием между чувствительными элементами не менее 2 мм, электрод сравнения и емкость для анализируемых образцов, отличающаяся тем, что корпус выполнен трубчатым из поливинилхлорида, а соединение ионоселективных сенсоров выполнено бесшовным.

Схема заявленного устройства проиллюстрирована на Фиг.2.

На Фиг.2 представлена предлагаемая проточная ячейка, элементы конструкции которой обозначены цифрами: 8 - система подачи калибраторов и анализируемых образцов, 9 - электрод сравнения и слив, 10 - рамка-держатель, 11 - поливинилхлоридная трубка, 12 - сенсорные участки, 13 - изолирующие участки, 14 - проводники для подключения сенсоров к измерительному прибору, 15 - проводник для подключения электрода сравнения к измерительному прибору.

Для проведения измерений с помощью предложенной проточной ячейки трубку заполняют калибратором или исследуемым образцом с помощью системы их подачи (8 на Фиг.2). При контакте калибратора или исследуемого образца с поверхностью сенсорного участка на границе раздела жидкой и сенсорной фаз возникает разность электрических потенциалов, которая служит селективным сигналом о концентрации соответствующего иона. Эта разность потенциалов регистрируется вторичным измерительным прибором, к которому подключены сенсоры. После измерения через ячейку прогоняют пузырек воздуха для удаления исследованного образца и заполняют ее последующим образцом или калибратором. По окончании работ ячейку промывают подходящим промывочным раствором, например 1% водным раствором гипохлорита натрия (NaOCl) или деионизованной водой, после чего заполняют воздухом и оставляют до следующего применения.

На базе Санкт-Петербургского государственного университета была подтверждена возможность создания устройства (примеры 1-3), а также были проведены лабораторные исследования, отражающие конкретные примеры реализации указанного изобретения. Полученные результаты лабораторных исследований иллюстрируются Фиг.3-7 и конкретными примерами (4-7).

На Фиг.3 изображены калибровочные кривые сенсоров 1-го вида, содержащих ионообменник KClTPB, полученные в растворах KCl с использованием предлагаемой ячейки, изготовленной по методике, описанной в примере 1. Номера на рисунке соответствуют номерам сенсоров.

На Фиг.4 представлены калибровочные кривые (средние значения) сенсоров 2-го вида, содержащих ионообменник KClTPB и ионофор валиномицин, предлагаемой ячейки, изготовленной по методике, описанной в примере 2. Номера на рисунке отвечают измерениям в сериях растворов KCl (1), NH₄Cl (2) и в растворе 0.1М NaCl (3).

На Фиг.5 представлены калибровочные кривые (средние значения) сенсоров 3-го вида, содержащих ионообменник KClTPB и ионофор нонактин, предлагаемой ячейки, изготовленной по методике, описанной в примере 2. Номера на рисунке отвечают измерениям в сериях растворов NH₄Cl (1), KCl (2) и в растворе 0.1 М NaCl (3).

На Фиг.6 изображены калибровочные кривые сенсоров, содержащих ионообменник KClTPB, полученные в растворах KCl с использованием предлагаемой ячейки, изготовленной по методике, описанной в примере 3. Номера на рисунке отвечают номерам сенсоров.

На Фиг.7 представлены калибровочные кривые (средние значения) сенсоров 1-го вида, содержащих ионообменник KClTPB, полученные в растворах гидрохлорида допамина с использованием предлагаемой ячейки, изготовленной по методике, описанной в примере 1, и выдержанной в растворе гидрохлорида допамина 0.01 М. Номера на рисунке отвечают серии растворов гидрохлорида допамина (1) и растворам KCl 0.01 М (2), HCl 0.0001 М (3) и NaCl 0.01 М (4).

Пример 1. Изготовление мультисенсорной потенциометрической ячейки с ионофорами одного вида

Мультисенсорную потенциометрическую ячейку изготавливали на основе пластифицированной диоктилфталатом поливинилхлоридной трубки с исходным внешним диаметром 2.5 мм и длиной 8 см. Данную трубку выдерживали в 50 мл летучего растворителя - ацетона - в течение 3 суток и затем допировали 6 одинаковых участков на расстоянии 5 мм друг от друга каждый 2-мя порциями по 5 мкл мембранной композиции: раствора, содержащего 2.3 мг катионообменника тетра-п-хлорфенил бората (КСlТФБ) в 470 мкл нелетучего растворителя-пластификатора о-нитрофенилоктилового эфира, с интервалом между нанесением порций композиции в 2 мин. По испарении ацетона внешний диаметр катетера сокращался до 1.7 мм. Затем на поверхность сенсорных зон наносили электронопроводящий полимерный композит, представляющий собой взвесь мелкодисперсного технического углерода в растворе поливинилхлорида в тетрагидрофуране, с помощью которого прикрепляли к сенсорным участкам проводники для подключения к измерительному прибору.

Пример 2. Изготовление мультисенсорной потенциометрической ячейки с ионофорами разных видов

Мультисенсорную потенциометрическую ячейку изготавливали согласно примеру 1 с отличием от описанного в примере 1 способа в том, что допирование осуществляли раствором, содержащим помимо катионообменника тетра-п-хлорфенил бората (КСlТФБ) в количестве 2.3 мг и нелетучего растворителя-пластификатора о-нитрофенилоктилового эфира, взятого в объеме 470 мкл, дополнительно валиномицин (сенсоры 2-го вида) в количестве 10.4 мг либо нонактин (сенсоры 3-го вида) в количестве 7.0 мг.

Пример 3. Изготовление мультисенсорной потенциометрической ячейки с ионофорами разных видов с использованием смешанного растворителя

Мультисенсорную потенциометрическую ячейку изготавливали согласно примеру 1 с отличием от описанного в примере 1 способа в том, что длина исходного катетера составляла 2.5 см, на нем размещалось 3 сенсорных участка, а допирование осуществляли раствором, содержащим помимо валиномицина в количестве 10.4 мг, катионообменника тетра-п-хлорфенил бората в количестве 2.3 мг, 600 мкл смешанного растворителя, содержащего нелетучий пластификатор диоктилфталат и летучий растворитель циклогексанон, взятые в соотношении 2:1 по объему.

Пример 4. Оценка эффективности потенциометрической ячейки, полученной по методике, описанной в примере 1

Ячейку, полученную по методике, описанной в примере 1, подключали к электроду сравнения и измерительному прибору и последовательно пропускали через нее растворы KCl концентрацией от 0.1 до 0.00001 М, объемом 200 мкл. Как видно из Фиг.3, все 6 сенсоров ведут себя аналогичным образом, проявляя в пределах концентрации KCl от 0.1 до 0.0001 М функцию ионов калия с угловым коэффициентом 53.5 мВ на десятикратное изменение активности ионов калия в растворе, что близко к теоретическому Нернстовскому значению. Полученные данные свидетельствует о достоверности результатов, получаемых в результате анализа проб малых объемов. Подсоса воздуха или блокирования канала ячейки не наблюдали.

Пример 5. Оценка эффективности потенциометрической ячейки, полученной по методике, описанной в примере 2

Ячейку, полученную по методике, описанной в примере 2, подключали к электроду сравнения и измерительному прибору и последовательно пропускали через нее растворы KCl концентрацией от 0.1 до 0.00001 М, объемом 200 мкл, NH₄Cl концентрацией от 0.1 до 0.00001 М, объемом 200 мкл и NaCl концентрацией 0.1 М, объемом 200 мкл. Как видно из Фиг.4, 5, калиевые и аммонийные сенсоры проявляют функции соответствующих ионов в пределах концентрации их хлоридов от 0.1 до 0.00001 М с угловыми коэффициентами 53.0 мВ и 60.0 мВ на десятикратное изменение соответственно активности ионов калия и аммония в растворе, что близко к теоретическому Нернстовскому значению. Селективность сенсоров к ионам калия и аммония в присутствии, соответственно, ионов аммония и калия, а также натрия, аналогична таковой для обычных ИСЭ. Это свидетельствует о возможности измерения концентрации ионов калия в случае присутствия ионов аммония и натрия в пробах и ионов аммония в случае присутствия ионов калия и натрия. При этом объем проб, который потребовался для получения достоверных результатов, оказался меньше среднего объема проб у аналогичных устройств и составил 200 мкл. Дальнейшее уменьшение объема пробы возможно при уменьшении масштаба ячейки, см. Примеры 3, 6. Подсоса воздуха или блокирования канала ячейки не наблюдали.

Пример 6. Оценка эффективности потенциометрической ячейки, полученной по методике, описанной в примере 3

Ячейку подключали к электроду сравнения и измерительному прибору и последовательно пропускали через нее растворы KCl концентрацией от 0.1 до 0.00001 М и NaCl концентрацией 0.1 М, объемом 60 мкл. Как видно из Фиг.6, сенсоры проявляют функции ионов калия в пределах концентрации KCl от 0.1 до 0.00001 М с угловыми коэффициентами 56.0 мВ и на десятикратное изменение соответственно активности ионов калия в растворе, что близко к теоретическому Нернстовскому значению. Селективность сенсоров к ионам калия в присутствии ионов натрия аналогична таковой для обычных ИСЭ. Это свидетельствует о воспроизводимости показаний сенсоров: одинаковые сенсорные участки ведут себя одинаковым образом, причем эти показания соответствуют измеряемым концентрациям ионов калия, что свидетельствует о достоверности результатов, получаемых в пробах малых объемов, и о возможности измерений в присутствии ионов натрия. Подсоса воздуха или блокирования канала ячейки не наблюдали.

Пример 7. Оценка эффективности потенциометрической ячейки, полученной по методике, описанной в примере 1, для определения биологически активного компонента допамина

Ячейку, полученную по методике, описанной в примере 1, подключали к электроду сравнения и измерительному прибору и последовательно пропускали через нее растворы гидрохлорида допамина концентрацией от 0.1 до 0.000001 М, а также растворы KCl 0.01 М, HCl 0.0001 М и NaCl 0.01 М. Как видно из Фиг.6, сенсоры проявляли функцию допамина в пределах концентрации гидрохлорида допамина от 0.01 до 0.00001 М с угловым коэффициентом 36.5 мВ на десятикратное изменение активности ионов допамина в растворе, высокую селективность к допамину по отношению к ионам натрия, а также некоторую селективность по отношению к калию и водороду.

Полученные данные говорят о возможности использования полученной ячейки для определения биологически активных компонентов. Подсоса воздуха или блокирования канала ячейки не наблюдали.

Полученные данные свидетельствуют о возможности надежных измерений концентрации различных ионов, как простых неорганических, так и биологически активных, в широких пределах с помощью предлагаемой трубчатой проточной мультисенсорной потенциометрической ячейки, причем селективность измерений та же, что и у обычных ионоселективных электродов и определяется видом ионофора, которым допирован соответствующий сенсорный участок.