УСТРОЙСТВО ВИЗУАЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ С НАНОМЕТКАМИ

Изобретение относится к области люминесцентно-микроскопического анализа биологических объектов, визуализации и регистрации изображений в биологии и медицине и может быть использована в приборостроении для производства высокочувствительных и высокоинформативных приборов, позволяющих получать на основе люминесцентной микроскопии качественные изображения нанометок в биологических тканях.

Известны устройства регистрации изображения биообъектов, которые основаны на различных принципах работы [1-3]. Эти устройства чаще всего реализуются с использованием оптического освещения и регистрации изображения биообъекта при помощи фото- либо видеокамеры. В качестве источников оптического излучения могут выступать лампы, светодиоды и лазеры. Чаще всего подобные устройства содержат оптическую систему для наблюдения и/или фиксирования изображения образца, держатель образца, расположенный напротив объектива оптической системы, источник возбуждения флуоресцентного излучения. Однако эти устройства не позволяют регистрировать изображения специфических областей биологической ткани на фоне ее аутолюминесценции с чувствительностью, необходимой для точного определения локализации этих специфических областей.

Одно из известных устройств визуализации объектов реализовано в виде люминесцентного микроскопа [4] и заключается в том, что при помощи коротковолнового спектрального диапазона широкополосного оптического излучения осуществляется возбуждение люминесценции образца, фоторегистрация которой позволяет получить искомое изображение. Разделение излучения накачки и люминесценции обеспечивается при помощи широкополосного фильтра, что приводит к низкой контрастности изображения нанокристаллических меток в биологических тканях.

Известно так же устройство [5], которое позволяет получить изображение с улучшенным контрастом по сравнению с аналогом [4]. При этом улучшение контраста достигается путем программной обработки изображений, полученных с различными временами задержки. К недостаткам этого устройства относится низкая информативность из-за отсутствия спектральной селективности при регистрации изображения.

Известно устройство для определения локализации специфических областей биологической ткани [6], которое наиболее близко по решаемой технической задаче к заявляемому изобретению и принято в качестве прототипа. Общими признаками у известного устройства и заявляемого изобретения являются использование микроскопической приставки с инфинитной оптикой и системы регистрации изображения. Известное устройство позволяет получать изображения биологического объекта и определять локализацию специфической области по цветовому локусу. Определение локализации специфической области биологического объекта в известном устройстве осуществляется программной обработкой цветового изображения.

Недостатками известного устройства являются невысокая информативность регистрируемого изображения биологической ткани, содержащей атипичные клетки, а также низкая чувствительность системы регистрации изображения люминесцирующих специфических областей на фоне аутолюминесценции биологической ткани, в частности, из-за низкой контрастности получаемых изображений. Кроме того, к недостаткам известного устройства относится ограниченная область исследуемых биологических объектов, что существенно ограничивает возможности его использования.

Заявляемое изобретение свободно от указанных недостатков.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение информативности получаемых изображений и чувствительности при определении специфических областей (локализации в биологических тканях атипических клеток, маркированных нанокристаллическими метками) за счет увеличения контраста изображения, а также существенное расширение круга исследуемых биологических объектов.

Указанный технический результат достигается тем, что в устройстве визуализации биологических объектов, содержащем установленную на штативе микроскопическую приставку с инфинитной оптикой, систему спектральной фильтрации, блок регистрации изображения, осветительную систему и систему обработки изображений, в соответствии с заявленным изобретением, источник осветительной системы выполнен в виде узкополосного светодиодного модуля, дополнительно между микроскопической приставкой с инфинитной оптикой и блоком регистрации изображения установлена система спектральной фильтрации, а между осветительной системой и блоком регистрации изображения установлен блок временной задержки сигналов, входы которого соединены с выходами осветительной системы и системы обработки изображения, а его выходы соединены со входами осветительной системой, системы обработки изображения и блока регистрации изображения, причем система спектральной фильтрации снабжена набором меняющихся полосовых оптических фильтров со ступенчатым изменением коэффициента пропускания.

Кроме того, указанный технический результат достигается тем, что светодиодный модуль имеет набор узкополосных источников в диапазоне 300 нм-650 нм.

Помимо этого, указанный технический результат достигается тем, что штатив снабжен крепежным приспособлением для поворота и фиксации микроскопической приставки с инфинитной оптикой в телесном угле 4π.

Сущность заявляемого изобретения поясняется Фиг.1-4.

На Фиг.1 представлена схема устройства визуализации биологических объектов.

На Фиг.2, иллюстрирующей спектры пропускания, представлены спектральные характеристики набора отрезающих возбуждающий свет оптических фильтров со ступенчатым изменением коэффициента пропускания.

На Фиг.3 и Фиг.4 представлены визуальные изображения люминесцирующих различных нанокристаллических меток в биологической ткани, зарегистрированные при разных условиях освещения и регистрации изображений.

Как видно из Фиг.1 заявляемое изобретение содержит микроскопическую приставку с инфинитной оптикой (1), систему спектральной фильтрации (2), блок регистрации изображения (3), систему обработки изображения (4), блок временной задержки сигналов (5), осветительную систему (6) в составе со светодиодным источником оптического излучения (7), штангу штатива (8) с крепежным приспособлением (9) для поворота и фиксации микроскопической приставки, штатив (10) для фиксации осветительной системы и закрепления исследуемого объекта (11).

На Фиг.1 изображена схема устройства. Конструктивная компоновка устройства выполнена в двух модулях. Микроскопическая приставка с инфинитной оптикой (1) с системой спектральной фильтрации (2) и блок регистрации изображения (3) крепится на штанге штатива (8), предназначенном для работы с протяженными предметами и объектами, имеющими сложную форму. Штатив снабжен крепежным приспособлением (9), при помощи которого микроскопическая приставка устанавливается на нужную высоту, плавно перемещается в горизонтальной плоскости, поворачивается и фиксируется относительно наблюдаемого объекта в телесном угле 4π. Осветительная система (6) со светодиодным модулем (7) крепится на отдельном штативе (10), предназначенном для закрепления исследуемого объекта (11), что позволяет гибко изменять условия освещения и наблюдения протяженных объектов.

Работа заявляемого устройства определения локализации атипичных клеток по люминесценции нанокристаллических меток в биологических тканях осуществляется следующим образом. На оптическом выходе микроскопической приставки с инфинитной оптикой (1) формируется параллельный световой пучок, что позволяет избежать смещения спектральных характеристик оптических фильтров при косом падении лучей, смонтирована система спектральной фильтрации (2) сигнала люминесценции меток - набор отрезающих возбуждающий свет оптических фильтров со ступенчатым изменением коэффициента пропускания (Фиг.2). Спектры пропускания фильтров имеют резкую границу со стороны коротких длин волн, чтобы надежно отрезать рассеянное объектом излучение монохроматического источника возбуждения от сдвинутого в красную область спектра люминесценции нанокристаллических меток.

Блок временной задержки сигнала совместно с программным интерфейсом блока регистрации изображения позволяет гибко и оперативно производить регистрацию с селекцией по времени сигналов люминесцирующих меток, имеющих характерные времена высвечивания в диапазоне 0,1-10 мс, от быстрой аутолюминесценции биологических тканей (0,1-10 нс).

Управление регистрацией сигналов люминесценции и отображением информации производится на основе системы обработки изображения с программными модулями управления осветительной системы и блока регистрации изображения, что обеспечивает управление приемом и обработки изображений с блока регистрации изображения с сохранением всех данных в памяти системы обработки изображения (4).

Первоначально выбирается требуемый для возбуждения специфической метки источник светодиодного модуля (7), включается осветитель, на компьютере запускается программное обеспечение блока регистрации изображения (3), выбирается требуемое увеличение микроскопической приставки с инфинитной оптикой (1), по изображению на мониторе производится фокусировка микроскопической приставки на объект (11), выбирается требуемый светофильтр в системе спектральной фильтрации (2), выбирается требуемый уровень освещенности объекта, экспозиция, при работе в стробоскопическом импульсном режиме выбирается время задержки начала экспозиции. Производится наблюдение люминесценции и, при необходимости, регистрация изображений.

Заявленное изобретение было апробировано в лабораторных условиях Санкт-Петербургского государственного университета в режиме реального времени.

В результате экспериментов было подтверждено достижение указанного технического результата: за счет получения высокой контрастности изображения и определения точной локализации атипичных клеток по люминесценции нанокристаллических меток на фоне свечения биологической ткани была получена высокая по сравнению с аналогами информативность и чувствительность.

Тестовые режимы работы заявляемого изобретения приведены в конкретных примерах ее апробации с тканью биологического объекта.

Пример 1. Ткань биологического объекта с нанокристаллическими метками на основе допированного неодимом граната. Освещение производилось в постоянном режиме светодиодом с длиной волны излучения 560 нм, попадающей в полосу поглощения данных меток. В системе фильтрации выбирался фильтр с границей пропускания 750 нм, пропускающий полосу люминесценции нанометок и отрезающий посторонний свет. Пример изображения люминесцирующих нанометок представлен на Фиг.3.

Пример 2. Ткань биологического объекта с нанокристаллическими метками на основе допированного европием ванадата иттрия. Освещение производилось в импульсном режиме светодиодом с длиной волны излучения 405 нм, попадающей в полосу поглощения данных нанометок. Частота импульсов - 12 Гц, скважность 23%. Задержка начала экспозиции относительно заднего фронта импульса возбуждения составляла 5 мс. В системе фильтрации выбирался фильтр с границей пропускания 650 нм, пропускающий полосу люминесценции нанометок. Пример изображения люминесцирующих нанометок в биологической ткани при регистрации изображения с временной задержкой представлен на Фиг.4.

Как показали результаты апробации, заявляемое изобретение позволяет с высокой информативностью и высокой чувствительностью визуализировать в тканях биологических объектов локализацию атипичных клеток и регистрировать качественное контрастное изображение люминесценцентных нанокристаллических маркеров на основе оксидных нанокрсталлических частиц, допированных редкоземельными элементами, на фоне свечения биологической ткани. Наличие системы фильтрации регистрируемого излучения со сменными светофильтрами с разным спектральным положением края оптического пропускания и блока регистрации изображения с временной задержкой позволяет за счет существенного уменьшения фонового сигнала от рассеянного света источников возбуждения и от аутолюминесценции биологических тканей повысить не только визуализацию атипичных клеток в биологических тканях, но и диагностировать (в перспективе) по характеру их локализации распознаваемость конкретных заболеваний.

Заявленное изобретение имеет более высокие возможности по сравнению с аналогами по визуализации и изучению разнообразных видов биологических тканей, что существенно повышает ее информативность для создания целого комплекса по определению локализации атипичных клеток в биологических объектах, а в перспективе и их диагностирование.

Кроме того, появляется также возможность применения заявленного изобретения визуализировать локализацию атипичных клеток в тканях биологических объектов и в случае одновременного использования различных нанокристаллических маркеров, отличающихся по спектру люминесценции.

Список использованной литературы:

1. Патент RU 2166201

2. Патент RU 85687

3. Патент RU 99102349

4. P.M. Рагузин // Авторское свидетельство SU 678449, 1979.08.05 //

5. Munoz Leo, Jose // European Patent EP2144272 //

6. CARL ZEISS MEDITEC AG, C. Hauger, R. Guckler, H. Jess, J. Stefen, W. Nahm // WO201297924 // - Прототип