СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МОДУЛЯТОРОВ КАТЕХОЛ О-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ

Настоящее изобретение относится к способу идентификации модуляторов активности фермента катехол-O-метилтрансферазы.

Катехол-O-метилтрансфераза (СОМТ) катализирует O-метилирование субстратов, у которых есть катехоловая часть. Донором метила в метилировании, которое осуществляет СОМТ, является S-аденозилметионин (SAM). СОМТ играет важную роль в катаболизме эндогенных катехоламиновых нейротрансмиттеров, катехолэстрогенов и ксенобиотиотических молекул. Ингибирование СОМТ является важным подходом в разработке новых терапевтических способов лечения болезни Паркинсона.

W.F. Herblin (Analytical Biochemistry 51, 19-22, 1973) описывает колориметрический анализ для оценки активности СОМТ. В данном анализе в качестве акцептора метила для СОМТ используется нитрокатехол. Нитрокатехол существует в виде желтого раствора в воде при кислом рН с максимумом поглощения при длине волны 350 нм. При небольшой щелочной ионизации рН пара-гидроксилы меняют раствор на оранжевый (λmax = 430 нм). При более сильной щелочной ионизации мета-гидроксилы меняют раствор на вишнево-красный (λmax = 520 нм). Анализ основан на наблюдениях, что нитрокатехол метилируется при помощи СОМТ и что метилированный нитрокатехол не показывает вишнево-красный цвет в результате второй ионизации. В этом анализе субстрат (нитрокатехол) и SAM должны быть в µМ концентрациях в диапазоне, который находится на уровне или выше Km, что ограничивает чувствительность.

Г. Zurcher и М. Da Prada (Journal of Neurochemistry, Vol.38, №1, 1982) описывает одношаговый радиохимический анализ для оценки активности СОМТ. В этом анализе катехол превращен в гуаякол, меченный тритием, соединение с очень низкой полярностью, путем инкубации СОМТ с [³H]метил SAM, Mg²⁺ и аденозиндезаминазой. Гуаякол экстрагируется при помощи среды с низкой полярностью, например толуолом, и подсчитывается в сцинтилляционных счетчиках.

Описанные выше анализы не предназначены для автоматизированного скрининга большого числа соединений для оценки их модулирующего влияния на активность СОМТ из-за ограниченной чувствительности (колориметрический анализ) или в связи со структурой анализа (этап экстракции в радиохимическом анализе).

Таким образом, существует необходимость в чувствительном гомогенном способе анализа, подходящем для скрининга большого числа соединений на предмет их модулирования активности СОМТ.

В первую очередь настоящее изобретение предусматривает способ идентификации модуляции активности фермента катехол-O-метилтрансферазы (СОМТ), включающий следующие этапы:

а) получение субстрата СОМТ с ковалентно связанным флуоресцентным красителем,

б) взаимодействие молекулы из этапа а) с ферментом катехол-O-метилтрансферазой (СОМТ), S-аденозилметионином (SAM) и соединением-кандидатом и

в) измерение показателей флуоресценции смеси из этапа б), в котором измененные показатели флуоресценции в присутствии соединения-кандидата по сравнению с контролем являются показательными для модулятора фермента катехол-O-метилтрансферазы (СОМТ).

В предпочтительном воплощении данный способ является способом для идентификации ингибиторов СОМТ, в котором сниженные показатели флуоресценции на этапе с), по сравнению с контролем, являются показательными для ингибитора СОМТ.

В еще одном предпочтительном воплощении субстратом для СОМТ является 4-нитрокатехол.

В еще одном предпочтительном воплощении флуоресцентным красителем является Alexa Fluor ® 488.

В еще одном предпочтительном воплощении показатели флуоресценции на этапе с) являются кинетическими показателями.

В еще одном предпочтительном воплощении СОМТ является человеческой СОМТ.

В еще одном предпочтительном воплощении способ является способом высокопроизводительного скрининга.

В еще одном предпочтительном воплощении способ выполняется на микропланшете.

В еще одном предпочтительном воплощении конечная концентрация СОМТ составляет приблизительно 25 нМ.

В еще одном предпочтительном воплощении конечная концентрация субстрата СОМТ составляет приблизительно 200 нМ.

В еще одном предпочтительном воплощении конечная концентрация SAM составляет приблизительно 500 нМ.

Во вторую очередь, настоящее изобретение предусматривает способ идентификации субстрата для фермента катехол-O-метилтрансферазы (СОМТ), включающий следующие этапы:

а) получение смеси, содержащей субстрат для СОМТ, ковалентно связанный с флуоресцентным красителем и S-аденозилметионин (SAM),

б) контактирование смеси из этапа а) с различными концентрациями соединения-кандидата,

в) контактирование смеси из этапа б) с ферментом катехол-O-метилтрансферазой (СОМТ) и

г) измерение кинетических показателей флуоресценции смеси из этапа в), в котором уменьшение показателей плато флуоресценции как функция от увеличения концентрации соединения-кандидата является показательным для субстрата фермента катехол-O-метилтрансферазы (СОМТ).

В предпочтительном воплощении субстратом СОМТ является 4-нитрокатехол.

В еще одном предпочтительном воплощении флуоресцентным красителем является Alexa Fluor ® 488.

Краткое описание фигур.

Фиг.1 показывает химическую структуру Alexa Fluor ® 488, ковалентно связанного с 4-нитрокатехолом;

Фиг.2 показывает константу тушения Штерна-Вольмера для нитрокатехола (синий), 2-метокси-5-нитрофенола (красный) и 1,2-диметокси-4-нитробензола (зеленый); 20 нМ свободного Alexa Fluor 488 были смешаны с высокими - до 25 мМ - концентрациями нитрокатехола, 2-метокси-5-нитрофенола и 1,2-диметокси-4-нитробензола, соответственно. Только для нитрокатехола наблюдается изменение интенсивности флуоресценции (I₀/I) Alexa Fluor ® 488, метилированные продукты не влияют на интенсивность флуоресценции Alexa Fluor ® 488.

Фиг.3 показывает ферментную кинетику метилирования Alexa Fluor 488 - нитрокатехола, катализируемое СОМТ, в флуоресцентном анализе настоящего изобретения;

Фиг.4а показывает измерения кинетики изменения интенсивности флуоресценции в присутствии различных концентраций ингибитора СОМТ Толкапона;

Фиг.4б показывает дозозависимую кривую для Толкапона, рассчитанную по уклону кинетических измерений на фиг.3а;

Фиг.5 показывает флуоресцентный анализ в присутствии дофамина, естественного субстрата СОМТ. Снижение плато было достигнуто при увеличении концентрации дофамина. Так как дофамин является субстратом, он метилируется так же, как и субстрат Alexa Fluor ® 488-нитрокатехол. Доступность SAM ограничена (500 нМ), так что при высокой концентрации дофамина субстрат Alexa Fluor ® 488-нитрокатехол больше не может быть полностью метилированным.

Фиг.6 показывает дозозависимые кривые для субстрата с низкой (500 нМ) и высокой (200 мкМ) концентрацией SAM и для каждой концентрации SAM наличие и отсутствие предварительной инкубации соединения и SAM в течение одного часа, предшествующее добавлению субстрата Alexa Fluor ® 488-нитрокатехола. Предварительная инкубация с низкой концентрацией SAM сдвигает кривую к нижнему IC₅₀, потому что соединение использует весь доступный SAM. При высоких концентрациях SAM нет никакой разницы между наличием и отсутствием предварительной инкубации, потому что SAM не является ограничивающим фактором и кривая смещается в сторону большего IC₅₀ по сравнению с низкой концентрацией SAM из-за истощения соединения.

Фиг.7 показывает дозозависимые кривые с низкой (500 нМ) и высокой (200 мкМ) концентрацией SAM снова с наличием и в отсутствие одного часа предварительной инкубации соединения с SAM из SAM-конкурентных соединений. Для SAM конкурентных соединений наличие и отсутствие предварительной инкубации не влияет на IC₅₀ для каждой концентрации SAM, но при высокой концентрацией SAM IC₅₀ смещается в сторону больших значений.

Подробное описание изобретения.

Анализ настоящего изобретения основан на полученных данных, что флуоресцентный краситель, ковалентно связанный с субстратом для СОМТ, например Alexa Fluor ® 488 ковалентно связанный с нитрокатехолом, показывает снижение флуоресценции за счет внутримолекулярного гашения и что метилирование субстрата СОМТ в комплексе субстрат СОМТ - флуоресцентный краситель при помощи СОМТ отменяет гашение флуоресценции, т.е. метилирование сустрата СОМТ в комплексе субстрат СОМТ - флуоресцентный краситель приводит к увеличению флуоресценции по сравнению с неметилированным комплексом.

Термин "СОМТ" используется в данном документе для обозначения природной последовательности СОМТ от любого животного, например, млекопитающих, видов, включая человека, и вариантов СОМТ (которые определены ниже). Полипептиды СОМТ могут быть выделены из различных источников, в том числе типов человеческих тканей или подготовлены рекомбинантными и или синтетическими методами.

Природная или рекомбинантно-полученная СОМТ может быть использована в данном анализе. «Рекомбинантный белок» представляет собой белок, выделенный, очищенный или идентифицированный в силу экспрессии в гетерологичных клетках, о которых говорят, что клетки были трансдуцированы или трансфицированы, либо временно либо стабильно, при помощи рекомбинантного экспрессирующего вектора, разработанного для управления экспрессией белка в клетке-хозяине. Рекомбинантная СОМТ может быть получена в прокариотических клетках, например, E.coli, в дрожжах, например в S.pombe, или в эукариотических клетках, например, в HEK 293 (человеческая эмбриональная почка, трансформированная ДНК аденовируса), в клетках насекомых Sf9. Предпочтительно, клетки насекомых Sf9 используются для высокой экспрессии рекомбинантной СОМТ. СОМТ, используемая в анализе, может быть очищена. Термин "очищенный", как он используется в данном документе, относится к полипептидам, которые удалены из их естественного окружения или от источника рекомбинантного производства, изолированы или разделены, по крайней мере на 60% и более, предпочтительно по меньшей мере 80%, свободны от других компонентов, например, мембран и микросом, с которыми они естественным образом связаны.

«Природная последовательность СОМТ» относится к полипептиду, имеющему такую же аминокислотную последовательность, как и полипептид СОМТ, встречающийся в природе, независимо от способа его изготовления. Природная последовательность СОМТ может быть изолирована из природы или изготовлена с помощью рекомбинантных и/или синтетических методов. Термин «природная последовательность СОМТ» более точно охватывает встречающиеся в природе укороченные или секретируемые формы, природно встречающиеся варианты форм (например, формы альтернативного сплайсинга) и природно встречающиеся аллельные варианты СОМТ. Идентификатором полипептида человеческой СОМТ в базе данных NCBI является ААА68927 (Seq. Id. No. 1).

Термин "вариант СОМТ" относится к варианту аминокислотной последовательности природной последовательности СОМТ, содержащему одну или более аминокислотную замену, и/или делецию, и/или вставку в природную последовательность. Варианты аминокислотной последовательности, как правило, по меньшей мере приблизительно на 75%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 95% идентичны последовательности природной аминокислотной последовательности СОМТ.

Термин "соединение" используется в данном документе в контексте "тест-соединение" или "лекарственное соединение-кандидат", описанное в связи с анализами настоящего изобретения. По существу, эти соединения содержат органические или неорганические соединения, полученные синтетически или из природных источников. Соединения включают неорганические или органические соединения, такие как полинуклеотиды, липиды или аналоги гормонов, которые характеризуются относительно низким молекулярным весом. Другие биополимерные органические тест-соединения включают пептиды, содержащие приблизительно от 2 до приблизительно 40 аминокислот, и более крупные полипептиды, содержащие от приблизительно от 40 до приблизительно 500 аминокислот, такие как антитела или конъюгаты антител.

Термин «кинетический показатель» относится к разнице флуоресцентного сигнала, измеренного в двух определенных моментах времени в линейной части ферментативной реакции. Одно измерение производится в начале ферментативной реакции (старт точка) и второй показатель снимается после инкубационного периода (конечная точка). Окончательный сигнал рассчитывается в оеф / мин (оеф (конечная точка) - оеф (старт точка)) / инкубационный период. (оеф: относительные единицы флуоресценции).

Способ настоящего изобретения может быть использован для идентификации соединений, которые ингибируют фермент катехол-O-метилтрансферазу (СОМТ). Таким образом, ингибиторы СОМТ, определенные способом настоящего изобретения, могут быть использованы в методах лечения, профилактики, или контроля заболеваний, в которых играет роль дезактивация экстранейрональных катехоламинов за счет СОМТ, например, для профилактики или контроля депрессий. В этом случае соединения по изобретению могут быть использованы в качестве индивидуальных соединений или в комбинации с другими терапевтически активными веществами, которые благоприятно влияют на течение болезни. Соединения по изобретению также могут быть использованы в качестве одного из препаратов совместно с другими терапевтически активными веществами.

Способ настоящего изобретения может быть использован для определения активности СОМТ в образцах тканей животных, которым было введено тест-соединение. Например, анализ подходит для определения активности СОМТ в образцах мозга и ткани печени от животных, например, мышей и крыс, которые были обработаны тест соединением (модулятором СОМТ).

Экспериментальная часть.

Синтез 4-нитрокатехол - Alexa Fluor ® 488

10 мМ раствор Аминоэтил-нитро-бензкатехин [1] в DMSO, содержащий 1% Триэтиламина, смешивали с 10 мМ раствором Alexa Fluor ® 488 сукцинимидил эфира карбоновой кислоты [2] (Invitrogen Corporation, 5791 Van Alien Way, Carlsbad, California 92008) в DMSO с 1% Триэтиламином в стехиометрическом соотношении 1:1. Реакционную смесь аккуратно перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и очищали на Akta Explorer 100 обращенно-фазовой ВЭЖХ. Продукт лиофилизировали и ресуспендировали в DMSO.

4-Нитрокатехол-Alexa Fluor® 488

Протокол флуоресцентного анализа.

Следующий протокол анализа, реагенты и материалы были использованы в примерах настоящего изобретения. Результаты примеров описаны в фигурах 1-7.

Микропланшеты:

384-луночный микропланшет, Corning black с плоским прозрачным дном, не связывающая поверхность, полистирол (ref. 3655)

Реагенты и буферные растворы:

- Буферные растворы:

- М фосфатный буфер рН 7,6 (Na₂HPO4 Fluka 71644, NaH₂PO4 Merck 6346.0500), хранится при температуре 4°С

- 580 мМ MgCl₂ (Merck 1.0833.0250), хранится при комнатной температуре

- 1 М CaCl₂, хранится при температуре 4°С

- 65 мМ DTT (Sigma D-0632), хранится при температуре -20°С

- Рекомбинантная человеческая СОМТ: изготовленная самостоятельно, хранится при -80°С

- 4-Нитрокатехол-А1еха Fluor 488: изготовленный самостоятельно, 1,3 мМ в DMSO, хранится при комнатной температуре в темноте

- S-Аденозил-метионин: 10 мМ в НаО (Sigma-Aldirch A2804), хранится при температуре -20°С

Реагенты и буферные растворы:

- Буфер для анализа (конечные концентрации):

- 40 мМ, Фосфатный буфер рН 7,6

- 2,88 мМ MgCl₂

- 0,9 мМ DTT

- 0,25 мм CaCl₂

- Разведения соединения: разведения в 100% DMSO (Sigma 41640), 6,25% конечная концентрация DMSO в анализе

- Рек. человеческая СОМТ: 80 нМ в буфере для анализа, 25 нМ конечная концентрация для анализа

- 4-Нитрокатехол-Alexa Fluor ® 488: 320 нМ в буфере для анализа, 200 нМ конечная концентрация для анализа

- S-Аденозил-метионин: 800 нМ в буфере для анализа, 500 нМ конечная концентрация для анализа

Способ анализа:

10 мкл hCOMT (человеческой СОМТ)

2 мкл тест соединения

1 мин на шейкере

20 мкл смеси субстрат-SAM

5 минут на шейкере

Показания счетчика: кинетические измерения на плато: изображение ТМ ридера (поглощение 475(40) нм, излучение 535(45) нм), интенсивность 7,5%, время экспозиции 1 сек.