СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ МЕНСТРУАЛЬНОЙ ФУНКЦИИ НА ФОНЕ СИНДРОМА ПОЛИКИСТОЗНЫХ ЯИЧНИКОВ У ДЕВОЧЕК-ПОДРОСТКОВ

Изобретение относится к области медицины, а именно гинекологии и эндокринологии, и может быть использовано для раннего выявления нарушений менструальной функции (НМФ), возникающих на фоне синдрома поликистозных яичников (СПКЯ).

Синдром гиперандрогении (ГА) является одной из наиболее актуальных проблем в эндокринологии и гинекологии. Важность этого заболевания в первую очередь определяется высокой распространенностью в популяции и доказанной ассоциацией с метаболическими расстройствами, сахарным диабетом 2 типа, сердечно-сосудистыми заболеваниями и бесплодием (Петеркова В.А., Семичева Т.В., 2005). Манифестация симптомов ГА может происходить в различные возрастные периоды, однако у большинства женщин первые предпосылки к развитию заболевания проявляются в период становления пубертата. Синдром ГА включает в себя следующие заболевания: синдром поликистозных яичников (СПКЯ), неклассическая форма врожденной гиперплазии надпочечников (ВГН), изолированная андрогензависимая дермопатия. НК-ВГН является исключением из этого ряда в связи с тем, что патогенез этого заболевания известен. Остальные не только не имеют четких данных о патогенезе, но и являются диагнозом исключения или другими словами - не имеют четкого определения (Марцинковская В.В., Жук С.И., 2007).

Особый интерес вызывает изучение факторов, которые влияют на фолликулогенез и могут препятствовать наступлению овуляции, приводя к кистозному перерождению яичников. Ряд исследователей считают, что нарушения фолликулогенеза при СПКЯ в наибольшей степени обусловлены повышением андрогенов яичникового происхождения. В свою очередь, высокие уровни андрогенов подавляют созревание фолликулов на разной стадии и приводят к формированию типичных увеличенных яичников с множеством мелких фолликулов.

Современные международные диагностические критерии включают в себя следующие признаки: во-первых, наличие ановуляции, которая выражается в олигоменореи или аменореи, во-вторых, в признаках гиперандрогении яичникового генеза, которая выражается клинически (наличие гирсутизма) или по изменению биохимических показателей (повышение уровней андрогенов) и, в-третьих, в морфологических признаках мульфолликулярных яичников (определяется при ультразвуковом исследовании). Наличие двух из этих трех признаков является современным диагностическим критерием СПКЯ (The Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS consensus workshop group, 2004).

Метод диагностики менструальной дисфункции, возникающей на фоне синдрома поликистозных яичников на основании только клинической симптоматики весьма неспецифичен, поскольку нарушения менструального цикла могут встречаться в пубертатном периоде достаточно часто и носить при этом функциональный транзиторный характер, будучи обусловлены несовершенством и незрелостью репродуктивной системы. Подобные нарушения в этом возрасте могут зависеть от длительности становления менархе, эмоционального состояния подростка, степени выраженности умственной и физической нагрузки, воздействия различных негативных факторов внутренней и внешней среды, для которых организм девочки-подростка в данный возрастной период наиболее уязвим. Известен способ диагностики синдрома поликистозных яичников, заключающийся в том, что определяют наличие следующих симптомов: увеличение яичников, нарушение ритма менструаций, ановуляция, а также гирсутного синдрома, ожирения, которые являются облигатными (непостоянными) признаками (Пермяков Н.К., Алиева Э.А., 1989).

Известен способ диагностики синдрома поликистозных яичников на основании таблицы клинико-лабораторных показателей (Крупко-Большова Ю.А., Корнилова А.И., 1990). Способ объективизирует диагностику заболевания, но имеет ряд существенных недостатков, в числе которых следующие: характеристика НМФ при данном заболевании не охватывает всего спектра нарушений и упрощена; характеристика степени гирсутизма необъективна и не отражает переходных состояний; - использование признака "ожирение 1-й и 2-й степени" необъективно, так как является облигатным признаком; некорректно использование базальной температуры для дифференциальной диагностики тяжести заболевания, так как и моно-, и двухфазная базальная температура могут иметь место при любой степени тяжести заболеваний; не является информационным показатель типа мазка - эстрогенный или андрогенный; а определение гонадотропных и половых гормонов по экскреции с мочой является устаревшим методом и признан малоэффективным.

В связи с этим существует необходимость разработки объективного метода ранней диагностики формирующегося СПКЯ у девочек-подростков для выбора наиболее оптимальных программ лечения и мониторинга их эффективности.

Предпринимались попытки диагностировать СПКЯ на основании эхографической картины яичников, трактовка результатов которой может носить весьма неоднозначный характер. Поскольку до 16-17 лет у подростков 80% циклов являются ановуляторными, эхографические признаки мультифолликулярных яичников и отсутствие доминантного фолликула могут считаться вариантом физиологической нормы, как при регулярном менструальном цикле, так и при различных нарушениях менструального цикла в пубертатном периоде (Саидова Р.А., 1999). У подростков поликистозные яичники необходимо дифференцировать с мультикистозными. Множественные кисты в яичниках считаются нормальным физиологическим явлением в пубертате, они регрессируют параллельно с развитием овуляторной функции. Для повышения точности эхографической диагностики СПКЯ выделяют количественные показатели - ЯМИ (в норме 3,5), повышение которого имеет важное значение для уточнения диагноза СПКЯ. У подавляющего большинства больных (91%) выявляется уменьшение переднезаднего размера матки при одновременном увеличении размеров и объема яичников (98%). У 90% больных яичниково-маточный индекс составляет более 3,5.

Также неудачными оказались попытки связать факт избыточной продукции тех или иных андрогенов с развитием дисфункции яичников. При изучении широкого спектра андрогенов и их предшественников при синдроме ГА у девочек-подростков показано отсутствие универсальных гормональных маркеров ГА; выявлено, что до 15% случаев этого заболевания протекает без гиперандрогенемии, и степень повышения андрогенов не коррелирует с выраженностью клинических симптомов (Богданова П.С., Карева М.А, 2010).

Так как по данным современной литературы СПКЯ развивается в организме девочек в результате нарушения физиологического ритма продукции гонадолиберинов, то пытались определять соотношение ЛГ и ФСГ, которое отражает состояние высших регуляторных центров (Trent M.E., Rich М V, Austin S.B., 2003). В норме ЛГ/ФСГ до менархе всегда меньше 1, более года после менархе колеблется от 1 до 1,5, более 2 лет - от 1,5 до 2 (Коколина В.Ф., 2001). Если для женщин фертильного возраста значение индекса ЛГ/ФСГ более 2 является патогномоничным для СПКЯ, то для подростков ЛГ/ФСГ более 1,5 так же является патогномоничным для СПКЯ. В то же время только 20% обследуемых девочек-подростков индекс ЛГ/ФСГ был более 1,5, но менее 2, то есть данные метод диагностики обладает низкой точностью (Безуглова Н.Г, 2005).

Известен также способ диагностики, выбранный в качестве прототипа (Чайка В.К., Матыцина Л.А., Иотенко Б.А. Способ диагностики синдрома поликистозных яичников у девочек-подростков, 1999), предусматривающий определение уровня гормонов в крови у девочек со времени начала менархе, оценку численного значения степени гирсутизма и яичниково-маточного индекса, после чего рассчитывают степень тяжести СПКЯ по формуле:

y=0,02012p1+040292Iп(t)+0,07243р-1,12114п(tm)-0,04008b+0,07146gir+0,07565ями+3,74045, где y - степень тяжести заболевания; p1 - уровень пролактина, определяемый в крови иммунофлюоресцентным методом, нг/л; p - уровень прогестерона в сыворотке крови, нмоль/л; t - уровень тестостерона в сыворотке крови, нмоль/л; b - уровень тестостерон-эстрадиол (связывающего глобулина), нмоль/л; gir - степень гирсутизма; ями - яичниково-маточный индекс; tm - толщина матки, мм; при этом, если значение у 0,5, считают девочку здоровой; 0,5<y<1,0 - относят к группе риска по развитию СПКЯ; 1,0<y<2,0 - диагностируют легкую степень течения СПКЯ; 2,0<y<3,0 - средняя степень течения СПКЯ; y>3,0 - тяжелое течение СПКЯ.

Недостатками данного способа являются:

- его трудоемкость,

- арифметическая сложность для поликлинического врача,

- не учитывается высокая вариабельность значений пролактина и прогестерона в зависимости от фазы менструального цикла,

- не оправдана привязка к гирсутному числу, так как тяжесть андрогензависимой дермопатии не коррелирует с выраженностью овариальной дисфункции, а определяется активностью соответствующего рецепторного аппарата.

Данные недостатки способа-прототипа снижают его точность и достоверность.

Задача изобретения: разработка более доступного, точного, достоверного способа диагностики нарушений менструальной функции на фоне синдрома поликистозных яичников у девочек-подростков.

Поставленная цель достигается тем, что у девочек-подростков на 3-5 день менструального цикла проводят определение уровня антимюллерова гормона в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа, и если его уровень превышает 5,2 нг/мл, диагностируют нарушения менструальной функции на фоне синдрома поликистозных яичников.

Технический результат от использования метода: повышение точности, снижение уровня погрешности, расширение возрастного диапазона обследуемых пациентов, что позволит своевременно провести соответствующие лечебные мероприятия СПКЯ, что в дальнейшем будет способствовать укреплению репродуктивного здоровья будущих женщин.

Антимюллеров гормон или ингибирующее вещество Мюллера (АМГ/ИВМ, AMH/MIS) - димерный гликопротеин относится к семейству β-трансформирующих факторов роста. У женщин от момента рождения и до наступления менопаузы АМГ продуцируется гранулезными клетками яичников. У женщин уровень АМГ в сыворотке крови относительно низкий вплоть до наступления пубертата. Концентрация АМН у женщин коррелирует с числом антральных фолликулов, с возрастом лучше всего отражает снижение репродуктивной функции у здоровых женщин с доказанной фертильностью. Овариальный резерв пациентки по результатам тройного теста (ингибин В, АМН и ФСГ на 3-й день цикла) сравнивается с ожидаемым резервом для данного возраста, что позволяет контролировать репродуктивную функцию. Синтез АМГ происходит в гранулезных клетках первичных фолликулов. Максимальное количество АМГ в преантральных и антральных фолликулах диаметром 4 мм и не экспрессируется в доминантных фолликулах. После выбора доминантного фолликула экспрессия АМГ снижается. Если количество антральных фолликулов уменьшается, экспрессия АМГ тоже снижается. При дальнейшем развитии фолликула его синтез снижается и практически отсутствует (ФСГ-зависимые стадии) при размере фолликулов более 8-9 мм в нормальных яичниках, что является необходимым условием для селекции доминантного фолликула. Выделяют два основных действия АМГ на яичник: во-первых, он подавляет первичные стадии роста фолликулов; во-вторых, подавляет ФСГ-зависимый рост и селекцию преантральных и небольших антральных фолликулов. Считается, что АМГ не находится под контролем гонадотропных гормонов (ФСГ, ЛГ) и адекватно отражает количество фолликулов. Поэтому его определение считается важным тестом как маркера для определения фолликулярного резерва яичника (оценка числа функционально активных фолликулов в яичниках женщины т.е. количество яйцеклеток у женщин в данный момент времени, которые могут быть использованы для оплодотворения), также для оценки овариальной дисфункции и овариального старения (Назаренко Т.А., Мишиева Н.Г., Фанченко Н.Д., 2005). Пониженные значения АМГ свидетельствуют о снижении овариального резерва. Синдром гиперандрогении - состояние в некотором смысле противоположное преждевременному истощению яичников. Локальное повышение уровня андрогенов в ткани яичника приводит к чрезмерной инициации развития фолликулов, при этом количество примордиальных и первичных фолликулов значительно увеличивается, в результате чего поднимается и уровень АМГ. Таким образом, этот показатель четко отражает степень нарушения фолликулогенеза в яичниках (Богданова П.С., Карева М.А., 2010).

Эти выводы были подтверждены нашими исследованиями, выявившими прямую зависимость между повышенным уровнем андрогенов в плазме крови, повышением уровня АМГ и эхографическими особенностями яичников, в частности увеличением их объема и количества фолликулов до 8 мм в диаметре.

Заявляемый способ исключает наличие субъективизма, не зависит от возраста, эмоционального статуса и позволяет врачу с высокой достоверностью по уровню АМГ в сыворотке крови определить степень риска развития овариальной дисфункции в дальнейшем, а также исключить гипердиагностику СПКЯ у девочек-подростков, своевременно назначить наиболее адекватную патогенетическую терапию. Эта мера будет способствовать восстановлению менструальной функции и улучшению показателей репродуктивного здоровья девочек-подростков.

Нашими исследованиями показано, что уровень АМГ у здоровых девочек-подростков контрольной группы колебался от 2,1 до 4,9 нг/мл и в среднем составил 3,4±0,2 нг/мл.

У пациенток с возрастом менархе не менее 2 лет, имеющих повышение показателей андрогенов в крови (тестостерон, андростерон или дегидроэпиандростерон), а также проявления андрогензависимой дермопатии и нормальный менструальный цикл, либо у пациенток без андрогензависимой дермопатии, с повышением показателей андрогенов в крови и нерегулярный менструальным цикл, определяют уровень АМГ в крови на 3-5 день менструального цикла. При значениях АМГ от 5,2 и выше расценивают как угрожаемых по развитию и прогрессированию, овариальной дисфункции; при уровне АМГ более 8,2 нг/мл в сочетании с наличием эхографических признаков мультифолликулярных яичников диагностируют как формирующийся СПКЯ.

Подробное описание способа и примеры его конкретного выполнения.

У пациенток 15-17 лет из группы риска по развитию СПКЯ на 3-5 день цикла производят сыворотки крови, утром натощак.

Уровень АМГ в сыворотке крови пациентов определяют методом иммуноферментного анализа с помощью набора DSL-10-14400 ACTIVE® Mullerian Inhibiting Substance/Anti-Mullerian Hormone (MIS/AMH) Enzyme-Linked Immunosorbent (ELISA (США). Стандартные растворы, растворы конъюгатов, промывочный буфер готовят согласно инструкции к набору. Все реагенты и образцы перед началом анализа должны быть выдержаны при комнатной температуре (~25°C) и тщательно перемешаны перед использованием осторожным переворачиванием. Вносят по 20 мкл стандартов, контролей и образцов в соответствующие лунки планшета. Добавляют по 100 мкл раствора рабочего буфера АМН GEN II в каждую ячейку, используя полуавтоматический диспенсер. Затем инкубируют в течение 1 часа при ~25°C на орбитальном шейкере при 600-800 об/мин. Используя автоматическую вошер, промывают 5 раз промывочным буфером и высушивают планшет, перевернув его на фильтрованную бумагу. Далее добавляют по 100 мкл раствора биотинового коньюгата в каждую ячейку, по окончании инкубации 5 раз промывают планшет, как описано выше. Затем добавляют 100 мкл раствора стрептавидин-ферментного конъюгата в каждую лунку. Вновь по окончании инкубации проводят пятикратную промывку планшета и высушивают его, перевернув на фильтрованную бумагу. Добавляют 100 мкл хромогенного раствора ТМБ в каждую лунку, используя полуавтоматический диспенсер. Добавляют 100 мкл стоп-реагента в каждую лунку, также используя полуавтоматический диспенсер. Измеряют оптическую плотность ячеек при 450 нм измерение оптической плотности микропланшета должно быть выполнено в течение 30 минут после добавления стоп-реагента раствора. Выражают уровень АМГ в сыворотке крови пациента в нг/л. При значениях АМГ выше 5,2 нг/мл диагностируют возможный риск формирования СПКЯ.

Работоспособность заявляемого способа подтверждаются следующими конкретными примерами.

Пример 1

Пациентка Дарья А-ва, 15 лет, страдает нарушениями менструального цикла с менархе по типу олигоменореи, ростом волос в атипичных местах, угревой сыпью. Девочка от 2 беременности, протекавшей с угрозой прерывания родов путем кесарева сечения. В анамнезе - инвертированный пубертат. Менструальный цикл с 12 лет, через 60-90 дней.

Об-но: гирсутное число - 14 баллов. На момент обследования на 5 день менструального цикла у девочки уровень ЛГ - 11,2 мМ/мл; ФСГ - 4,9 мМ/мл; эстрадиол - 48 пг/мл; 17-ГОП - 1,1 нг/мл; ДГЭА - 14,0 нг/мл; ДГЭА-С - 5,7 мкг/мл; тестостерон - 5,0 нмоль/л; тестостерон свободный - 6,7 пг/мл.

УЗИ органов малого таза: объем правого яичника - 13,9 см³; объем левого яичника 11,4 см³, в проекции обоих яичников множество незрелых фолликулов до 7-8 мм в диаметре.

Уровень АМГ в сыворотке крови составил 5,2 нг/мл, что свидетельствовало о формирующемся СПКЯ.

Диагноз, поставленный в соответствии с заявляемым изобретением, согласуется с комплексной оценкой состояния гормонального дисбаланса (по определению уровней лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов, их взаимоотношения и т.д.).

Пример 2

Пациентка Анастасия К-ва, 16 лет, страдает нарушениями менструального цикла по типу олиго и аменореи в течение 3-х лет, угревой сыпью. Перинатальный анамнез не отягощен. У матери отмечались нарушения менструального цикла в пубертатном периоде. Менструальный цикл с 12 лет, нерегулярно с 14 лет, через 40-60 дней.

Об-но: гирсутное число - 8 баллов. На момент обследования у девочки уровень ЛГ - 10,7 мМ/мл; ФСГ - 5,8 мМ/мл; эстрадиол - 35 пг/мл; 17-ГОП - 0,9 нг/мл; ДГЭА - 9,0 нг/мл; ДГЭА-С - 4,4 мкг/мл; тестостерон - 3,2 нмоль/л; тестостерон свободный - 5,7 пг/мл.

УЗИ органов малого таза: объем правого яичника - 8,7 см³; объем левого яичника 7,1 см³, в проекции обоих яичников множество незрелых фолликулов до 6-7 мм в диаметре.

Уровень АМГ в сыворотке крови у пациентки составил 6,3 нг/мл, что свидетельствует о пубертатной дисфункции яичников.

Пример 3

Пациентка Анна Ф-ко, 17 лет, страдает нерегулярным менструальным циклом с менархе, жалобами на рост волос в атипичных местах. Менструальный цикл с 14 лет, меноррагии чередуются с олигоменореей. Перинатальный анамнез отягощен. Беременность протекала с гестозом II половины.

Об-но: гирсутное число - 10 баллов. На момент обследования у девочки уровень ЛГ - 7,2 мМ/мл; ФСГ - 4,1 мМ/мл; эстрадиол - 48 пг/мл; 17-ГОП - 1,3 нг/мл; ДГЭА - 14,7 нг/мл; ДГЭА-С - 6,4 мкг/мл; тестостерон - 3,2 нмоль/л; тестостерон свободный - 8,7 пг/мл

УЗИ органов малого таза: объем правого яичника - 11,9 см³; объем левого яичника 9,8 см³, в проекции обоих яичников множество незрелых фолликулов до 4-5 мм в диаметре.

Уровень АМГ в сыворотке крови составил 5,3 нг/мл, что свидетельствовало о пубертатной дисфункции яичников.

Пример 4

Пациентка Ксения Н-ва, 16 лет, предъявляет жалобы на рост волос в атипичных местах, угревую сыпь. Менструальный цикл с 12 лет, через 24-26 дней. Перинатальный анамнез не отягощен. Мать страдала гирсутизмом.

Об-но: гирсутное число - 13 баллов. На момент обследования у девочки уровень ЛГ - 6,3 мМ/мл; ФСГ - 4,8 мМ/мл; эстрадиол - 70 пг/мл; 17-ГОП - 0,9 нг/мл; ДГЭА - 9,1 нг/мл; ДГЭА-С - 3,4 мкг/мл; тестостерон - 2,2 нмоль/л; тестостерон свободный - 3,1 пг/мл.

УЗИ органов малого таза: объем правого яичника - 5,9 см³; объем левого яичника 6,1 см³, в проекции обоих яичников множество незрелых фолликулов до 5-7 мм в диаметре.

Уровень АМГ в сыворотке крови составил 5,1 нг/мл, что свидетельствовало об отсутствии яичниковой патологии.

Пример 5 (в динамике через 6 месяцев)

Пациентка Анастасия К-ва, 17 лет, страдает нарушениями менструального цикла по типу олиго и аменореи в течение 3,5 лет, угревой сыпью. Менструальный цикл с 12 лет, нерегулярно с 14 лет, через 40-90 дней.

Об-но: гирсутное число - 12 баллов. На момент обследования у девочки уровень ЛГ - 14,2 мМ/мл; ФСГ - 5,1 мМ/мл; эстрадиол - 28 пг/мл; 17-ГОП - 1,1 нг/мл; ДГЭА - 12,0 нг/мл; ДГЭА-С - 5,0 мкг/мл; тестостерон - 4,2 нмоль/л; тестостерон свободный - 4,9 пг/мл.

УЗИ органов малого таза: объем правого яичника - 8,9 см³; объем левого яичника 7,7 см³, в проекции обоих яичников множество незрелых фолликулов до 6-8 мм в диаметре.

Уровень АМГ в сыворотке крови составил 9,6 нг/мл. Таким образом, высокий уровень АМГ, наряду с возрастанием индекса ЛГ/ФСГ=2,7:1, дает право утверждать о наличии у пациентки формирующегося СПКЯ.

Пример 6 (в динамике через 6 месяцев)

Пациентка Анна Ф-ко, 17 лет, страдает нерегулярным менструальным циклом с менархе, жалобами на рост волос в атипичных местах. Менструальный цикл с 14 лет, меноррагии чередуются с олигоменореей.

Об-но: гирсутное число - 12 баллов. На момент обследования: ЛГ - 13,2 мМ/мл; ФСГ - 4,8 мМ/мл; эстрадиол - 130 пг/мл; 17-ГОП - 1,2 нг/мл; ДГЭА - 18,7 нг/мл; ДГЭА-С - 4,3 мкг/мл; тестостерон - 2,8 нмоль/л; тестостерон свободный - 7,4 пг/мл.

УЗИ органов малого таза: объем правого яичника - 14,9 см³; объем левого яичника 12,2 см³, в проекции обоих яичников множество незрелых фолликулов до 7-9 мм в диаметре.

Уровень АМГ в сыворотке крови составил 12,8 нг/мл, что свидетельствовало о СПКЯ. Динамическое наблюдение за пациенткой выявило возрастание показателя АМГ, увеличение объема обоих яичников, повышение индекса ЛГ/ФСГ>3:1.

По заявляемому способу обследовано 102 пациентки в возрасте от 14 до 17 лет с нарушениями менструального цикла и клиническими проявлениями гиперандрогении. Медиана уровня АМГ в сыворотке крови составила 6,13 нг/мл (квартили 2,87; 10,20 нг/мл).

В группе с отсутствием нарушений менструального цикла уровень АМГ (n=20) в сыворотке крови менее 4,1 нг/мл отмечен у 18 чел (90%).

В группе с клиническими признаками гиперандрогении и регулярным менструальным циклом (n=42) уровень АМГ в сыворотке крови не менее 1,8 нг/мл, но не более 5,1 нг/мл отмечен у 39 чел (92,8%).

В группе клиническими признаками гиперандрогении и нарушениями менструального цикла (n=40) уровень АМГ в сыворотке крови более 6,7 нг/мл, но менее 24,5 нг/мл выявлен у 33 чел (82,5%).

В группе с нарушениями менструального цикла и эхографическими признаками мультифолликулярных яичников (n=18) уровень АМГ в сыворотке крови более 10,1 нг/мл выявлен у 15 чел. (83,3%).

Таким образом, исследование уровня АМГ в сыворотке крови у девочек-подростков с нарушениями менструального цикла показало, что он является высокоинформативным и объективным критерием и высокоточным диагностическим маркером СПКЯ. Точность заявляемого способа достигает 91,6%.

Исходя из вышеизложенного заявляемый способ диагностики СПКЯ у девочек-подростков по сравнению с существующими, имеет следующие преимущества:

1. Способ позволяет осуществить раннюю диагностику СПКЯ с целью выбора своевременного превентивного лечения.

2. Данный способ объективен, не зависит от возраста и эмоционального статуса пациента.

3. Предлагаемый способ обладает достаточно высокой точностью, прост в исполнении и найдет широкое применение в гинекологической и эндокринологической практике.