СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ НЕРАЗВИВАЮЩЕЙСЯ БЕРЕМЕННОСТИ

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования неразвивающейся беременности (НБ).

НБ представляет собой особую форму невынашивания беременности, характеризующуюся гибелью эмбриона или плода на раннем сроке беременности с длительной задержкой его в полости матки. Частота НБ остается стабильно высокой и составляет 45-88,6% случаев самопроизвольных выкидышей на ранних сроках (I.Y. Thorstesen, 2000; Н.М. Подзолкова, и др., 2002; В.Е. Радзинский, 2010).

Перенесенная НБ отрицательно сказывается на репродуктивной функции женщин, так в 27,4% отмечается привычное невынашивание беременности, а риск потери беременности после первого самопроизвольного выкидыша в последующем составляет 13-17%. Еще более значимо, что после 2 предшествующих самопроизвольных прерываний риск потери беременности возрастает более чем в 2 раза и составляет 36-38%. У женщин, не имеющих живых детей, вероятность выкидыша после третьего самопроизвольного прерывания составляет около 40-45%, а это уже не только медицинская, но и социальная проблема.

На настоящий момент не вызывает сомнения тот факт, что развитие различного рода патологических процессов ассоциировано с возникновением состояния оксидантного стресса (ОС), который либо является непосредственной причиной возникновения заболевания, либо сопровождает развитие данного процесса. По литературным данным ОС (системный или локальный) является ведущим механизмом в развитии осложнений беременности, в том числе и НБ (В.В. Абрамченко 2001; Д.Л. Теплый, 2008; Л.В. Ванько, 2010; E.H. Ruder, 2008). При ОС происходит избыточная продукция свободных радикалов (активных форм кислорода - АФК), действие которых направлено на три типа клеточных мишеней: белки, нуклеиновые кислоты и липиды. В нормально функционирующем организме свободные радикалы участвуют в метаболических процессах клеток, а при патологических состояниях - в их деструкции. Имеются данные, что их взаимодействие с ДНК клеток лежит в основе мутагенного, канцерогенного и тератогенного эффектов.

Промежуточным продуктом перекисного окисления липидов является малоновый диальдегид (МДА), а ранними маркерами окислительной модификации белков (ОМБ) - карбонильные группы белков (КГБ), которые обладают токсическими, деструктивными воздействиями на клетки и ткани организма (И.И. Крукиер - «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины». - 2003. - Т.133, №3. - С.418-421; Е.Е. Дубинина «Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение)». Физиологические и клинико-биохимические аспекты - СПб.: Издательство Медицинская пресса, 2006. - 400 с.).

В этой связи значительный интерес представляет изучение и белков, ассоциированных с беременностью (гравидарных белков), которые также подвергаются воздействию продуктов ОС и отражают течение беременности (Д.Д. Петрунин и соавт., 1976, 1982, 1983; Н.М. Побединский и др., 1983; Л.Д. Посисеева и др., 1997; И.А. Салов. «Неразвивающаяся беременность: патогенез, клиника, диагностика и лечение».: дис.. докт. мед. наук. - Саратов, 1998; М.Н. Болтовская, 2001).

Полиэтиологичность НБ, изменившийся взгляд на патогенез (роль инфекции, хронического эндометрита), а также реальное существование трех патогенетических вариантов, ставит перед исследователями важные задачи, а именно поиск новых подходов к оценке состояния эндометрия на этапе предгравидарной подготовки к планируемой новой беременности (В.Е. Радзинский, А.А. Оразмурадова «Ранние сроки беременности» - М.: Status Praesens, 2009. - 480 с.).

Очевидно, что наиболее реальным путем профилактики НБ является своевременное выявление и коррекция локальных гомеостатических нарушений.

Поиск клеточных маркеров, которые бы адекватно отражали метаболические и биохимические процессы локального гомеостаза, происходящих при НБ, является в настоящее время одной из актуальных проблем современного акушерства и гинекологии. Современные исследования показали, что материал, полученный в результате диагностического выскабливания стенок полости матки и аспирации, дает большую информацию для выявления причин и адекватного последующего лечения пациенток с НБ (В.М. Сидельникова «Привычная потеря беременности». - М.: Триада - X, 2002, - 304 с.).

В качестве исследуемого субстрата нами был выбран эндометриальный секрет (аспирационная жидкость, менструальная кровь). Это связано с тем, что ранее при использовании иммунофлюоресцентной, гистохимической методик исследования образцов нормальной, гиперплазированной и малигнизированной ткани эндометрия была показана способность ряда ферментов и их изоформ накапливаться в апикальных отделах железистых клеток, а затем выделяться в эндометриальную слизь (Е.Г. Шварев «Опухолевые маркеры в диагностике и оценке эффективности гормонотерапии рака эндометрия» - Автореферат на соискание ученой степени доктора мед. наук. - СПб., 1993. - 34 с; Л.Н. Липовенко «Клиническое значение эндометриальных факторов в генезе неразвивающейся беременности» - Автореферат на соискание ученой степени кандидата мед. наук, М.: 2004. - 136 с.).

На наш взгляд этот феномен открывает перспективы использования биохимического исследования биологических жидкостей (менструальной крови и аспирационной жидкости из полости матки) в мониторинге за состоянием эндометрия, в том числе и после перенесенной НБ.

В литературе имеются немногочисленные данные о биохимических особенностях биологических жидкостей (БЖ), оттекающих непосредственно от патологически измененного органа (И.Ю. Краснощекова «Патогенетическое обоснование применения антиоксидантов в комплексном лечении женщин с воспалительными процессами придатков матки» - Автореферат на соискание ученой степени кандидата мед. наук. - Иваново, - 2001. - 24 с.; Р.Н. Короткина, Г.Н. Мацкевич, А.Ш. Давлеканова, А.А. Вишневский, А.Г. Куницын, А.А. Карелин «Сравнительное исследование активности ферментов обмена глутатиона и антиоксидантных ферментов в злокачественных и доброкачественных опухолях легких человека». - Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - Т.133. - №6. - С.697-700).

Для диагностики НБ в практической медицине используется несколько методов.

В последнее десятилетие широкое распространение получил эхографический способ диагностики (ультразвуковое исследование - УЗИ) НБ двух типов: анэмбрионии и гибели эмбриона/плода (В.Н. Демидов с соавт. 1993; В.И. Кулаков, В.М. Сидельникова 2011).

Недостатками данного метода являются:

- необходимость наличия дорогостоящего высокотехнологичного оборудования и специально обученного высококвалифицированного медперсонала;

- УЗИ при НБ - констатация факта гибели плода (эмбриона);

- метод ультразвукового исследования и допплерометрии не позволяют прогнозировать исход планируемой беременности.

Наиболее распространенным является способ оценки НБ, основанный на гистологическом исследовании удаленных тканей (М. Берстон «Гистохимия ферментов», пер. с англ. - М.: 1965; Р. Лилли «Патогистологическая техника и практическая гистохимия», пер. с англ. - М.: 1969; Э. Пирс «Гистохимия», пер. с англ. - М.: 1962; А.П. Авцына «Принципы и методы гистоцито-химического анализа в патологии». - Л., 1971; О.И. Топчиева, В.А. Прянишникова, З.П. Жемкова. «Биопсия эндометрия» - М.: Медицина, 1978).

Недостатками гистологического способа являются:

- проводится после установления факта наличия НБ, как лечебная и диагностическая манипуляция;

- сложность технического исполнения;

- необходимость наличия специально оборудованного помещения и обученного персонала;

- необходимость использования дорогостоящего оборудования;

- длительность исследования до выдачи окончательного заключения (10-14 дней).

Описан так же способ прогнозирования НБ по уровню содержания фактора роста плаценты в сыворотке крови. При снижении его в 2,7 и более раз относительно нормы прогнозируют НБ (патент на изобретение №2313793 от 2006, авторы В.В. Авруцкая, И.И. Крукиер, Т.Н. Погорелова).

Недостатком данного метода является то, что данное биологически активное соединение изменяется на любое осложнение беременности и для определения требуется специальное оборудование и наличие тест-систем.

Исследования последних лет показали высокую информативность биологических жидкостей при гинекологической патологии. Аналогом данного изобретения является способ диагностики гиперпластических процессов эндометрия у больных миомой матки (патент на изобретение №2327164 от 20.07.2008 г., авторы: Л.В. Дикарева, Е.Г. Шварев, Д.Л. Теплый). У больных с гиперпластическими процессами матки в смывах из полости матки, менструальной крови исследовали содержание МДА и фермента антиоксидантной защиты - каталазы. Увеличение показателей МДА в менструальной крови свидетельствуют о гиперпластических процессах эндометрия различной степени выраженности.

Наиболее близким к предлагаемому способу является определение гликоделина в менструальной крови.

Сущность способа-прототипа состоит в том, что в менструальной крови для оценки недостаточности лютеиновой фазы, функциональной полноценности эндометрия и контроля эффективности предгравидарной подготовки у женщин с НБ в анамнезе определяется уровень гликоделина. Беременность должна планироваться после повторной оценки функционального состояния эндометрия - нормальные уровни гликоделина больше 160 нг/мл и прогестерона больше 32 нмоль/мл (Ю.С. Балханов «Возможности восстановления морфофункциональной способности эндометрия у женщин с невынашиванием беременности». Автореферат на соискание ученой степени кандидата мед. наук - Пермь, 2009).

Недостатком указанного способа оценки функционального состояния эндометрия является то, что он не позволяет прогнозировать возможное прекращение развития беременности.

Все перечисленные и предложенные ранее методы не позволяют определить продукты ОМБ, так же как и продукты ПОЛ, обладающие цитотоксическим действием на локальном уровне при НБ, и оценивать динамику этих показателей в менструальных выделениях при проведении предгравидарной подготовки планируемых беременностей.

В литературе встречаются сообщения об исследовании продуктов ПОЛ и ОМБ, а именно МДА и КГБ в периферической крови, в эндометриальном секрете, но отсутствует информация, касающаяся изучения уровня указанных маркеров ОС в аспирационной жидкости (АЖ) в норме и при НБ.

Изобретение направлено на оптимизацию способа прогнозирования развития НБ на доклинической стадии, на предупреждение повреждающего воздействия продуктов оксидативного стресса на эндометрий на этапе предгравидарной подготовки.

Технический результат изобретения достигается тем, что в супернатанте аспирационной жидкости из полости матки или менструальной крови определяют одномоментно содержание карбонильных групп белков, малонового диальдегида и при значениях от 9,43 до 16,91 нмоль/мг карбонильных групп и от 0,71 мкмоль/л до 7,28 мкмоль/л малонового альдегида судят об отсутствии их повреждающего воздействия на эндометрий и плодное яйцо, а при значениях карбонильных групп белков от 22,32 нмоль/мг и выше и при значениях малонового диальдегида более 7,28 мкмоль/л судят о их повреждающем воздействии на плодное яйцо и высоком риске развития неразвивающейся беременности.

Промежуточные показатели маркеров оксидативного стресса (малонового диальдегида и карбонильных групп белков) свидетельствуют о высоком риске повреждающего воздействия на плодное яйцо, требующие комплексного лечения.

Определение скорости перекисного окисления липидов (МДА) в биологических субстратах проводили по методике Е.А. Строева, Е.Г. Макарова (1986), а определение карбонильных групп проводили по методу, предложенному Оливером и соавторами (1987) и модифицированному Е.Е. Дубининой (1993). Метод основан на взаимодействии карбонильных групп с 2,4-ДНФГ и был предложен для определения окисленных белков в супернатанте разрушенных светом фибробластов (М.Ю. Фролова. «Возможности метода определения карбонильных групп белков сыворотки крови для оценки состояния «окислительного стресса» в клинической практике». Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. - СПб. - 2003. - 24 с.).

Определение МДА, КГБ проводили одномоментно (одновременно) в сыворотке крови и АЖ из полости матки или менструальных выделениях (восстановленный менструальный цикл после НБ). Необходимо отметить, что изменения исследуемых показателей более наглядны в АЖ из полости матки (менструальной крови), чем в периферической крови. Данное обстоятельство может быть связано с наличием сопутствующей экстрагенитальной патологии и ее влиянием на их уровень.

Всем исследуемым наряду с традиционным клинико-лабораторным обследованием проводилось УЗИ органов малого таза трансвагинальным доступом, молочных желез, цитологическое исследование эндо-экзоцервикса. Полученные результаты показателей КГБ и МДА сопоставлялись с клиническими данными, гистологическими заключениями беременностей.

Обследовано 80 женщин в возрасте от 16 до 43 лет, 30 женщин с диагнозом НБ, контрольную группу составили 50 (60%) женщин с нормально протекающей беременностью в сроках от 5 до 12 недель, обратившихся для прерывания беременности по желанию в гинекологические стационары г.Астрахани.

Предлагаемый способ был успешно апробирован в гинекологических отделениях ГБУЗ АО КРД, ГБУЗ АО АМОКБ, женской консультации АО КРД г.Астрахани в 2012-2013 гг.

Результаты апробации приводятся ниже.

Пример №1

Беременная А., 1980 года рождения, № истории 3517, поступила в гинекологическое отделение 14/11/12 г. с диагнозом: беременность в сроке 5 недель (на артифициальный аборт). Жалобы при поступлении: не предъявляет.

Менструальная и репродуктивная функции. Менструации с 13 лет по 4 дня, регулярные, умеренные, цикл 28 дней

Последние менструации 2/10/12 г.

В анамнезе 0 беременностей.

Сопутствующая патология: нет

Объективно:

Влагалищное исследование: наружные половые органы развиты правильно, слизистая влагалища не изменена. Тело матки увеличено до 5-недель беременности, мягкое, безболезненное. Придатки с обеих сторон без особенностей. Параметрии свободны. Выделения - бели.

УЗИ от 10/11/12 г. - матка размерами 52×46×53 мм увеличена до 5 недель беременности, контуры четкие, ровные, структура неоднородная. M-эхо 0,9 мм. В полости матки плодное яйцо КТР - 3 мм, СВД - 16 мм, сердцебиение плода определяется. Правый яичник 22×32 мм, левый яичник - 31×28 мм.

Забор материала: после осмотра женщины на зеркалах, в асептических условиях, произведена вакуум-аспирация содержимого полости матки. Полученную смесь центрифугируют в течение 15 минут с частотой 3000 об/мин.

Супернатант (надосадочную жидкость) используют для дальнейшей работы.

Результаты биохимических исследований в АЖ:

КГБ - 12,72 нмоль/мг

МДА - 0,71 мкмоль/л.

Указанные результаты КГБ и МДА соответствуют прогрессирующей беременности без признаков угрозы.

Результат гистологического исследования №0966-45: децидуальная ткань, не измененные ворсины хориона.

Пример №2

Беременная М., 1989 года рождения, № истории 3495, поступила в гинекологическое отделение 23/12/12 г. с диагнозом: беременность в сроке 5 недель гестации (на артифициальный аборт).

Жалобы при поступлении: не предъявляет.

Менструальная и репродуктивная функции.

Менструации с 14 лет по 4 дня, регулярные, умеренные, цикл 30 дней.

Последние менструации 2/11/12 г.

В анамнезе: роды - 2, аборты - 2.

Сопутствующая патология: дрожжевой кольпит, хронический аднексит, ремиссия.

Объективно:

Влагалищное исследование: наружные половые органы развиты правильно, слизистая влагалища не изменена. Тело матки увеличено до 5-недель беременности, мягкая, безболезненная. Придатки с обеих сторон без особенностей. Параметрии свободны. Выделения - бели.

УЗИ от 21/12/12 г. - матка размерами 54×46×48 мм увеличена до 5 недель беременности, контуры четкие, ровные, структура неоднородная. М-эхо 0,9 мм. В полости матки плодное яйцо КТР - 0,45 мм, СВД - 15 мм, сердцебиение плода определяется. Правый яичник 30×21 мм, левый яичник - 18×25 мм.

Забор материала проводился аналогично, см. пример №1

Результаты биохимических исследований в АЖ:

КГБ - 9,43 нмоль/мг

МДА - 1,43 мкмоль/л.

Указанные результаты соответствуют прогрессирующей беременности без признаков угрозы.

Результат гистологического исследования №0967-67: децидуальная ткань, неизмененные ворсины хориона.

Пример №3

Беременная З., 1980 года рождения, № истории 8831, поступила в гинекологическое отделение 18/12/12 г. с диагнозом: беременность 4 недели (на артифициальный аборт).

Жалобы при поступлении: не предъявляет.

Менструальная и репродуктивная функции.

Менструации с 13 лет по 4 дня, регулярные, умеренные, цикл 30 дней.

Последние менструации 29/11/12 г.

В анамнезе: роды - 2, аборты - 2.

Сопутствующая патология: хронический аднексит, ремиссия

Объективно:

Влагалищное исследование: наружные половые органы развиты правильно, слизистая влагалища не изменена. Тело матки увеличено до 4-недель беременности, мягкая, безболезненная. Придатки с обеих сторон без особенностей. Параметрии свободны. Выделения - бели.

УЗИ от 19/12/12 г. - матка размерами 52×40×34 мм увеличена до 4 недель беременности, контуры четкие, ровные, структура неоднородная. M-эхо 0,8 мм. В полости матки плодное яйцо КТР - 0,3 мм, СВД - 17 мм, сердцебиение плода определяется. Правый яичник 28×25 мм, левый яичник - 34×29 мм.

Забор материала проводился аналогично, см. пример №1.

Результаты биохимических исследований в АЖ:

КГБ - 16,91 нмоль/мг

МДА - 7,28 мкмоль/л.

Указанные результаты КГБ и МДА соответствуют прогрессирующей беременности без признаков угрозы.

Результат гистологического исследования №0965-89: децидуальная ткань, неизмененные ворсины хориона.

Пример №4

Беременная С., 1986 года рождения, № истории 40321, поступила в гинекологическое отделение 28/03/13 г. с диагнозом: неразвивающаяся беременность в сроке 6 недель гестации по типу гибели эмбриона.

Жалобы при поступлении на задержку менструации, сукровичные выделения из половых путей в течение суток.

Менструальная и репродуктивная функции: менструации с 15 лет по 5 дней, регулярные, умеренные, цикл 25 дней. Дата последних менструаций 3/02/13 г.

В анамнезе: 1 аборт.

В 2008 году лапаротомия, цистэктомия.

Сопутствующая патология: железодефицитная анемия легкой степени.

Объективно:

Влагалищное исследование: наружные половые органы развиты правильно, слизистая влагалища не изменена. Тело матки увеличено до 5 недель, мягкая, безболезненная. Придатки с обеих сторон без особенностей. Параметрии свободны. Выделения - сукровичные.

УЗИ органов малого таза от 27/03/13 г. - матка размерами 62×52×52 мм увеличена до 5 недель беременности, контуры четкие, ровные, структура неоднородная. M-эхо 12 мм. В полости матки деформированное плодное яйцо КТР 4,7 мм СВД 3 мм, сердцебиение плода не определяется. Правый яичник 37×31 мм, левый яичник - 24×20 мм.

Забор материала проводился аналогично, см. пример №1.

Результаты биохимических исследований в АЖ:

КГБ - 38,2 нмоль/мг

МДА - 8,51 мкмоль/л.

Указанные результаты маркеров ОС (КГБ и МДА) соответствуют о повреждающем действии на плодное яйцо.

Результат гистологического исследования №0197709: децидуальная ткань с выраженной лимфоцитарной инфильтрацией.

Пример №5

Беременная Б., 1978 года рождения, № истории 40245, поступила в гинекологическое отделение 20/02/13 г. с диагнозом: неразвивающаяся беременность в сроке 10 недель гестации по типу гибели эмбриона.

Жалобы при поступлении на задержку менструации, тянущие боли внизу живота, сукровичные выделения из половых путей в течение 3-х дней.

Менструальная и репродуктивная функции.

Менструации с 13 лет по 5 дней, регулярные, умеренные, цикл 28 дней.

Последние менструации 6/11/12 г.

В анамнезе: 1 аборт, 1 роды.

Сопутствующая патология: хронический гастродуоденит, ремиссия, нарушение жирового обмена 2 степени, хронический аднексит, ремиссия.

Объективно:

Влагалищное исследование: наружные половые органы развиты правильно, слизистая влагалища не изменена. Тело матки увеличено до 10 недель беременности, мягкая, безболезненная. Придатки с обеих сторон без особенностей. Параметрии свободны. Выделения - сукровичные.

УЗИ от 18/02/13 г. - матка размерами 102×89×76 мм увеличена до 10 недель беременности, контуры четкие, ровные, структура неоднородная. M-эхо 10 мм. В полости матки деформированное плодное яйцо КТР - 28,5 мм, СВД - 58 мм, сердцебиение плода не определяется. Правый яичник 23×34 мм, левый яичник - 27×31 мм.

Забор материала проводился аналогично, см. пример №1.

Результаты биохимических исследований в АЖ:

КГБ - 22,32 нмоль/мг

МДА - 10,05 мкмоль/л.

Указанные результаты маркеров ОС (КГБ и МДА) свидетельствуют о повреждающем действии на плодное яйцо.

Результат гистологического исследования №063471-73: децидуальная ткань, ворсины хориона с выраженной лимфоцитарной инфильтрацией.

Пример №6

Беременная О., 1985 года рождения, № истории 40355, поступила в гинекологическое отделение 18/02/13 г. с диагнозом: неразвивающаяся беременность в сроке 8 недель гестации по типу гибели эмбриона.

Жалобы при поступлении на задержку менструации, тянущие боли внизу живота, сукровичные выделения из половых путей в течение 2-х дней.

Менструальная и репродуктивная функции.

Менструации с 13 лет по 5 дней, регулярные, умеренные, цикл 28 дней.

Последние менструации 22/12/12 г.

В анамнезе: 1 роды.

Сопутствующая патология: железодефицитная анемия легкой степени.

Объективно:

Влагалищное исследование: наружные половые органы развиты правильно, слизистая влагалища не изменена. Тело матки увеличено до 8 недель беременности, мягкая, безболезненная. Придатки с обеих сторон без особенностей. Параметрии свободны. Выделения - сукровичные.

УЗИ от 16/02/13 г. - матка размерами 96×72×66 мм увеличена до 8 недель беременности, контуры четкие, ровные, структура неоднородная. M-эхо 0,8 мм. В полости матки деформированное плодное яйцо КТР - 18 мм, СВД - 39 мм, сердцебиение плода не определяется. Правый яичник 33×20 мм, левый яичник - 25×19 мм.

Забор материала проводился аналогично, см. пример №1.

Результаты биохимических исследований в АЖ:

КГБ - 34,53 нмоль/мг

МДА - 10,56 мкмоль/л.

Указанные результаты маркеров ОС (КГБ и МДА) свидетельствуют о повреждающем действии на плодное яйцо.

Результат гистологического исследования №065564-77: децидуальная ткань, ворсины хориона в выраженной лимфоцитарной инфильтрацией, часть из них склерозированы.

Предлагаемым способом достигается оптимизация способа прогнозирования развития НБ на доклинической стадии, и предупреждение повреждающего воздействия продуктов оксидативного стресса на эндометрий на этапе предгравидарной подготовки.

Разработка комплекса клинических и лабораторных критериев прогнозирования НБ позволяет уточнить врачебную тактику у пациенток, имеющих в анамнезе НБ, оценивать эффективность комплексной терапии, своевременно ее коррегировать на этапе предгравидарной подготовки.

Важно, что данный способ может быть использован в условиях женской консультации для пациенток, состоящих на диспансерном учете по невынашиванию беременности. Результаты биохимического исследования могут быть сопоставлены с цитологическим исследованием аспирата из полости матки, а также с морфологической картиной менструальной крови.

Заявляемый способ отличается малой инвазивностью, технической простотой, доступностью выполнения в условиях женской консультации, стационарных ЛПУ.