ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ АДЪЮВАНТ НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ ДЛЯ ВАКЦИН ПРОТИВ ВЫСОКОПАТОГЕННЫХ ШТАММОВ ВИРУСА ГРИППА

Область применения

Изобретение относится к нано-иммунобиотехнологии и, в частности, к созданию иммуногенных препаратов и вакцин, которые могут быть использованы для профилактики инфекционных заболеваний, в частности, вызванных вирусом гриппа сезонных и высокопатогенных пандемических штаммов.

Актуальность

Пандемия гриппа 2009/10 гг., вызванная вирусом гриппа H1N1, комбинированного, преимущественно свиного происхождения показала, что массовая защита населения от вирусов гриппа с высоким уровнем патогенности может быть обеспечена только вакцинацией. Более того, анализ возрастной структуры заболеваемости в этот период показал, что люди, родившиеся до 1957 года, болели значительно реже или переносили заболевание в легкой клинической форме. Эти показатели находились в прямой корреляции с наличием у них относительно высокого титра антител к вирусам H1N1, циркулировавших с период с 1918 по 1955 гг. Известно, что HA и NA этих вирусов близки по антигенной структуре к современным штаммам вирусов H1N1, вызвавшим пандемию гриппа 2009-10 гг.

Эти наблюдения стимулировали исследования типовых и универсальных детерминант для конструирования пандемических вакцин и способствовали формулированию требований к протективным свойствам нового поколения противогриппозных вакцин. Решение задачи получения высокопротективных вакцин невозможно без выбора соответствующих технологий и функциональных адъювантов [Киселев О.И. Прогресс в создании пандемических противогриппозных вакцин и технологии их производства. Биотехнология 2010 №2, с.1-25; Atmar R.L, Keitel W.A. Adjuvants for pandemic influenza vaccines. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2009, Vol.333, p.323-44. doi: 10.1007/978-3-540-92165-3_16]. Поэтому использование новых подходов на основе нанотехнологий с поиском принципиально новых иммуноадъювантов может способствовать решению данной задачи.

В настоящее время в России и других странах - производителях гриппозных вакцин выпускаются следующие виды вакцинных препаратов:

1. Живая гриппозная вакцина.

2. Цельновирионная инактивированная вакцина.

3. Сплит-вакцина.

4. Субъединичная вакцина.

Значительно позднее была разработана полимерсубъединичная вакцина типа «Гриппол». Однако основной прогресс в этой области следует отнести к 1970-80-м годам. Следует обратить также внимание на то, что главным направлением совершенствования противогриппозных вакцин было повышение их безопасности. Именно поэтому от цельновирионных вакцин был совершен переход к сплит-вакцинам, а от сплит-вакцин к субъединичным. При высокой очистке антигенов возникла проблема падения иммуногенности. В связи с этим начался поиск иммуноадъювантов. В результате около 15 лет назад был использован в качестве адъюванта «полиоксидоний». Вакцина на основе полиоксидония получила название полимер-субъединичной. Однако совершенно очевидно, что такой подход также устарел. Полиоксидоний является слабым иммуноадъювантом и до сих пор неизвестны механизмы его действия. В последние годы испытано множество новых адъювантов, действие которых основано на механизме стимуляции иммунного ответа через Toll-рецепторы [Takeshi Ichinohe Т., Iwasaki A., Hideki Hasegawa Н. Innate sensors of influenza virus: clues to developing better intranasal vaccines. Expert Rev Vaccines. 2008; 7(9):1435-1445._doi: 10.1586/14760584.7.9.1435.]. Фактически, в настоящее время признано невозможным создание эффективных и безопасных вакцин без применения адъювантов [WHO. Squalene-based adjuvants in vaccines. December 3, 2008 Matyas G, Rao M, Pittman P, Burge R, Robbins I, Wassef N et al. Detection of antiboides to squalene III. Naturally occurring antibodies to squalene in humans and mice. JIM, 2004, 286:47-67]. Возможности нанотехнологий позволяют использовать новое агрегатное состояние известных адъювантов или создавать принципиально новые адъювантные композиции для получения вакцинных препаратов, характеризующихся невысокой антигенной нагрузкой и высокой безопасностью. Появилось понятие наноадъювантов, сформулированное в наших и ряде других исследований [Киселев О.И. Прогресс в создании пандемических противогриппозных вакцин и технологии их производства. Биотехнология 2010 №2, с.1-25; Narasimhan, В. Novel Biodegradable Nanoadjuvants for Immunotherapy of Pancreatic Cancer. National Institutes of Health, 10/1/2006 to 9/30/2008].

Уровень техники

1) Адъюванты в составе современных противогриппозных вакцин

В современных противогриппозных вакцинах преимущественно используются адъюванты на основе гидроксида алюминия, полиоксидония и сквалена [Киселев О.И. Прогресс в создании пандемических противогриппозных вакцин и технологии их производства. Биотехнология 2010 №2, с.1-25; Ерофеева М.К., Никаноров И.Ю. 9.1. Специфическая профилактика. Современные отечественные и зарубежные вакцины. В кн.: Грипп. Эпидемиология, диагностика, лечение, профилактика. Изд. МИА (Медицинское информационное агентство). Под ред. О.И. Киселева, Л.М. Цыбаловой и В.И. Покровского. М. 2012. С.443-466]. В отношении адъювантов на основе гидроксида алюминия следует отметить, что в последние годы прогрессивно возрастает обоснованная критика его использования в производстве и применении вакцинных препаратов [Tomljenovic L., Shaw С.А. Aluminum vaccine adjuvants: are they safe? Curr Med Chem. 2011; 18(17):2630-7]. Под сомнение ставится даже безопасность адъювантов на основе гидроксида алюминия. В первую очередь, эти опасения аргументируются тем, что растворимая окись алюминия из места введения диффундирует в лимфатические узлы и кровоток. В результате токсическое действие адъюванта проявляется на функциях нейронов головного мозга. Многократное введение вакцин в течение жизни человека может ускорять или инициировать развитие таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера [Shawa С.А. Petrikc M.S. Aluminum hydroxide injections lead to motor deficits and motor neuron degeneration. J. of Inorg. Biochem. 2009, Volume 103, p.1555-1562]. Принципиальное отличие наночастиц на основе производных алюминия или замены этих адъювантов на физиологически совместимый гидроксиаппатит от гидроксида алюминия состоит в их агрегатном состоянии и невозможности диффузии в лимфатическую систему и тем более в кровоток, поэтому их применение направлено на решение двух основных задач изобретения: повышения уровня безопасности путем максимально возможного снижения антигенной нагрузки и снижения диффузии в локусе введения. Вторая задача решается путем использования уникальных адсорбционных свойств гидроксиаппатита для адсорбции функциональных иммуноадъювантов.

Таким образом, преимущества использования адъювантов на основе неорганических (гидроксиаппатита) наночастиц можно систематизировать следующим образом:

1. Высокая инертность неорганических веществ в качестве основного материала.

2. Высокая адсорбционная способность, позволяющая создавать депо антигена при использовании небольших количеств адъюванта (10-20 мкг/мл), что делает возможным усиление иммунного ответа при меньшей антигенной нагрузке.

3. Высокая адсорбционная способность наночастиц может быть использована для решения проблемы формирования депо биологически активных компонентов (белки, пептиды, фрагменты нуклеиновых кислот) для стимуляции соответствующих функций иммунного ответа.

4. Технологически более простое и быстрое производство по сравнению с основными адъювантами органической природы.

2) Иммунологические адъюванты на основе наночастиц

Гидроксид алюминия в водной среде представляет собой микрокристаллы оксидо-гидроксида алюминия размерами 4,5 нм × 2,2 нм × 10 нм, однако эти частицы образуют более крупные агрегаты размером 1-10 мкм. Синтез стабильных наночастиц гидроксида алюминия заданного размера, по-видимому, достаточно сложен, последняя публикация описывает процесс с использованием молекул кремнийорганического соединения как центров образования наночастиц (Preparation of Amorphous Aluminum Oxide-Hydroxide Nanoparticles in Amphiphilic Silicone-Based Copolymer Microemulsions; Yana Berkovich et al., Journal of Colloid and Interface Science. 2002. 245, 58-67).

Альтернативным материалом при разработке адъюванта нового поколения может стать гидроксиапатит. Это вещество является естественным компонентом костной ткани, составляя около 50% ее массы. Биосовместимость гидроксиапатита, демонстрируемая большим опытом использования в имплантологии, позволит избежать побочных эффектов, таких как, например, макрофагический миофасцит, связанный с патологическим накоплением алюминия в клетках. Возможность использования гидроксиапатита, в том числе и в наноформе, стала исследоваться только в последние 2-3 года.

Необходимо учитывать, что оптимальным является иммуноадъювант с широким спектром применения, в частности сочетаемый с вакцинами различных типов. В случае гриппозных вакцин наиболее важна стимуляция образования нейтрализующих антител, позволяющая остановить развитие инфекции в самом начале, однако индукция T_H2-зависимого иммунного ответа также актуальна: она важна на более поздних стадиях развития гриппозной инфекции, у лиц преклонного возраста или с ослабленным иммунитетом. Наличие собственного неспецифического иммуностимуляторного действия желательно как дополнение к усилению иммуногенности вакцинного антигена с учетом генетической изменчивости вируса гриппа. Кроме того, все эти качества должны сочетаться с безопасностью при применении в составе вакцины. Иммуноадъювант также должен быть достаточно стабилен в составе вакцины. Наконец, большое значение имеет также простота технологии синтеза, позволяющая сделать производство вакцины быстрым и масштабируемым. Перспективным кандидатом, сочетающим все эти характеристики, являются неорганические наночастицы, в частности на основе гидроксиапатита, сочетающие в себе свойства биосовместимости гидроксиапатита и уникальные свойства материалов в наноформе.

Раскрытие изобретения

В настоящем изобретении ставилась задача создания иммунологического адъюванта на основе наночастиц гидроксиапатита для применения в создании вакцин. Фактически задача была решена путем:

а) выбора типа неорганических наночастиц с наилучшими сорбционными свойствами по отношению к химерному белку NS-ESAT (слитый белок, включающий последовательность NS белка вируса гриппа А и антигенного белка ESAT-6 Mycobacterium tuberculosis [Sereinig S., Stukova M. Zabolotnyh N. et al. Influenza Virus NS Vectors Expressing the Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 Protein Induce CD4 Th1 Immune Response and Protect Animals against Tuberculosis Challenge. Clinic, and Vaccine Immunol. 2006, Vol.13, p.898-904, 1556-681 1/06/$08.000 doi:10.1128/CVI.00056-06]). Выбор антигена определялся тем, что он полностью охарактеризован по структуре и первичным антигенным свойствам. Белки NS1 вирусов гриппа A и B являются ключевыми факторами контроля сигнальных систем и носителями фактора патогенности у высокопатогенных вирусов гриппа типа A. В структуре гибридного белка NS1-ESAT6 последовательность вирусного компонента представлена 125 N-концевой аминокислотной последовательностью, включающей дсРНК-связывающий сайт. Этот сайт играет ключевую роль в подавлении индукции синтеза интерферонов I-го типа через блокаду активации дсРНК-зависимой протеинкиназы (Киселев О.И. Геном пандемического вируса гриппа H1N1v-2009. «Компания Димитрейд График Групп» 2011. С.168). Сайты связывания дсРНК представляют значительный интерес с точки зрения конструирования комбинированных вакцин и способности к взаимодействию с экспонированными фосфатными группами и соответствующими наночастицами;

б) оценки иммуногенных свойств наночастиц, «нагруженных» антигеном путем определения степени пролиферации лимфоцитов после иммунизации лабораторных животных белком NS-ESAT в сочетании с препаратом наночастиц гидроксиапатита. Иммуногенность наночастиц сравнивалась с иммуногенностью коммерческого адъюванта. Результаты оценки иммунологических свойств нанокомпозиции свидетельствуют том, что наибольший эффект, при прочих равных условиях, проявился при введении NS-ESAT в сочетании с наночастицами гидроксиапатита с адсорбированным на них синтетическим пептидом - лигандом CXCR 1 и 2 рецепторов.

Первый аспект изобретения связан с получением комплекса наночастиц гидроксиапатита и белка NS-ESAT. Было показано, что наночастицы гидроксиапатита обладали наибольшей адсорбционной активностью по отношению к белку NS-ESAT.

Второй аспект изобретения относится к исследованию иммуноадъювантных свойств наночастиц гидроксиапатита. Было показано, что двукратная иммунизация химерным белком NS-ESAT в сочетании с препаратом наночастиц гидроксиапатита приводит к стимуляции клеточного иммунного ответа в большей степени, чем иммунизация белком NS-ESAT без адъюванта или белком NS-ESAT в сочетании с коммерческим адъювантом на основе геля гидроксида алюминия и магния.

Третий аспект изобретения направлен на решение задачи усиления адъювантных свойств гидроксиаппатита путем адсорбции на наночастицах гидроксиаппатита коротких пептидов, относящихся к лигандам CXCR 1 и 2 рецепторов [Weathington N.M. van Houwelington А.Н., Noerager B.D. et al. A novel peptide CXCR ligand derived from extracellular matrix degradation during airway inflammation. Nature Med. 2006, Vol.12, p.317-323]. Лиганды на CXCR хемокиновые рецепторы для стимуляции иммунного ответа на индивидуальные антигены используются впервые.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Электронные микрофотографии наночастиц гидроксиапатита. Негативное контрастирование, 1,5% фосфорновольфрамовая кислота. Масштабный отрезок - 50 нм.

Фиг.2. Доля сорбированного белка после инкубации четырех различных белков: альбумина человека, инсулина человека, лизоцима куриного яйца и химерного белка NS-ESAT (исходная концентрация каждого белка - 40 мкг/мл) с наночастицами трех типов: оксида титана, оксида алюминия и гидроксиапатита (5%-ная взвесь).

Фиг.3. Индекс стимуляции спленоцитов мышей после двукратной иммунизации (внутрибрюшинно) белком NS-ESAT (10 мкг/доза) в сочетании с наночастицами гидроксиапатита или коммерческим адъювантом на основе гидроксида алюминия и магния.

Фиг.4. Индекс стимуляции спленоцитов мышей после двукратной иммунизации (внутрибрюшинно) белком NS-ESAT (10 мкг/доза) в сочетании с наночастицами гидроксиапатита, «нагруженными» CXCR лигандом, - пептидом Про-Про-Гли-Про-Гис.

Осуществление изобретения

Осуществление изобретения иллюстрируется следующими примерами

Пример 1. Электронно-микроскопические исследования морфологии наночастиц гидроксиапатита.

Наночастицы гидроксиапатита исследовали под электронным микроскопом JEM-100S (JEOL, Япония). Результаты представлены на Фиг.1. Было определено, что большинство наночастиц имеют диаметр 60-100 нм.

Пример 2. Получение комплекса наночастиц гидроксиапатита с химерным белком NS-ESAT.

Для исследования различных свойств комплексов наночастиц с химерным белком NS-ESAT использовались раствор указанного белка в фосфатно-солевом буфере и 5%-ная водная суспензия наночастиц гидроксиапатита (Sigma-Aldrich). Суспензия наночастиц диспергировалась с помощью обработки ультразвуком, а затем смешивалась с раствором химерного белка NS-ESAT в соотношении 1:1. Раствор белка предварительно фильтровался через бактериальный фильтр с диаметром пор 0,3 мкм. После этого проводилась инкубация при 37°C в течение 2 часов при перемешивании.

Пример 3. Исследование сорбционной способности различных наночастиц и стандартного адъюванта по отношению к химерному белку NS-ESAT и другим белкам.

Для исследования сорбции использовались растворы четырех различных белков: химерного белка NS-ESAT, альбумина человека, инсулина человека, лизоцима куриного яйца в фосфатно-солевом буфере (исходная концентрация каждого белка - 40 мкг/мл) и 5%-ная водная суспензия наночастиц оксида титана, оксида алюминия и гидроксиапатита. Сорбционные свойства оценивались как отношение концентрации общего белка в пробе после инкубации с наночастицами к концентрации общего белка до инкубации. Инкубация проводилась при условиях, описанных в примере 2. После инкубации наночастицы осаждались центрифугированием при 13 500 об/мин на центрифуге Eppendorf, и в супернатанте определялось содержание белка. Общий белок определялся спектрометрически по Бредфорду. Результаты опыта показали, что наибольшей среди исследованных наночастиц разной химической природы сорбцией в отношении белка NS-ESAT обладают именно наночастицы гидроксиапатита (Фиг.2). Однако в отношении других белков, исследованных в опыте, сорбционная способность наночастиц гидроксиапатита не всегда была максимальной и, в целом, сильно зависела от конкретного белка (Фиг.2).

Пример 4. Исследование иммуноадъювантных свойств наночастиц гидроксиапатита.

В ходе опыта по оценке адъювантного эффекта проводилась двукратная иммунизация беспородных лабораторных мышей (самок) раствором химерного белка NS-ESAT в фосфатно-солевом буфере. Для сравнения в одной из групп животных иммунизация проводилась химерным белком NS-ESAT в сочетании с коммерческим адъювантом на основе геля гидроксида алюминия и магния (Imject Alum, фирма Thermo Scientific). Вторая иммунизация осуществлялась через две недели после первой, доза - 10 мкг белка. По прошествии месяца после первой иммунизации были выделены лимфоциты селезенки мышей и простимулированы белком ESAT, после чего по скорости включения радиоактивной метки оценивалась степень пролиферации лимфоцитов (определяемая в виде индекса стимуляции) и, соответственно, эффективность иммунизации. Важно, что при этом определялась эффективность стимуляции клеточного звена иммунного ответа, недостаточная при использовании стандартных адъювантов на основе алюминия. Наибольший эффект, при указанных условиях, проявился при введении NS-ESAT в сочетании с наночастицами гидроксиапатита (Фиг.3), причем стимуляция иммунного ответа была больше, чем в группах, иммунизированных белком NS-ESAT без адъюванта или белком NS-ESAT в сочетании с коммерческим адъювантом. Это делает наночастицы гидроксиапатита перспективным адъювантом, стимулирующим клеточный иммунный ответ, в частности, в составе гриппозных вакцин.

Пример 5. Исследование адъювантных свойств пептидов - лигандов CXCR 1 и 2 рецепторов.

Как уже указывалось, гидроксиаппатит относится к высокоэффективным сорбентам. Для стимуляции иммунного ответа в последние годы активно исследуются агонисты Toll - рецепторов [Tomai М.A., Miller R.L., Lipson К.Е., et al. Resiquimod and other immune response modifiers as vaccine adjuvants. Expert Rev. Vaccine. 2007, Vol.6(5), p.835-847]. Несмотря на высокую эффективность, этот подход имеет ряд принципиальных недостатков. Первый - среди этих адъювантов рассматриваются низкомолекулярные вещества (Ресиквимод), которые обладают быстрой диффузией в локусе введения. Второй недостаток - действие на рецепторы предусматривает активацию их сигнальных систем, что носит индивидуальный характер и не всегда эффективно (например, при иммунизации детей или пожилых людей).

Другой подход представляется более продуктивным: стимуляция цитокиновых рецепторов широкого функционального профиля. К таким рецепторам относятся CXCR 1 и 2 рецепторы [Murdoch С. CXCR4: chemokine receptor extraordinaire. Immunol Rev. 2000, Vol.177, p.175-84].

В связи с этим представляет интерес использование в составе наночастиц-адъювантов пептидных хемоаттрактантов, которые, с одной стороны, могли бы инициировать миграцию иммунокомпетентных клеток в локусы появления чужеродных антигенов, а с другой стороны, - стимулировать презентацию антигенов наиболее функциональным путем. К таким хемоаттрактантам относятся лиганды CXCR 1 и 2 рецепторов, в частности короткий пептид Про-Про-Гли-Про-Гис (PPGPH). Гомологичный этому пептиду домен выявлен в большинстве хемокинов и ИЛ-8 [Weathington N.M. van Houwelington А.Н., Noerager B.D. et al. A novel peptide CXCR ligand derived from extracellular matrix degradation during airway inflammation. Nature Med. 2006, Vol.12, p.317-323]. Для получения нового высокоэффективного адъюванта мы адсорбировали этот пептид на наночастицах гидроксиаппатита.

Синтетический пептид Про-Про-Гли-Про-Гис (PPGPH) адсорбировали на наночастицах гидроксиаппатита в 0,1 М фосфатном буфере, pH 6,8. Наночастицы после адсорбции пептида отмывали при 10000 xg и смешивали с антигеном (см. примеры 1 и 2, фиг.2). Результаты тестирования иммуногенности представлены на Фиг.4. Как видно из представленных данных, иммуногенность антигена NS-ESAT в случае использования комплекса наночастиц гидроксиаппатита с пептидом значительно возрастает, что является неожиданным эффектом и свидетельствует о высоком уровне стимуляции и возможности использования такого подхода для конструирования нановакцин.