КОНЪЮГАТЫ 2-МЕТИЛТИО-6-НИТРО-1,2,4-ТРИАЗОЛО[5,1-c]-1,2,4-ТРИАЗИН-7(4I')-ОНА С ГЛУТАТИОНОМ И ДРУГИМИ ПЕПТИДАМИ, ОБЛАДАЮЩИЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к области биологически активных соединений и, в частности, к производным 2-метилтио-6-(глутатион-8-ил)-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-она типа ковалентных аддуктов с глутатионом и цистеин-содержащими пептидами, отличающихся низкой токсичностью и обладающих широким спектром противовирусной активности, и может быть использовано в синтезе противовирусных препаратов, сочетающих в структуре компоненты органических соединений, пептиды и пептидомиметики, для создания средств лечения вирусных заболеваний животных и человека.

Производные азолоазинов идентифицированы в качестве химических соединений, проявляющих высокий уровень и широкий спектр противовирусной активности, в частности противовирусное действие в отношении вирусов гриппа типов А и В.

В качестве аналога выбраны соединения, описанные в работе (В.Л. Русинов, О.Н. Чупахин, С.Л. Деев, Т.С. Шестакова, Е.Н. Уломский, Л.И. Русинова, О.И. Киселев, Э.Г. Деева. Синтез и противовирусная активность аналогов нуклеозидов на основе 1,2,4-триазоло[3,2-с][1,2,4]триазин-7-онов. Известия АН, Серия химическая, 2010, №1, с.135-142). Данная группа препаратов, включая 2-R-6-нитро-4-аллилоксиметил-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-оны, содержит ряд характерных заместителей: R=Н, СН₃, SCH₃, и NO₂. Для всех этих соединений наиболее метаболически нестабильной является NO₂-группа. В связи с этим появляются возможности направить метаболизм данных соединений и, в частности, -Метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-С]-1,2,4-триазин-7(4Н)-он, по пути природных модификаций, обеспечивающих существенное изменение базовых фармакологических свойств соединения и усиления его противовирусной активности. К недостаткам данных соединений можно отнести относительно высокую токсичность в клеточных культурах (низкую токсичность in vivo), невысокую растворимость и, следовательно, биодоступность, а также низкий уровень противовирусной активности в клеточных культурах.

В качестве прототипа выбран 2-Метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-С]-1,2,4-триазин-7(4Н)-он, дегидрат проявляющий противовирусную активность (патент РФ 2294936, приоритет 29.06.2005 г.), имеющий следующую структуру:

Данный препарат получил товарное название «Триазавирин». Он характеризуется относительно высокой токсичностью в клеточных культурах (низкой токсичность in vivo), невысокой растворимостью и, следовательно, биодоступностью и низким уровнем противовирусной активности в клеточных культурах.

Препарат «Триазавирин» (ТЗВ) (2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-он) находится на 2 фазе клинических испытаний и поэтому представляет особый интерес с точки зрения усовершенствования его фармакологических свойств без существенных изменений его структуры и основных химических свойств.

Изобретение направлено на усовершенствование фармакологических свойств препарата ТЗВ, а именно снижение клеточной токсичности при сохранении высокого уровня противовирусной активности in vivo, а также усиление прямого противовирусного действия на уровне тканевых культур.

Для этого предложен конъюгат 2-метилтио-6-(глутатион-8-ил)-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-она с пептидом общей формулы (2), где пептид представляет собой трипептид Глицин-Цистеин-Глутамин или другой пептид, содержащий Цистеин, SH - группа которого способна переходить в состояние тиолятного аниона и взаимодействовать с нитрогруппами азолоазинов,

атом S происходит из SH - группы Цистеина, а Х и Y могут быть представлены любой аминокислотой, включая L- и D- аминокислоты, их модифицированные аналоги, (n) - до 100-аминокислотных остатков при сохранении конформации полипептида, не изменяющей реактогенности и доступности остатков Цистеина.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг.1 представлена хроматограмма инкубационной смеси ТЗВ/Г-SH после инкубации в течение 24 часов при +37°С. Детекция по поглощению на 214 нм (пептидная связь -·-). Пик - Глутатион, пик - возможно, комплекс ТЗВ/Г-SH, пик - свободный ТЗВ, на фиг.2 - хроматограмма 50 mM раствора ТЗВ после 24 часов инкубации при +37°С. Детекция осуществлялась проточным UV-детектором по поглощению на длине волны 214 нм. Масс-спектрометрический анализ структуры аддукта ТЗВ-ГТН, на фиг.3 - хроматограмма инкубационной смеси Г-SH (10 мг/мл) и препарата ТЗВ (1 мг/мл) после 24 ч инкубации при +50°С. Детекция осуществлялась проточным UV-детектором по поглощению на длине волны 214 нм. Пик 1 - Г-SH, пик 2 - ТЗВ-Г-SH, пик 3 - ТЗВ.

Изобретение может быть реализовано следующим образом.

Пример 1. Способ получения соединения конъюгатов ТЗВ с восстановленным глутатионом.

Для получения конъюгата препарата ТЗВ с восстановленным Глутатионом получали растворы ТЗВ в концентрации 50 мкМ и эквимолярный раствор из восстановленного Глутатиона (Г-SH) в 50 мМ буфере Tris-HCl, pH=7.4. Смешивали равные объемы исходных растворов, далее смесь инкубировали на термошейкере 24 часа при 4°C и 37°C.

После инкубации 100 мкл смеси наносились на колонку через инжекторную петлю. Хроматографию проводили на колонках Phenomenex С 12 и YMC Pack Pro С4 в буферной системе 50 мМ Tris-HCl - ацетонитрил (линейный градиент ацетонитрила 0→100%).

Хроматографическим анализом инкубационной смеси ТЗВ показано, что ТЗВ, способен связываться с Г-SH. Как видно на фиг.1, после инкубации смеси ТЗВ и Г-SH в течение 24 часов при 37°C на хроматограмме наряду с пиками ТЗВ и Г-SH выявляется дополнительный пик ТЗВ/Г-SH, который отсутствует на хроматограммах компонентов смеси, инкубированных в тех же условиях. Установлено, что инкубация при 37°C приводила к существенному повышению выхода комплекса, происходит более эффективно в отличие от 4°C. Фракции, соответствующие пику комплекса ТЗВ/Г-SH, отбирали и проводили исследование структуры методом масс-спектрометрии.

Анализ поведения ТЗВ в растворах показал, что при длительной инкубации в физиологических условиях (фиг.2) ТЗВ не образует димеров и других производных, которые могли бы иметь такие же, как комплекс ТЗВ/Г-SH хроматографические свойства.

Аддукт ТЗВ/Г-SH с достаточно высоким выходом образуется при 10-кратном избытке Г-SH. Это свидетельствует о том, что данный процесс может осуществляться без каталитической активности оксидоредуктаз или, например, глутатион-S-трансферазы (Gallogly M.M., Mieyal J.J. Mechanisms of reversible protein glutathionylation in redox signaling and oxidative stress. Current Opinion in Pharmacology, 2007, Volume 7, p.381-391, Dalle-Donne I., Colombo G., Nicoletta Gagliano N., et al. S-Glutathiolation in life and death decisions of the cell. 2011, Vol.45, No.1, p.3-15 (doi:10.3109/10715762.2010.515217)). В присутствии окислительно-восстановительных ферментов клеток данный процесс в физиологических условиях для аналоговых природных соединений протекает с более высоким выходом, приближающимся к 90 и более %, если не происходит каталитической трансформации соединения в амино-производные (Karpenko I., Deev S., Kiselev O., Charushin V. et al Antiviral Properties, Metabolism, and Pharmacokinetics of a Novel Azolo-1,2,4-Triazine-Derived Inhibitor of Influenza A and В Virus Replication Antimicrob. Agents Chemother. 2010, Vol.54, p.2017-2022). На фиг.3 представлена хроматограмма реакционной смеси ТЗВ с избытком Г-SH в присутствии донора NO и перекиси водорода. Данные условия моделируют in vitro условия окислительного стресса, характерного для вирусных инфекций, в целом, и гриппа, в частности (Ludwig S, Planz О, Pleschka S, Wolff T. Influenza-virus-induced signaling cascades: targets for antiviral therapy? Trends Mol. Med. 2003, Vol.9, p.46-52. Nencioni L, Iuvara A, Aquilano K, et al. Influenza A virus replication is dependent on an antioxidant pathway that involves GSH and Bcl-2. FASEB J. 2003, Vol.17, p.758-60. Cai J., Chen Y., Seth S. et al. Inhibition of influenza infection by glutathione. Free Rad. Biol. & Med. 2003, Vol.34, p.928-936).

На фиг.3 отчетливо виден существенный прирост Г-SH. Поэтому при образовании конъюгата существенным фактором является температура инкубации. Вероятно, в клетках такая реакция осуществляется как при участии свободного радикального окисления Глутатиона и нитрогруппы ТЗВ, а при взаимодействии с тиолятным анионом Глутатиона нитрогруппа ТЗВ элиминируется. В результате образуется соединение 1 с характерным масс-спектром (фиг.2).

Глутатион является трипептидом Глутамин-Цистеин-Глицин. В связи с расширением спектра функциональной активности представляет интерес выяснение вопроса о возможности получения коньюгатов с цистеином и пептидами различного состава.

В связи с этим исследовали взаимодействие ТЗВ с цистеином и другими цистеин-содержащими пептидами. Данные по взаимодействию ТЗВ с аминокислотами и пептидами приведены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, ТЗВ взаимодействует с цистеином, не взаимодействует с аланином и близкими по структуре аминокислотами. При этом наблюдается взаимодействие с образованием коньюгатов с короткими Цистеин-содержащими пептидами. Повышение выхода аддукта может быть достигнуто путем изменения условия проведения реакции.

Пример 2. Противовирусные свойства аддуктов препарата ТЗВ.

Клетки. В качестве клеточной культуры для репродукции вирусов гриппа использовали односуточную монослойную эпителиальную культуру клеток MDCK (почка собаки).

Вирусы. Для оценки противовирусной активности использовали эталонный вирус A/Puerto Rico/8/34, устойчивый к ремантадину, а также пандемический вирус гриппа H1N1v А/Санкт-Петербург/2/09 (идентичный так называемому пандемическому вирусу «свиного гриппа» A/California/7/09). Вирус H1M1vA/Санкт-Петербург/2/09, как и вирус A/California/7/09 также проявлял устойчивость к ремантадину, что делает оба вирусных изолята идентичными по лекарственной резистентности и удобным объектом для испытания новых противовирусных препаратов.

Токсичность соединений определяли с помощью МТТ-теста в культуре клеток MDCK.

Исследование цитотоксичности заявляемого соединения (ТЗВ/Г-SH) показало, что СС₅₀ (концентрация препарата, при которой гибнет 50% клеток монослоя) в условиях тестирования на клетках MDCK, составила 1200 мкг/мл (при сравнении с ТЗВ - 362 мкг/мл). Концентрация соединения, при которой выживают все клетки монослоя, составила 620 мкг/мл (при 212 мкг/мл для ТЗВ).

Изучение противовирусной активности соединения in vitro в отношении вируса A/Puerto Rico/8/34 и вируса пандемического гриппа H1N1v А/Санкт-Петербург/2/09 (A/California/7/09-подобный) оценивали по подавлению цитотоксической активности вируса (%).

Из данных, представленных в таблице 2, видно, что аддукт ТЗВ-Глут проявляет более высокую прямую (в клеточной культуре) противовирусную активность. Аддукт ТЗВ подавляет репродукцию вируса A/Puerto Rico/8/34/ на 93,3% при концентрации 20 мкг/мл. Такого эффекта можно достигнуть только при концентрации ТЗВ 100-150 мкг/мл и Арбидола - 50 мкг/мл. Низкий уровень активности ремантадина в данном тесте связан с тем, что вирус PR8/34 является резистентным к этому препарату. При концентрации 10 мкг/мл соединение ТЗВ-Г-SH обеспечивает защиту клеток от цитопатического действия вирусной инфекции на 87%. При этом снижение токсичности ТЗВ в составе аддукта в 4 раза повышает химиотерапевтический индекс почти в 10 раз.

Таким образом, аддукты ТЗВ-Глут проявляют высокую противовирусную активность на штамме вируса гриппа типа А, устойчивом к препарату ремантадин.

Полученные данные свидетельствуют о том, что препарат ТЗВ в виде конъюгата с Глутатионом может быть использован в лечебных схемах в широком диапазоне дозировок в зависимости от тяжести заболевания и осложнений.

Таким образом, аддукты ТЗВ-Г-SH характеризуются низкой токсичностью и при этом сохраняют высокий уровень противовирусной активности. С одной стороны, это объясняет один из механизмов действия препарата ТЗВ, а с другой стороны, открывает новое направление в получении противовирусных препаратов с максимальной адаптацией к системам дезинтоксикации клеток организма и контроля окислительно-восстановительного потенциала, в значительной степени определяющегося функциями Глутатиона. Получение аддуктов Г-SH в физиологических условиях свидетельствует о том, что данные соединения могут образовываться в условиях нормального и измененного инфекцией метаболизма клеток. Простота получения аддуктов позволяет осуществить их промышленный выпуск, а при совместном применении достигнуть аддитивного противовирусного эффекта путем метаболической активации препарата ТЗВ через S-глутатионирование.