Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ФИБРИН-МОНОМЕРА ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ

Способ промышленного получения фибрин-мономера из плазмы крови относится к области медицины и системе гемостаза человека, фармацевтическому производству. Получаемый продукт - фибрин-мономер может быть использован как местное или системное кровоостанавливающее средство, для ускорения заживления швов и ран в хирургии, травматологии, гинекологии, спортивной медицине и т.д. После стерилизации может использоваться для внутривенного введения с целью остановки кровотечений в экстренных случаях.

Известные способы выделения фибрин-мономера из плазмы крови отличаются высокой трудоемкостью и продолжительным циклом изготовления, дороговизной расходных материалов, невысоким выходом фибрин-мономера. Кроме того, эти способы получения применимы для небольшой лаборатории и не подходят для фармацевтического производства.

Известен способ получения растворимого фибрин-мономера (патент №2253474), в котором в качестве сырья используют фибриноген человека.

При получении фибрин-мономера фибриноген человека подвергают обработке тромбиноподобным ферментом - анцистрон (из яда змеи). Образовавшийся фибрин растворяют путем диализа против 0,01 нормальной НСl. Полученный фибрин-мономер может использоваться для определения тканевого активатора плазминогена и/или его ингибитора.

Недостатками известного способа являются:

1. В качестве сырья для получения фибрин-мономера предлагается использовать фибриноген человека, а не плазму.

2. Растянутость по времени - 6-8 часов инкубации при +37°C и несколько часов диализа.

3. Высокая дороговизна используемых реагентов (в частности, анцистрона и пептидного субстрата плазмина).

4. Малый масштаб производства (для небольшой лаборатории).

5. Ограниченное применение продукта фибрин-мономера - для определения тканевого активатора плазминогена и/или его ингибитора.

Наиболее близким по достигаемому техническому результату является способ получения фибрин-мономера (патент №SU 663404), принятый за прототип.

В качестве сырья при изготовлении фибрин-мономера используют 0,2% раствор фибриногена. К 1000 мл 0,2% раствора фибриногена добавляют монойодуксусную кислоту или монойодацетамид в конечной концентрации 0,001-0,05 М и эпсилоаминокапроновую кислоту в концентрации 0,3-0,6% с последующим добавлением к фибриногену 100-200 ед. активности тромбина в объеме 10 мл физиологического раствора.

Образующийся сгусток собирают стеклянной палочкой, отжимают, промывают в физиологическом растворе и переносят в 100 мл 10-20% раствора мочевины в ацетатном буфере (pH 5,2) и растворяют при комнатной температуре. После растворения сгустка раствор белка разбавляют 800 мл физиологического раствора и добавляют 200 мл буфера Палитча. Сгусток снова собирают, отжимают, промывают в физиологическом растворе и растворяют в минимальном объеме раствора мочевины. Эту операцию повторяют 3-4 раза.

В результате получают 50-100 мл 0,5-1% раствора фибрин-мономера, который хранят при +4-5°C.

Общими признаками известного способа с заявляемым являются:

а) для перевода фибриногена в фибрин добавляется тромбин;

б) при растворении фибринового сгустка используется ацетатный буфер (pH 5,2) с 10-20% мочевиной;

в) операцию отмыва фибринового сгустка проводят 3-4 раза.

Недостатками способа-прототипа является низкая эффективность, связанная:

1. В качестве сырья используют раствор фибриногена с концентрацией 0,2%, который требует отдельной технологии получения из плазмы или использования готового дорогостоящего лиофильно высушенного фибриногена.

2. Невысокий выход фибрин-мономера. Максимальный выход фибрин мономера - до 50% от раствора фибриногена.

3. Раствор фибрин-мономера, который хранят при +4-5°C неопределенное время.

4. Малый масштаб производства (в пределах лаборатории).

5. Способ применения - только как аналитический реагент в биохимии, физиологии и фармакологии.

Техническим результатом заявляемого способа является повышение эффективности, выраженной в более высоком выходе продукта фибрин-мономера; в получении достаточно чистого и более стабильного в виде раствора фибрин-мономера.

Технический результат достигается тем, что берут 30 л свежезамороженной плазмы человека и размораживают при температуре +37°C, при постоянном перемешивании добавляют в плазму 10 л насыщенного раствора сульфата аммония и полученную смесь выдерживают 15 мин при комнатной температуре, после чего центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость сливают, затем в 7 л 0,05 М фосфатного буфера растворяют 1,4 кг мочевины и подогревают до температуры +37°C, далее в этом буфере растворяют полученный ранее осадок фибриногена, затем добавляют сюда же 50000 ед. тромбина человека, перемешивают и оставляют смесь на 1 час при комнатной температуре, далее разделяют полученную смесь на три части, в емкость с одной из трех частей исходного раствора фибриногена вносят 40 л 0,05 М фосфатного буфера с температурой +37°C, образовавшийся в емкости фибриновый сгусток собирают, промывают в дистиллированной воде и отжимают, в результате получают три отмытых фибриновых сгустка, далее отмыв фибринового сгустка повторяют таким же образом еще два раза, конечный продукт - фибрин-мономер получают путем растворения отмытого фибринового сгустка в 4 л ацетатного буфера с 10-20% мочевиной и pH 5,0-5,5, который разливают во флаконы из расчета 10-20 мг/флакон, далее флаконы с фибрин-мономером замораживают и лиофильно высушивают, после чего укупоренные флаконы подвергают лучевой стерилизации, лиофилизированный фибрин-мономер растворяется дистиллированной водой, в лиофилизированном виде хранится не менее 2-х лет, в жидком виде стабилен более 24 часов при +4-8°C.

Способ осуществляют следующим образом:

Для осуществления способа используют следующее оборудование:

1. Центрифуга ЦР-6 (загрузка до 10 л, до 4000 об/мин), производитель БФК (Россия).

2. pH-метр WTW 315i (Германия).

3. Спектрофотометр Shimadzu UV1800 (Япония).

4. Мешалка магнитная Heidolph (Германия).

5. Весы прецизионные Ohaus (Швейцария).

6. Емкости пластиковые или из нерж. стали: 10 л - 1 шт. Бак 50 л - 3 шт.

7. Автоматический дозатор на 10-200 мкл, производитель Biohit (Финляндия).

8. Автоматический дозатор на 5000 мкл, производитель Biohit (Финляндия).

9. Аппарат для размораживания плазмы Quick Thaw (Helmer, США) и реактивы:

1. Ацетат натрия (CH₃COONaH₂O), производитель Panreac (Испания).

2. Уксусная кислота ледяная (CH₃COOH), производитель Реахим (Россия). Приготовление 0,2М ацетатного буфера (pH 5,0-5,5):

30 г ацетата натрия и 5 мл ледяной уксусной кислоты растворить в 6 л дистиллированной воды.

3. Натрий фосфорнокислый однозамещенный, 2-водный (NaH₂PO₄), производитель Реахим (Россия).

4. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный (Na₂HPO₄), производитель Реахим (Россия).

Приготовление 0,05М фосфатного буфера pH 7,4: 725 г NaH₂PO₄ 2-водного и 72,5 г Na₂HPO₄ 12-водного растворить в 100 л дистиллированной воды.

5. Сульфат аммония ((NH₄)₂SO₄), производитель «Реахим» (Россия). Приготовление насыщенного раствора сульфата аммония:

5 кг сульфата аммония растворить в дистиллированной воде до объема 10 л.

6. Мочевина (NH₂CONH₂), производитель «Panreac» (Испания).

7. Набор Coomassie G250 (для метода Бредфорда), производитель ЗАО «Силекс» (Россия).

8. Тромбин человека стерильный 500 ед/флакон, производитель фирма «Технология-Стандарт» (Россия).

9. Фибриноген человека, производитель Sigma-Aldrich.

10. Набор для определения концентрации фибриногена в плазме крови (Тех-Фибриноген тест производства ООО фирма Технология-Стандарт).

Способ осуществляют поэтапно.

1. Осаждение фибриногена

Берут 30 л свежезамороженной плазмы человека, размораживают при температуре +37°C. При постоянном перемешивании добавляют в плазму 10 л насыщенного раствора сульфата аммония и полученную смесь выдерживают 15 мин при комнатной температуре, после чего центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, полученный осадок представляет собой фибриноген (промежуточный продукт - 1).

В 7 л 0,05 М фосфатного буфера растворяют 1,4 кг мочевины и подогревают до температуры +37°C. Приготовливают 50000 ед. тромбина человека стерильного (100 флаконов по 500 ед./флакон), растворив содержимое каждого флакона 2 мл воды для инъекций. В приготовленном буфере растворяют полученный ранее осадок фибриногена при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Затем добавляют сюда же 50000 ед. тромбина человека, перемешивают и оставляют смесь на 1 час при комнатной температуре.

2. Выделение фибринового сгустка и его отмывка

После выдержки полученной смеси выделяют фибриновый сгусток (промежуточный продукт - 2). Для этого разделяют полученную смесь на 3 части по 4 л. В емкость с одной из трех частей исходного раствора фибриногена вносят 40 л 0,05 М фосфатного буфера, имеющего температуру +37°C. Образовавшийся в емкости фибриновый сгусток собирают, промывают в 5 л дистиллированной воды и отжимают. В результате проведения трех таких циклов получают 3 фибриновых сгустка.

Отмыв фибринового сгустка проводят следующим образом:

В 6 л 0,2 М ацетатного буфера растворяют 1 кг мочевины. В приготовленном буфере растворяют фибриновые сгустки, интенсивно перемешивая на магнитной мешалке в течение 1,5-2-х часов. Разделяют исходный раствор фибрин-мономера на три части, по 3 л в отдельные емкости. В емкость с одной из трех частей исходного раствора фибрин-мономера вносят 30 л 0,05 М фосфатного буфера с температурой +37°C.

Образовавшийся в емкости фибриновый сгусток собирают и промывают в 5 л дистиллированной воды и отжимают. Повторяют отмыв два-три раза.

3. Подготовка раствора фибрин-мономера к лиофилизации, определение концентрации фибрин мономера

Отмытый фибриновый сгусток растворяют при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке в течение 1,5-2-х часов в 4 л 0,2 М ацетатного буфера с 15% мочевины.

Концентрацию фибрин-мономера в растворе определяют фотометрически по методике Бредфорд, в качестве стандарта используют очищенный фибриноген человека. После определения концентрации осуществляют розлив из расчета по 10-20 мг/флакон. Разлитый фибрин-мономер замораживают при температуре минус 20-минус 50°C и лиофильно высушивают. Укупоренные флаконы с лиофилизированным фибрин-мономером подвергают лучевой стерилизации.

Заявленный способ обладает высокой эффективностью за счет более высокого выхода фибрин-мономера (до 90% фибриногена плазмы) по сравнению с прототипом при относительно невысоких затратах.

Примеры, подтверждающие расчет выхода фибрин-мономера:

Пример 1

5 мешков замороженной плазмы человека (по 300 мл) разморозить при +37°.

Используя набор для определения концентрации фибриногена, определяют концентрацию фибриногена в плазме в каждом мешке. Определили: №1 - 3 г/л, №2 - 3,2 г/л, №3 - 2,3 г/л, №4 - 2,8 г/л, №5 - 3,7 г/л. При смешивании плазмы в пуле (1500 мл) 3 г/л.

Фибрин-мономер получают по заявленному способу.

Концентрацию фибрин-мономера определяют на фотометре при длине волны 605 нм по методу Бредфорда. Разливают во флаконы из расчета по 10 мг/флакон, получено 315 флаконов. Выход фибрин-мономера составил 70% от фибриногена плазмы.

Пример 2

5 мешков замороженной плазмы человека (по 600 мл) разморозить при +37°.

Используя набор для определения концентрации фибриногена, определяют концентрацию фибриногена в плазме в каждом мешке. Определили: №1 - 2,5 г/л, №2 - 2,0 г/л, №3 - 3,2 г/л, №4 - 2,1 г/л, №5 - 2,9 г/л. При смешивании плазмы в пуле (3000 мл) определили 2,5 г/л.

Фибрин-мономер получают по описанному выше способу.

Концентрацию фибрин-мономера определяют на фотометре при длине волны 605 нм по методу Бредфорда. Разливают во флаконы из расчета по 15 мг/флакон, получено 450 флаконов. Выход фибрин-мономера составил 90% от фибриногена плазмы.

Перед использованием флакон с стерильным лиофилизированным фибрин-мономером растворяется дистиллированной водой. Концентрация фибрин-мономера во флаконе не менее 5 мг/мл. Водный раствор фибрин-мономера отличается высокой стабильностью (более 24 часов при +4-8°C) и способностью к полимеризации. Лиофилизированный фибрин-мономер хранится не менее 24 мес при температуре +4-8°C.

Конечная продукция после стерилизации может использоваться как высокоэффективное кровоостанавливающее средство, при внутренних или наружных кровотечениях, а также для внутривенного введения в экстренных случаях. Может использоваться для диагностических и биохимических исследований, как отдельный реагент или в составе различных наборов.