Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ КОСТНОГО МОЗГА

Способ культивирования мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга, относится к области медицины - трансфузиологии и к разделам биотехнологии.

Одним из перспективных направлений в медицине является использование стволовых клеток для замещения в организме поврежденных и изношенных клеток и тканей. Стволовые клетки можно получить из разных частей организма, в частности гемопоэтические стволовые клетки получают из пуповинной и плацентарной крови, мезенхимные стволовые клетки (МСК) получают из костного мозга, жировой ткани, фибробластов. Перспектива использования мезенхимных стволовых клеток состоит в том, чтобы при их трансплантации в организм человека задействовать не только аутологичные клетки, но и клетки аллогенные, расширив таким образом их изготовление и применение. Выделив путем эксфузии небольшое количество костного мозга ~0,5-1 мл, а из него мезенхимные стволовые клетки посредством культивации, можно добиться получения их на несколько порядков больше.

В медицине известны способы культивирования МСК из костного мозга, так, в статье авторов Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Онищенко Н.А., Гуреев С.В., Остроумов Е.Н., Честухин В.В., Крашенников М.Е., Миронков Б.Л., Хубутия А.Ш. «Первый опыт клинического применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для сократительной функции миокарда» «Российский кардиологический журнал» №5(43) 2003 г. стр.42-50, описан способ их получения. При получении трансплантационного материала осуществляют забор аутологичных клеток костного мозга путем пункции гребня подвздошной кости больного в количестве 150-300 мл. Путем определенных технологических действий получают клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных элементов, в количестве 350-1500×10⁶. Затем эти клетки ресуспендировали в ростовой среде Iskov”s (Gibco, Grand Island), с добавками. Суспензию клеток высевали для культивирования в чашки Петри диаметром 150 мм в концентрации 2,5-3,0×10⁶ кл/мл при 37°C в CO₂ инкубаторе - атмосфере с 5% CO₂ и 95% влажности на 2-е суток. В конце вторых суток в среду вносили 5-азацитидин до конечной концентрации 6 мкМ на 72 часа для направления дифференцировки стромальных МСК в кардиомиоцитоподобные и для ингибирования спонтанной дифференцировки их в по остеобластоидному направлению. Через 72 часа инкубации на 6-е сутки культивирования смешанная культура МСК использовалась для дальнейшего культивирования. Для этого культуральную среду полностью заменяли ростовой с добавлением к ней (инсулиноподобного фактора роста II, основного фактора роста фибробластов) тироксина и трийодтиронина. Среду заменяли через каждые три дня в течение 2-3 месяцев для наращивания значительной клеточной массы в зависимости от исходного пула стволовых клеток в аспирате больного. Затем пластик-адгезивные клетки снимались трипсином отмывались центрифугированием. Образовавшийся осадок ресуспендировали в растворе Хэнкса с добавками до конечной концентрации 10×10⁶ кл/мл и хранился на льду до введения больному не более 8 часов.

Недостатками такого способа культивирования являются: очень большой забор костного мозга (150-300 мл), за одну биопсию такое количество аутологичного костного мозга аспирировать травматично для пациента, при осуществлении нескольких эксфузий необходимо было указать, по какой порции костного мозга было взято, сколько раз проведена аспирация, с каким промежутком времени и как был восстановлен пациент, кроме того, в указанном способе отсутствует проверка костного мозга и полученных мезенхимных стволовых клеток на контаминацию, инфицирование, гистосовместимость, биологический посев, при проведении операций инфаркта миокарда (сердечной недостаточности, ишемии и т.д.) зачастую очень срочных, срок получения и культивирования - 3 месяца - очень длителен, данный способ является экспериментальным, пробным и осуществлен лабораторным путем, для более широкого применения способ не технологичен и занимает много времени.

В качестве прототипа известно техническое решение «Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ex vivo», п. РФ №2323252 от 25.10.2006 г, дата публикации 27.04.2008 г., C12N 5/08, заключающееся в выделении из костного мозга ядросодержащих клеток и осуществлении культивирования в ростовой среде, выполненной в виде минерально-солевого раствора, содержащего аминокислоты, антибиотики, L-глютамина и эмбриональную телячью сыворотку, либо в виде среды RPMI-1640 (“Sigma”, USA), содержащей пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L - глютамин 2 мМ, 15% эмбриональной телячьей сыворотки, до получения заданного количества мезенхимальных стволовых клеток, в процессе каждого из которых высевают выделенные клетки в культуральные сосуды, в которых в ростовой среде увеличивают популяцию мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Извлечение последних осуществляют 0,03-0,1%-ным раствором трипсина. В процессе каждого цикла культивирования регулярно определяют pH ростовой среды и заменяют ростовой средой, pH которой от 6,0 до 8,0. Перед и после обработки мезенхимальные стволовые клетки отмывают в изотоническом растворе от следов ростовой среды и трипсина.

Недостатками вышеуказанного способа культивирования являются: при достижении монослоя популяции МСК наблюдается увеличение адгезии к культуральному сосуду и количество межклеточных контактов, что затрудняет процесс переноса клеток на новый культуральный сосуд. Также при достижении монослоя популяции МСК возникает явление контактного торможения, что отрицательно сказывается на пролиферативном потенциале клеток. Ростовые среды, используемые в способе, недостаточно эффективны и современны для получения МСК, что ведет к возможной потере МСК и не обеспечивает однородную популяцию, отсутствие определения иммунофенотипирования для получения сведений об ядросодержащих клетках, и в какой степени осуществлена однородность популяции МСК.

Техническим результатом предложенного решения является повышение эффективности выделения стволовых клеток посредством повышения однородности с использованием новой ростовой среды с добавлением к ней заменителя сыворотки, с определением популяции мезенхимных стволовых клеток, повышая экономичность и технологичность процесса выделения МСК из костного мозга.

Этот результат достигается тем, что в способе культивирования мезенхимных стволовых клеток, заключающемся в осуществлении увеличения мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга, в соответствующих флаконах в процессе культивирования их в ростовой среде не менее двух циклов с увеличивающим по площади дном до получения их до заданного количества в среде углекислого газа при температуре 37°C с промежуточным воздействием на полученные клетки раствором трипсина, при этом флакон с фракцией мезенхимных стволовых клеток в ростовой среде, выполненной в виде раствора, содержащего 45 мл культуральной среды Advanced Stem Cell Media с добавленными к ней 5 мл заменителя сыворотки Advanced Supplement for Stem Cells, 0,5 мл 100-кратного раствора глутамина, 1 мл или 0,5 мл раствора стрептомицина или гентамицина, устанавливают в CO₂-инкубатор с экспозицией на 3 суток с прикреплением к пластику культурального флакона мезенхимных стволовых клеток, после двукратной промывки в ламинарном боксе содержимого флакона теплым с температурой 36-38°C фосфатным солевым буфером с удалением неприкрепившихся клеток, добавляют во флаконы ростовую среду и вновь вносят флакон с клетками и ростовой средой в CO₂-инкубатор, последующее культивирование-субкультивирование проводят с периодом не чаще чем раз в 5 дней при достижении конфлюентности не более 90% со сменой культуральной среды не чаще чем раз в три дня, в ламинарном боксе, удалив из флакона кондиционную среду и двукратно промыв клетки раствором трипсина с ЭДТА, добавляют к клеткам 0,2-0,5 мл последний раствор с ЭДТА и выдерживают содержимое в течение 3 минут, при этом взяв каплю суспензии, содержащей мезенхимные стволовые клетки, считают их количество в камере Горяева, подсчитывая количество клеток в четырех больших квадратах в углах каждой из двух заштрихованных областей, затем разливают суспензию из предыдущего флакона, стряхивая клетки от подложки и отмывая оставшиеся клетки ростовой средой, в новый флакон, содержащий 10 мл ростовой среды с увеличенной площадью дна - 75 см², и рассеивают клетки во флаконе в соотношении объемов 1 к 3-м или 1 к 4-м в зависимости от площади дна, и вновь для их роста устанавливают флаконы с ростовой средой и с клетками в CO₂-инкубатор, после получения мезенхимных стволовых клеток в требуемом количестве до их выдачи проверяют кондиционную среду с клетками на наличие или отсутствие бактериальной контаминации, осуществив анализ на бактериальный посев и иммунофенотипирование с использованием проточного цитометра на наличие маркеров CD90, CD105, CD34, CD45, CD166 с определением количества жизнеспособных мезенхимных стволовых клеток и фиксированием результатов выделения мезенхимных стволовых клеток в паспорт на образец мезенхимных стволовых клеток.

Сущность изобретения как технического решения выражается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.

Существенными признаками решения, совпадающими с признаками прототипа, являются: А - осуществление увеличения мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга, в соответствующих флаконах в процессе культивирования в ростовой среде не менее двух циклов с увеличивающим по площади дном до получения их до заданного количества в среде углекислого газа при температуре 37°C с промежуточным воздействием на полученные клетки раствором трипсина.

Существенными отличительными признаками изобретения являются: Б - флакон с фракцией мезенхимных стволовых клеток в ростовой среде, выполненной в виде раствора 45 мл культуральной среды Advanced Stem Cell Media с добавленными к ней 5 мл заменителя сыворотки Advanced Supplement for Stem Cells, 0,5 мл 100-кратного раствора глутамина, 1 мл или 0,5 мл раствора стрептомицина или гентамицина, устанавливают в CO₂-инкубатора с экспозицией на 3 суток с прикреплением к пластику культурального флакона мезенхимные стволовые клетки; В - после двукратной промывки в ламинарном боксе содержимого флакона теплым с температурой 36-38°C фосфатным солевым буфером с удалением неприкрепившихся клеток, добавляют ростовую среду и вновь вносят флакон с клетками и ростовой средой в CO₂-инкубатор; Г - последующее культивирование-субкультивирование проводят с периодом не чаще чем раз в 5 дней при достижении конфлюентности не более 90% со сменой ростовой среды не чаще чем раз в три дня; Д - в ламинарном боксе, удалив из флакона кондиционную среду и двукратно промыв клетки раствором трипсина 0,05% (1х) с ЭДТА, добавляют к клеткам 0,2-0,5 мл последний раствор трипсина с ЭДТА и выдерживают содержимое в течение 3-х минут; Е - взяв каплю суспензии, содержащей мезенхимные стволовые клетки, считают их количество в камере Горяева, подсчитывая количество клеток в четырех больших квадратах в углах каждой из двух заштрихованных областей; Ж - разливают суспензию из предыдущего флакона, стряхивая в нем клетки от подложки и отмывая оставшиеся клетки ростовой средой, в новый флакон, содержащий ростовую среду 10 мл с увеличенной площадью дна - 75 см², рассеивают клетки в флаконе в соотношении объемов 1 к 3-м или 1 к 4-м в зависимости от площади дна культурального флакона, и вновь для их роста устанавливают флакон с ростовой средой и с клетками в CO₂-инкубатор; И - после получения мезенхимных стволовых клеток в требуемом количестве до их выдачи проверяют кондиционную среду с клетками на наличие или отсутствие бактериальной контаминации, осуществив анализ на бактериальный посев и иммунофенотипирование с использованием проточного цитометра на наличие маркеров CD90, CD105, CD34, CD45, CD166 с определением количества жизнеспособных мезенхимных стволовых клеток и фиксированием результатов выделения мезенхимных стволовых клеток в паспорт на образец мезенхимных стволовых клеток.

Способ культивирования мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга, заключается в следующем. После выделения из костного мозга лейкоцитарного концентрата на фиколе, приготовления ростовой среды, в которой растут клетки, выполненной в виде раствора, содержащего 45 мл культуральной среды Advanced Stem Cell Vedia с добавленными к ней 5 мл заменителя сыворотки Advanced Supplement for Stem Cells, 0,5 мл 100-кратного раствора глутамина, 1 мл или 0,5 мл раствора стрептомицина или гентамицина, и центрифугирования выделяют чистые лейкоциты (ядросодержащие клетки). После соединения последних с чистой культуральной ростовой средой, центрифугирования и слива супернатанта, добавляют ростовую среду и переносят полученную суспензию с мезенхимальными стволовыми клетками на 1-2 флакона с площадью дна 25 см². Устанавливают флаконы с клетками в ростовой среде в CO₂-инкубатор IBBD 6220 (Thermo, Германия) с экспозицией на 3 суток для прикрепления за это время фракции мезенхимных стволовых клеток к пластику. Через 5 суток переносят флаконы из инкубатора в ламинарный бокс “GL-170 Biowizard GoldenLine (Kojair, Finland), промывают 2 раза содержимое флакона 2 мл теплым с температурой 36-38°C фосфатным солевым буфером с удалением неприкрепившихся мезенхимных стволовых клеток. Добавляют новую ростовую среду и вновь устанавливают флакон с клетками в ростовой среде в CO₂-инкубатор. Последующее культивирование-субкультивирование проводят не чаще чем раз в 5 дней при достижении конфлюентности не более 90% со сменой ростовой среды не чаще чем раз в 3 дня. В ламинарном боксе, удалив из флакона кондиционную среду (отработанную) серологической пипеткой, двукратно по 2 мл промывают клетки раствором трипсина 0,05% (1х) в ЭДТА. Добавляют к промытым мезенхимным стволовым клеткам 0,2-0,5 мл раствора приготовленного трипсина с ЭДТА и выдерживают содержимое в течение 3-х минут. Вносят в новые флаконы с площадью дна 25 см² по 5 мл ростовой среды, а во флаконы с площадью дна 75 см² по 10 мл ростовой среды. Аккуратно стучат по стенке флакона, открепляя (стряхивая) клетки от подложки. Смывают оставшиеся клетки 1,5-1,8 мл ростовой средой и снова пипетируют. Количество клеток в суспензии, т.е. в ростовой среде, считают в камере Горяева. Каплю суспензии, содержащей мезенхимные стволовые клетки, вносят в камеру Горяева и подсчитывают количество клеток в четырех больших квадратах в углах каждой из двух заштрихованных областей. Считают клетки, касающиеся правой и верхней ограничивающих линий, но не клетки, касающиеся левой и нижней ограничивающих линий. Разливают полученную суспензию из предыдущего флакона в новый флакон с ростовой средой. Рассеивают клетки в соотношении объемов 1 к 3-м или 1 к 4-м в зависимости от площади дна культурального флакона. Затем вновь ставят флакон с мезенхимными стволовыми клетками в ростовой среде в CO₂-инкубатор, продезинфицировав рабочие наружные поверхности флакона 70% спиртом и освещением его УФ светом в течение 15 минут. После получения мезенхимных стволовых клеток в требуемом количестве до их выдачи проверяют кондиционную среду с клетками на наличие или отсутствие бактериальной контаминации. Кондиционную среду выделяют в отдельный стерильный флакон, откуда переносят ее стерильным шприцем в сосуд для проверки на бактериальный посев. Кроме того, проводят иммунофенотипирование клеток, используя проточный цитометр FC500 (Becman Coulter, USA), на наличие маркеров CD90, CD105, CD34, CD45, CD166 с определением количества жизнеспособных мезенхимных стволовых клеток с использованием для подсчета камеры Горяева. Все результаты культивирования на образец мезенхимных стволовых клеток заносят в соответствующий паспорт.

Использование изобретения «Способ культивирования мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга» по сравнению с прототипом повышает качество выделения мезенхимных стволовых клеток, на каждом пассаже выделения конфлюентность достигает 85-90%, используются современные реагенты в основном из Германии (Hy Clone, Gibco), позволяющие получить более качественную, экономичную и эффективную ростовую среду, позволяющую сократить время роста и получить более однородную популяцию мезенхимных стволовых клеток. В предлагаемом способе проводят иммунофенотипирование с использованием маркеров CD90, CD105, CD34, CD45, CD166, что повышает и эффективность конечного определения мезенхимных клеток и надежность и качество фиксации однородности при определении популяции мезенхимных стволовых клеток В предложенном способе выделения и культивирования мезенхимных стволовых клеток из костного мозга используется современное технологичное оборудование из США, Германии, Финляндии, Японии, и проводится выделение и культивирование стволовых клеток в производственном масштабе на предприятии ООО «Покровский банк стволовых клеток» с участием Медицинской Академии постдипломного образования в г. Санкт-Петербурге с фиксацией результатов выделения мезенхимальных стволовых клеток в паспорте на данный образец.