Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА РОСТА МИКРООРГАНИЗМОВ

1. Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к микробиологии, и может быть использовано при получении питательных сред биологически активных веществ.

2. Уровень техники

Известен способ выращивания дрожжей в условиях аэрации на минеральных питательных средах, содержащих источники углерода, азота, фосфора и микроэлементов с использованием в качестве стимулятора роста дрожжей одной или нескольких а-аминокарбоновых кислот, смешанных с отдельными аминокислотами, такими как аргинин, лейцин и лизин, а также витаминами группы В, особенно пиридоксином и пантотеновой кислотой (патент Франции №1538957, кл. С12С, 1969 г.).

Недостатком этого способа является высокая стоимость исходных продуктов.

Известен способ выращивания дрожжей с использованием в качестве стимулятора роста кротонбетаина и бутилбетаина (патент Японии №5417026, кл. С12С 11/08, 1979 г.).

Однако действие этих стимуляторов проверено только в периодических режимах выращивания дрожжей путем встряхивания колб при низких концентрациях биомассы. Другим недостатком известного способа является значительный расход кротонбетаина и бутилбетаина, который составляет 0,1 мг на 1 л питательной среды.

Известен способ получения экстракта кормовых дрожжей, в котором кормовые дрожжи смешивают с водой, кипятят при постоянном перемешивании и фильтруют (RU 2084171, М. кл⁶: C12N 1/00, 1/14, 20.07.1997 г.).

Недостатком указанного способа является длительность процесса фильтрации, наличие взвешенных частиц и высокая пигментация экстракта.

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа по признакам изобретения и достигаемому эффекту, принятым в качестве прототипа, является способ получения стимуляторов роста микроорганизмов из кормовых дрожжей, в котором кормовые дрожжи смешивают с водой с последующим кипячением, добавляют к экстракту натрий фосфорнокислый двузамещенный, перемешивают до полного растворения соли, подщелачивают до рН 7,2-8,3, после чего добавляют хлористый кальций, подщелачивают до рН 6,7-7,1, кипятят в течение часа, фильтрат концентрируют и высушивают (RU №2227158, М. кл.⁷: C12N 1/00, 1/14, 22.07.2002 г.).

Недостатком прототипа является ограниченная производительность и значительная длительность процесса.

3. Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является интенсификация роста микроорганизмов, используемых в биотехнологических производствах пробиотиков, производстве ферментов, в производстве кормовых белковых продуктов и т.д.

Поставленная задача достигается тем, что в способе получения стимулятора роста микроорганизмов выращивают грибы рода Fusarium sambusinum штаммов MKF-2001-3 или BKMF-3051D на среде, содержащей источник углерода - 3-4%, азота - 0,2-0,3%, фосфора - 0,2-0,3% и микроэлементы - 0,07-0,08% в стерильных условиях при температуре 26-30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 40-48 часов, суспензию гриба и/или культуральную жидкость подтитровывают соляной кислотой до рН=4,0-4,5, нагревают в течение 1,0-1,5 часов до 115°С, выдерживают в течение 2 часов, остужают в течение 1,0-1,5 часов до комнатной температуры, полученная таким образом суспензия и/или культуральная жидкость является стимулятором роста микроорганизмов.

4. Осуществление изобретения

Заявленный способ получения стимулятора роста микроорганизмов осуществляют следующим образом: выращивают грибы рода Fusarium sambusinum штамов MKF-2001-3 или BKMF-3051D на среде, содержащей источник углерода 3-4%, азота - 0,2-0,3%, фосфора - 0,2-0,3% и микроэлементы - 0,07-0,08% в стерильных условиях при температуре 26-30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 40-48 часов.

При этом основные из указанных технологических операций производят при следующей детализации процессов и параметров.

Суспензию гриба подтитровывают соляной кислотой до рН=4,0-4,5, нагревают в течение 1,0-1,5 часов до 115°С, выдерживают в течение 2 часов, остужают в течение 1,0-1,5 часов до комнатной температуры, вносят стимулятор в количестве 0,002-0,8% от объема питательной среды.

Культуральную жидкость отделяют фильтрованием от биомассы, подтитровывают соляной кислотой до рН=4,0-4,5, нагревают в течение 1,0-1,5 часов до 115°С, выдерживают в течение 2-х часов, остужают в течение 1,0-1,5 часов до комнатной температуры, вносят стимулятор в количестве 0,1-8,0% от объёма питательной среды.

Примеры реализации способа.

Пример 1. Готовят питательную среду, для чего 37,5 г дерти и 87,5 г ржаных отрубей заливают 875 мл водопроводной воды. Гидромодуль: твердая и жидкая фракция: 1:7.

Питательную среду подвергали термообработке на кипящей водяной бане в течение 4-х часов при рН=6,7. После термообработки смесь охлаждали до 35°С, с помощью 10% серной кислоты доводили рН до 5,0 и добавляли соли: (NH₄)₂SO₄ - 5 г/л и КН₂РO₄ - 1,5 г/л. В полученную среду вносили ферментный препарат - глюкавамарин.ГЗХ. Ферментолиз проводили в течение 5 часов, после чего полученный ферментолизат анализировали (на содержание сахаров - РВ), разливали по колбам; в количестве 200 мл в каждую колбу.

Колбы с питательной средой стерилизовали в течение 40 мин при 0,5 атм. После стерилизации питательной среды колбы охлаждали до 30°С и вносили в питательную среду биостимулятор.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae diastaticus ВКПМ-у-1218 выращивали в колбах на качалке в течение 24 часов при температуре 32°С и скорости перемешивания среды 240 об/мин. После выращивания биомассы дрожжей в колбах с биостимулятором концентрация сахаров (РВ) снизилась с 6 г/л до 0,4 г/л, в контрольных колбах она была в пределах 0,6-0,7 г/л. В опытных колбах количество биомассы дрожжей было 3,5 г АСВ, в контроле - 2,9 г/л, т.е. на 20,67% меньше. Содержание сырого протеина в целевом продукте составило 42,8%, тогда как в контроле - 41,4%.

Пример 2. Дрожжеподобный гриб Trichosporon cutaneum ВСБ-775 выращивали на той же питательной среде, что и в примере 1, в колбах на качалке в течение 36 часов, используя биостимулятор в количестве 0,1% объема. В итоге определяли количество выращенной биомассы, степень ассимиляции сахаров (РВ) и содержание сырого протеина в биомассе гриба.

В опытных колбах количество накопленной биомассы было в пределах 4,0-4,2 г АСВ, а в контрольных - 3,7-3,8 (+9,33%). Содержание сырого протеина в опытных образцах биомассы было 43,2%, а в контрольных - 41,8% (+3,35%).

Пример 3. Проводили испытания биостимулятора при выращивании дрожжей-сахаромицетов на ферментолизате зерносырья.

Выращивание дрожжей-сахаромицетов (S. cerevisiae diastaticus BKПМ-у-1218) проводили в аппарате V-30 л (полезный объем - 20 л) на ферментолизате зерносырья.

Ферментолизат и культуральную жидкость готовили по режиму, указанному в примере 1. В контроле выращивание дрожжей осуществляли без добавления стимулятора. Выращивание культуры дрожжей осуществляли при следующих параметрах:

t среды - 30-32°С

рН среды - 4,5-5,0

интенсивность перемешивания - 800 об/мин, аэрация - 5-8 л/л среды.

Длительность процесса выращивания определяли по достижению количества остаточных сахаров РВ = 0,4. В контроле этот период составил 16 часов, в опыте - 12 часов. Процесс выращивания дрожжей сократился примерно на 25%. АСВ в опыте было больше, чем в контроле, на 4,34%.

По окончании процесса ферментации дрожжевая суспензия поступала на плазмолиз (t - 80°С, время 1 час); плазмолизат высушивали на распылительной сушилке.

В результате испытаний были наработаны образцы кормового белкового продукта. В контроле содержание сырого протеина составило 41,2%, белка по Барнштейну - 30,8%. В опытной партии содержание сырого протеина составило 44,5%, белка по Барнштейну - 33,8%. Содержание протеина выросло на 8%, белка на 9,74%. Как видим, использование биостимулятора позволяет ускорить биоконверсию сахаров и повысить качество целевого продукта.

Пример 4. Выращивание пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae (штамм ВНИИ ПП) проводили в ферментере БИОР-01 объемом 100 л. Рабочий объем составлял 50 л.

В аппарат заливали около 40 л водопроводной воды, вносили компоненты питательной среды по следующей прописи (г/л):

рН до засева - 5,8.

В контроле биостимулятор в среду не вносили. Культивирование вели при 30°С при непрерывном перемешивании и аэрации. Процесс вели до достижения стационарной фазы роста. Накопление биомассы составило в контроле 1150 г, в опыте -1400 г. Количество биомассы выросло на 21,74%.

Пример 5. Выращивание клеток Bacillu.licheniformis B-8130, продуцента пробиотических препаратов проводили в ферментере БИОР-01 объемом 100 л. Рабочий объем составлял 50 л.

В аппарат заливали около 40 л водопроводной воды, вносили компоненты питательной среды по следующей прописи (г/л):

рН до засева - 7,0-7,2.

В контроле биостимулятор в среду не вносили. Культивирование вели при 37°С при непрерывном перемешивании и аэрации. Процесс вели до повышения уровня рН среды до 8,6-8,8 и появления свободных спор.

В контрольном аппарате продолжительность выращивания - 48-72 ч, образование спор 10-20%. В опытном аппарате - продолжительность выращивания - 26-28 ч, образование спор в 95-100% клеток.

Пример 6. Выращивание клеток Bacillu.subtilis ГА-13, компонента бакпрепарата биокомпоста проводили в ферментере БИОР-01 объемом 100 л. Рабочий объем составлял 50 л.

В аппарат заливали около 40 л водопроводной воды, вносили компоненты питательной среды по прописи (г/л) примера 5, биостимулятор в объеме 2,5 л (5%).

В контроле биостимулятор в питательную среду не вносили. Культивирование вели при 37°С при непрерывном перемешивании и аэрации до повышения уровня рН среды до 8,6-8,8 и появления свободных спор.

В контрольном аппарате продолжительность выращивания - 48-52 ч, образование спор 20-30%. В опытном аппарате - продолжительность выращивания - 25-27 ч, образование спор в 95-100% клеток.

Пример 7. Мицелиальный гриб Penicilliun verruculosum выращивали на питательной среде, содержащей источники угрерода, азота и минеральные соли, перед стерилизацией в среду добавляют 5-8% биостимулятор, затем культивировали в течение 120 ч на качалке при температуре 29°С и постоянном перемешивании, в процессе ферментации отбирали пробы и в фильтрате культуральной жидкости определяли активность карбогидраз (целлюлаз и ксиланаз). Продукция (активность) ферментов в присутствии биостимулятора повышалась на 20% для целлюлаз и 25% для ксиланаз.

Пример 8. Дрожжи S. cerevisiae diastaticus (ВКПМ-у-1218 выращивали при непрерывном режиме в промышленном аппарате V-900 м³ (Vpaб - 450 м³) на ферментолизате зерносырья.

Количество подаваемого биостимулятора составляло 0,002% от объема протока в час.

Основной эффект заключался в сокращении времени выращивания с 8,2 часа до 6,6 часа или на 24,24%. Количество АСВ возросло на 4,88%. Качество целевого продукта - кормового продукта оценивалось по содержанию сырого протеина, +4,44%, и белка по Барнштейну - +6,04%. Количество производимого кормового продукта выросло с 80,7 до 113,7 тонн в сутки, т.е. на 40,9%. При этом расходный коэффициент по зерносырью снизился с 1,55 т/т до 1,37 т/т.

Необходимо отметить также, что физиологическое состояние дрожжевых клеток характеризовалось активным почкованием (50-60%) и гомогенной протоплазмой. В связи с глубокой утилизацией субстрата (углеводов) в последней секции наблюдалось значительное количество вакуолизированных клеток.

Пример 9. Провели выращивание лептоспир серотипов Помона, Иктерогеморрагия, Тарассови на стандартной сывороточной среде (контроль) и на сывороточной модифицированной среде, содержащей 5% биостимулятора (опыт) при температуре 28°С в течение 10 суток.

Опытную серию вакцины готовили из культур лептоспир, выращенных на модифицированной сывороточной среде и содержащих 450-500 млн м.к. см³, путем их смешивания.

Контрольную серию вакцины готовили из культур лептоспир, выращенных на сывороточной среде и содержащих 85-95 млн м.к. см³, путем их концентрирования до содержания 500 млн м.к. см³ и последующего смешивания.

Культуры лептоспир инактивировали в присутствии 0,1% формальдегида в течение 5 суток при температуре 37°С. В период опытной работы было изготовлено по 3 серии опытной и контрольной вакцины против лептоспироза объемом 2 дм³ каждая.

Серии вакцины против лептоспироза контролировали на стерильность, безвредность и активность по принятым стандартным методикам.

Результат.

Объединенную пробу вакцины 29 августа 2009 г. ввели в дозе 1,0 см³ внутримышечно пяти кроликам серой окраски массой 2,8-3,0 кг.

Через 25 суток у иммунизированных кроликов из ушной вены произвели забор крови в объеме 5,0 см³. Сыворотки, полученные из крови кроликов, исследовали в реакции микроагглютинации с культурами штаммов лептоспир, входящих в состав вакцин.

Провели учет результатов в реакции микроагглютинации. В сыворотке крови кроликов, иммунизированных контрольной концентрированной культурой лептоспир, установили наличие специфических антител к лептоспирам Помона и Тарассови - 1:200 и Иктерогеморрагия 1:50.

В сыворотке крови кроликов иммунизированных опытной культурой лептоспир, выращенных в присутствии биостимулятора, выявлены антитела к лептоспирам Помона и Тарассови 1:400 и Иктерогеморрагия 1:100.

Выводы: включение биостимулятора в состав питательной среды для культивирования лептоспир существенно повышает накопление лептоспир и биосинтез специфических антигенов.

Пример 10. Гриб Fusarium sambucinum штамма MKF-200-3 выращивали на среде, содержащей в качестве основного источника углерода сахарозу (3-4%, на мелассе, содержащей сахарозу). В мелассу вносят дополнительно сульфат аммония (NH₄)₂SO₄ в количестве 5 г/л (0,5%) и фосфат калия (KH₂PO₄) в количестве 3,5 г/л (0,35%).

Что касается необходимых микроэлементов (Zn, Mg, Mn, Fe и др.), то они содержатся в мелассе и дополнительно не вносятся.

Выращивание в аппарате V-30 л (полезный объем 20 л) проводили в течение 48-ми часов при следующим параметрам: t=30°C, pH=5,0.

Суспензию гриба подтитровывали соляной кислотой до рН=4,2, нагревали в течение 1,5 часов до 115°С, выдерживали в течение 1,3 часа до комнатной температуры, вносили стимулятор в количестве 0,05%, т.е. на полезный объем аппарата V-30 - 100 мл. Полученная суспензия гриба является заявленным биостимулятором.

5. Технические результаты

Преимуществом заявленного предложения по сравнению с прототипом является существенная интенсификация роста микроорганизмов за счет стимулирования биологической активности их факторов роста. Использование стимуляторов роста в процессе получения биомассы как при периодическом, так и при непрерывном культивировании приводит к более полной утилизации субстрата, что позволяет повышать выход целевого продукта при сниженных расходных коэффициентах по источнику углерода и электроэнергии. Объемы кормовых и других целевых продуктов за счет использования предлагаемого стимулятора увеличивались до 40% и более при сокращении времени выращивания до 50%.