Способ получения кормового белкового продукта

Изобретение относится к комбикормовой промышленности, в частности к способу получения белковой кормовой добавки из лиственных древесных отходов, огромное количество которых постоянно привлекает внимание разработчиков [1].

Цель изобретения достигается щелочным гидролизом измельченного механоактивированного лиственного древесного сырья смешанного с отрубями, с последующим выращиванием на гидролизате консорциума микроорганизмов для получения биомассы, содержащей белок, а также промежуточные продукты его биосинтеза и распада.

Предлагаемый способ включает измельчение и механоактивацию древесного сырья, гидролиз, добавку в гидролизат отрубей и выращивание микроорганизмов на гидролизате, с введеными в него отрубями. При этом измельчение ведут на механоактивационной мельнице, последующий щелочной гидролиз ведут при рН (10÷12), при температуре ≤50°С в акустическом поле широкополосного гидроакустического излучателя в течение ≥2 часов, гидролизат нейтрализуют водным раствором серной кислоты до рН 7, отруби вводят в гидролизат в количестве ~10%, гидролизат с отрубями инокулируют консорциумом микроорганизмов Fusarium sambucinum+Trichosporon cutaneum+Saccharomyces cerevisiae. Биосинтез белка ведут при температуре 36±3°С в течение (24÷50) часов, получая при этом биомассу, содержащую до 45±5% (по с в.) сырого протеина.

Как известно, в древесине содержится не менее 46% целлюлозы, состоящей из остатков молекул глюкозы, которая и образуется при гидролизе целлюлозы:

(С₆Н₁₀O₅)_n+nН₂O →nС₆Н₁₂O₆

Известно также, что некоторые микроорганизмы способны выделять ферменты, разрушающую полимерную цепочку целлюлозы до сахаров - мономеров [2], являющихся основным источником углеводов в питательном субстрате метаболизирующих сахара дрожжей, грибов и бактерий, биомасса которых представляет собой высокобелковую добавку к кормам сельскохозяйственных животных [3].

Добавка небольшого количества отрубей интенсифицирует активность и ускоряет метаболизм Saccharomyces cerevisiae [3].

Проблема насыщения белком растительного кормового сырья постоянно привлекает внимание исследователей [4, 5].

Так, известна технология получения кормов для с.х. жвотных из измельченного сырья - виноградной лозы и виноградных выжимок - при биоконверсии которого имеет место частичная деструкция целлюлозы ферментами, синтезируемыми микроскопическими грибами, при этом образуются растворимые углеводы, которые в свою очередь поглощаются микроорганизмами в процессе их жизнедеятельности. Биомасса микроорганизмов, содержащих и синтезирующих белки, увеличивается и, при этом происходит обогащение сырья "сырым" протеином (т.е. белком и промежуточными продуктами его синтеза или распада), ферментами, витаминами и другими биологически активными веществами, синтезируемыми микроорганизмами, или содержащимися в них. В полученных кормах содержание "сырого" протеина увеличивается в 1,5-2 и более раза по сравнению с исходным сырьем [5].

Известно описание способа переработки опилок древесины хвойных пород в корм с повышенным содержанием белка, в соответствии с которым опилки обрабатывают униполярной водой, делигнифицируют, обрабатывают подготовленную массу в диспергаторной установке с водой с рН 10-11 или водой с рН 3-4, полученную массу разделяют на две фазы, твердую фазу инокулируют мицелием гриба и ведут его культивирование в течение 23 дней [6]. Авторы способа утверждают, что метод позволяет существенно обогатить корма белками, однако, биоконверсия грибами требует длительного времени и не получила распространения [3], кроме того, т.н. «униполярная» или «активированная» вода не стандартизованы, что не гарантирует воспроизводимости результатов, а «вода с рН 10-11» или «вода с рН 3-4» и вовсе противоречит современным научным представлениям.

Известна кормовая добавка, представляющая собой мочевину, фиксированную кормовыми дрожжами [7]. Полученный продукт требует точной дозировки введения в корм, так как превышение уровня мочевины в корме сельскохозяйственных животных отрицательно влияет на их продуктивность и развитие.

Известен также растительно-белковый корм, получаемый из грубого растительного сырья, при производстве которого массу грубого растительного сырья подвергают варке, после чего вводят в нее аминобактерии в количестве до 50% от массы абсолютно сухого сырья и продолжают термообработку в течение 10 мин при температуре 110-120°С [8]. Однако, как сообщают авторы изобретения, в таком кормовом продукте содержание сырого протеина не превышает 19%.

Известно описание способа получения растительных кормов, включающего измельчение растительного сырья и введение в него аммиака или парааммонийной смеси. Однако при такой обработке обогащения корма не обогащаются белком [9, 10].

Известен способ получения белка культивированием дрожжей на сточных водах, содержащих сапонины. Однако для нормального роста дрожжевой культуры автором приходиться добавлять крахмал, кукурузную муку, азотсодержащие соединения, соли магния и фосфаты и вести ферментацию в течение 27-40 часов. Метод сложен, требует длительного времени для реализации и непригоден для получения кормового белка их отходов лесодобывающей или лесоперерабатывающей промышленности [11].

Известен способ получения обогащенного белком удобрения, пригодного, как полагают авторы, для использования в качестве кормовой добавки. Способ включает переработку навоза, содержащего большое количество жуков и других живущих в навозе существ [12]. Однако обогащение белком при этом ничтожно.

Известны способы получения белковой биомассы путем глубинного культивирования гриба [13,14], однако их производительность невысока, и они требуют для своей реализации дорогостоящих, в частности сусло-агаровых сред, с молочной сывороткой в качестве основного питательного компонента.

Известен способ получения биомассы дрожжей при их выращивании на питательной среде, содержащей муку пшеницы, ржи, риса, кукурузы и др. и/или отруби и другие отходы переработки злаковых культур, подвергнутых предварительно ферментационной обработке с помощью протеолитических или амилолитических ферментов [15,16].

Известен случай использования смешанной культуры микроорганизмов (консорциума микроорганизмов) - продуцента кормового белкового продукта, содержащего бактерии Cellulosimicrobium funkei ВКПМ АС-1948, дрожжеподобный гриб Trichosporon mycotoxinivorans ВКПМ Y-3975, а также дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585, находящихся в трофической взаимосвязи, обеспечивающей устойчивое развитие всего консорциума. [17].

Наиболее близким к заявляемому изобретению по существу и результату является способ получения биомассы путем выращивания микроорганизмов на питательной среде, содержащей солому в качестве источника углерода [18], причем для повышения выхода продукта за счет более высокой скорости роста и степени конверсии сырья, в качестве микроорганизмов используют консорциум штаммов гриба Aspergillus fumigatus ВКМ F-1020 и дрожжей Rodotorula aurotiaca BKM У-327 или Candida rugosa ВКПМ У-445 или гриба Allescheriterrestris BKM F 6062 и дрожжей Candida rugosa ВКПМ У-445, или гриба Sporotrichum pulverilentum BKM F-1764 и дрожжей Candida rugosa ВКПМ У-445, или Rodotorula aurotiaca BKM У-327.

К недостаткам способа относятся:

- ограниченность его применения для биотрансформации соломы или другого подобного сырья, легко разлагающегося в природных условиях;

- непригодность для биотрансформации древесины;

- относительно низкое (не более 30%) содержание белка в целевом продукте.

Наиболее близким к заявляемому изобретению по существу и результату является способ получения биомассы путем выращивания микроорганизмов

Технической задачей настоящего изобретения является получение высокобелковой кормовой добавки из древесного сырья. Изобретение реализуется, и задача решается следующим образом:

измельчают опилки древесины лиственных пород на механоактивационной мельнице;

- древесное сырье (опилки) подвергают щелочному гидролизу в среде с (1-3%) раствором щелочи в акустическом поле широкополосного гидроакустического излучателя в течение 2 часов;

- гидролизат опилок нейтрализуют, после чего инокулируют консорциумом микроорганизмов Fusarium sambucinum + Trichosporon cutaneum + Saccharomyces cerevisiae;

биосинтез белка ведут с использованием консорциума микроорганизмов Fusarium sambucinum + Trichosporon cutaneum + Saccharomyces cerevisiae.

Известно, что ультразвук способен ускорять процесс пропитки пористых веществ жидкостями [20], а следовательно, сократить длительность процесса предподготовки древесного сырья с использованием растворов, например щелочей. Использование ультразвука с относительно низкой плотностью мощности позволяет в процессе щелочной обработки на порядок снизить расход щелочи, необходимой для щелочного гидролиза, сократить (на порядок) время предподготовки, а также способствует снижению энергетических затрат на механоактивацию при измельчении древесного сырья, обработанного ультразвуком в щелочной среде;

- в подвергнутое щелочному гидролизу в ультразвуковом поле с широким спектром частот гидроакустического излучателя измельченное и механоактивированное сырье вводят отруби в качестве добавки и консорциум микроорганизмов, в частности Fusarium sambucinum + Trichosporon cutaneum + Saccharomyces cerevisiae, способных соответственно выделять целлюлолитические ферменты, разрушающие целлюлозу древесины до Сахаров, утилизировать сахара и быстро расти, наращивая белковую биомассу в среде.

В результате количество биомассы в среде увеличивается и содержание белка достигает ≥45%.

Изобретение поясняется примерами, не носящими, однако, ограничительного характера.

Пример 1.

Предварительно измельченные до 100 мкм и при этом механоактивированные опилки лиственной древесины гидролизуют в водном растворе гидроксида калия при рН 11, температуре 50°С, в акустическом поле широкополосного гидроакустического излучателя в течение 2 часов с плотностью акустической энергии 0,3 Вт⋅с/см³, нейтрализуют до рН 7 водным раствором серной кислоты, добавляют 10% отрубей, вводят в полученную среду консорциум микроорганизмов Fusarium sambucinum + Trichosporon cutaneum + Saccharomyces cerevisiae и выращивают при температуре 32°С в течение 48 часов. Содержание белка в конечном продукте, определенное методом Къельдаля, составляет 45±5%.

Пример 2.

Предварительно измельченные до 100 мкм и при этом механоактивированные опилки лиственной древесины гидролизуют в водном растворе гидроксида калия при рН 10, температуре 40°С в акустическом поле широкополосного гидроакустического излучателя в течение 2 часов с плотностью акустической энергии 0,3 Вт⋅с/см³, нейтрализуют до рН 7 водным раствором серной кислоты, не добавляют отруби, вводят в полученную среду консорциум микроорганизмов Fusarium sambucinum + Trichosporon cutaneum +S accharomyces cerevisiae и выращивают при температуре 32°С в течение 24 часов. Содержание белка в конечном продукте, определенное методом Къельдаля, составляет 28±5%.

Пример 3.

Предварительно измельченные до 100 мкм, и при этом механоактивированные опилки лиственной древесины гидролизуют в водном растворе гидроксида калия при рН 10, температуре 40°С в акустическом поле широкополосного гидроакустического излучателя с плотностью акустической энергии 0,3 Вт⋅с/см, в течение 2 часов, нейтрализуют до рН 7 водным раствором серной кислоты, добавляют 10% отрубей, вводят в полученную среду консорциум микроорганизмов Fusarium sambucinum + Trichosporon cutaneum + Saccharomyces cerevisiae и выращивают при температуре 32°С в течение 24 часов. Содержание белка в конечном продукте, определенное методом Къельдаля, составляет 34±5%.

Из приведенной таблицы следует, что заявленный способ позволяет получать белковый корм с содержанием белка до 45±5%.

Варьирование других параметров процесса биоконверсии лиственных древесных опилок не привело к результатам, превышающим показатели, представленные в Примере 1.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что вышеописанное изобретение - «Способ получения кормового белкового продукта» - обладает заявленными свойствами, и совокупность отличительных признаков описываемого способа обеспечивает достижение указанного технического результата.

В результате проведенного анализа уровня техники получения обогащенных белком кормов из древесного сырья, аналог, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения, не обнаружен, следовательно, заявленное изобретение соответствует условию ''новизна".

Дополнительный поиск известных решений показал, что заявленное изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, поскольку подобрана совокупность механических, акустических, биохимических, микробиологических воздействий, обеспечивающих эффективную биотрансформацию древесного сырья в обогащенный белком корм для животных. Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "изобретательский уровень".

Нет технологических препятствий практического осуществления заявленного способа, в том виде, как он охарактеризован в изложенной формуле изобретения. Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "промышленная применимость".

Предлагаемый способ увеличивает необходимое разнообразие возможностей, обеспечивающее оптимальный выбор средств для решения проблемы дефицита белка в кормах с.х. животных.

Список литературы

1. Кармадонов А.Н. Егоренко Ю.А. Возможности использования древесных отходов в промышленности и сельском хозяйстве. Ползуновский вестник 2, 2004, С.230-233.

2. Wong W.K.R., Curry С, Parekh R.S., Parekh S.R., Wayman M, Davies R.W., Kilburn D.G., Skipper N. Wood Hydrolysis by Cellulomonas Fimi Endoglucanase and Exogiucanase Coexpressed as Secreted Enzymes in Saccharomyces Cerevisiae. Nature Biotechnology 1988, 6, p.713-719.

3. Сушкова В.И., Воробьева Г.И. Безотходная конверсия растительного сырья в биологически активные вещества. Киров, Из-во ДеЛи, 2008, 204 С.

4. В.И. Билай, Т.И. Билай, Е.Г. Мусич. Трансформация целлюлозы грибами. Киев, Наук. Думка, 1983, 295 С.

5. Бекер М.Е. Микробная биоконверсия растительного сырья и перспективы ее использования. - Вестник АН СССР, 1983, №6, с.89-98.

6. Вольф В.В., Трапезников А.В., Булаткина Г.П. Способ получения белкового корма из древесных отходов. Патент РФ №2092073, 1997.

7. Ладан П.Е., Подъячев В.Н., Цупиков М.Т., Ахламов М.В., Ольшанский А.В. Способ получения кормовой добавки для жвачных животных. А.С. №791366, 1980.

8. Елкин В.А., Холькин Ю.И., Денисенко Г.Д., Иванов А.С, Безденежный В.В. Способ получения растительно-белкового корма из грубого растительного сырья. АС №1604329, 1988.

9. Демин А.В., Селин М.Е., Джалилов А.Х., Лотоцкий А.Е, Мильман И.Э., Кузищин А.И., Титов А.А. Способ обработки грубых кормов и устройство для его осуществления. А.С.1629021, 1991.

10. Казакевич В.А., Кучинскас З.М. Способ обработки соломы аммиаком и устройство для его осуществления. АС 1629026, 1991.

11. Li Qingxin, Bi Yafan_, Liu Dayin Method for producing protein feed by fermenting the waste water from saponin production. Patent CN 1482255, 2003.

12. Christian Fayd'Herbe de Maudave, Method of producing high protein fertilizers and bird and stock feed from waste US patent 4,023,954, 1975.

13. Биттеева М.Б., Бирюков В.В., Черкезов А.А., Ширшиков Н.В., Щеблыкин И.Н., Горшина Е.С., Шушеначева Е.В., Стехыовская Л.Д., Китайкин В.М., Зюкова Л.А. Способ получения белковой биомассы гриба. Патент РФ №2189395, 2000.

14. Бирюков В.В., Биттеева М.Б., Черкезов А.А., Ширшиков Н.В., Щеблыкин И.Н., Горшина Е.С., Осипова В.Г., Коваленко Н.В., Китайкин В.М., Зюкова Л.А. Способ получения белковой биомассы гриба. Патент №2186851, 2000.

15. Ибрагимов Ф.Б., Сычев А.Е., Низамов Р.А., Куватов Д.М., Захарычев А.П., Жучков В.Н. Способ получения биомассы. Патент №2041946, 1995.

16. Буракаева А.Д.. Левин Е.В. Использование микофильного гриба HYPOMYCES ROSELLUS для получения гидролитических ферментов на углеводсодержащих средах. ВЕСТНИК Оренбургского государственного университета 2015, №1 (176).

17. Воробьева Г. И., Заикина А. И., Сычев А. Е., Акопян В. Б., Ступин А. Ю. Смешанная культура Cellulosimicrobium funkei, Trichosporon mycotoxinivorans, Saccharomyces cerevisiae - продуцент кормового белкового продукта на древесных опилках. Патент 2014124505, 2014.

18. Винаров А.Ю., Заикина А.И., Захарычев А.П., Зобнина В.П., Сидоренко Т.Е., Ковальский Ю.В., Рогачева Р.А., Зорина Л.В. Способ получения белковой кормовой добавки. Патент №2159287, 2000.

19. Выслоух В.А., Сидоренко Т.Е., Воробьева Г.И., Пинуев И.О. Способ получения белковой биомассы. Патент №1479509, 1987.

20. Акопян В.Б., Ершов Ю.А. Основы взаимодействия ультразвука с биологическими объектами. Москва, Из-во ЮРАЙТ, 2016, 223 С.