СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ В И В МЕТОДОМ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ НА ОРГАНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЭЛЕКТРОДАХ

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к инверсионному вольтамперометрическому способу определения водорастворимых витаминов группы В (B₁, B₂) на органо-модифицированных электродах.

Известен способ вольтамперометрического определения водорасторимых витаминов B₁ и B₂ на стеклоуглеродном (B₂) и ртутно-пленочном (B₁) электродах [Анисимова Л.С.; Слипченко В.Ф.; Филичкина О.Г.; Пикула Н.П.; Городилова В.М.; Слепченко Г.Б. // Способ количественного определения витаминов B₁ и B₂ в пищевых продуктах. Патент РФ №2084885 от 20.07.1997]. Недостатком при использовании ртутно-пленочных электродов в анализе является применение токсичной металлической ртути при их изготовлении. Диапазон определяемых концентраций указанных витаминов 10^-1÷10 мг/кг. Метод определения был использован авторами для определения водорастворимых витаминов B₁ и B₂ в пищевых продуктах.

Известен способ определения водорастворимых витаминов B₁ и В₂ методом вольтамперометрии на графитовых электродах, модифицированных тозилатными солями арилдиазония с различными заместителями [Слепченко Г.Б., Мартынюк О.А., Постников П.С., Трусова М.Е., Фам Кам Ньюнг, Филимонов В.Д. Новые возможности вольтамперометрического определения фармацевтических препаратов на органо-модифицированных электродах // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. - 2009. - Т.75. - №12. - С.11-14]. Авторами показано, что модифицированные электроды с заместителями (-NH₂, -СООН, -NO₂) по сравнению с графитовыми электродами более чувствительны и селективны при определении витаминов в пищевых продуктах. Предлагаемые новые органо-модифицированные электроды не позволяют их использовать в анализе биологических жидкостей, где содержание витаминов ниже 10^-3÷10^-2 мг/л.

Задачей заявленного изобретения является снижение предела обнаружения водорастворимых витаминов B₁, B₂, а также разработка методики их определения в пищевых продуктах и биологических объектах методом вольтамперометрии на органо-модифицированных электродах.

Поставленная задача достигается, тем, что способ количественного определения водорастворимых витаминов B₁ и B₂ включает их перевод из пробы в раствор и вольтамперометрическое определение с использованием индикаторного органо-модифицированного электрода. При этом накопление указанных витаминов в перемешиваемом растворе проводят в течение 30-60 с при потенциале электролиза B₁ - минус 0,7-0,9 В, B₂ - минус 0,4-0,6 В относительно насыщенного хлоридсеребряного электрода на фоновом электролите B₁-0,1 М Na₂HPO₄, B₂ - 0,01 М HCl (табл.1) с последующей регистрацией анодных пиков в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм при скорости развертки потенциала 20÷30 мВ/с, концентрацию водорастворимых витаминов определяют по высоте пика методом добавок аттестованных смесей.

В качестве индикаторных электродов применяли графитовый электрод (ГЭ) и органо-модифицированный электрод тозилатными солями арилдиазония без заместителя.

При помещении ГЭ в водный раствор тозилатной соли арилдиазония происходит спонтанное выделение азота и генерирование свободных радикалов Ar, ковалентно связывающихся с поверхностью графитового электрода согласно схеме:

С+4-C₆H₅N₂+TsO-→C-С₆Н₅+N₂+TsOH,

где С - поверхность графитового электрода.

Было изучено влияние концентрации модификатора и времени контакта графитового электрода с раствором диазониевой соли на аналитический сигнал водорасторимых витаминов B₁ и B₂. Рабочей концентрацией исходной диазониевой соли для приготовления модифицированного электрода является концентрация 30 мг/дм³, дальнейшее увеличение приводит к снижению аналитического сигнала определяемых витаминов. Время контакта подложки графитового электрода с раствором диазониевой соли в пределах 5-10 с незначительно влияет на величину аналитического сигнала, однако при увеличении времени контакта (от 15 до 30 с) наблюдается его снижение.

В результате проведенных исследований нами была выбрана рабочая концентрация тозилатной соли арилдиазония и время контакта ее с электродом (30 мг/дм³ при 5-10 с). Увеличение времени контакта и концентрации модификатора, а также электрохимическое нанесение модификатора на подложку приводит к блокировке поверхности электрода и вследствие этого уменьшение полезного сигнала определяемого соединения.

Для определения витамина B₁ использовали графитовый электрод, модифицированный ртутью и тозилатной солью арилдиазония без заместителя. Хорошо воспроизводимые результаты были получены при электрохимическом накоплении ртути (II) на поверхности электрода с последующим нанесением модификатора.

Максимальное значение регистрируемого тока с использованием графитового электрода ниже по сравнению с графитовым электродом, модифицированным тозилатной солью арилдиазония без заместителя в 6-8 раз. Немаловажен факт, что процесс приготовления электродов исключает использование токсичной металлической ртути.

Полученные электроды сохраняют свою стабильность в работе в течение 3-4 суток и устойчивы при хранении в бидистиллированной воде. По истечении срока службы электродов возможна их повторная модификация, как описано выше, после снятия слоя модификатора с поверхности электрода путем зачистки ее фильтровальной бумагой.

Массовую долю водорастворимых витаминов B₁ и В₂ в пробе вычисляют в мг/100 г по формуле

где X₁ - содержание данного компонента в анализируемой пробе, мг/100 г;

С_д - концентрация аттестованной смеси /АС/ витамина, из которой делается добавка к анализируемой пробе, мг/см³;

V_д - объем добавки АС витамина, см³;

J₁ - величина максимального тока компонента в анализируемой пробе, А;

J₂ - величина максимального тока компонента в пробе с добавкой АС, А;

V_ал - объем аликвоты пробы, взятой для анализа, см³;

V_к - объем анализируемого раствора после гидролиза, см³;

m_пр. - масса анализируемого вещества, г.

Установленные условия проведения электродного процесса позволили количественно определять водорастворимые витамины B₁, B₃ на основе реакции электроокисления и электровосстановления на органо-модифицированных электродах. Предлагаемый вольтамперометрический способ позволил существенно улучшить метрологические характеристики анализа данных витаминов. Диапазон определяемых концентраций 1,2*10^-4÷2,0*10² мг/л.

Измерения проводили на компьютеризованных вольтамперометрических анализаторах СТА (ООО «ИТМ», г.Томск).

Установленные условия анализа в предлагаемом способе впервые позволили экспрессно (за 60-90 минут) количественно определять витамины B₁, B₂ в пищевых продуктах на уровне 10^-2÷10² в присутствии пигментов, в окрашенных средах без предварительного отделения других водорастворимых витаминов РР, аскорбиновой, фолиевой, никотиновой, лимонной кислот, триптофана, мочевины, цистина, цистеина, ионов PO₃ ^4-, Cl^-, F^-, Br^-, S^2-, SO₂ ^4-, Zn²⁺, Cu²⁺, Cd²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺ и др. Исследовано, что вольтамперометрическому определению водорастворимых витаминов B₁, B₂ на уровне 10^-4÷10^-2 в крови и сыворотке крови не мешают растворенные жиры, углеводы, соли, микроэлементы, гормоны и др. в соотношении 1:10.

Пример 1. Определение содержания витамина B₁ в пищевых продуктах (овощи и фрукты) на уровне (10^-2÷10²) мг/кг.

Навеску пробы массой 50 г переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³, добавляют 50 см³ бидистиллированной воды, 2.0 см³ соляной кислоты концентрации 7 моль/дм³, нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры и добавляют 1 г марганца хлорида 4-водного, центрифугируют в течение 15 мин. Центрифугат сливают в колбу и добавляют 3-4 г хлорида калия, осадок отфильтровывают через бумажный фильтр. Полученный фильтрат является подготовленной пробой для выполнения вольтамперометрических измерений. Для измерений берут аликвоту 1,0 см³.

Электронакопление и регистрацию аналитического сигнала проводят при указанных условиях (табл.1). Пик витамина B₁ фиксируют в диапазоне - (1,2÷1,4)В на органо-модифицированном электроде при чувствительности прибора (1÷5)10^-8 А/мм в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм. Массовую концентрацию витамина B₁ в пробе оценивают методом добавок аттестованных смесей, измеряя высоту пиков. Время анализа одной пробы с учетом времени пробоподготовки занимает около 60-90 минут.

Пример 2. Определение содержание витамина B₂ в биологических жидкостях (кровь и сыворотка крови).

В колбу вместимостью 50 мл вносят 1 мл крови или сыворотки крови и 5 мл 96%-ного этилового спирта. Затем приливают к содержимому колбы 0,2 мл концентрированной соляной кислоты и нагревают на плитке до 70-80°C в течение 5 минут. Затем содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через двойной бумажный фильтр. Полученный фильтрат является подготовленной пробой для вольтамперометрического измерения пробы. Для измерений берут аликвоту объемом 1-2 мл и вносят в кварцевый стаканчик с фоновым электролитом.

Пик витамина B₂ фиксируют в диапазоне - (0,15÷0,35)В на органомодифицированном электроде при чувствительности прибора (1÷5)10^-8 А/мм в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм. Массовую концентрацию витамина B₂ в пробе оценивают методом добавок аттестованных смесей, измеряя высоту пиков. Время анализа одной пробы с учетом времени пробоподготовки занимает около 10-20 минут.

Таким образом, впервые установлена способность количественного химического анализа водорастворимых витаминов B₁, B₂ по пикам окисления (B₂) и восстановления (B₁) на графитовом электроде, модифицированном тозилатными солями арилдиазония без заместителя (в прототипе количественное определение указанных витаминов проводят на модифицированном электроде тозилатными солями арилдиазония с заместителями (-NH₂, -COOH, -NO₂)).

Анализ характеристик количественного химического определения водорастворимых витаминов B₁, B₂ по предлагаемому способу свидетельствуют о чувствительности определения (диапазон измеряемых концентраций значительно шире, чем описанный в прототипе). Условия, используемые в прототипе, не позволяют контролировать большие концентрации витаминов B₁, B₂.

Предложенный способ прост, не требует большого количества реактивов и трудозатрат и может быть приемлем в любой химической лаборатории, имеющей полярограф, особенно в настоящее время, когда налажен выпуск отечественной и зарубежной электроаппаратуры с контрольным управлением и обработкой данных (анализаторы типа СТА, ТА и др.). Предложенный способ может быть использован в фармакокинетических и фармацевтических исследованиях, для разработки методик анализа водорастворимых витаминов группы В в сложных многокомпонентных биосистемах (кровь, моча). Благодаря широкому диапазону определяемых концентраций данный способ определения водорастворимых витаминов группы В позволяет применять его для широкого числа объектов: как для пищевых продуктов, где его содержание 10^-2÷10² мг/кг, так и для биологических объектов, где его определение проводится на уровне 10^-4÷10^-2 мг/л.