Результат интеллектуальной деятельности: Способ подготовки жирномасличного лекарственного растительного сырья для определения подлинности микроскопическим исследованием

Изобретение относится к фармации, а именно к фармакогнозии, и может быть использовано для подготовки высушенного лекарственного растительного сырья (ЛРС), богатого жирным маслом, к микроскопическому анализу и определению его подлинности при проведении фармакогностического анализа микроскопированием с помощью светового и люминесцентного микроскопов.

В действующей на настоящий момент нормативной документации (НД) [ОФС.1.5.3.0003.15 Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов. - 22 с.], пробоподготовка высушенного ЛРС, богатого жирным маслом (плоды и семена), для анализа подлинности не прописана. Микроскопический анализ подобного вида растительных объектов осуществляется согласно общим требованиям (в качестве примера можно привести рябины обыкновенной плоды, облепихи крушиновидной плоды). Согласно НД [ОФС.1.5.3.0003.15 Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов. - 22 с.] существует несколько общих способов пробоподготовки плодов, содержащих незначительное количество жирного или эфирного масла. Первый способ используется для приготовления препаратов кожуры и околоплодника с поверхности, для чего семена или плоды кипятят в 5% растворе натрия гидроксида в течение 2-3 мин и тщательно промывают водой. Объект помещают на предметное стекло, препаровальными иглами отделяют кожуру семени или ткани околоплодника и рассматривают их в растворе хлоралгидрата или 33% растворе глицерина.

Второй способ используется для анализа тканей мезокарпия и эндокарпия, которые рассматривают в давленых препаратах и на срезах.

Третий способ рекомендован для пробоподготовки порошкованного сырья. В данном способе навеску порошка (около 1 г) помещают в фарфоровую чашку, и кипятят 1 мин в растворе азотной кислоты разведенной 16%, процеживают через слой ткани и промывают горячей водой. Далее растительное сырье кипятят в 5% растворе натрия гидроксида, в течение 1 мин, и промывают горячей водой, затем порошок рассматривают в 33% растворе глицерина под микроскопом.

В качестве недостатков, описанных выше способов пробоподготовки при использовании в анализе высушенного ЛРС, богатого жирным маслом, выступают в первом и третьем способах, воздействие агрессивной жидкости на растительный объект, что влечет за собой как повреждение некоторых диагностически - значимых структур (трихом, выделительного аппарата, включений и др.), так и разрушение различных групп биологически активных соединений (БАС), многие из которых относятся к классам гликозидов и сложных эфиров, легко гидролизующихся, как известно, в кислой и щелочной средах в условиях нагревания. Кроме того, некоторые группы БАС, такие как флавоноиды, антоцианы и антраценпроизводные, образуют при обработке щелочными растворами разнообразные окрашенные продукты реакции, что приводит к невозможности проведения люминесцентной микроскопии, как метода, позволяющего выявлять места локализации БАС в ЛРС по их авто люминесценции. Дополнительно, следует отметить, что объект, подготовленный с помощью кипячения в щелочи должен быть проанализирован в течение ограниченного периода времени (до 24 часов), ввиду ее агрессивного воздействия на анатомические структуры ЛРС. Второй способ не применим к анализу жирномасличных объектов, так как не способствует удалению жирного масла, способствующего повышенному комкованию измельченного сырья, а также мешающего проведению микроскопического анализа за счет содержания в масле насыщенно-окрашенных пигментов.

Известен способ [Патент 2712095, опубл. 24.01.2020, бюл. №3] подготовки свежего хлорофиллсодержащего лекарственного растительного сырья к микроскопироскопическому исследованию, включающий экстракцию хлорофилла этанолом с концентрацией 96%, при этом обесцвечивание лекарственного растительного сырья проводят в герметично закрытой таре, так чтобы фрагменты растений были скрыты под слоем этанола («до зеркала»), небольшие листья, цветки берут в цельном виде, крупные части растения частично измельчают руками или ножницами до размера, необходимого исследователю, экстракцию хлорофилла проводят в течение 5-12 часов, помещают поперечный срез черешков, стеблей, плотных кожистых листьев или препарата листа (цветка, раструба) с поверхности анализируемого объекта в каплю хлоралгидрата на предметном стекле, микроскопирование проводят с использованием светового микроскопа.

Близким аналогом предлагаемого способа является способ, используемый для пробоподготовки к микроскопическому исследованию строения клеток кожуры и околоплодника в порошке из плодов и семян, содержащих крахмал или незначительное количество жирного масла [ОФС.1.5.3.0003.15 Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов. -2 с.]. В целях удаления жирного масла, объекты настаивают в смеси, состоящей из спирта и эфира (1:3) в течение 20 минут, сливая затем растворитель. Данный метод допускает замену спирто-эфирной смеси ксилолом или эфиром. Основным недостатком аналога является использование сильнолетучих, легковоспламеняющихся и высокотоксичных растворителей (диэтиловый эфир, ксилол). Эфир является растворителем с относительной летучестью, равной 1. Температура самовоспламенения диэтилового эфира 164°С тогда, как у предлагаемого нами в способе гексана 434°С. По опасности для организма человека и гексан и эфир относятся к 4 классу, а этанол - 3 классу токсичности (более опасный). Следовательно, токсичность спирто-эфирной смеси будет выше таковой у чистого гексана.

В качестве прототипа выступает способ подготовки лекарственного растительного сырья для микроскопического исследования [Исследование микроскопических признаков высушенных плодов облепихи крушиновидной / О.В. Тринеева [и др.] // Вестник ВГУ. Сер. Химия. Биология. Фармация. - 2014. - №4. - С. 135-139; Тринеева О.В. Комплексное исследование содержания и специфического профиля биологически активных веществ плодов облепихи крушиновидной: монография. - Воронеж: Издательский дом ВГУ, 2016. - 224 с.]. Метод [Исследование микроскопических признаков высушенных плодов облепихи крушиновидной / О.В. Тринеева [и др.] // Вестник ВГУ. Сер. Химия. Биология. Фармация. - 2014. - №4. - С. 135-139] включает удаление жирного масла экстракцией гексаном в течение 24 часов из измельченных плодов облепихи крушиновидной с последующей обработкой раствором хлоралгидрата и микроскопированием с помощью светового микроскопа. Недостатком данной методики [Исследование микроскопических признаков высушенных плодов облепихи крушиновидной / О.В. Тринеева [и др.] // Вестник ВГУ. Сер. Химия. Биология. Фармация. - 2014. - №4. - С. 135-139] является длительность проведения пробоподготовки, составляющей 24 часа. Это лишает прототип экспрессности, ставит под сомнение полноту экстрагирования жирного масла, учитывая статическое настаивание объектов в растворителе без смены последнего, что делает его использование нецелесообразным для контроля качества растительного сырья в фармакогнозии. В отличие от описанной методики, предлагаемые изменения направлены на уменьшение времени пробоподготовки жирномасличного ЛРС к определению подлинности при проведении фармакогностического анализа без многостадийной пробоподготовки и использования агрессивных, легколетучих и высокотоксичных веществ с применением светового и люминесцентного микроскопов, преимуществом которого является повышение информативности анализа, экспрессность, простота использования, отсутствие необходимости применения летучих, легковоспламеняющихся и высокотоксичных соединений. В основе методики, взятой за прототип, лежит врямязатратный процесс пробоподготовки.

Задача настоящего изобретения заключается в разработке неразрушающего, экспрессного, технологически выгодного способа пробоподготовки высушенного ЛРС, богатого жирным маслом, для определения подлинности и установления мест локализации биологически активных соединений с помощью микроскопического анализа в короткие сроки и без воздействия агрессивных факторов с сохранением всех диагностически значимых структур в нативном виде, что может быть использовано как в фармацевтической, так и косметологической, и пищевой промышленностях.

Технический результат заключается в повышении точности результатов микроскопического исследования и возможности определения подлинности высушенных жирномасличных растительных объектов - плодов с помощью световой и люминесцентной микроскопии после полного удаления жирного масла в короткие промежутки времени, а именно время подготовки к анализу сокращается с 24 до 2 часов, без воздействия агрессивных жидкостей (азотная кислота, гидроксид натрия), высоких температур, высокотоксичных растворителей (этанол и диэтиловый эфир) и без использования многостадийного и узконаправленного процесса пробоподготовки, специфического оборудования (аппарат Сокслетта и др.), при сохранении диагностически значимых анатомических структур и БАС в нативном виде.

Область применения предлагаемого способа обусловлена тем, что для анализа качества жирномасличного ЛРС и определения его подлинности при проведении фармакогностического анализа на настоящий момент нет оптимального экспрессного способа его пробоподготовки, а использование его в нативном виде (без пробоподготовки) затруднено ввиду повышенной комкуемости кусочков сырья, а также слабой интенсивности свечения при использовании люминесцентной микроскопии.

Технический результат достигается тем, что в способе подготовки высушенного жирномасличного лекарственного растительного сырья к микроскопироскопическому исследованию, включающем измельчение высушенного объекта, экстракцию жирного масла гексаном, удаление остатков растворителя из ЛРС, обработку ЛРС хлоралгидратом, согласно изобретению навеску ЛРС измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм, обезжиривают ЛРС в герметично закрытой таре, таким образом, чтобы все частицы ЛРС были скрыты под слоем гексана («до зеркала»), при соотношении масса сырья (г): объем экстрагента (мл) - 1:50 ведут последующую экстракцию жирного масла гексаном в течение 2 часов при озвучивании на ультразвуковой ванне при температуре 60°С с частотой 50 Гц и мощностью 220 В, фильтруют через фильтр марки «Белая лента» с последующим промыванием объекта гексаном, промывание ведут до отсутствия розовато-оранжевого окрашивания сливов растворителя по качественной реакции со спиртовым раствором Судана III 0,3%, при добавлении его в количестве 2-3 капель, удаляют остатки растворителя из ЛРС высушиванием в сушильном шкафу при температуре 60°С до постоянной массы.

Изобретение проиллюстрировано микрофотографиями, на которых представлены результаты микроскопического анализа ЛРС, богатого жирным маслом, на примере плодов облепихи крушиновидной (фиг. 1).

На фиг. 1 представлены фрагменты плодов облепихи крушиновидной: А - плоды облепихи крушиновидной, подготовленные согласно прототипу; Б - внешний вид измельченных плодов облепихи крушиновидной после удаления жирного масла экстрагированием гексаном в ультразвуковой ванне; В - микроскопическое исследование измельченных плодов облепихи, подготовленные согласно прототипу, ув. 100; Г -микроскопическое исследование измельченных плодов облепихи крушиновидной после удаления жирного масла экстрагированием гексаном на ультразвуковой ванне, ув. х 40; Д -исследование измельченных плодов облепихи крушиновидной с помощью люминесцентной микроскопии, подготовленные согласно прототипу, ув. х 40; Е - исследование измельченных плодов облепихи крушиновидной после удаления жирного масла экстрагированием гексаном на ультразвуковой ванне с помощью люминесцентной микроскопии, ув. х 40.

На фиг.2 изображены фрагменты плодов рябины обыкновенной: А - плоды рябины обыкновенной, подготовленные согласно прототипу; Б - внешний вид измельченных плодов рябины обыкновенной после удаления жирного масла экстрагированием гексаном в ультразвуковой ванне; В - микроскопическое исследование измельченных плодов рябины обыкновенной, подготовленные согласно прототипу, ув. 40; Г - микроскопическое исследование измельченных плодов рябины обыкновенной после удаления жирного масла экстрагированием гексаном на ультразвуковой ванне, ув. х 40; Д - исследование измельченных плодов рябины обыкновенной с помощью люминесцентной микроскопии, подготовленные согласно прототипу, ув. х 40; Е - исследование измельченных плодов рябины обыкновенной после удаления жирного масла экстрагированием гексаном на ультразвуковой ванне с помощью люминесцентной микроскопии, ув. х 40.

Способ подготовки высушенного ЛРС, содержащего жирное масло, к микроскопическому исследованию с помощью светового и люминесцентного микроскопа реализуется следующим образом.

Необходимое количество высушенного ЛРС измельчается до размера частиц сырья, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм, помещается в коническую колбу с притертым шлифом, заливается гексаном так, чтобы кусочки измельченного ЛРС были полностью скрыты под слоем гексана до образования «зеркала» (количество экстрагента зависит от формы и размера исследуемых объектов). Далее колба закрывается притертой пробкой, помещается на 2 часа в ультразвуковую ванну и обрабатывается при температуре 60°С ультразвуком с частотой 50 Гц и мощностью 220 В. Затем содержимое колбы фильтруют через фильтр «Белая лента» с последующим промыванием частиц сырья гексаном порциями до отсутствия розовато-оранжевого окрашивания сливов растворителя по качественной реакции со спиртовым раствором Судана III 0,3%, после чего остатки растворителя удаляются из ЛРС высушиванием в сушильном шкафу при температуре 60°С до постоянной массы, ЛРС обрабатывается хлоралгидратом и подвергается микроскопированию с помощью светового или люминесцентного микроскопа, для чего обезмасленное высушенное ЛРС помещается тонким слоем на предметное стекло и анализируется с помощью микроскопа.

Предлагаемый способ позволяет существенно сократить время анализа, исключить использование агрессивных жидкостей, сохранить БАС в ЛРС в нативном виде и установить основные диагностически значимые признаки ЛРС при микроскопировании жирномасличного растительного сырья для определения его подлинности в фармакогностическом анализе. При этом, данная методика проста в исполнении, экспрессна, доступна, не требует специфического дорогостоящего оборудования, технологически и экономически выгодна и позволяет проводить анализ в удобное для аналитика время.

Способ иллюстрируется следующими конкретными примерами.

1. Пример 1. Высушенные плоды облепихи крушиновидной (около 0,5 г) измельчаются до размера частиц сырья, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм, помещается в герметично закрывающуюся тару, заливаются гексаном так, чтобы фрагменты растений были скрыты под слоем жидкости (примерно 25 мл) и озвучиваются в ультразвуковой ванне при температуре 60°С с частотой 50 Гц и мощностью 220 В в течение 2 часов с последующим фильтрованием содержимого колбы через фильтр «Белая лента», пятикратным промыванием кусочков растительного сырья гексаном порциями по 10 мл до отсутствия розовато-оранжевого окрашивания сливов растворителя по качественной реакции со спиртовым раствором Судана III 0,3% [Государственная фармакопея Российской Федерации: в 4 т.- 14-е изд. - Москва, 2018. - URL: http://femb.ru/femb/pharmacopea.php], при добавлении его в количестве 2-3 капель, высушиванием обезмасленного сырья в сушильном шкафу при температуре 60°С в течение 20 минут до постоянной массы, обработкой ЛРС хлоралгидратом помещением сырья в его каплю и микроскопированием с помощью светового и/или люминесцентного микроскопа.

На фиг. 1 и 2. рис. А, В, Д отражен вид растительных объектов, подготовленных по методике, приведенной в прототипе. Кусочки растительного сырья комкуются, маслянистые на ощупь, оставляют жирное пятно на бумаге, при микроскопическом определении диагностических признаков, анатомическая картина искажена из-за присутствия капель жирного масла и агломерации сырья.

На фиг. 1 и 2 рис. Б, Г, Е отражен вид растительных объектов после предлагаемой пробоподготовки. Кусочки растительного сырья хорошо отделимы друг от друга, имеют вид легко сыпучего порошка, не жирные на ощупь. При проведении микроскопического анализа отчетливо визуализируются диагностические элементы, усиливается автолюминесценция тканей.

На фиг. 1 представлены фрагменты плодов облепихи крушиновидной: А - плоды облепихи крушиновидной, подготовленные согласно прототипу; Б - внешний вид измельченных плодов облепихи крушиновидной после удаления жирного масла экстрагированием гексаном в ультразвуковой ванне; В - микроскопическое исследование измельченных плодов облепихи, подготовленные согласно прототипу, ув. 100; Г -микроскопическое исследование измельченных плодов облепихи крушиновидной после удаления жирного масла экстрагированием гексаном на ультразвуковой ванне, ув. х 40; Д -исследование измельченных плодов облепихи крушиновидной с помощью люминесцентной микроскопии, подготовленные согласно прототипу, ув. х 40; Е - исследование измельченных плодов облепихи крушиновидной после удаления жирного масла экстрагированием гексаном на ультразвуковой ванне с помощью люминесцентной микроскопии, ув. х 40.

Пример 2. Высушенные плоды рябины обыкновенной (около 0,5 г) измельчаются до размера частиц сырья, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм помещается в герметично закрывающуюся тару, заливаются гексаном так, чтобы фрагменты растений были скрыты под слоем жидкости (примерно 25 мл) и озвучиваются в ультразвуковой ванне при температуре 60°С с частотой 50 Гц и мощностью 220 В в течение 2 часов с последующим фильтрованием содержимого колбы через фильтр «Белая лента», пятикратным промыванием кусочков растительного сырья гексаном порциями по 10 мл до отсутствия розовато-оранжевого окрашивания сливов растворителя по качественной реакции со спиртовым раствором Судана III 0,3% [Государственная фармакопея Российской Федерации: в 4 т. - 14-е изд. - Москва, 2018. - URL: http://femb.ru/femb/pharmacopea.php], при добавлении его в количестве 2-3 капель, высушиванием обезмасленного сырья в сушильном шкафу при температуре 60°С в течение 20 минут до постоянной массы, обработкой ЛРС хлоралгидратом, помещением сырья в его каплю и микроскопированием с помощью светового и/или люминесцентного микроскопа.

На микрофотографиях, приведенных на фиг. 2, изображены фрагменты плодов рябины обыкновенной: А - плоды рябины обыкновенной, подготовленные согласно прототипу; Б - внешний вид измельченных плодов рябины обыкновенной после удаления жирного масла экстрагированием гексаном в ультразвуковой ванне; В - микроскопическое исследование измельченных плодов рябины обыкновенной, подготовленные согласно прототипу, ув. 40; Г - микроскопическое исследование измельченных плодов рябины обыкновенной после удаления жирного масла экстрагированием гексаном на ультразвуковой ванне, ув. х 100; Д - исследование измельченных плодов рябины обыкновенной с помощью люминесцентной микроскопии, подготовленные согласно прототипу, ув. х 40; Е - исследование измельченных плодов рябины обыкновенной после удаления жирного масла экстрагированием гексаном на ультразвуковой ванне с помощью люминесцентной микроскопии, ув. х 40.