Результат интеллектуальной деятельности: УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АГРЕГАЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ

Изобретение относится к области медицинской техники и может использоваться в устройствах для анализа агрегации тромбоцитов.

Тромбоциты, являющиеся форменными элементами крови, играют важную роль в процессах свертывания крови и тромбообразования. Способность этих клеток менять свою форму и слипаться один с другим под действием индукторов характеризует агрегационную активность тромбоцитов. Повышенная агрегационная активность тромбоцитов возникает, например, при таких состояниях как инфаркт миокарда, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, нарушения мозгового кровообращения. Пониженная характерна, например, при врожденной патологии тромбоцитов или приобретенной тромбоцитопатии в результате ряда факторов. Известны различные методы и устройства для определения агрегационной активности тромбоцитов.

Широкое распространение получили устройства, использующие оптический турбидиметрический метод, основанный на измерениях светового пучка, прошедшего через анализируемую среду и претерпевшего светорассеяния на оптических неоднородностях, при этом световой пучок от источника излучения проходит через прозрачную емкость с исследуемым образцом плазмы крови вдоль оси, совпадающей с нормалью к фотоприемной поверхности (G.V.R. Born, M.J. Kross. The aggregation of blood platelets «The Journal of Physiology», 1963, v. 168, p. 178-195). Мерой агрегации является регистрируемое изменение светопропускания плазмы крови, связанное с уменьшением рассеяния света на тромбоцитах в результате их слипания в агрегаты, образующиеся под воздействием индукторов агрегации. Использующие этот метод известные агрегометры содержат как правило термостабилизированный (термостатированный) кюветодержатель с кюветой, размещенную в кювете магнитную мешалку, источник освещения, расположенный на одной оптической оси с источником освещения фотоприемник и блок регистрации оптической плотности суспензии тромбоцитов. Достоинствами этого метода и реализующего его устройств является простота и возможность оценки такого важного показателя как средний радиус тромбоцитарных агрегатов. Недостатками являются недостаточная информативность определения агрегационной активности тромбоцитов при воздействии на плазму крови индукторов с низкой концентрацией и невозможность анализа плазмы крови с низкой концентрацией тромбоцитов (менее 10⁸ тр/мл), поскольку образование малых агрегатов на светопропускание суспензии тромбоцитов сказывается незначительно. Использование же магнитной мешалки снижает воспроизводимость, а также и точность результатов определения агрегационной активности тромбоцитов. При этом таким узлам присуща проблема стандартизации характера перемешивания пробы, что критично, например, при регистрации спонтанной агрегации.

Известно, например, устройство для исследования агрегации тромбоцитов путем регистрации спонтанной агрегации, использующее турбидиметрический метод, основанный на измерении изменения оптической плотности плазмы крови, обогащенной тромбоцитами, в процессе их агрегации, и содержащее источник стабилизированного света, рабочую емкость с обогащенной тромбоцитами плазмой крови, систему перемешивания плазмы крови, фотоприемник, аналого-цифровой преобразователь и регистрирующий блок, при этом рабочая емкость образована двумя расположенными горизонтально плоскопараллельными дискообразными оптически прозрачными пластинами, в нижней из которых выполнено цилиндрическое углубление, а пластины размещены в поле зрения светового микроскопа и выполнены с обеспечением возможности их вращения во взаимопротивоположных направлениях для перемешивания плазмы крови (RU 2278381 С1, 2006). В этом устройстве, в отличие от аналогичных устройств, в которых перемешивание осуществляется посредством магнитных мешалок, перемешивание плазмы крови обеспечивается без введения в нее инородных тел при создании внутри рабочей емкости сдвига с заданной скоростью. В результате этого достигается достаточная чувствительность устройства при измерении спонтанной агрегации тромбоцитов. Однако это устройство малопроизводительно, поскольку предусмотрена работа только с одной порцией плазмы крови. Боковой ввод светового пучка и его немонохромный характер не позволяют обеспечить высокую стабильность его параметров при прохождении в рабочую емкость, что снижает воспроизводимость и точность измерений. Устройство не позволяет регистрировать индуцированную агрегацию, поскольку его конструкция не предусматривает возможность введения индуктора агрегации непосредственно в процессе перемешивания пробы при эксплуатации устройства. Поэтому это устройство имеет недостаточную эксплуатационную эффективность.

Известно также устройство для анализа агрегаций тромбоцитов крови, использующее турбидиметрический метод и метод анализа флуктуаций светопропускания, содержащее основание с прозрачной ячейкой для исследуемого образца плазмы крови, узел перемешивания, включающий магнитную мешалку и электродвигатель с магнитом, выполненным с обеспечением возможности вращения вокруг вертикальной оси, совпадающей с продольной осью прозрачной ячейки, источник и приемник лазерного излучения, оптические оси которых совпадают и перпендикулярны продольной оси прозрачной ячейки, входную и выходную диафрагмы и блок обработки, включающий фильтры высоких и низких частот и блок определения параметров агрегации (US 5071247 А, 1991). К недостатку устройства относится низкая воспроизводимость агрегатограмм и их невысокая точность, что обусловлено использованием магнитных мешалок. Это связано с тем, что мембрана тромбоцитов весьма чувствительна к внешнему механическому воздействию, при этом даже небольшие сдвиговые напряжения в суспензии способны вызвать спонтанную агрегацию тромбоцитов. Расположенная в прозрачной ячейке (рабочей емкости) магнитная мешалка является основным источником нестабильности в процессах агрегации и дезагрегации тромбоцитов, она дает очень грубое перемешивание суспензии, которое практически невозможно стандартизовать. Другой недостаток связан с использованием дискретной рабочей емкости (прозрачной ячейки), что не позволяет обеспечить высокую производительность при эксплуатации устройства. Кроме того, боковой ввод и вывод лазерного излучения снижает воспроизводимость анализа, поскольку лазерное излучение дважды проходит через боковые цилиндрические стенки прозрачной ячейки, геометрию которых трудно стандартизовать. Соответственно затруднительно обеспечить воспроизводимые условия для реализации метода анализа флуктуаций светопропускания, на основе которого рассчитывается средний радиус тромбоцитарных агрегатов. Все это также не позволяет обеспечить высокую эксплуатационную эффективность такого устройства.

Из известных устройств наиболее близким к предложенному является устройство для определения агрегационной активности тромбоцитов, содержащее размещенные в корпусе кюветодержатель, по меньшей мере одну кювету, выполненную из оптически прозрачного материала и образующую рабочую емкость для исследуемого образца плазмы крови, модуль термостабилизации, по меньшей мере один источник лазерного излучения, расположенный с обеспечением возможности прохождения лазерного излучения через соответствующую рабочую емкость, по меньшей мере один приемник лазерного излучения, узел перемешивания плазмы крови и блок управления (RU 2343456 С1, 2009). Это устройство основано на нефелометрическом методе с использованием измерения рассеянного светового излучения. В этом устройстве использован боковой ввод и вывод лазерного излучения, при этом оптическая ось источников лазерного излучения и нормаль к фотоприемной поверхности соответствующего приемника лазерного излучения составляет некоторый угол. Узел перемешивания плазмы крови выполнен на основе средств, создающих вращающее магнитное поле, приводящее в движение магнитные мешалки. В каждую кювету помещают одну магнитную мешалку, например, перемешивающий элемент в виде шарика из ферромагнитного материала. В этом устройстве осуществляется регистрация интенсивности рассеяния лазерного излучения под углом к оптической оси источника лазерного излучения. Устройство обеспечивает достаточную чувствительность за счет создания условий эффективного рассеяния лазерного излучения на тромбоцитах в плазме крови. Однако оно не позволяет достичь высоких воспроизводимости и точности результатов анализа, что связано с боковым вводом и выводом лазерного излучения и использованием узла перемешивания с магнитной мешалкой. Кроме того, необходимость в дополнительной операции размещения в рабочих емкостях магнитной мешалки и последующее ее удаление усложняет эксплуатацию устройства. Конструкция устройства не предусматривает применение стандартизованных рабочих емкостей с использованием кювет в виде стрипа, позволяющее обеспечить одномоментное введение в рабочие емкости индукторов агрегации и тем самым дополнительно повысить воспроизводимость результатов анализа, а также повысить производительность устройства. В целом это не позволяет обеспечить высокую эксплуатационную эффективность устройства.

Техническая проблема, решаемая изобретением, заключается в создании устройства для определения агрегационной активности тромбоцитов, лишенного недостатков прототипа. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, состоит в повышении эксплуатационной эффективности устройства, в том числе за счет повышения воспроизводимости и точности результатов определения агрегационной активности тромбоцитов.

Это достигается тем, что в устройстве для определения агрегационной активности тромбоцитов, содержащем размещенные в корпусе кюветодержатель, по меньшей мере одну кювету, выполненную из оптически прозрачного материала и образующую рабочую емкость для исследуемого образца плазмы крови, модуль термостабилизации, по меньшей мере один источник лазерного излучения, расположенный с обеспечением возможности прохождения лазерного излучения через соответствующую рабочую емкость, по меньшей мере один приемник лазерного излучения, узел перемешивания плазмы крови и блок управления, узел перемешивания плазмы крови выполнен в виде вибродвигателя, механически связанного с кюветодержателем, который закреплен на упругих опорах и выполнен подвижным с обеспечением возможности совершать гармонические колебания в горизонтальной плоскости по взаимно перпендикулярным осям со сдвигом фаз в 90 градусов, при этом частота возбуждаемых вибродвигателем колебаний выбрана равной собственной частоте механической колебательной системы, образованной кюветодержателем с кюветами и упругими опорами, источники лазерного излучения размещены снизу от соответствующей рабочей емкости, а приемники лазерного излучения размещены сверху от нее так, что их оптические оси совпадают с продольной центральной осью соответствующей рабочей емкости в статическом состоянии, при этом дно рабочих емкостей выполнено плоским. Кюветы могут быть выполнены в виде стрипа, содержащего образующие рабочие емкости для исследуемых образцов плазмы крови лунки по количеству пар источников и приемников лазерного излучения. Вибродвигатель может быть выполнен в виде электродвигателя, снабженного эксцентриком, выполненным с обеспечением возможности вращения в горизонтальной плоскости. Вибродвигатель может быть встроен непосредственно в кюветодержатель. Модуль термостабилизации может быть выполнен в виде резистивного нагревательного элемента, снабженного датчиком температуры. Модуль термостабилизации может быть встроен непосредственно в кюветодержатель. Приемники лазерного излучения могут быть снабжены на своем входе собирающей оптической линзой. Приемники лазерного излучения могут быть снабжены на своем выходе режекторным фильтром. Блок управления может быть выполнен в виде микроконтроллера, связанного с источниками и приемниками лазерного излучения, модулем термостабилизации и узлом перемешивания плазмы крови. Микроконтроллер может быть выполнен с обеспечением возможности связи с персональным компьютером.

Достижение указанного технического результата обеспечивается всей совокупностью существенных признаков, представленной в независимом пункте формулы изобретения, каждый признак которой необходим, а вместе они достаточны для решения указанной проблемы и достижения указанного технического результата.

На чертеже показана структурная схема устройства для определения агрегационной активности тромбоцитов.

Оно содержит корпус 1, в котором размещены все элементы и узлы устройства. Устройство содержит кюветодержатель 2 с по меньшей мере одной кюветой, выполненной из оптически прозрачного материала и образующей рабочую емкость 3 для исследуемого образца 4 плазмы крови. В преимущественном исполнении устройства кюветы выполнены в виде стрипа (Strip) 5, содержащего образующие рабочие емкости 3 лунки в количестве, например, восьми и представляющего собой линейный элемент стрипованного 96-луночного лабораторного планшета, например, фирмы Corning Inc. Дно рабочих емкостей (лунок) 3 выполнено плоским. Кюветодержатель 2 выполнен, например, из легкого и хорошо проводящего тепло материала (например, дюралюминия марки Д16т) и снабжен электроизоляционным покрытием. Устройство содержит модуль 6 термостабилизации, который выполнен преимущественно в виде резистивного нагревателя, соединенного с датчиком температуры. В качестве резистивного нагревателя может быть использован, например, чип-резистор на расчетную мощность 2 Вт, а в качестве датчика температуры может быть использована, например, микросхема DS1621S+ (фирма Maxim Integrated). Модуль 6 термостабилизации преимущественно встроен непосредственно в кюветодержатель 2, при этом эти чип-резистор и микросхема приклеены к кюветодержателю 2 поверх электроизоляционного покрытия. Устройство содержит по меньшей мере один источник 7 лазерного излучения, расположенный с обеспечением возможности прохождения лазерного излучения через соответствующую рабочую емкость 3, и по меньшей мере один приемник 8 лазерного излучения. Источники 7 лазерного излучения размещены снизу от соответствующей рабочей емкости 3, а приемники 8 лазерного излучения размещены сверху от нее так, что в статическом состоянии устройства их оптические оси совпадают с продольной центральной осью соответствующей рабочей емкости 3. Количество пар источников 7 и приемников 8 лазерного излучения при выполнении кювет в виде стрипа 5 равно количеству лунок в нем. В качестве источников 7 лазерного излучения могут быть использованы, например, лазерные модули DSP6505-0415 (фирма DESHENG) с длиной волны 650 нм, образующие тонкий пучок излучения диаметром 0,3-0,5 мм. В качестве приемников 8 лазерного излучения могут быть использованы, например, фотоприемники (фотодиоды) BPW34 (фирма Vishay). Приемники 8 лазерного излучения преимущественно снабжены на своем входе собирающей оптической линзой, например, диаметром 6-7 мм и радиусом кривизны 10-12 мм (на чертеже не показана). На своем выходе приемники 8 лазерного излучения преимущественно снабжены режекторным фильтром (фильтр-пробка), выполненным аналоговым или цифровым, например, на базе микропроцессора TMS320C5x (фирма Texas Instruments). Устройство содержит узел перемешивания плазмы крови, который выполнен в виде механически связанного с кюветодержателем 2 вибродвигателя, который выполнен преимущественно в виде электродвигателя 9, снабженного эксцентриком 10, и преимущественно встроен непосредственно в кюветодержатель 2. Вибродвигатель может быть, например, впрессован или вклеен в выполненное для этого в кюветодержателе 2 отверстие (на чертеже не отражено). Ось электродвигателя 9, например, перпендикулярна горизонтальной плоскости, а эксцентрик 10 выполнен преимущественно с обеспечением возможности вращения в этой плоскости. В качестве вибродвигателя может использоваться, например, миниатюрный вибромотор QX-6A-3V (фирма QX Motor). Кюветодержатель 2 закреплен на упругих опорах 11 и выполнен подвижным с обеспечением возможности совершать гармонические колебания в горизонтальной плоскости по взаимно-перпендикулярным осям со сдвигом фаз в 90°, при этом частота возбуждаемых вибродвигателем колебаний выбрана равной собственной частоте механической колебательной системы, образованной кюветодержателем 2 с кюветами и упругими опорами 11. Количество упругих опор 11 может составлять, например, четыре. Каждая из них выполнена, например, в виде тонкого металлического стержня (спицы) диаметром 0,3-0,8 мм и длиной 10-40 мм из пружинной стали или бронзы, жестко закрепленного одним концом на основании корпуса 1, а другим - на кюветодержателе 2, с обеспечением возможности упруго и равномерно изгибаться вдоль своей оси. Собственные частоты этой механической системы при выполнении кювет в виде стрипа 5 лежат в диапазоне 50-150 Гц. Для обеспечения возбуждения резонанса в такой механической колебательной системе частота вращения эксцентрика составляет, например, 3000-9000 об/мин. Устройство содержит блок управления 12, выполненный преимущественно в виде микроконтроллера, связанного с источниками 7 и приемниками 8 лазерного излучения, модулем термостабилизации 6 и узлом перемешивания плазмы крови. С приемниками 8 лазерного излучения блок управления 12 может быть связан непосредственно или через режекторный фильтр. В качестве микроконтроллера может быть использован, например, микрочип AT91SAM7X256C (фирма Atmel). Микроконтроллер выполнен преимущественно с обеспечением возможности связи с персональным компьютером (на чертеже не показан), размещенным вне корпуса 1. Для этого он снабжен USB интерфейсом и/или блоком беспроводной передачи данных, например, Wi-Fi. Электропитание устройства может осуществляться, например, посредством размещенного в корпусе 1 источника постоянного тока или от персонального компьютера через кабель с USB разъемом. Корпус 1 снабжен съемной или откидной крышкой (на чертеже не показана).

Заявленное устройство для определения агрегационной способности тромбоцитов реализует турбидиметрический метод анализа. Его конструкция позволяет обеспечить преимущества, характерные для использующих этот метод известных устройств, и устранить недостатки устройства-прототипа, реализующего нефелометрический метод анализа, за счет иного выполнения узла перемешивания плазмы крови и иной схемы прохождения лазерного излучения через рабочие емкости 3.

Устройство в преимущественном исполнении работает следующим образом. При включения электропитания прогревается кюветодержатель 2 за счет тепла, выделяемого модулем 6 термостабилизации. После прогрева кюветодержателя 2 до заданной температуры в него устанавливается стрип 5, рабочие емкости (лунки) 3 которого в количестве восьми заполняются исследуемыми образцами 4 плазмы крови. С помощью 8-канальной пипетки во все рабочие емкости 3 одновременно вводятся порции индуктора агрегации, например, коллагена, и включается рабочий режим устройства. При этом в автоматическом режиме, обеспечиваемым блоком управления 12, включается электродвигатель 8 и происходит перемешивание содержимого каждой рабочей емкости 3. Одновременно включаются источники 7 и приемники 8 лазерного излучения, лазерные лучи от источников 7 лазерного излучения попадают в соответствующие рабочие емкости 3 через их прозрачное плоское дно, частично рассеиваются на тромбоцитах и через собирающие оптические линзы попадают на фотодиоды соответствующих приемников 8 лазерного излучения, где преобразуются в электрические сигналы. Режекторные фильтры обеспечивают удаление из этих электрических сигналов составляющих, совпадающих с частотой вынужденного механического колебания кюветодержателя 2 и высшие гармоники этого колебания. Далее электрические сигналы поступают в блок управления 12, выполненный в виде микроконтроллера, для обработки в режиме реального времени. Определение агрегационной активности тромбоцитов осуществляется расчетом характеризующего агрегационную активность тромбоцитов среднего радиуса тромбоцитарных агрегатов на основе одномоментного построения восьми кинетических кривых агрегации. Расхождение между каналами при измерении стандартных кинетических кривых агрегации одновременно по восьми каналам составляет не более 5-7%. Результаты анализа передаются через кабель или Wi-Fi на персональный компьютер.

Особенностью устройства является использование орбитального принципа перемешивания. При этом кюветодержатель 2 совершает вращательные движения так, что каждая его точка вращается с одинаковой амплитудой. Такое вращение может рассматриваться как векторная сумма сложения гармонических колебаний по взаимно перпендикулярным осям в горизонтальной плоскости (плоскости кюветодержатедя 2). Для обеспечения правильного кругового движения между этими колебаниями должен быть фазовый сдвиг 90°. Такие колебания возбуждаются, например, электродвигателем 9 с эксцентриком 10, вращающимся в горизонтальной плоскости. Необходимая амплитуда колебаний кюветодержателя 2 достигается благодаря эффекту резонанса за счет выбора частоты возбуждаемых вибродвигателем 9 колебаний (угловой частоты вращения эксцентрика 10) равной собственной частоте механической колебательной системы, образованной кюветодержателем 2 с кюветами (стрипом 5) и упругими опорами 11. Это обеспечивает при минимальном энергопотреблении эффективное и в то же время максимально щадящее перемешивание в виде ламинарного течения среды без турбулентных завихрений (присущих магнитным узлам перемешивания плазмы крови), травмирующих тромбоциты. Следствием этого является повышение воспроизводимости и точности (и связанного с этим повышение достоверности) результатов определения агрегационной активности тромбоцитов при эксплуатации устройства, что является основной составляющей его эксплуатационной эффективности. Однако, поскольку для качественного фотометрического анализа требуется соблюдение условия неизменности пути прохождения лазерного излучения через анализируемую среду, необходимо обеспечить оптимальное схему размещения источников 7 и приемников 8 лазерного излучения относительно рабочих емкостей 3 с исследуемым образцом 4 плазмы крови. Это достигается при направлении лазерного излучения вдоль продольной центральной оси рабочих емкостей 3 (в статическом состоянии устройства и соответственно статическом состояния рабочих емкостей 3). Направление лазерного излучения снизу рабочих емкостей 3, имеющих прозрачное плоское дно, позволяет обеспечить стабильность интенсивности и диаметра лазерного луча в них. При обратном прохождении лазерного излучения эти условия не могут достигаться из-за линзового эффекта поверхности плазмы крови в рабочих емкостях 3, в результате чего лазерный луч расширяется, что нежелательно, и ухудшается стабильность его параметров. Повышение стабильности параметров лазерного луча после его вхождения в рабочие емкости 3 через их дно по сравнению с вводом и выводом через боковые стенки позволяет повысить воспроизводимость результатов определения агрегационной активности тромбоцитов. Кроме того, отказ от магнитных мешалок в пользу орбитального перемешивания при колебательных движениях кюветодержателя 2 и одновременно отказ от бокового прохождения лазерного излучения рабочих емкостей 3 в пользу вертикального (продольноосевого), дает возможность использовать вместо одиночных кювет стрипа 5 с идентичными лунками. Это позволяет реализовать одномоментное введение в рабочие емкости 3 индукторов агрегации, например, посредством стандартной многоканальной пипетки, что особенно важно при регистрации быстрых кинетических фаз агрегации. Это дополнительно способствует повышению достоверности результатов анализа и повышает производительность устройства. Повышение воспроизводимости и точности определения агрегационной активности тромбоцитов как составляющих эксплуатационной эффективности устройства при его эксплуатации достигает 20-30%.

Устройство для определения агрегационной активности тромбоцитов, выполненное в соответствии с изобретением, обладает более высокой эксплуатационной эффективностью по сравнению с известными аналогичными. Оно обеспечивает высокие воспроизводимость и точность результатов определения агрегационной активности тромбоцитов. Устройство просто по конструкции и удобно в эксплуатации. В преимущественном конструктивном исполнении устройство обладает высокой производительностью.