Устройство для определения функциональной активности комплемента

Изобретение относится к области медицинской и ветеринарной иммунологии, а именно к устройствам для определения функциональной активности комплемента в крови человека при диагностике ряда заболеваний и предназначено для определения функциональной активности комплемента по его токсическому действию на свободноплавающие инфузории.

Система комплемента относится к основным системам врожденного иммунитета, функция которых состоит в том, чтобы отличить ʺсвоеʺ от ʺне своегоʺ.

Иммунитет, создаваемый анатомическими, физиологическими, клеточными и молекулярными факторами, которые являются естественными составляющими элементами организма, иначе называют врожденным.

Благодаря наличию иммунной системы организм защищен от большинства болезнетворных микроорганизмов (вирусов, бактерий, грибков, простейших, гельминтов) и токсических продуктов их жизнедеятельности. Иммунитет также защищает организм от воздействия различных веществ, обладающих чужеродными свойствами (например, растительных и животных ядов), от развития опухолевых клеток.

Комплемент - это сложная ферментативная система из многих белков, содержащаяся в сыворотке крови. В обычных условиях они неактивны, при активации они участвуют в защитных реакциях. Система активируется спонтанно определенными патогенами или комплексом антиген:антитело. Активированные белки либо непосредственно разрушают патоген (киллерное действие), либо обеспечивают лучшее их поглощение фагоцитами (опсонизирующее действие); либо выполняют функцию хемотаксических факторов, привлекая в зону проникновения патогена клетки воспаления.

Известно, что комплемент обладает неспецифическим токсическим действием на биологические тест-объекты, в частности инфузории [Sinclair I.J.B. The role of complement in the immune reactions of Paramecium aurelia and Tetrahymena pyriformis. Immunology. 1958. V.1. P. 291-299].

Известен способ определения активности комплемента на инфузориях Tetrahymena pyriformis, основанный на регистрации кинетических кривых выживаемости этого вида инфузорий под действием разных доз сыворотки испытуемого объекта. В измерительные ячейки прибора для подсчета числа живых инфузорий вносят суспензию клеток Tetrahymena pyriformis и испытуемую сыворотку крови с последующим определением числа живых клеток в каждую минуту. Совпадение динамики изменения числа живых клеток во времени для испытуемой сыворотки и контрольной, представляющей пул 10 сывороток здоровых доноров, предполагает равенство активностей сывороточного комплемента в этих сыворотках [патент РФ №2518739, 2013 г.].

Известно устройство для оценки качества продуктов живой и неживой природы (патент РФ №2122025, 1997 г.), принцип работы которого основан на подсчете количества живых инфузорий в тестируемых образцах, находящихся в ячейках перемещающегося планшета, за которыми ведется видеонаблюдение. Качество продукта определяется на основе 2-х измерений количества живых клеток - в начале опыта и по его окончании.

Недостатки известного устройства состоят в невысокой достоверности получаемых результатов, их низкой воспроизводимости, обусловленной как спецификой самой инфузории Tetrahymena pyriformis, так и конструктивными особенностями описанного устройства, не предусматривающего проведение исследований при постоянной температуре, отсутствие возможности надежного определения стартового момента времени исследований, трудоемкости подготовительной стадии эксперимента.

Как ранее обнаружили авторы, при действии комплемента на инфузории Tetrahymena pyriformis через определенный промежуток времени, зависящий от количества активного комплемента, начинается процесс обездвиживания инфузорий, протекающий со скоростью, также зависящей от количества активного комплемента.

Обе измеряемые величины: время инкубации, необходимое для достижения обездвиживания половины микроорганизмов, а также скорость перехода подвижных инфузорий в неподвижные могут быть использованы для расчета количества функционально активного комплемента.

Способ определения предусматривает внесение в измерительные ячейки устройства суспензии инфузорий в буферном растворе, добавление в ячейки сыворотки крови в необходимом количестве, как источника комплемента, и автоматический циклический подсчет оставшихся подвижными клеток во времени.

Методы расчета основаны либо на определении времени инкубации инфузорий с комплементом, необходимого для гибели половины инфузорий, либо на определении константы скорости гибели клеток, которую удобно рассчитывать по тангенсу угла наклона зависимости логарифма числа подвижных клеток от времени в период наблюдаемого падения числа живых клеток. Обе величины, зависящие от количества активного комплемента, могут быть сравнены с активностью комплемента в пуле не менее 10 сывороток человека, что выбирается в качестве стандарта. Тем самым достигается определение функциональной активности комплемента методом, пригодным для стандартизации.

Наиболее близким к предложенному является устройство для определения функциональной активности комплемента крови, включающее корпус, внутри которого расположен измерительный блок, содержащий модуль для размещения тестируемых образцов, источники света для подсветки образцов и видеокамеры с микрообъективами для фиксации состояния образцов, блок питания и микроконтроллер, подсоединенный к персональному компьютеру [патент РФ 2361913, 2006 г]

Работа с этим устройством обязательно включает подготовительный этап, куда входит включение устройства, запуск компьютера, заполнение и установку планшета с пробами на планшетный столик. Основной этап работы начинается с запуска управляющей программы.

Недостатки известного устройства состоят в следующем:

- конструкция известного устройства не позволяет достичь высокой воспроизводимости результатов анализов (под воспроизводимостью результатов понимают получение близких результатов двух испытаний, полученных одним методом, в идентичных условиях, в разных лабораториях) из-за:

- отсутствия блока термостатирования, что не позволяет проводить исследования при постоянной температуре. Поскольку комплемент - это белковая ферментативная система, ее активность существенно зависит от температуры. Поэтому измерение активности комплемента должно проводиться при постоянной температуре;

- специфики самой инфузории Tetrahymena pyriformis. Тетрахимена - высокоподвижная инфузория. Поэтому она первоначально быстро и равномерно распределяется по всему полю зрения видеокамеры. Однако этот вид инфузории обладает тягой к концентрации в пристеночной зоне, в результате чего при кинетических исследованиях количество живых инфузорий в поле зрения оказывается заниженным;

- из-за того, что кинетические исследования требуют надежного определения стартового момента времени. В случае анализа, где задействовано сразу много проб, это становится весьма актуальным;

- в известном устройстве применяют нестандартные лунки, что исключает использование многоканальных автоматических пипеток. Это в свою очередь увеличивает трудоемкость проведения анализов и снижает их производительность;

- известное устройство содержит электромеханические движущиеся части, что снижает его надежность и увеличивает габариты.

Технической проблемой, решаемой изобретением, является создание надежного, простого и удобного в использовании устройства, позволяющего с максимальной эффективностью и надежностью получать достоверные результаты исследований функциональной активности комплемента и обеспечить их воспроизводимость.

Техническим результатом изобретения является обеспечение возможности получения достоверных результатов исследований, повышение их воспроизводимости, путем повышения надежности устройства, сокращения трудоемкости проведения исследований, сокращения времени на подготовку образцов, при этом обеспечивая уменьшение габаритов устройства и удешевление конструкции.

Для достижения технического результата в устройстве для определения функциональной активности комплемента крови, включающем корпус, внутри которого расположен измерительный блок, содержащий модуль для размещения тестируемых образцов, источники света для подсветки образцов и видеокамеры с микрообъективами для фиксации состояния образцов, блок питания и микроконтроллер, подсоединенный к персональному компьютеру,

модуль для размещения тестируемых образцов выполнен в виде стрипа с ячейками и снабжен узлом встряхивания, видеокамеры с микрообъективами объединены в блок таким образом, что каждая ячейка стрипа имеет размещенную над ней видеокамеру с микрообъективом, а измерительный блок снабжен узлом термостатирования, выполненным в виде теплового насоса на основе элемента Пелтье и термодатчика, при этом источники света для подсветки образцов размещены под каждой ячейкой стрипа и образуют осветительный узел темнопольной микроскопии.

Предпочтительно при этом, что осветительный узел темнопольной микроскопии выполнен в виде диафрагмы и платы с концентрически размещенными на ней светодиодами и светопоглощающей пластиной под каждой ячейкой стрипа.

Выполнение модуля для размещения тестируемых образцов в виде стрипа с ячейками позволяет, в отличие от известных устройств, работать со стандартным расходным (одноразовым и стерильным) материалом, что дает возможность работать, например, с автоматическими пипетками, диспенсерами, ридерами и т.д.). При этом многоканальные автоматические пипетки позволяют вносить пробы в ячейки стрипа одномоментно, а не последовательно, как в известных устройствах. Это точно идентифицирует начало кинетического процесса гибели инфузорий, что, в свою очередь, повышает достоверность исследований, воспроизводимость регистрации кинетических кривых, а значит и воспроизводимость исследований в целом. Кроме того, снижается трудоемкость и экономится время исследований.

Снабжение модуля для размещения тестирумых образцов узлом встряхивания - решает проблему неравномерного распределения инфузорий в объеме пробы. Инфузории в покое предпочитают концентрироваться в пристеночной зоне ячейки, что осложняет видеоанализ и маскирует (занижает) число живых клеток. Узел встряхивания кратковременно возбуждает (ажитирует) клетки и не дает им прилипать к стенкам ячейки. Это устраняет систематическую ошибку и повышает достоверность подсчета клеток, а также воспроизводимость анализа в целом. Узел встряхивания может быть выполнен любым известным спсособом, например, на базе миниатюрного вибромотора.

Объединение видеокамеры с микрообъективами в блок таким образом, что каждая ячейка стрипа имеет размещенную над ней видеокамеру с микрообъективом, позволяет проводить микроскопический анализ обьектов одномоментно во всем стрипе. Это дает возможность снимать более подробные и статистически значимые кинетические кривые выживаемости клеток, чем при электромеханическом сканировании, как в известных устройствах. Это, в свою очередь, повышает достоверность регистрации кинетических кривых и воспроизводимость анализа в целом. Объединение видеокамеры с микрообъективами в блок может быть осуществлено одним из известных и применимых в данном случае способов, например, с помощью штанги. Размещение источников света для подсветки образцов под каждой ячейкой стрипа обеспечивает индивидуальное освещение каждой ячейки. Благодаря этому отпадает необходимость в электромеханическом сканировании стрипа, что обеспечивает отсутствие в устройстве движущихся частей и повышает таким образом надежность устройства, а также снижает его габариты.

Снабжение измерительного блока узлом термостатирования, выполненным в виде теплового насоса на основе элемента Пельтье и термодатчика, позволяет проводить измерения при фиксированной температуре, при этом термодатчик является элементом обратной связи, контролирующим реальную температуру в измерительном блоке. Потребность в узле термостатирования обусловлена тем, что активность комплимета критически зависит от температуры. Следовательно, от температуры зависит и форма кинетических кривых выживаемости клеток. Таким образом, стабилизация температуры в измерительном блоке повышает воспроизводимость регистрации кинетических кривых, а значит и воспроизводимость анализа в целом. Элемент Пельтье - это термоэлектрический преобразователь, принцип действия которого базируется на эффекте Пельтье - возникновении разности температур при протекании электрического тока. Достоинством элемента Пельтье являются небольшие размеры, отсутствие каких-либо движущихся частей, а также газов и жидкостей. При обращении направления тока возможно как охлаждение, так и нагревание - это дает возможность термостатирования при температуре окружающей среды как выше, так и ниже температуры термостатирования. Также достоинством являются отсутствие механических частей и отсутствие шума. Все вышесказанное объясняет использование его в узле термостатирования.

Выполнение источников света для подсветки образцов в виде осветительного узла темнопольной микроскопии обусловлено следующими обстоятельствами.

Поскольку инфузории слабоокрашены и полупрозрачны, микроскопический анализ проводится в темном поле (темнопольная микроскопия). Анализ основан на освещении обьекта косыми лучами света. Лучи не попадают в обьектив видеокамеры, поэтому поле зрения выглядит совершенно черным. Если в ячейке содержатся живые инфузории, то на черном поле видны яркие светящиеся обьекты. Такой подход ускоряет и повышает надежность последующего видеоанализа. Результат видеоанализа - число живых клеток в поле зрения видеокамеры. В итоге, использование темнопольной микроскопии повышает достоверность регистрации кинетических кривых, а значит достоверность и воспроизводимость анализа в целом. Для выполнения осветительного узла темнопольной микроскопии в виде диафрагмы и платы с размещенными на ней светодиодами и светопоглощающими пластинами под каждой ячейкой стрипа использованы технология печатного монтажа и микро-миниатюрные SMD компоненты, что в целом приводит к уменьшению габаритов и удешевлению всей конструкции.

Предлагаемое устройство показано на чертежах, где на фиг. 1 показана блок-схема устройства, на фиг. 2 и 3 - схематично, осветительный узел темнопольной микроскопии, на фиг. 4 - типичные кривые выживаемости инфузорий.

Устройство для определения функциональной активности комплемента крови содержит корпус 1, внутри которого размещен измерительный блок 2 с модулем 3 для размещения тестируемых образцов, источники света 4 для подсветки образцов, видеокамеры 5 с микрообъективами 6 для фиксации состояния образцов, блок питания 7, микроконтроллер 8, подсоединенный к персональному компьютеру 9.

Модуль 3 для размещения тестируемых образцов выполнен в виде стрипа 10 с ячейками 11 и снабжен узлом встряхивания тестируемых образцов 12.

Видеокамеры 5 с микрообъективами 6 объедиены в блок посредством штанги 13. так что над каждой ячейкой 11 стрипа 10 размещена видеокамера 5 с микрообъективом 6.

Измерительный блок 2 устройства снабжен узлом термостатирования 14, выполненным в виде теплового насоса 15 на основе элемента Пельтье и термодатчика 16.

Осветительный узел темнопольной микроскопии представляет собой плату 17 с последовательно размещенными на ней источниками света для подсветки образцов 18. На плате 17 под каждой ячейкой 11 стрипа 10 концентрически расположены SMD светодиоды 19, светопоглощающая пластина 20 и диафрагма 21, ограничивающая и формирующая световой конус. Осевая линия светового конуса совпадает с осевой линией расположенной над ней ячейки 11 (Фиг. 2, 3).

На Фиг. 4 приведены кинетические кривые выживаемости инфузорий при разных дозах плазмы крови. Так, к 100 мкл суспензии инфузорий Tetrahymena periformis было добавлено 10 мкл (кривая А), 15 мкл (кривая В) и 20 мкл (кривая С) сыворотки крови человека. Комплемент, содержащийся в сыворотке, является неспецифическим токсикантом для этого вида. Хорошо видно, что с увеличением дозы сокращается время, вызывающее гибель 50% инфузорий. Данные кривые являются исходным материалом для проведения различных вариантов статистической обработки токсикологических данных.

Работает устройство следующим образом.

После его подключения к бытовой сети и персональному компьютеру 9 оператор запускает на компьютере 9 специализированное приложение, контролирующее работу устройства в интерактивном режиме. После того как температура измерительного блока 2 стабилизируется, устройство готово к проведению анализов. Для проведения анализа в измерительный блок 2 помещается стерильный стрип 10. Автоматической пипеткой во все ячейки 11 стрипа 10 помещают по 100 мкл суспензии инфузорий оптимальной концентрации. Оптимальная концентрация клеток дает наименьшую погрешность определения их количества. При низкой концентрации клеток будет возрастать стандартная ошибка, а при высокой появится систематическая ошибка подсчета клеток. После 5-минутной термостабилизации стрипа 10 с помощью узла термостатирования 14 в него вносятся образцы разведенной сыворотки крови при помощи 8-канальной автоматической пипетки. Крышка (на чертеже не показано) измерительного блока 2 закрывается, что служит сигналом для фиксации момента отсчета времени при построении кинетических кривых выживаемости инфузорий. С этого момента автоматически включаются источники света для подсветки ячеек 11 и начинается анализ видеоданных. С периодичностью в 1 мин стрип 10 встряхивается с помощью узла встряхивания тестируемых образцов 12 на протяжении 1 с, при этом текущие видеоданные игнорируются. Периодичность и продолжительность встряхивания стрипа 10 можно настраивать в зависимости от используемого типа инфузорий. Далее, в соответствии с заранее заданным протоколом обработки данных, рассчитывается титр комплемента, характеризующий его активность, или проводится иная статистическая обработка.