Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ИМПРИНТИРОВАННОГО ПОЛИМЕРА

Изобретение относится к области аналитической химии и молекулярной биологии и может быть использовано для получения полимера, содержащего отпечатки (импринтинг) молекул, с последующим его применением для анализа и разделения молекулярного материала.

Молекулярно-импринтированный полимер (МИП) - это искусственный рецептор, получающийся при отпечатывании молекул шаблона (зачастую молекулы целевого аналита) в слое на поверхности полимера и их последующем удалении путём деструкции и промывки. Образовавшийся отпечаток представляет собой селективный сайт, который демонстрирует предпочтительное сродство к молекуле шаблону по сравнению с другими молекулами. К основным достоинствам МИП относятся: повышенная структурная прочность, устойчивость к высокой температуре и давлению, инертность к агрессивным средам, сохранение нативных свойств при хранении в течение нескольких лет, а также снижение затрат на производство и использование. Реализация этих положительных факторов обусловлена созданием жесткой полимерной сетки, выступающей в качестве МИП-матрицы.

В общем случае синтез МИП в себя три основные стадии:

1) образование комплекса между молекулой-шаблоном и остатками функциональных мономеров;

2) полимеризация полученного комплекса и сшивающего агента, приводящая в результате к образованию жесткого полимерного каркаса, содержащего участки с фиксированным расположением функциональных групп, задаваемым шаблоном;

3) удаление шаблона и получение полимера с отпечатком шаблона.

Важный этап успешного создания МИП - выбор подходящего функционального мономера, который при взаимодействии с молекулой шаблоном на стадии предварительной полимеризации способен образовать комплекс и возможность исключения из синтеза кросс линкеров.

Известен способ получения молекулярно-импринтированного полимера (патент РФ 2385889 по кл. МПК C09D 163/02, опуб. 10.04.2010), включающий подготовку реакционной смеси, содержащей капрон, молекулу-шаблон и растворитель, полимеризацию смеси, нанесение последней на твердый носитель, высушивание и удаление шаблона, отличающийся тем, что готовят реакционную смесь, содержащую 0,5-10% капрона, 0,5-5% порообразующей добавки и растворитель, в которую добавляют молекулу-шаблон до конечной концентрации 0,001-0,5 г/л, смесь перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 5-10 мин, а удаление шаблона осуществляют путем последовательных промывок водой и этиловым спиртом, при этом в качестве растворителя используют моноспирт общей формулы R-CHal₂-СНХ-ОН, где Hal - атом галогена, a R и/или Х - атом водорода; атом галогена; гидроксильная группа; цианогруппа; линейные алкильные заместители, в том числе прерывающиеся гетероатомами, например кислородом, серой, азотом, в качестве порообразующей добавки используют полимерные соединения, выбранные из следующих: полиэтиленгликоль, бычий сывороточный альбумин, поливинилпирролидон или растворители, скорость испарения которых отличается от скорости испарения моноспирта, выбранные из протонных: вода, бутанол или апротонных: пиридин, диметилсульфоксид, глицерин, диметилформамид, а в качестве шаблона используют нуклеотиды или белки.

Недостатком способа является синтез в среде органического растворителя, что может влиять на устойчивость конформации молекулы шаблона и невозможность получения равномерной тонкой пленки МИП одностадийным синтезом на поверхности подложки с высокой удельной поверхностью.

Известен способ получения молекулярно импринтированного полимера на основе о-фенилендиамина для использования в электрохимическом биосенсоре для прямой регистрации миоглобина (патент РФ №2604688 по кл. МПК G01N 33/543, опуб. 10.11.2016), заключающийся в электрополимеризации о-фенилендиамина в присутствии миоглобина, как молекулы-шаблона, удалении миоглобина из полимера с последующей электрохимической регистрацией миоглобина в анализируемых водных буферных растворах за счет взаимодействия миоглобина с полостями в полимере, соответствующими молекуле миоглобина.

Недостатком способа является использование концентрированного щелочного раствора этилового спирта, который может изменять конформацию шаблона при инкубации и снижать таким образом специфичность и сорбционную ёмкость МИП.

Особый интерес в качестве материала для МИП на белковые молекулы представляет полианилин (ПАНИ). ПАНИ относится к проводящим полимерам и обладает уникальными электрическим и электрохимическими свойствами. Помимо этого, ПАНИ широко используется для изготовления сенсоров из-за лёгкого процесса полимеризации, механической стабильности и устойчивости. Перспективность применения ПАНИ в конструировании МИП в том числе обусловлена механизмом захвата целевых молекул полученным ПАНИ-МИП. Высокая прочность водородных связей, образующихся между полимерной плёнкой и функциональными группами молекул аналита, а также геометрическая конфигурация селективного сайта ПАНИ-МИП, позволяют с высокой эффективностью сорбировать целевые молекулы из исследуемых образцов.

Известен (Biosensors and Bioelectronics Volume 94, 15 August 2017, Pages 39-46) способ получения диспергируемых в воде молекулярных импринтированных проводящих частиц ПАНИ путем макромолекулярной совместной сборки ПАНИ с амфифильным сополимером и электрохимический сенсор на их основе. Амфифильный сополимер синтезируется с использованием 2-акриламидо-2-метил-1-пропансульфоновой кислоты и стирола в качестве мономера, в дальнейшем осуществляется самосборка сополимера с частицами ПАНИ в водном растворе для получения частиц ПАНИ, подвижных в электрическом поле. При этом, в раствор добавляется яичный альбумин в качестве шаблона и происходит связывание альбумина с модифицированными частицами ПАНИ, что приводит к образованию молекулярно импринтированных частиц ПАНИ. В дальнейшем полученные частицы ПАНИ МИП наносятся на поверхность электрода и приводится измерение электрохимического отклика. Время отклика полученного сенсора составляет менее 3 минут.

Недостатком метода является многостадийность и длительность процедуры, а также получение ПАНИ МИП в диспергированной форме, что требует дополнительной стадии нанесения полученного МИП на подложку для создания сенсорного устройства.

Известен способ получения биомиметического молекулярно импринтированного полимера (Synthetic Metals, 2019, Volume 256, 116136), заключающийся в электрополимеризации проводящей сополимерной матрицы анилина и карбоксилированного анилина на электроде оксида графена в присутствии тропонина Т методом циклической вольтамперометрии. Линейный диапазон определения тропонина T находится в диапазоне от 0,02 до 0,09 нг/мл, с пределом обнаружения 0,008 нг/мл.

Однако использование оксида графена в качестве материала для поверхности электрода не позволяет достичь хорошей воспроизводимости результата синтеза, значительно увеличивает время синтеза и усложняет процесс.

Известен способ получения ПАНИ МИП на основе молекулярно-импринтированных нанопроволок ПАНИ, используемого в электрохимическом биосенсоре для обнаружения хлорамфеникола (Journal of The Electrochemical Society, 2020, 167(2), 027527.). ПАНИ нанопроволоки выращивают на рабочем золотом электроде с использованием циклической вольтамперометрии. Синтез ПАНИ на электроде происходит посредством диффузионно-управляемого процесса с медленной кинетикой.

Недостатком способа является необходимость использования электрохимического метода синтеза ПАНИ МИП, что подразумевает невозможность синтеза подобных структур на непроводящих поверхностях и крайне затрудняет использование данного способа для создания перспективных оптических МИП сенсоров.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ синтеза молекулярно импринтированных полимеров, специфичных к пероксидазе хрена (ПХ) (Химия биологически активных веществ. Межвуз. сб. науч. трудов II Всерос. конф. 2019. С. 299-301.), который был выбран в качестве прототипа. Синтез ПАНИ МИП проводят в два этапа: на первом этапе осуществляют предварительную модификацию поверхности плотной электропроводной пленкой ПАНИ. На втором этапе осуществляют синтез ПАНИ МИП на поверхности полученного на первом этапе слоя ПАНИ. Для этого вводят раствор ПХ в качестве молекулы-шаблона в раствор для синтеза ПАНИ методом окислительной полимеризации.

Недостатком способа является невозможность его использования для синтеза МИП с большой обменной емкостью специфичных к белкам, не относящимся к классу оксиредуктаз, но представляющих основной интерес при анализе биологических жидкостей, например альбуминов и иммуноглобулинов. Данный эффект вероятнее всего связан с особенностями механизма окисления анилина в присутствии оксиредуктаз, молекулы которых непосредственно участвуют в синтезе ПАНИ, при этом на поверхности нанопроволок ПАНИ образуются специфические сайты связывания.

Технической проблемой заявляемого изобретения является расширение функциональных возможностей способа получения молекулярно-импринтированного полимера за счёт создания полимера для широкого круга молекул, включая белковые, в т.ч. альбумины и глобулины, и обеспечивающего возможность создания широкого спектра сенсорных элементов и систем разделения и концентрирования.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в получении стабильного по своим свойствам в течение длительного времени слоя молекулярно-импринтированного полимера на основе полианилина, в том числе на белковые молекулы на электропроводящих поверхностях, а также на поверхностях органических и неорганических неэлектропроводных полимерных материалов при упрощении и удешевлении процедуры синтеза ПАНИ МИП.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения молекулярно импринтированного полимера на основе полианилина на подложке, заключающемуся в очистке подложки и проведении её модификации путём окислительной полимеризации анилина либо его производных в присутствии окислителя до образования на подложке плотной электропроводной пленки полианилина, удалении остатков окислителя и анилина либо его производных, проведении дальнейшего синтеза в смеси, состоящей из анилина, либо его производных и окислителя в кислой среде, согласно изобретению, модификацию подложки проводят при рН от 3 и менее, при этом в смесь для синтеза перед внесением окислителя добавляют белковые молекулы-шаблоны классов глобулинов или альбуминов и дополнительно вводят молекулы класса оксиредуктаз в молярном соотношении к белковым молекулам-шаблонам от 0,1:1 до 2,5:1, а синтез проводят при концентрации анилина или его производных и окислителя в диапазоне от 10^-5 до 10^-3 моль/литр.

Синтез проводят при РН не менее 4,5.

Модификацию проводят до образования электропроводной плёнки полианилина толщиной 50-2500 нм.

Значение рН от 3 и менее при проведении модификации обеспечивает необходимые условия для получения однородной плотной электропроводной плёнки ПАНИ

Выбор молярного соотношения от 0,1:1 до 2,5:1 обеспечивает образование молекулярно импринтированных полимеров с наилучшей сорбционной емкостью.

Выбор значения концентрации анилина или его производных и окислителя в диапазоне от 10^-5 до 10 ^-3 моль/литр обеспечивает синтез молекулярно импринтированного полимера с наибольшей удельной площадью поверхности.

Способ осуществляется следующим образом.

На первом этапе образец органического или неорганического полимера, например стекла, для изготовления МИП подвергают процедуре предварительной очистки с помощью пероксидно-кислотных растворов, растворов ПАВ, дистиллированной и деионизованной воды. Далее проводят синтез ПАНИ методом окислительной полимеризации анилина, либо его производных, например анилинхлорида в присутствии сильного окислителя, например пероксодисульфата аммония в кислой среде. Избыток окислителя удаляют обработкой растворами восстановителей, например аскорбиновой кислоты, после чего образцы с нанесенным первым слоем ПАНИ промывают фосфатно-соляным буфером (ФСБ) и бидистиллированной водой до нейтральной реакции среды. Далее проводят второй этап с получением структур конечных ПАНИ МИП. При этом, в раствор анилина либо его производных, например анилинхлорида, и окислителя, например пероксодисульфата аммония, вводят белковые молекулы-шаблоны и молекулы класса оксиредуктаз, например ПХ в молярном соотношении молекул класса оксиредуктаз к белковым молекулам-шаблонам от 0,1:1 до 2,5:1, при этом синтез проводят при рН не менее 4,5 с использованием сильно разбавленных кислот. В результате на поверхности изначально синтезированного плотного равномерного слоя ПАНИ образуется слой ПАНИ с развитой структурой, состоящий, например, из нанопроволок ПАНИ МИП, с большой удельной поверхностью и обменной емкостью по отношению к молекулам шаблонам. Присутствие на поверхности нанопроволок ПАНИ МИП специфичных сайтов к пероксидазе хрена не оказывает влияния на сорбционные характеристики полученного ПАНИ МИП по отношению к молекулам, использованным в качестве шаблонов и на аналитические характеристики возможных сенсорных устройств ввиду отсутствия пероксидазы хрена в образцах биологических жидкостей.

Полученные образцы обрабатывают раствором восстановителя, например аскорбиновой кислоты, промывают бидистиллированной водой и высушивают в токе аргона. Подготовленные таким образом сенсорные элементы пригодны к длительному хранению при температуре не более 5 градусов Цельсия. При этом, в качестве основы для синтеза ПАНИ МИП могут быть использованы как планарные подложки, так и подложки на основе поликапилляров, микроструктурных (фотонно кристаллических) оптических волокон (волноводов), пористой керамики, мембран и т.п., изготовленных из электропроводных и неэлектропроводных органических и неорганических полимерных материалов и металлов.

Пример 1.

Синтез ПАНИ МИП на поверхности планарного стекла проводят следующим образом. Перед синтезом ПАНИ МИП стёкла обрабатывают раствором: H₂SO₄ (ω = 97 %) + H₂O₂ (ω = 25 %) в объёмном соотношении 1:1 для удаления возможных загрязнений и следовых остатков стеклянной пыли Синтез первого слоя ПАНИ на поверхности подложки проводят следующим образом: готовят растворы анилинхлорида (C₆H₈ClN), (10 мл, 7.2 × 10^-4 М) и пероксодисульфата аммония ((NH₄)₂S₂O₈), (10 мл, 1.25 × 10^-3 М) в HCl (0,2 M), после чего в раствор C₆H₈ClN вносят раствор (NH₄)₂S₂O₈ в объёмном соотношении 1:1. В полученную смесь вертикально устанавливают образцы планарного стекла. Через 1,5 мин. извлекают стекла, промывают бидистиллированной водой (20 мл) и раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (20 мл, pH = 7.4) до достижения нейтральной реакции среды. Для удаления избытка (NH₄)₂S₂O₈ применяют реакцию восстановления. Для этого образцы стекла вертикально устанавливают в раствор аскорбиновой кислоты (C₆H₈O₆) (20 мл, 5.5 × 10^-4 М). После восстановления стёкла обрабатывают бидистиллированной водой и ФСБ, аналогично описанному выше образу для достижения нейтральных значений pH.

Синтез ПАНИ МИП специфичного к сорбции яичного сывороточного альбумина (ОВА) осуществляют со следующими параметрами: C₆H₈ClN (10 мл, 1.5 × 10^-5 М) и (NH₄)₂S₂O₈ (10 мл, С = 1.8 × 10^-5 М) в HCl (0,6 × 10^-3 M). Формирование селективных сайтов на поверхности ПАНИ осуществляют с добавлением раствора ПХ и молекул ОВА в качестве молекулы шаблона (C = 1 мг/мл, молярное соотношение ПХ к ОВА 0,5:1) в раствор C₆H₈ClN непосредственно перед внесением (NH₄)₂S₂O₈.

В реакционную смесь вертикально устанавливают стёкла на 60 мин. Дальнейшую очистку полученных сайтов связывания от молекул ПХ и ОВА осуществляют обработкой раствором C₆H₈O₆ (40 мл, 5.6 × 10^-4 М) в течение 30 мин. Регенерацию ПАНИ МИП после использования проводят аналогичным образом с добавлением этапа удаления неспецифически связанных молекул ПХ и ОВА промывкой раствором ФСБ с добавлением поверхностно активного вещества, например Triton X100: (0.02 % вес., 200 мл) в течение 15 мин.

Сорбционная емкость для ПАНИ-МИП на планарном стекле, полученного указанным способом, составляет 80-280 мкг/см².

Пример 2.

Синтез ПАНИ МИП на пористом керамическом носителе (ПК) проводят следующим образом. Образец ПК помещают в стеклянную трубку для возможности его обработки растворами в проточном режиме. Для удаления возможных загрязнений внутри ПК каждый образец промывают раствором ФСБ (50 мл, pH = 7.4).

Синтез сорбирующего слоя ПАНИ проводят следующим образом. Готовят растворы C₆H₈ClN (0,5 мл, 7.5 × 10^-4 М) и (NH₄)₂S₂O₈ (0,5 мл, 1.3 × 10^-3 М) в HCl (0.2 M), после чего в раствор C₆H₈ClN вносят раствор (NH₄)₂S₂O₈ в объёмном соотношении 1:1. Получившуюся смесь вносят в ПК и выдерживают в течение 0,5 мин. Для удаления избытка (NH₄)₂S₂O₈ применяют реакцию восстановления, образцы ПК промывают раствором C₆H₈O₆ (6 × 10^-4 М) путем прокачки насосом в течение 15 мин. После восстановления ПК обрабатывают раствором ФСБ (20 мл, pH = 7.4), для достижения нейтральных значений pH.

Синтез ПАНИ-МИП специфичного к сорбции иммуноглобулина (IgG) осуществляют следующим образом: C₆H₈ClN (0,5 мл, 1.5 × 10^-5 М) и (NH₄)₂S₂O₈ (0,5 мл, 1.8 × 10^-5 М) в HCl (0,6×10^-3 M). Формирование селективных сайтов на поверхности ПАНИ осуществляют с добавлением раствора ПХ и молекул IgG в качестве молекулы шаблона (1 мг/мл, молярное соотношение ПХ к IgG 0,6:1) в раствор C₆H₈ClN непосредственно перед внесением (NH₄)₂S₂O₈. Реакционную смесь вносят в ПК и выдерживают в течение 30 мин. Очистку полученных сайтов связывания от молекул шаблона осуществляют обработкой раствором C₆H₈O₆ (С = 6 × 10^-4 М) путем прокачки раствора насосом в течение 30 мин. Регенерацию ПАНИ МИП после использования проводят аналогичным образом с добавлением этапа удаления неспецифически связанных молекул ПХ и ОВА промывкой раствором ФСБ с добавлением поверхностно активного вещества, например Triton X100: 0.02 % масс., 200 мл в течение 30 мин.

Сорбционная емкость ПАНИ МИП на пористом керамическом носителе, полученного указанным способом, составляет 150-360 мкг/см².

Пример 3.

Синтез ПАНИ МИП на поверхности пластины из металлического никеля проводят следующим образом. Для удаления возможных загрязнений пластину промывают последовательно растворами: соляной кислоты (0,5 М), бидистиллированной воды и раствором ФСБ (5 мл, pH = 7.4).

Синтез сорбирующего слоя ПАНИ проводят следующим образом. Готовят растворы C₆H₈ClN, (1 мл, 9 × 10^-4 М) и (NH₄)₂S₂O₈ (1 мл, 1.4 × 10^-3 М) в HCl (0.2 M), после чего в раствор C₆H₈ClN добавляют раствор (NH₄)₂S₂O₈ в объёмном соотношении 1:1. Получившуюся смесь наносят на пластину и выдерживают в течение 1 мин. Далее пластину промывают раствором C₆H₈O₆ (8 × 10^-4 М) в течение 30 мин. и раствором ФСБ (pH = 7.4), для достижения нейтральных значений pH.

Синтез ПАНИ МИП осуществляют следующим образом: C₆H₈ClN (1мл, 1.5 × 10^-5 М) и (NH₄)₂S₂O₈ (1 мл, 1.75 × 10^-5 М) в HCl (0.5×10^-3 M). Формирование селективных сайтов на поверхности ПАНИ осуществляют с добавлением раствора ПХ и молекул бычьего сывороточного альбумина в качестве молекулы шаблона (C = 1 мг/мл, молярное соотношение ПХ к бычьего сывороточного альбумина 0,9:1) в раствор C6H8ClN непосредственно перед внесением (NH₄)₂S₂O₈. Реакционную смесь наносят на поверхность пластины и выдерживают 60 мин. Дальнейшую очистку полученных сайтов связывания от молекул ПХ и ОВА осуществляют обработкой раствором C₆H₈O₆ (5.6 × 10^-4 М) в течение 30 мин. Регенерацию ПАНИ МИП после использования проводят аналогичным образом с добавлением этапа удаления неспецифически связанных молекул ПХ и ОВА промывкой раствором ФСБ с добавлением поверхностно активного вещества, например Triton X100: (0.02 % вес.) в течение 15 мин.

Сорбционная емкость ПАНИ МИП на подложке из пластины металлического никеля полученного указанным способом, составляет 176-370 мкг/см².