Результат интеллектуальной деятельности: СОДЕРЖАЩАЯ РНК КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Введение

Настоящее изобретение относится к содержащим РНК композициям, предназначенным для применения для лечения или профилактики опухолевых и/или раковых заболеваний, к фармацевтической композиции, к набору и вариантам применения содержащих РНК композиций для лечения или профилактики опухолевых и/или раковых заболеваний.

Рак, который называют также злокачественной опухолью, представляет собой группу заболеваний, характеризующихся аномальным ростом клеток, которые обладают способностью внедряться или распространяться в другие части организма. В 2012 г. во всем мире зафиксировано примерно 14,1 миллиона новых случаев рака (не включая рак кожи, отличный от меланомы).

Стандартные методы лечения рака включают химиотерапию, лучевую терапию и хирургию, при этом эти методы лечения рака используют индивидуально или в сочетании. Другие методы лечения основаны на иммунотерапии рака, которая сфокусирована на стимуляции иммунной системы путем вакцинации, или на адаптивной клеточной иммунотерапии с целью вызывания противоопухолевого ответа.

В некоторых подходах используют генную терапию и генетическую вакцинацию для лечения рака или других опухолевых заболеваний. Генная терапия и генетическая вакцинация представляют собой методы молекулярной медицины, которые базируются на интродукции нуклеиновых кислот в клетки или ткани пациента. В результате информация, кодируемая интродуцируемыми нуклеиновыми кислотами, процессируется в организме, т.е. приводит к экспрессии терапевтического пептида или белка или экспрессии антигена, который кодируется нуклеиновыми кислотами.

Общепринятые генетические терапевтические методы, включая генную терапию и генетическую вакцинацию, базируются на применении молекул ДНК для переноса требуемой генетической информации в клетку. Для интродукции ДНК в клетки разработаны различные методы, такие как трансфекция фосфатом кальция, трансфекция полибреном, слияние протопластов, электропорация, микроинъекция и липофекция. ДНК вирусов можно применять также в качестве ДНК-носителя, позволяющего достигать очень высокого уровня трансфекции. Применение ДНК влечет риск встраивания ДНК в интактный ген генома клетки хозяина, например, путем рекомбинации. В этом случае пораженный ген может мутировать, и инактивироваться или может кодировать ошибочную информацию. Другой риск применения ДНК в качестве фармацевтического агента представляет собой риск индукции патогенных антител к лекарственным средствам (анти-ДНК антитела) у пациента, что может приводить к (возможно фатальному) иммунному ответу.

Применение РНК в качестве генного терапевтического агента или генетической вакцины является существенно более безопасным, поскольку для РНК отсутствует риск интеграции в геном, индуцирующей нежелательную патогенную индукцию антител к лекарственным средствам.

Таким образом, экспрессионные системы РНК имеют выраженные преимущества относительно экспрессионных систем ДНК для использования в генной терапии и генетической вакцинации, хотя из существующего уровня техники было известно или в течение длительного времени предполагалось, что нестабильность мРНК или РНК в целом может являться проблемой при применении в медицинских методах, базирующихся на системах экспрессии РНК.

Нестабильность РНК обусловлена, в частности, расщепляющими РНК ферментами (рибонуклеазы - РНКазы). Существует также много других процессов, которые приводят к дестабилизации РНК, при этом взаимодействие между РНК и белками часто играет решающую роль. Предложены некоторые средства повышения стабильности РНК, что позволяет применять ее в качестве агента генной терапии или РНК-вакцины.

Для решения проблемы стабильности РНК ex vivo в заявке на европейский патент ЕР 1083232 А1 описан метод интродукции РНК, в частности мРНК, в клетки и организмы, в котором РНК образует комплекс с катионным пептидом или белком.

Известно применение мРНК для лечения и/или профилактики рака. Например, в международной заявке на патент WO 03/051401 А2 описана фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере одну мРНК, которая содержит по меньшей мере одну область, кодирующую опухолевый антиген, в комбинации с водным растворителем и предпочтительно с цитокином, например, GM-CSF. Предложено применение фармацевтической композиции для терапии и/или профилактики рака.

В международной заявке на патент WO 2006/008154 А1 описана смесь мРНК для вакцинации против опухолевых заболеваний, в которой по меньшей мере один тип мРНК содержит по меньшей мере одну область, кодирующую опухолевый антиген. По меньшей мере одна другая мРНК содержит по меньшей мере один тип кодирующей иммуногенный белок области.

Однако все еще существует необходимость в эффективном лечении опухолевых заболеваний и, прежде всего, в лечении рака. Таким образом, в основу изобретения была положена задача разработать подход для эффективного лечения опухолевых заболеваний, при котором опухолевая ткань и раковые клетки подвергаются специфической деструкции.

Эта задача решается с помощью объекта изобретения, изложенного в формуле изобретения. В частности, задача, положенная в основу настоящего изобретения, решается согласно первому объекту изобретения с помощью содержащей РНК композиции, предназначенной для применения для лечения или профилактики опухолевых и/или раковых заболеваний. Согласно другим объектам изобретения задача решается с помощью фармацевтической композиции, набора или набора, состоящего из компонентов, и с помощью способа лечения опухолевых или раковых заболеваний.

Определения

Для целей ясности и удобочитаемости ниже представлены основная научная информация и определения. Все технические особенности, указанные при этом, могут являться компонентом каждого и всех до единого вариантов осуществления изобретения. В контексте указанных вариантов осуществления изобретения могут быть специально даны дополнительные определения и пояснения.

Иммунная система: Иммунная система может защищать организмы от инфекции. Если патогену удалось пройти через физический барьер организма и попасть в указанный организм, то врожденная иммунная система обеспечивает немедленный, но неспецифический ответ. На тот случай, если патоген ускользает от этого врожденного ответа, у позвоночных имеется второй уровень защиты, представляющий собой адаптивную иммунную систему. В этом случае иммунная система адаптирует свой ответ в процессе инфекции для улучшения распознавания патогена. Затем этот улучшенный ответ сохраняется после элиминации патогена в форме иммунологической памяти и позволяет адаптивной иммунной системе организовывать более быстрые и сильные атаки каждый раз при проникновении указанного патогена. Таким образом, иммунная система включает врожденную и адаптивную иммунную систему. Каждая из этих двух частей, как правило, включает так называемые гуморальный и клеточный компоненты.

Иммунный ответ: Иммунный ответ, как правило, может представлять собой либо специфическую реакцию адаптивной иммунной системы на конкретный антиген (так называемый специфический или адаптивный иммунный ответ), либо неспецифическую реакцию врожденной иммунной системы (так называемый неспецифический или врожденный иммунный ответ).

Адаптивная иммунная система: Адаптивная иммунная система состоит из высокоспециализированных клеток системы и процессов, которые элиминируют или предупреждают рост патогенов. Адаптивный иммунный ответ обеспечивает способность иммунной системы позвоночных животных распознавать и запоминать специфические патогены (для создания иммунитета) и организовывать более сильную атаку в каждом случае при обнаружении патогена. Система обладает высокой способностью к адаптации вследствие соматической гипермутации (процесс ускоренных соматических мутаций) и V(D)J-рекомбинации (необратимая генетическая рекомбинация сегментов гена рецептора антигена). Этот механизм позволяет небольшому количеству генов создавать огромное количество различных рецепторов антигенов, которые затем уникальным образом экспрессируются на каждом индивидуальном лимфоците. Поскольку реаранжировка гена приводит к необратимому изменению ДНК каждой клетки, то все потомство такой клетки должно затем наследовать гены, кодирующие ту же самую рецепторную специфичность, включая В-клетки памяти и Т-клетки памяти, которые имеют решающее значение для долговременного специфического иммунитета. Теория иммунной сети представляет собой теорию, объясняющую работу адаптивной иммунной системы, основанную на взаимодействия между вариабельными областями рецепторов Т-клеток, В-клеток и молекул, образованных Т-клетками и В-клетками, которые имеют вариабельные области.

Адаптивный иммунный ответ: Как правило, под адаптивным иммунным ответом понимают антигенспецифический ответ. Специфичность в отношении антигена позволяет вырабатывать ответы, приспособленные к специфическим антигенам, патогенам или инфицированным патогеном клеткам. Способность создавать такие приспособленные ответы, как правило, поддерживается в организме «клетками памяти». Если патоген инфицирует организм более чем один раз, то указанные специфические клетки памяти используются для его быстрой элиминации. В этом контексте первая стадия адаптивного иммунного ответа представляет собой активацию наивных антигенспецифических Т-клеток или различных иммунных клеток, способных индуцировать антигенспецифический иммунный ответ, антигенпрезентирующими клетками. Это происходит в лимфоидных тканях и органах, через которые постоянно проходят наивные Т-клетки. Типы клеток, которые могут служить в качестве антигенпрезентирующих клеток, представляют собой среди прочего дендритные клетки, макрофаги и В-клетки. Каждая из указанных клеток выполняет отдельную функцию при вызывании иммунных ответов. Дендритные клетки могут поглощать антигены посредством фагоцитоза и макропиноцитоза, и они могут стимулироваться при контакте, например, с чужим антигеном, к миграции в местную лимфоидную ткань, где происходит их дифференцировка в зрелые дендритные клетки. Макрофаги поглощают находящиеся в форме частиц антигены, такие как бактерии, и индуцируются инфекционными агентами или другими соответствующими стимулами и экспрессируют в результате этого молекулы ГКГС. Уникальная способность В-клеток к связыванию и интернализации растворимых белковых антигенов посредством своих рецепторов может иметь важное значение также и для индукции Т-клеток. Презентация антигена на молекулах ГКГС приводит к активации Т-клеток, что индуцирует их пролиферацию и дифференцировку в «вооруженные» эффекторные Т-клетки. Наиболее важной функцией эффекторных Т-клеток является уничтожение инфицированных клеток цитотоксическими CD8⁺-T-клетками и активация макрофагов Th1-клетками, что в совокупности создает опосредованный клетками (клеточный) иммунитет, и активация В-клеток, как Th2-, так и Th1-клетками, приводящая к образованию различных классов антител, в результате чего создается гуморальный иммунный ответ. Т-клетки распознают антиген посредством своих Т-клеточных рецепторов, которые не распознают антиген и не связываются с ним непосредственно, но вместо этого распознают короткие пептидные фрагменты, например, полученных из патогена белковых антигенов, которые связываются с молекулами ГКГС на поверхностях других клеток.

Клеточный иммунитет/клеточный иммунный ответ: Клеточный иммунитет относится, как правило, к активации макрофагов, естественных клеток-киллеров (NK), антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов и высвобождению различных цитокинов в ответ на антиген. В более общем смысле клеточный иммунитет основан не на антителах, а на активации клеток иммунной системы. Клеточный иммунный ответ характеризуется, например, активацией антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов, которые способны индуцировать апоптоз клеток организма, экспонирующих эпитопы антигенов на своей поверхности, таких как инфицированные вирусом клетки или клетки с внутриклеточными бактериями, и раковые клетки, экспонирующие опухолевые антигены; активацию макрофагов и естественных клеток-киллеров, позволяющую им разрушать патогены; и стимуляцию клеток к секреции различных цитокинов, которые влияют на функцию других клеток, участвующих в адаптивных иммунных ответах и врожденных иммунных ответах.

Гуморальный иммунитет/гуморальный иммунный ответ: Гуморальный иммунитет, как правило, относится к производству антител и необязательно к вспомогательным процессам, сопровождающим производство антител. Гуморальный иммунный ответ, как правило, может характеризоваться, например, активацией Th2 и производством цитокинов, образованием зародышевого центра и переключением изотипа, созреванием аффинности и образованием клеток памяти. Гуморальный иммунитет, как правило, может относиться также к эффекторным функциям антител, включая нейтрализацию патогенов и токсинов, классическую активацию комплемента и стимулирование опсонинами фагоцитоза и элиминации патогенов.

Врожденная иммунная система: Врожденная иммунная система, которую называют также неспецифической иммунной системой, как правило, включает клетки и механизмы, которые неспецифически защищают хозяина от заражения другими организмами. Это означает, что клетки врожденной системы могут распознавать патогены и реагировать на них обычным путем, но, в отличие от адаптивной иммунной системы, она не обеспечивает долговременный или защитный иммунитет хозяина. Врожденная иммунная система может, например, активироваться лигандами рецепторов, которые распознают ассоциированные с патогеном молекулярные паттерны (РАМР), например, Толл-подобных рецепторов (TLR), или другими вспомогательными субстанциями, такими как липополисахариды, TNF-альфа, лиганд CD40 или цитокины, монокины, лимфокины, интерлейкины или хемокины, иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты, иммуностимуляторная РНК (isPHK), CpG-ДНК, антибактериальный агент или противовирусный агент. Как правило, ответ врожденной иммунной системы включает рекрутинг иммунных клеток к областям заражения посредством производства химических факторов, включая специализированные химические медиаторы, которые называют цитокинами; активацию каскада комплемента; идентификацию и удаление чужих субстанций, присутствующих в органах, тканях, крови и лимфе, специализированными лейкоцитами; активацию адаптивной иммунной системы с помощью процесса, известного как презентация антигена; и/или функционирование в качестве физического и химического барьера для инфекционных агентов.

Адъювант/адъювантный компонент: Адъювант или адъювантный компонент в наиболее широком смысле, как правило, представляет собой (например, фармакологический и/или иммунологический) агент или композицию, который/которая может модифицировать, например, усиливать, эффективность других агентов, таких как лекарственное средство или вакцина. Как правило, понятие в контексте настоящего изобретения относится к соединению или композиции, которое/которая служит в качестве носителя или вспомогательной субстанции для иммуногенов и/или других фармацевтически активных соединений. Это понятие следует рассматривать в широком смысле, и оно относится к широкому спектру субстанций, которые обладают способностью повышать иммуногенность антигенов, включенных в рассматриваемый адъювант или совместно применяемых с ним. В контексте настоящего изобретения адъювант предпочтительно должен усиливать специфический иммуногенный эффект действующих веществ, предлагаемых в настоящем изобретении. Как правило, понятия «адъювант» или «адъювантный компонент» имеют одинаковое значение и их можно применять взаимозаменяемо. Адъюванты можно подразделять, например, на иммунопотенциаторы, системы доставки антигенов или даже их комбинации.

Под понятием «адъювант», как правило, понимают субстанции, которые не содержат агенты, которые сами обусловливают иммунитет. Адъювант помогает иммунной системе неспецифически усиливать антигенспецифический иммунный ответ, например, стимулируя презентацию антигена иммунной системе или индукцию неспецифического врожденного иммунного ответа. Кроме того, адъювант может предпочтительно, например, модулировать антигенспецифический иммунный ответ, например, путем сдвига доминирующего антигенспецифического ответа на основе Th2 в сторону повышения антигенспецифического ответа на основе Th1 или наоборот. Таким образом, адъювант предпочтительно может модулировать экспрессию/секрецию цитокинов, презентацию антигенов, тип иммунного ответа и т.д.

Иммуностимуляторная/иммуностимулирующая РНК:

Иммуностимуляторная/иммуностимулирующая РНК (isPHK) в контексте изобретения, как правило, может представлять собой РНК, которая сама обладает способностью индуцировать врожденный иммунный ответ. Обычно она не имеет открытой рамки считывания и, таким образом, не кодирует пептид-антиген или иммуноген, но вызывает врожденный иммунный ответ, например, посредством связывания со специфическим типом Толл-подобного рецептора (TLR) или другими приемлемыми рецепторами. Таким образом, иммуностимуляторные/иммуностимулирующие РНК предпочтительно представляют собой некодирующие РНК. Однако, естественно, также и мРНК, имеющие открытую рамку считывания и кодирующие пептид/белок (например, антигенную функцию), могут индуцировать врожденный иммунный ответ.

Антиген: В контексте настоящего изобретения понятие «антиген» относится, как правило, к субстанции, которая может распознаваться иммунной системой и которая может обладать способностью запускать антигенспецифический иммунный ответ, например, посредством образования антител и/или антигенспецифических Т-клеток, в качестве компонента адаптивного иммунного ответа. Антиген может представлять собой белок или пептид. В этом контексте первая стадия адаптивного иммунного ответа представляет собой активацию наивных антигенспецифических Т-клеток антигенпрезентирующими клетками. Это происходит в лимфоидных тканях и органах, через которые постоянно проходят наивные Т-клетки. Три типа клеток, которые могут служить в качестве антигенпрезентирующих клеток, представляют собой дендритные клетки, макрофаги и В-клетки. Каждая из указанных клеток выполняет отдельную функцию при вызывании иммунных ответов. Присутствующие в ткани дендритные клетки поглощают антигены посредством фагоцитоза и макропиноцитоза, и при заражении стимулируется их миграция в местную лимфоидную ткань, где может происходить их дифференцировка в зрелые дендритные клетки. Макрофаги поглощают находящиеся в форме частиц антигены, такие как бактерии, и индуцируются инфекционными агентами, в результате чего экспрессируют молекулы ГКГС класса II. Уникальная способность В-клеток к связыванию и интернализации растворимых белковых антигенов посредством своих рецепторов может иметь важное значение для индукции Т-клеток. Презентация антигена на молекулах ГКГС приводит к активации Т-клеток, что индуцирует их пролиферацию и дифференцировку в «вооруженные» эффекторные Т-клетки. Наиболее важной функцией эффекторных Т-клеток является уничтожение (цитолиз) инфицированных клеток цитотоксическими CD8⁺-T-клетками и активация макрофагов Th1-клетками, что в совокупности создает опосредованный клетками иммунитет, и активация В-клеток как Th2-, так и Th1-клетками, приводящая к образованию различных классов антител, что приводит к запуску гуморального иммунного ответа. Т-клетки распознают антиген посредством своих Т-клеточных рецепторов, которые не распознают антиген и не связываются с ним непосредственно, но вместо этого распознают короткие пептидные фрагменты, например, полученные из патогена белковых антигенов, например, которые связываются с молекулами ГКГС на поверхностях других клеток.

Т-клетки подразделяют на два основных класса, имеющих различные эффекторные функции. Два класса отличаются по экспрессии белков клеточной поверхности CD4 и CD8. Эти два типа Т-клеток отличаются классом молекулы ГКГС, которую они распознают. Известно два класса молекул ГКГС: молекулы ГКГС класса I и ГКГС класса II, которые отличаются структурой и схемой экспрессии в тканях организма. СВ4⁺-Т-клетки связываются с молекулой ГКГС класса II, а СВ8⁺-Т-клетки с молекулой ГКГС класса I. Молекулы ГКГС класса I и ГКГС класса II отличаются различным распределением среди клеток, что отражает различные эффекторные функции Т-клеток, которые их распознают. Молекулы ГКГС класса I презентируют пептиды цитозольного и ядерного происхождения, например, из патогенов, обычно вирусов, CD8⁺-T-клеткам, которые дифференцируются в цитотоксические Т-клетки, специализацией которых является цитолиз любой клетки, которую они специфически распознают. Почти все клетки экспрессируют молекулы ГКГС класса I, хотя уровень конститутивной экспрессии варьируется от одного типа клеток к другому. Но не только патогенные пептиды из вирусов презентируются молекулами ГКГС класса I, но ими презентируются также и аутоантигены типа опухолевых антигенов. Молекулы ГКГС класса I связывают пептиды из белков, расщепленных в цитозоле, и транспортируют в эндоплазматический ретикулум. CD8⁺-Т-клетки, которые распознают комплексы ГКГС класса I:пептид на поверхности инфицированных клеток, специализируются в отношении цитолиза любой клетки, экспонирующей чужеродные пептиды, и поэтому избавляют организм от клеток, инфицированных вирусами и другими цитозольными патогенами. Основной функцией СВ4⁺-Т-клеток (СВ4⁺-Т-клетки-хелперы), которые распознают молекулы ГКГС класса II, является активация других эффекторных клеток иммунной системы. Так, молекулы ГКГС класса II в норме присутствуют на В-лимфоцитах, дендритных клеток и макрофагах, клетках, которые участвуют в иммунных ответах, но не на других клетках тканей. Макрофаги, например, активируются в отношении уничтожения находящихся внутри везикул патогенов, которые они несут, а В-клетки в отношении секреции иммуноглобулинов против чужеродных молекул. У молекул ГКГС класса II отсутствует связывание с пептидами в эндоплазматическом ретикулуме, и поэтому молекулы ГКГС класса II связывают пептиды из белков, расщепленных в эндосомах. Они могут захватывать пептиды из патогенов, внедрившихся в везикулярную систему макрофагов, или из антигенов, интернализированных незрелыми дендритными клетками или иммуноглобулиновыми рецепторами В-клеток. Патогены, которые накапливаются в больших количествах внутри везикул макрофагов и дендритных клеток, имеют тенденцию к стимуляции дифференцировки Th1-клеток, в то время как внеклеточные антигены имеют тенденцию к стимуляции производства Th2-клеток. Th1-клетки активируют микробиоцидные свойства макрофагов и индуцируют производство антител IgG-типа В-клетками, которые очень эффективно осуществляют опсонизацию внеклеточных патогенов, что приводит к их поглощению фагоцитарными клетками, в то время как Th2-клетки инициируют гуморальный ответ путем активации наивных В-клеток в отношении секреции IgM и индуцируют производство обладающих слабой опсонизирующей способностью антител, таких как IgG1 и IgG3 (мышиные) и IgG2 и IgG4 (человеческие), а также IgA и IgE (мышиные и человеческие).

Эпитоп (называемый также «антигенной детерминантой»): Т-клеточные эпитопы могут содержать фрагменты, предпочтительно имеющие длину от примерно 6 до примерно 20 аминокислот или даже более, например, фрагменты, процессируемые и презентируемые молекулами ГКГС класса I, предпочтительно имеют длину от примерно 8 до примерно 10 аминокислот, например, 8, 9 или 10, (или даже 11 или 12 аминокислот), или фрагменты, процессируемые и презентируемые молекулами ГКГС класса II, предпочтительно имеют длину примерно 13 аминокислот или более, например, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или даже большее количество аминокислот, при этом указанные фрагменты можно выбирать из любой части аминокислотной последовательности. Указанные фрагменты, как правило, распознаются Т-клетками в форме комплекса, состоящего из пептидного фрагмента и молекулы ГКГС. В-клеточные эпитопы, как правило, представляют собой фрагменты, локализованные на внешней поверхности (нативных) белковых или пептидных антигенов.

Вакцина: Под вакциной, как правило, понимают предназначенный для профилактики или терапии продукт, содержащий по меньшей мере один антиген или антигенную функцию. Антиген или антигенная функция может стимулировать адаптивную иммунную систему организма для выработки адаптивного иммунного ответа.

Обеспечивающая образование антигена мРНК: Обеспечивающая образование антигена мРНК может, как правило, представлять собой мРНК, имеющую по меньшей мере одну открытую рамку считывания, которая может транслироваться клеткой или организмом, которая/который содержит такую мРНК. Продукт указанной трансляции представляет собой пептид или белок, который может действовать в качестве антигена, предпочтительно иммуногена. Продукт может представлять собой также слитый белок, состоящий из нескольких иммуногенов, например, слитый белок, который состоит из двух или большего количества эпитопов, пептидов или белков, при этом эпитопы, пептиды или белки могут быть связаны линкерными последовательностями.

Би/полицистронная мРНК: Би/полицистронная мРНК, как правило, может иметь две (бицистронная) или большее количество (полицистронная) кодирующих последовательностей (cds) (которые часто называют открытыми рамками считывания (ОРС)). В этом контексте кодирующая последовательность/открытая рамка считывания представляет собой последовательность, состоящую из нескольких нуклеотидных триплетов (кодонов), которые могут транслироваться в пептид или белок. Трансляция указанной мРНК приводит к образованию двух (бицистронная) или большего количества (полицистронная) различных продуктов трансляции (при условии, что кодирующие последовательности/ОРС не являются идентичными). Для экспрессии в эукариотах такие мРНК могут, например, содержать последовательность участка внутренней посадки (связывания) рибосомы (IRES).

5'-Кэп-структура: 5'-Кэп представляет собой, как правило, модифицированный нуклеотид (аналог кэп-структуры), прежде всего гуаниновый нуклеотид, добавленный к 5'-концу молекулы РНК. Предпочтительно 5'-кэп добавляют с использованием 5'-5'-трифосфатной связи (которую обозначают также m7GpppN). Другими примерами структур 5'-кэпа являются глицерил, инвертированная дезоксигруппа (фрагмент), лишенная азотистого основания, 4',5'-метиленовый нуклеотид, 1-(бета-D-эритрофуранозильный) нуклеотид, 4'-тионуклеотид, карбоциклический нуклеотид, 1,5-ангидрогекситольный нуклеотид, L-нуклеотиды, альфа-нуклеотид, нуклеотид с модифицированным основанием, треопентофуранозильный нуклеотид, ациклический 3',4'-секонуклеотид, ациклический 3,4-дигидроксибутильный нуклеотид, ациклический 3,5-дигидроксипентильный нуклеотид, 3'-3'-инвертированный нуклеотидный фрагмент, 3'-3'-инвертированный лишенный азотистого основания фрагмент, 3'-2'-инвертированный нуклеотидный фрагмент, 3'-2'-инвертированный лишенный азотистого основания фрагмент, 1,4-бутандиолфосфатный, 3'-фосфороамидатный, гексилфосфатный, аминогексилфосфатный, 3'-фосфатный, 3'-фосфоротиоатный, фосфородитиоатный или связанный мостиком или несвязанный мостиком метилфосфонатный фрагмент. Указанные модифицированные структуры 5'-кэпа в контексте настоящего изобретения можно применять для модификации последовательности мРНК в предлагаемой в изобретении композиции. Другими модифицированными структурами 5'-кэпа, которые можно применять в контексте настоящего изобретения, являются САР1 (метилирование рибозы нуклеотида, примыкающего к m7G), САР2 (метилирование рибозы 2-го нуклеотида, расположенного в прямом направлении относительно m7G), САР3 (метилирование рибозы 3-го нуклеотида, расположенного в прямом направлении относительно m7G), САР4 (метилирование рибозы 4-го нуклеотида, расположенного в прямом направлении относительно m7G), ARCA (аналог кэп-структуры с правильной ориентацией), модифицированный ARCA (например, модифицированный фосфотиоатом ARCA), инозин, Nl-метилгуанозин, 2'-фторгуанозин, 7-деазагуанозин, 8-оксогуанозин, 2-аминогуанозин, ЗНК-гуанозин и 2-азидогуанозин.

В контексте настоящего изобретения структуру 5'-кэпа можно получать также путем химического синтеза РНК или транскрипции РНК in vitro (ко-транскрипционное кэпирование) с использованием аналогов кэпа, или структуру кэпа можно получать in vitro с использованием кэпирующих ферментов (например, поступающих в продажу наборов для кэпирования).

Аналоги кэп-структур: Аналог кэп-структуры означает неполимеризуемый динуклеотид, который имеет функциональность в виде кэпа, которая облегчает трансляцию или локализацию и/или предупреждает расщепление молекулы РНК при включении на 5'-конец молекулы РНК. Неполимеризуемый означает, что аналог кэп-структуры можно включать только на 5'-конец, поскольку в нем отсутствует 5'-трифосфат, и поэтому он не может удлиняться в 3'-направлении с помощью зависимой от матрицы РНК-полимеразы.

Аналоги кэп-структур включают (но, не ограничиваясь только ими) химическую структуру, выбранную из группы, которая состоит из m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC; неметилированных аналогов кэп-структур (например, GpppG); диметилированного аналога кэп-структуры (например, m2,7GpppG), триметилированного аналога кэп-структуры (например, m2,2,7GpppG), диметилированных симметричных аналогов кэп-структуры (например, m7Gpppm7G) или анти-обратных аналогов кэп-структур (например, ARCA; m7,2'OmeGpppG, m7,2'dGpppG, m7,3'OmeGpppG, m7,3'dGpppG и их тетрафосфатные производные) (Stepinski и др., RNA 7(10), 2001, сс. 1486-1495).

Ранее описаны другие аналоги кэп-структур (US 7074596, WO 2008/016473, WO 2008/157688, WO 2009/149253, WO 2011/015347 и WO 2013/059475). В последние годы описан синтез замещенных N⁷-(4-хлорфеноксиэтилом) аналогов кэп-структур (Kore и др., Bioorg. Med. Chem. 21(15), 2013, сс. 4570-4574).

Фрагменты белков: В контексте настоящего изобретения «фрагменты» белков или пептидов, могут, как правило, содержать последовательность белка или пептида, как она определена в настоящем описании, которая касательно ее аминокислотной последовательности (или кодирующей ее молекулы нуклеиновой кислоты), укорочена на N-конце, С-конце и/или внутри последовательности по сравнению с аминокислотной последовательностью исходного (нативного) белка (или кодирующей его молекулой нуклеиновой кислоты). Таким образом, указанное укорочение может иметь место либо на аминокислотном уровне, либо соответственно на уровне нуклеиновой кислоты. Следовательно, идентичность последовательности применительно к такому фрагменту, как он определен в настоящем описании, предпочтительно относится к полному белку или пептиду, как они определены в настоящем описании, или к полной (кодирующей) молекуле нуклеиновой кислоты указанного белка или пептида. Касательно антигенов указанный фрагмент может содержать от примерно 6 до примерно 20 или даже большее количество аминокислот, например, фрагменты, процессированные и презентируемые молекулами ГКГС класса I, предпочтительно имеют длину от примерно 8 до примерно 10 аминокислот, например, 8, 9 или 10 (или даже 6, 7, 11 или 12 аминокислот), или фрагменты, процессированные и презентируемые молекулами ГКГС класса II, предпочтительно состоят примерно из 13 или большего количества аминокислот, например, из 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или даже большего количества аминокислот, при этом указанные фрагменты можно выбирать из любой области аминокислотной последовательности. Указанные фрагменты, как правило, распознаются Т-клетками в форме комплекса, состоящего из пептидного фрагмента и молекул ГКГС, т.е. фрагменты, как правило, не распознаются в их нативной форме. Фрагменты белков или пептидов (например, в контексте антигенов) могут содержать по меньшей мере один эпитоп указанных белков или пептидов. Кроме того, подразумевается, что фрагмент белка может содержать также домены белка, типа внеклеточного домена, внутриклеточного домена или трансмембранного домена и укороченные или усеченные версии белка. Предпочтительно фрагмент белка содержит функциональный фрагмент белка, это означает, что фрагмент обладает таким же действием или такой же функциональностью, что и полный белок, из которого он получен.

Варианты белков: Как следует из контекста настоящего изобретения, можно создавать «варианты» белков или пептидов, имеющие аминокислотную последовательность, которая отличается от исходной последовательности наличием одной мутации или большего количества мутаций, например, замен, инсерций и/или делеций аминокислот(ы). Предпочтительно указанные фрагменты и/или варианты обладают той же самой биологической функцией или специфической активностью, что и полноразмерный нативный белок, например, присущей ему специфической антигенной характеристикой. Как следует из контекста настоящего изобретения, «варианты» белков или пептидов могут содержать консервативную(ые) аминокислотную(ые) замену(ы) по сравнению с их нативной, т.е. не подвергнутой мутации физиологической последовательностью. Такие аминокислотные последовательности, а также, в частности, кодирующие их нуклеотидные последовательности, подпадают под указанное в настоящем описании понятие «варианты». Замены, при которых заменяют друг на друга аминокислоты, относящиеся к одному и тому же классу, называют консервативными заменами. В частности, такими классами являются аминокислоты, имеющие алифатические боковые цепи, положительно или отрицательно заряженные боковые цепи, ароматические группы в боковых цепях, или аминокислоты, боковые цепи которых могут входить в водородные мостики, например, боковые цепи которых несут гидроксильную функцию. Это означает, например, что аминокислоту, имеющую полярную боковую цепь, заменяют на другую аминокислоту, также имеющую полярную боковую цепь, или, например, аминокислоту, характеризующуюся гидрофобной боковой цепью, заменяют на другую аминокислоту, также имеющую гидрофобную боковую цепь (например, серин (треонин) на треонин (серин) или лейцин (изолейцин) на изолейцин (лейцин)). Можно осуществлять инсерции и замены, прежде всего, в тех положениях в последовательности, которые не приводят к модификации трехмерной структуры или не влияют на связывающую область. Модификации в трехмерной структуре, обусловленные инсерцией(ями) или делецией(ями) можно легко определять, например, с использованием CD-спектров (спектры кругового дихроизма) (Urry, Absorption, Circular Dichroism и ORD of Polypeptides, в: Modern Physical Methods in Biochemistry, под ред. Neuberger и др., изд-во Elsevier, Amsterdam, 1985).

Аминокислотная последовательность «варианта» белка или пептида может быть идентична по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% состоящему из 10, 20, 30, 50, 75 или 100 аминокислот участку указанного белка или пептида.

Кроме того, варианты белков или пептидов, как они указаны в настоящем описании, которые могут кодироваться молекулой нуклеиновой кислоты, могут содержать также такие последовательности, в которых нуклеотиды нуклеиновой кислоты обменены в соответствии с вырожденностью генетического кода, что не приводит к изменению соответствующей аминокислотной последовательности белка или пептида, т.е. аминокислотная последовательность или по меньшей мере ее часть могут не отличаться от исходной последовательности одной мутацией или большим количеством мутаций в указанном выше смысле.

Предпочтительно вариант белка содержит функциональный вариант белка, это означает, что вариант обладает таким же действием или такой же функциональностью, что и полный белок, из которого он получен.

Идентичность последовательности: Для определения процента идентичности двух последовательностей, например, нуклеотидных последовательностей или аминокислотных последовательностей, указанных в настоящем описании, предпочтительно аминокислотных последовательностей, кодируемых молекулой нуклеиновой кислоты полимерного носителя, указанного в настоящем описании, или самих аминокислотных последовательностей, последовательности можно выравнивать для последующего сравнения друг с другом. Так, например, положение в первой последовательности можно сравнивать с соответствующим положением во второй последовательности. Если положение в первой последовательности занято тем же компонентом (остатком), который находится в этом положении во второй последовательности, то две последовательности являются идентичными в этом положении. Если это не имеет места, то последовательности различаются в этом положении. Если во второй последовательности присутствуют инсерции по сравнению с первой последовательностью, то можно встраивать бреши в первую последовательность, что позволяет продолжать осуществление сравнительного анализа. Если во второй последовательности имеются делеции по сравнению с первой последовательностью, то можно встраивать бреши во вторую последовательность, что позволяет продолжать осуществление сравнительного анализа. Таким образом, процент идентичности двух последовательностей является функцией количества идентичных положений, деленного на общее количество положений, включая те положения, которые заняты только в одной последовательности. Процент идентичности двух последовательностей можно определять с помощью математического алгоритма. Предпочтительным примером математического алгоритма, который можно применять, является (но, не ограничиваясь только им) алгоритм, предложенный Karlin и др., PNAS USA, 90, 1993, сс. 5873-5877 или Altschul и др., Nucleic Acids Res., 25, 1997, сс. 3389-3402. Указанный алгоритм входит в программу BLAST. С помощью этой программы можно идентифицировать последовательности, обладающие конкретной степенью идентичности с последовательностями, предлагаемыми в настоящем изобретении.

Моноцистронная мРНК: Моноцистронная мРНК, как правило, может представлять собой мРНК, которая содержит только одну кодирующую последовательность (открытую рамку считывания). В этом контексте кодирующая последовательность/открытая рамка считывания представляет собой последовательность, состоящую из нескольких нуклеотидных триплетов (кодонов), которые могут транслироваться в пептид или белок.

Нуклеиновая кислота: Понятие «нуклеиновая кислота» обозначает либо ДНК-, либо РНК-молекулу и является синонимом понятия «полинуклеотид». Если в контексте настоящего описания упоминается нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность, кодирующая конкретный белок и/или пептид, то указанная нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность соответственно предпочтительно содержит также регуляторные последовательности, обеспечивающие в приемлемом хозяине, например, человеке, экспрессию, т.е. транскрипцию и/или трансляцию нуклеотидной последовательности, которая кодирует конкретный белок или пептид.

Пептид: Пептид, представляет собой полимер, состоящий из аминокислотных мономеров. Как правило, мономеры связаны пептидными связями. Понятие «пептид» не накладывает ограничения на длину полимерной цепи аминокислот. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пептид может содержать, например, менее 50 мономерных звеньев. Более длинные пептиды называют также полипептидами, как правило, они имеют от 50 до 600 мономерных звеньев, более конкретно от 50 до 300 мономерных звеньев.

Фармацевтически эффективное количество: В контексте изобретения под фармацевтически эффективным количеством, как правило, понимают количество, достаточное для того, чтобы индуцировать иммунный ответ или запускать требуемое терапевтическое действие.

Белок: Белок, как правило, состоит из одного или нескольких пептидов и/или полипептидов, уложенных в виде 3-мерной структуры, которая может требоваться для проявления биологической функции белка.

Поли(С)-последовательность: Поли (С)-последовательность, как правило, представляет собой длинную последовательность, состоящую из цитозиновых нуклеотидов, как правило, содержащую от примерно 10 до примерно 200 цитозиновых нуклеотидов, предпочтительно от примерно 10 до примерно 100 цитозиновых нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 70 цитозиновых нуклеотидов или еще более предпочтительно от примерно 20 до примерно 50 или даже от примерно 20 до примерно 30 цитозиновых нуклеотидов. Поли(С)-последовательность предпочтительно может располагаться в 3'-направлении относительно кодирующей области, содержащейся в нуклеиновой кислоте.

Поли(А)-хвост: Поли(А)-хвост, который называют также «3'-поли(А)-хвостом» или «поли(А)-последовательностью», как правило, представляет собой длинную гомополимерную последовательность аденозиновых нуклеотидов, содержащую вплоть до примерно 400 аденозиновых нуклеотидов, например, от примерно 25 до примерно 400, предпочтительно от примерно 50 до примерно 400, более предпочтительно от примерно 50 до примерно 300, еще более предпочтительно от примерно 50 до примерно 250, наиболее предпочтительно от примерно 60 до примерно 250 аденозиновых нуклеотидов, добавленную к 3'-концу мРНК. В контексте настоящего изобретения поли(А)-хвост мРНК предпочтительно получают из ДНК-матрицы с помощью транскрипции in vitro в РНК. Альтернативно этому, поли (А)-последовательность можно получать также in vitro с помощью общепринятых методов химического синтеза без необходимости ее транскрипции с ДНК-предшественника. Кроме того, поли(А)-последовательности или поли(А)-хвосты можно создавать путем ферментативного полиаденилирования РНК.

Стабилизированная нуклеиновая кислота: Стабилизированная нуклеиновая кислота, как правило, имеет модификацию, повышающую устойчивость к расщеплению in vivo (например, расщеплению экзо- или эндонуклеазой) и/или расщеплению ex vivo (например, в процессе производства до введения вакцины, например, в процессе приготовления раствора вакцины, предназначенного для введения). Стабилизацию РНК, прежде всего мРНК, можно, например, обеспечивать с использованием 5'-кэп-структуры, поли(А)-хвоста и/или любой другой модификации UTR. Ее можно обеспечивать также путем модификации каркаса и/или модификации содержания G/C или содержания С в нуклеиновой кислоте. В данной области известны различные другие методы и их можно рассматривать в контексте изобретения.

Носитель/полимерный носитель: В контексте изобретения носитель, как правило, может представлять собой соединение, которое облегчает транспорт и/или включение в комплекс другого соединения. Указанный носитель может образовывать комплекс с указанным другим соединением. Полимерный носитель представляет собой носитель, образующий полимер.

Катионный компонент: Понятие «катионный компонент», как правило, относится к заряженной молекуле, которая является положительно заряженной (катион) при значении рН, составляющем, как правило, от 1 до 9, предпочтительно при значении рН, равном или ниже 9 (например, от 5 до 9), равном или ниже 8 (например, от 5 до 8), равном или ниже 7 (например, от 5 до 7), наиболее предпочтительно при физиологическом значении рН, например, от 7,3 до 7,4. Таким образом, согласно настоящему изобретению катионный пептид, белок или полимер является положительно заряженным в физиологических условиях, прежде всего в физиологических условиях клетки in vivo. Катионный пептид или белок предпочтительно содержит большее количество катионных аминокислот, например, большее количество Arg, His, Lys или Orn, чем других аминокислотных остатков (в частности, большее количество катионных аминокислот, чем анионных аминокислотных остатков типа Asp или Glu), или содержит блоки, сформированные преимущественно из катионных аминокислотных остатков. Понятие «катионный» может относиться также к «поликатионным» компонентам.

Наполнитель: Наполнитель представляет собой агент, например, носитель, который, как правило, можно использовать в фармацевтической композиции или вакцине для облегчения введения компонентов фармацевтической композиции или вакцины индивидууму.

3'-нетранслируемая область (3'-UTR): 3'-UTR, как правило, является частью мРНК, локализованной между кодирующей белок областью (т.е. открытой рамкой считывания) и поли(А)-последовательностью мРНК. 3'-UTR мРНК не транслируется в аминокислотную последовательность. Последовательность 3'-UTR, как правило, кодируется геном, который транскрибируется в соответствующую мРНК в процессе экспрессии гена. Геномная последовательность сначала транскрибируется в незрелую мРНК, которая содержит необязательные интроны. Незрелая мРНК затем дополнительно процессируется с образованием зрелой мРНК в процессе созревания. Указанный процесс созревания включает стадии 5'-кэпирования, сплайсинга незрелой мРНК с вырезанием необязательных интронов и модификаций 3'-конца, таких как подиаденилирование 3'-конца незрелой мРНК и необязательные расщепления эндо-/или экзонуклеазами и т.д. В контексте настоящего изобретения 3'-UTR соответствует последовательности зрелой мРНК, которая расположена с 3'-стороны стоп-кодона кодирующей белок области, предпочтительно непосредственно примыкает с 3'-стороны к стоп-кодону кодирующей белок области, и которая простирается до 5'-стороны поли(А)-последовательности, предпочтительно до нуклеотида, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к поли(А)-последовательности. Понятие «соответствует» означает, что последовательность 3'-UTR может представлять собой последовательность РНК, такую как последовательность мРНК, указанную при определении последовательности 3'-UTR, или последовательность ДНК, которая соответствует указанной последовательности РНК. В контексте настоящего изобретения понятие «3'-UTR гена», например, «3'-UTR гена альбумина», означает последовательность, которая соответствует 3'-UTR зрелой мРНК, полученной из указанного гена, т.е. мРНК, полученной путем транскрипции гена и созревания незрелой мРНК. Понятие «3'-UTR гена» включает последовательность ДНК и последовательность РНК 3'-UTR.

5'-нетранслируемая область (5'-UTR): Под 5'-UTR, как правило, понимают конкретный сегмент матричной РНК (мРНК). Она локализована на 5'-конце открытой рамки считывания мРНК. Как правило, 5'-UTR начинается с сайта инициации транскрипции и закачивается на расстоянии одного нуклеотида перед стартовым кодоном открытой рамки считывания. 5'-UTR может содержать элементы, предназначенные для контроля генной экспрессии, так называемые регуляторные элементы. Указанные регуляторные элементы могут представлять собой, например, сайты связывания рибосом или 5'-концевой олигопиримидиновый тракт.5'-UTR может подвергаться посттранскрипционным модификациям, например, путем добавления 5'-кэпа. В контексте настоящего изобретения 5'-UTR соответствует последовательности зрелой мРНК, локализованной между 5'-кэпом и стартовым кодоном. Предпочтительно 5'-UTR соответствует последовательности, которая простирается от нуклеотида, расположенного с 3'-стороны 5'-кэпа, предпочтительно от нуклеотида, непосредственно примыкающего с 3'-стороны к 5'-кэпу, до нуклеотида, расположенного с 5'-стороны стартового кодона кодирующей белок области, предпочтительно до нуклеотида, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к стартовому кодону кодирующей белок области. Нуклеотид, непосредственно примыкающий с 3'-стороны к 5'-кэпу зрелой мРНК, как правило, соответствует сайту инициации транскрипции. Понятие «соответствует» означает, что последовательность 5'-UTR может представлять собой последовательность РНК, такую как последовательность мРНК, указанная при определении последовательности 5'-UTR, или последовательность ДНК, которая соответствует указанной последовательности РНК. В контексте настоящего изобретения понятие «5'-UTR гена», такое как «5'-UTR ТОР-гена», обозначает последовательность, которая соответствует 5'-UTR зрелой мРНК, полученной из этого гена, т.е. мРНК, полученной путем транскрипции гена и созревания незрелой мРНК. Понятие «5'-UTR гена» включает последовательность ДНК и последовательность РНК 5'-UTR.

5'-концевой олигопиримидиновый тракт (ТОР): 5'-концевой олигопиримидиновый тракт (ТОР), как правило, обозначает сегмент пиримидиновых нуклеотидов, локализованный в 5'-концевой области молекулы нуклеиновой кислоты, например, в 5'-концевой области некоторых молекул мРНК или в 5'-концевой области функционального элемента, например, транскрибируемой области некоторых генов. Последовательность начинается с цитидина, который, как правило, соответствует сайту инициации транскрипции, и за которым следует сегмент, как правило, состоящий примерно из 3-30 пиримидиновых нуклеотидов. Например, ТОР может содержать 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или даже большее количество нуклеотидов. Пиримидиновый сегмент и, следовательно, 5'-ТОР, заканчивается одним нуклеотидом, примыкающим с 5'-стороны к первому пуриновому нуклеотиду, расположенному в прямом направлении относительно ТОР. МРНК, которая содержит 5'-концевой олигопримидиновый тракт, часто обозначают как ТОР-мРНК. Таким образом, гены, из которых получают указанные матричные РНК, обозначают как ТОР-гены. Последовательности ТОР, например, обнаружены в генах и мРНК, кодирующих пептидные факторы элонгации и рибосомные белки.

ТОР-мотив: В контексте настоящего изобретения ТОР-мотив обозначает нуклеотидную последовательность, которая соответствует 5'-ТОР, описанному выше. Таким образом, ТОР-мотив в контексте настоящего изобретения предпочтительно обозначает сегмент пиримидиновых оснований длиной 3-30 нуклеотидов. Предпочтительно ТОР-мотив состоит по меньшей мере из 3 пиримидиновых нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 4 пиримидиновых нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 5 пиримидиновых нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 6 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 7 нуклеотидов, наиболее предпочтительно по меньшей мере 8 пиримидиновых нуклеотидов, при этом сегмент пиримидиновых нуклеотидов предпочтительно начинается на его 5'-конце с цитозинового нуклеотида. В ТОР-генах и ТОР-мРНК ТОР-мотив предпочтительно начинается на его 5'-конце с сайта инициации транскрипции и заканчивается одним нуклеотидом, примыкающим с 5'-стороны к первому пуриновому остатку в указанном гене или указанной мРНК. ТОР-мотив в контексте настоящего изобретения предпочтительно локализован на 5'-конце последовательности, которая представляет собой 5'-UTR, или на 5'-конце последовательности, которая кодирует 5'-UTR. Таким образом, в контексте настоящего изобретения сегмент из 3 или большего количества пиримидиновых нуклеотидов предпочтительно называют «ТОР-мотивом», если сегмент локализован на 5'-конце соответствующей последовательности, такой как РНК, предлагаемая в изобретении, 5'-UTR-элемент РНК, предлагаемой в изобретении, или нуклеотидная последовательность, которую получают из 5'-UTR ТОР-гена, указанного в настоящем описании. Другими словами, сегмент, состоящий из 3 или большего количества пиримидиновых нуклеотидов, который не локализован на 5'-конце 5'-UTR или 5'-UTR-элемента, но локализован где-либо внутри 5'-UTR или S'-UTR-элемента, предпочтительно не обозначают как «ТОР-мотив».

ТОР-ген: ТОР-гены, как правило, характеризуются присутствием 5'-концевого олигопримидинового тракта. Кроме того, большинство ТОР-генов характеризуются связанной с ростом регуляцией трансляции. Однако известны также ТОР-гены с тканеспецифической регуляцией трансляции. Как указано выше, 5'-UTR ТОР-гена соответствует последовательности 5'-UTR зрелой мРНК, происходящей из ТОР-гена, которая предпочтительно простирается от нуклеотида, расположенного с 3'-стороны 5'-кэпа, до нуклеотида, расположенного с 5'-стороны стартового кодона. 5'-UTR ТОР-гена, как правило, не содержит никаких стартовых кодонов, предпочтительно не содержит расположенных в обратном направлении (u) AUG (uAUG) или расположенных в обратном направлении открытых рамок считывания (uOPC). В данном контексте под расположенными в обратном направлении AUG и расположенными в обратном направлении открытыми рамками считывания, как правило, понимают AUG и открытые рамки считывания, которые находятся с 5'-стороны относительно стартового кодона (AUG) открытой рамки считывания, которая должна транслироваться. 5'-UTR ТОР-генов, как правило, являются относительно короткими. Длины 5'-UTR ТОР-генов могут варьироваться от 20 нуклеотидов вплоть до 500 нуклеотидов и, как правило, они содержат менее чем примерно 200 нуклеотидов, предпочтительно менее чем примерно 150 нуклеотидов, более предпочтительно менее чем примерно 100 нуклеотидов. Примерами 5'-UTR ТОР-генов в контексте настоящего изобретения являются нуклеотидные последовательности, простирающиеся от нуклеотида в положении 5 до нуклеотида, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к стартовому кодону (например, ATG), указанные последовательности представлены в SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422 международной заявки на патент WO 2013/143700, или представляют собой их гомологи или варианты, описание указанного документа включено в настоящее описание в качестве ссылки. В этом контексте наиболее предпочтительным фрагментом 5'-UTR ТОР-гена является 5'-UTR ТОР-гена без 5'ТОР-мотива. Понятие «5'-UTR ТОР-гена» предпочтительно относится к 5'-UTR встречающегося в естественных условиях ТОР-гена.

Химический синтез РНК: Химический синтез относительно коротких фрагментов олигонуклеотидов с определенной химической структурой представляет собой быстрый и недорогой подход к изготовлению по заказу олигонуклеотидов с любой требуемой последовательностью. В то время как ферменты обеспечивают синтез ДНК и РНК только в направлении от 5'- к 3'-концу, на химический синтез олигонуклеотидов не накладывается указанное ограничение, хотя его наиболее часто осуществляют в противоположном направлении, т.е. от 3'- к 5'-концу. В настоящее время процесс осуществляют в виде твердофазного синтеза с использованием фосфорамидитного метода и фосфорамидитных структурных блоков из защищенных нуклеозидов (А, С, G и U) или химически модифицированных нуклеозидов.

Для получения требуемого олигонуклеотида структурные блоки последовательно связывают с растущей олигонуклеотидной цепью на твердой фазе в порядке, требуемом для последовательности продукта, с использованием полностью автоматизированного процесса. После завершения сборки цепи продукт высвобождают из твердой фазы в раствор, удаляют защитные группы и собирают. Наличие побочных реакций накладывает практическое ограничение на длину синтетических олигонуклеотидов (вплоть до примерно 200 нуклеотидных остатков), поскольку количество ошибок повышается с увеличением длины подлежащего синтезу олигонуклеотида. Продукты часто выделяют с помощью ЖХВП с получением требуемых олигонуклеотидов высокой чистоты.

Химически синтезированные олигонуклеотиды нашли широкое применение в молекулярной биологии и медицине. Их наиболее часто применяют в качестве антисмысловых олигонуклеотидов, малых интерферирующих РНК, праймеров для секвенирования и амплификации ДНК, зондов для обнаружения комплементарной ДНК или РНК посредством молекулярной гибридизации, инструментов для направленной интродукции мутаций и сайтов рестрикции и для синтеза искусственных генов.

In vitro транскрипция РНК: Понятия «in vitro транскрипция РНК» или «транскрипция in vitro» относятся к процессу, при котором РНК синтезируют в бесклеточной системе (in vitro). ДНК, в частности плазмидную ДНК, применяют в качестве матрицы для создания РНК-транскриптов. РНК можно получать путем ДНК-зависимой in vitro транскрипции соответствующей ДНК-матрицы, которая согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой линеаризированную плазмидную ДНК-матрицу. Промотор для контроля in vitro транскрипции может представлять собой любой промотор любой ДНК зависимой РНК-полимеразы. Конкретными примерами ДНК-зависимых РНК-полимераз являются РНК-полимеразы Т7, Т3 и SP6. ДНК-матрицу для in vitro транскрипции РНК можно получать путем клонирования нуклеиновой кислоты, в частности кДНК, соответствующей требуемой РНК, подлежащей транскрипции in vitro, и интродукции в соответствующий вектор для in vitro транскрипции, например, в плазмидную ДНК. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ДНК-матрицу линеаризируют с помощью приемлемых рестриктаз перед транскрипцией in vitro. кДНК можно получать с помощью обратной транскрипции мРНК или химическим синтезом. Кроме того. ДНК-матрицу для синтеза РНК in vitro можно получать также путем синтеза гена.

В данной области известны методы in vitro транскрипции (см., например, Geall и др., Semin. Immunol. 25(2), 2013, сс. 152-159; Brunelle и др., Methods Enzymol. 530, 2013, сс. 101-114). Реагенты, применяемые в указанном методе, как правило, включают:

1) линеаризированную ДНК-матрицу с промоторной последовательностью, которая обладает высокой аффинностью связывания с соответствующей РНК-полимеразой, такой как кодируемая бактериофагом РНК-полимераза;

2) рибонуклеозидтрифосфаты (НТФ) для четырех оснований (аденин, цитозин, гуанин и урацил);

3) необязательно аналог кэп-структуры, указанный выше (например, m7G(5')ppp(5')G (m7G));

4) ДНК-зависимую РНК-полимеразу, которая обладает способностью связывать промоторную последовательность с линеаризированной ДНК-матрицей (например, РНК-полимераза Т7, Т3 или SP6);

5) необязательно ингибитор рибонуклеазы (РНКаза) для инактивации любой загрязняющей РНКазы;

6) необязательно пирофосфатазу для расщепления пирофосфата, который может ингибировать транскрипцию;

7) MgCl₂, дополняющий ионы Mg²⁺, в качестве кофактора для полимеразы;

8) буфер для поддержания приемлемого значения рН, который может содержать также антиоксиданты (например, ДТТ), и/или полиамины, такие как спермидин, в оптимальных концентрациях.

РНК. мРНК: РНК представляет собой общепринятое сокращенное обозначение рибонуклеиновой кислоты. Она представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, т.е. полимер, состоящий из нуклеотидных мономеров. Указанные нуклеотиды, как правило, представляют собой мономеры аденозинмонофосфата (АМФ), уридинмонофосфата (УМФ), гуанозинмонофосфата (ГМФ) и цитидинмонофосфата (ЦМФ) или их аналоги, соединенные друг с другом вдоль так называемого каркаса. Каркас образуется фосфодиэфирными связями между сахаром, т.е. рибозой первого и фосфатным остатком второго, соседнего мономера. Специфический порядок расположения мономеров, т.е. порядок расположения оснований, связанных с сахарным/фосфатным каркасом, называют последовательностью РНК. Как правило, РНК можно получать путем транскрипции последовательности ДНК, например, внутри клетки. В эукариотических клетках транскрипция, как привило, происходит внутри ядра или митохондрий. In vivo транскрипция ДНК, как правило, приводит к образования так называемой незрелой РНК (которую обозначают также как пре-мРНК, мРНК-предшественник или гетерогенная ядерная РНК), которая должна процессироваться с образованием так называемой матричной РНК, общепринятым сокращением которой является мРНК. Процессинг незрелой РНК, например, в эукариотических организмах, включает широкое разнообразие различных пост-транскрипционных модификаций, таких как сплайсинг, 5'-кэпирование, полиаденилирование, экспорт из ядра или митохондрий и т.п. Совокупность этих процессов называют также созреванием РНК. Зрелая матричная РНК, как правило, имеет нуклеотидную последовательность, которая может транслироваться в аминокислотную последовательность конкретного пептида или белка. Как правило, зрелая мРНК содержит 5'-кэп, необязательно 5'-UTR, открытую рамку считывания, необязательно 3'-UTR и поли(А)-хвост.

Помимо матричной РНК существует несколько некодирующих типов РНК, которые могут участвовать в регуляции транскрипции и/или трансляции и иммуностимуляции. В контексте настоящего изобретения понятие «РНК» включает любой тип молекул одноцепочечной (ssPHK) или двухцепочечной РНК (dsPHK), известный в данной области, такой как вирусная РНК, ретровирусная РНК и РНК-репликон, малая интерферирующая РНК (siPHK), антисмысловая РНК (as РНК, кольцевая РНК (circ РНК), рибозимы, аптамеры, рибопереключатели (РНК-переключатели),

иммуностимулирующая/иммуностимуляторная РНК, транспортная РНК (тРНК), рибосомная РНК (рРНК), малая ядерная РНК (sn РНК), малая ядрышковая РНК (sno РНК), микроРНК (mi РНК) и взаимодействующая с Piwi-комплексом РНК (pi РНК).

Фрагмент нуклеотидной последовательности, в частности РНК: Фрагмент нуклеотидной последовательности состоит из непрерывного нуклеотидного сегмента, который соответствует непрерывному нуклеотидному сегменту полноразмерной нуклеотидной последовательности, которая является основой нуклеотидной последовательности фрагмента, длина которого составляет по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно 90% от полноразмерной нуклеотидной последовательности. Указанный фрагмент в контексте настоящего изобретения предпочтительно представляет собой функциональный фрагмент полноразмерной нуклеотидной последовательности.

Вариант нуклеотидной последовательности, в частности РНК: Вариант нуклеотидной последовательности обозначает вариант нуклеотидных последовательностей, которые являются основой нуклеотидной последовательности. Например, вариант нуклеотидной последовательности может характеризоваться одной или несколькими нуклеотидными делециями, инсерциями, добавлениями и/или заменами по сравнению с нуклеотидной последовательностью, из которой получают вариант. Предпочтительно вариант нуклеотидной последовательности идентичен по меньшей мере на 40%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% нуклеотидной последовательности, из которой получают вариант. Предпочтительно вариант представляет собой функциональный вариант.

«Вариант» нуклеотидной последовательности может иметь по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичных нуклеотидов на состоящем из 10, 20, 30, 50, 75 или 100 нуклеотидов сегменте указанной нуклеотидной последовательности.

Внутриопухолевое введение/применение: Понятие «внутриопухолевое введение/применение» относится к непосредственной доставке фармацевтической композиции в опухоль или раковую ткань, или в примыкающую к ним область, и/или в область, находящуюся в непосредственной близости от опухоли или раковой ткани. Это включает также несколько инъекций в различные области опухоли или раковой ткани. Кроме того, внутриопухолевое введение/применение включает доставку фармацевтической композиции в один или несколько метастазов.

Методы внутриопухолевой доставки лекарственных средств известны в данной области (Brincker, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 15(2), 1993, сс. 91-98; Celikoglu и др., Cancer Therapy 6, 2008, сс. 545-552). Например, фармацевтическую композицию можно вводить путем общепринятой игольной инъекции, безыгольной струйной инъекции или электропорации или их комбинаций в опухолевую или раковую ткань. Фармацевтическую композицию можно инъецировать непосредственно в опухоль или раковую ткань с большой точностью с использованием компьютерной томографии, ультразвука, визуализации в гамма-камере, позитронно-эмиссионной томографии или магнитно-резонансной визуализации опухоли. Другие процедуры выбирают из группы, включающей (но, не ограничиваясь только ими) непосредственную внутриопухолевую инъекции с помощью эндоскопии, бронхоскопии, цитоскопии, колоноскопии, лапароскопии и катетеризации.

Рецепторы-ловушки: Рецепторы-ловушки распознают некоторые факторы роста или цитокины с высокой аффинностью и специфичностью, но они структурно не способы передавать сигналы или презентировать агонист комплексам сигнальных рецепторов. Они действуют в качестве молекулярной ловушки для агониста и компонентов сигнального рецептора. Рецептор-ловушка или рецептор-раковина представляет собой рецептор, который связывает лиганд, ингибируя его связывание с его нормальным рецептором. Например, рецептор VEGFR-1 может препятствовать связыванию сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) с VEGFR-2.

Доминантно-негативные рецепторы: Доминантно-негативные рецепторы представляют собой варианты конкретного рецептора, который содержит доминантно-негативные (DN) мутации, приводящие к образованию мутантных полипептидов, которые при сверхэкспрессии нарушают активность рецептора дикого типа.

Подробное описание изобретения

Содержащая РНК композиция, предлагаемая в изобретении, содержит по меньшей мере одну РНК и наиболее пригодна для применения для лечения или профилактики опухолевых и/или раковых заболеваний, когда содержащую РНК композицию предпочтительно применяют/вводят внутрь опухоли. Наиболее предпочтительно содержащую РНК композицию инъецируют непосредственно в опухолевую ткань. Альтернативно этому, наиболее предпочтительно содержащую РНК композиция инъецируют в примыкающую область или в непосредственной близости к опухолевой ткани и/или метастазам.

При создании изобретения было установлено, что внутриопухолевое введение соответственно применение содержащей РНК композиции, предлагаемой в изобретении, обеспечивает эффективное лечение опухолевых и/или раковых заболеваний и родственных нарушений. Также неожиданно было установлено, что внутриопухолевое введение обладает эффективностью в отношении уменьшения размера опухоли. Кроме того, применение содержащей РНК композиции, предлагаемой в изобретении, может повышать выживаемость на животных моделях.

По меньшей мере одну РНК в содержащей РНК композиции можно выбирать из группы, состоящей из химически модифицированной или немодифицированной РНК, одноцепочечной или двухцепочечной РНК, кодирующей или некодирующей РНК, мРНК, олигорибонуклеотида, вирусной РНК, ретровирусной РНК, РНК-репликон, тРНК, рРНК, иммуностимуляторной РНК, микроРНК, siPHK, малой ядерной РНК (snPHK), малой РНК, образующей шпильки (sh), РНК-переключателя, РНК-аптамера, РНК-ловушки, антисмысловой РНК, рибозима или любой их комбинации.

В конкретных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одну РНК в содержащей РНК композиции выбирают из кодирующей РНК или некодирующей РНК.

Кодирующая РНК

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции содержит по меньшей мере одну кодирующую область по меньшей мере одного пептида или белка. Предпочтительно кодирующую РНК выбирают из группы, состоящей из мРНК, вирусной РНК, ретровирусной РНК и РНК-репликона.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции кодирует по меньшей мере один цитокин и/или по меньшей мере один хемокин, и/или по меньшей мере один продукт гена самоубийства, и/или по меньшей мере один иммуногенный белок или пептид, и/или по меньшей мере один индуктор клеточной гибели /апоптоза, и/или по меньшей мере один ингибитор ангиогенеза, и/или по меньшей мере один белок теплового шока, и/или по меньшей мере один опухолевый антиген, и/или по меньшей мере один ингибитор β-катенина, и/или по меньшей мере один активатор пути STING (стимулятор генов интерферонов), и/или по меньшей мере один модулятор контрольных «точек» (чекпойнт), и/или по меньшей мере одно антитело, и/или по меньшей мере один доминантно-негативный рецептор, и/или по меньшей мере один рецептор-ловушку, и/или по меньшей мере один ингибитор супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC), и/или по меньшей мере один ингибитор пути IDO (индоламин-2,3-диоксигеназа), и/или по меньшей мере один белок или пептид, который связывает его с ингибиторами апоптоза, или их фрагменты или варианты, которые более подробно описаны ниже.

1. Цитокины

В предпочтительном варианте предлагаемой в изобретении содержащей РНК композиции РНК содержит по меньшей мере одну кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один цитокин или его фрагмент или вариант. Предпочтительно цитокин представляет собой интерлейкин (IL). Один или несколько интерлейкинов можно выбирать, например, из следующего перечня: IL-1α, IL-1β, IL-1ra (антагонист), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10; IL-11, IL-12, IL-13, IL14, IL-15, IL-16, IL-17A, IL-17B, EL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A/B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35. Кроме того, цитокин может представлять собой один или несколько цитокинов, выбранных из семейства TNF, например, выбранных из следующего перечня: TNF, предпочтительноTNFα, LTα, LTβ, LIGHT, TWEAK, APRIL, BAFF, TL1A, GITRL, OX40L, CD40L (CD154), FASL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, TRAIL, лиганд RANK. Дополнительные примеры предпочтительных цитокинов можно выбирать из следующего перечня: лиганд FLT3, G-CSF, GM-CSF, IFNα/β/ω, IFNγ, LIF, М-CSF, MIF, OSM, фактор стволовых клеток, TGFJ31, TGF(32, TGF(33, лиганд TSLP.

Наиболее предпочтительными являются цитокины, выбранные из следующего перечня: IL-12, IL-15, IL-2, IFNγ, TNFα, IL-18, IFNα, IL-1β, IL-32, IL-7, IL-21, IL-8, GM-CSF.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения РНК в предлагаемой в изобретении композиции кодирует интерлейкин-12 или CD40L. При создании изобретения было установлено, что мРНК, кодирующая указанные цитокины, является особенно эффективной, когда ее применяют согласно предложенному в изобретении подходу. Особенно предпочтительными являются последовательности РНК, представленные в SEQ ID NO: 1, 3, 4194, 4195, 4196, 4197, 4198, 4199, 4200, которые кодируют IL-12. Кроме того, особенно предпочтительными являются последовательности РНК, представленные в SEQ ID NO: 3898, 3899, 3900, 3901, 3902, 3903, 3904, 10073, которые кодируют CD40L.

Согласно предпочтительным вариантам в контексте настоящего изобретения цитокины можно выбирать из любого цитокина, выбранного из группы, которая состоит из 4-1BBL; Apo2L/TRAIL; APRIL; BAFF; CD27L; CD30L; CD40L (CD154); CXCL8; EL-17C; FasL; FLT3 лиганд; G-CSF; GITRL; GM-CSF; IL-альфа; IFNB; IFNG; IFNoMera; 1b-Lальфа; IL-1-бета; IL-10; IL-11; IL-12; IL-12A; IL-13; IL-14; IL-15; IL-16; IL-17A; IL-17B; IL-17D; IL-17F; IL-18; IL-19; IL- 1 ra_(антагонист); IL-2; IL-20; IL-21; IL-22; IL-23; IL-24; IL-25; IL-26; IL-27A; IL-27B; IL-28A; IL-28B; IL-29; IL-3; IL-31; IL-32; IL-33; IL-37; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-9; LIF; LIGHT; LTальфа; LTбета; M-CSF; MIF; OSM; OX40L; RANK лиганд; Stem Cell Factor (фактор стволовых клеток); TGбета1; TGFбета2; TGFбета3; TL1A; TNF; TWEAK, которые предпочтительно представлены в таблице 1. В этом контексте особенно предпочтительными являются последовательности РНК, которые кодируют цитокин, представленный в таблице 1.

Согласно настоящему изобретению в более предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении композиция содержит по меньшей мере одну РНК, предпочтительно мРНК, которая содержит по меньшей мере одну кодирующую область, кодирующую по меньшей мере один цитокин или его фрагмент или вариант, в которой по меньшей мере одна кодирующая область содержит последовательность РНК, идентичную (полностью) или по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичную последовательностям РНК, указанным в SEQ ID NO: в таблице 1.

2. Хемокины:

В другом предпочтительном варианте предлагаемой в изобретении содержащей РНК композиции РНК содержит по меньшей мере одну кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один хемокин или его фрагмент или вариант.

Хемокины представляют собой хемотактические цитокины, которые контролируют схемы миграции и позиционирования иммунных клеток, данные о которых обобщены у Griffith и др., Annu. Rev. Immunol. 32, 2014, сс. 659-702 (PMID 24655300). Функция хемокинов имеет решающее значение для всех видов подвижности иммунных клеток от миграции, необходимой для развития и гомеостаза, до подвижности, необходимой для создания первичных и амнестических клеточных и гуморальных иммунных ответов, до патологического рекрутинга иммунных клеток при заболевании. Хемокины образуют самое большое семейство цитокинов, состоящее примерно из 50 эндогенных хемокиновых лигандов у человека и мышей.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения хемокины можно выбирать из любого хемокина, выбранного из группы, состоящей из CCL1; CCL11; CCL12; CCL13; CCL14; CCL15; CCL16; CCL17; CCL18; CCL19; CCL2; CCL20; CCL21; CCL22; CCL24; CCL25; CCL26; CCL27; CCL28; CCL3; CCL4; CCL5; CCL6; CCL7; CCL8; CCL9; CX3CL1; CXCL1; CXCL10; CXCL11; CXCL12; CXCL13; CXCL14; CXCL15; CXCL2; CXCL3; CXCL4; CXCL5; CXCL6; CXCL7; CXCL8; CXCL9; XCL1; XCL2, предпочтительно описанных в таблице 2. В этом контексте особенно предпочтительными являются последовательности РНК, которые кодируют хемокины, указанные в таблице 2.

В этом контексте наиболее предпочтительными являются хемокины, выбранные из следующего перечня: CXCL9, CXCL10, CCL5, XCL1, CCL20, CCL19, CCL21, CCL2, CCL3, CCL16 и CXCL12.

Согласно настоящему изобретению в более предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении композиция содержит по меньшей мере одну РНК, предпочтительно мРНК, которая содержит по меньшей мере одну кодирующую область, кодирующую по меньшей мере один хемокин или его фрагмент или вариант, в которой по меньшей мере одна кодирующая область содержит последовательность РНК, идентичную (полностью) или по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичную последовательностям РНК, указанным в SEQ ID NO: в таблице 2.

3. Продукты генов самоубийства

В другом предпочтительном варианте предлагаемой в изобретении содержащей РНК композиции РНК кодирует по меньшей мере один продукт так называемого гена самоубийства, прежде всего фермент самоубийства, предпочтительно метаболизирующий нуклеотиды фермент. Предпочтительно РНК применяют в комбинации с пролекарством, которое является субстратом для продукта гена самоубийства, прежде всего фермента самоубийства, и которое превращается в цитотоксическое соединение с помощью продукта гена самоубийства. Соответствующее пролекарство можно добавлять в предлагаемую в изобретении содержащую РНК композицию или его можно вводить отдельно пациенту.

Один или несколько предпочтительных ферментов самоубийства можно выбирать из следующего перечня: тимидинкиназа, предпочтительно вирусная тимидинкиназа, более предпочтительно тимидинкиназа вируса Herpes simplex, тимидинкиназа Varicella zoster; растительная тимидинкиназа, предпочтительно тимидинкиназа томатов; цитозиндеаминаза, предпочтительно бактериальная цитозиндеаминаза или цитозиндеаминаза дрожжей; дезоксинуклеозидкиназа, предпочтительно дезоксинуклеозидкиназа Drosophila melanogaster; дезоксицитидинкиназа, предпочтительно дезоксицитидинкиназа млекопитающих, фосфорилаза пуриновых нуклеозидов, предпочтительно бактериальная фосфорилаза пуриновых нуклеозидов.

Известно, что терапия на основе генов самоубийства уже зарекомендовали себя как перспективный метод лечения рака (Ardiani и др., Curr. Gene Ther. 12(2), 2012, сс. 77-91. PMID: 22384805). Этот подход базируется на успешной доставке и экспрессии гена самоубийства в опухолевых клетках. Ген самоубийства кодирует фермент, который обладает уникальной способностью активировать в ином случае неэффективное пролекарство. После экспрессии гена самоубийства в трансфектированных клетках вводят соответствующее пролекарство, и оно превращается в цитотоксическое соединение под действием продукта гена самоубийства. Большинство генов самоубийства кодируют ферменты, принадлежащие к классу метаболизирующих нуклеотиды ферментов, общим механизмом действия активированных пролекарств является воздействие на синтез ДНК, что в результате приводит к индукции апоптоза. Активность этих лекарственных средств является максимальной в раковых клетках из-за их большей скорости пролиферации по сравнению со здоровыми клетками. Благодаря перспективе преимущественной доставки генов в опухолевые клетки эта стратегия может обеспечивать избирательное уничтожение опухолей, оказывая щадящее действие на здоровые клетки, особенность, которую, как правило, не обеспечивают стандартные химиотерапевтические и радиотерапевтические подходы.

Ниже в таблице 3 (Ardiani и др., Curr. Gene Ther. 12(2), 2012, сс. 77-91. PMID: 22384805) обобщены предпочтительные метаболизирующие нуклеотиды ферменты, которые можно применять согласно подходу, предлагаемому в изобретении. Таблица включает варианты и мутанты указанных ферментов, созданные с использованием стратегий инженерии белков.

Тимидинкиназа вируса Herpes simplex типа 1 (HSVTK, КФ 2.7.1.21), гомодимер с молекулярной массой субъединицы 45 кДа, ответственна за фосфорилирование тимидина, дезоксицитидина, дезокситимидилата (dTMP), а также различных фармацевтически важных пиримидиновых и гуанозиновых аналогов. Прежде всего, HSVTK ответственна за начальное и скорость-лимитирующее фосфорилирование антивирусных гуанозиновых аналогов ацикловира (ACV) и ганцикловира (GCV). Будучи монофосфорилированы, эти аналоги могут дополнительно фосфорилироваться эндогенными ферментами (гуанилаткиназой и нуклеозиддифосфокиназой) перед включением в образующуюся ДНК, вызывая дестабилизацию двойной цепи и, как следствие, клеточную гибель.

Кроме того, можно применять тимидинкиназу вируса Varicella zoster (VZV-tk), например, в сочетании с пролекарством 6-метоксипуринарабинозидом (ага-М) или 1-(2'-дезокси2-фтори-b-O-арабинофуранозил)-5-йодурацилом (FIAU). Другими примерами являются тимидинкиназы вируса алеутской болезни (ADV), респираторно-синцитиального вируса (RSV) и цитомегаловируса (CMV).

Цитозиндеаминаза (CD; КФ 3.5.4.1) представляет собой фермент в «пути спасения» пиримидина, который катализирует деаминирование цитозина с образование урацила и аммония. CD из Е. coli (bCD) представляет собой гексамер с молекулярной массой субъединиц 48 кДа с каталитическим металлом, таким как железо. Этот фермент отсутствует у млекопитающих и присутствует только в грибах и бактериях. Его используют в терапии на основе генов самоубийства благодаря его способности деаминировать противогрибковое лекарственное средство, 5-фторцитозин (5FC) с образованием 5-фторурацила (5FU), эффективного антинеопластического лекарственного средства. UPRT (урацилфосфорибозилтрансфераза) можно применять в качестве возможного энхансера.

Цитозиндеаминаза Saccharomyces cerevisiae или дрожжей (yCD, КФ 3.5.4.1) представляет собой гомодимер с молекулярной массой субъединиц 17,5 кДа, и, как установлено, обладает более высокой активностью в отношении 5FC, чем bCD (величина Кт ниже в 22 раза), с несколько более высокой каталитической эффективностью (kcat/Km) в отношении 5FC, чем в отношении ее встречающегося в естественных условиях субстрата цитозина.

Дезоксирибонуклеозидкиназа Drosophila melanogaster (Dm-dNK; КФ 2.7.1.145) представляет собой имеющую молекулярную массу 29 кДа гомодимерную мультисубстратную киназу, которая обладает способностью фосфорилировать все четыре встречающихся в естественных условиях дезоксирибонуклеозида, требуемые для синтеза ДНК. Кроме того, помимо ее широкой субстратной специфичности Dm-dNK характеризуется более высокими каталитическими скоростями в отношении этих указанных встречающихся в естественных условиях дезоксирибонуклеозидов и нескольких нуклеозидных аналогов по сравнению с дезоксинуклеозидкиназами млекопитающих. Благодаря указанным отличительным признакам Dm-dNK представляет собой особенно предпочтительный фермент для основанной на применении гена самоубийства предлагаемой в изобретении терапии.

Человеческая дезоксицитидинкиназа (dCK; КФ 2.7.1.74) представляет собой гомодимерный фермент с молекулярной массой 30,5 кДа в «пути спасения» дезоксирибонуклеозидов, и она ответственна за активацию всех встречающихся в естественных условиях дезоксирибонуклеозидов, за исключением тимидина, в качестве предшественников синтеза ДНК. Благодаря ее специфичности в отношении широкого спектра субстратов dCK обладает способность активировать множество нуклеозидных аналогов, эффективных в отношении различных типов рака. Однако dCK дикого типа по существу является относительно плохим катализатором с низкой скоростью циркуляции, и ее способность активировать пролекарство зависит от ее уровней экспрессии. Фактически, нуклеозидные аналоги, которые являются эффективными субстратами dCK, такие как цитарабин (АгаС), флударабин (F-AraA), кладрибин (CdA) и гемцитабин (dFdC), представляют собой эффективные средства против лейкоза, поскольку установлено, что для лимфобластов характерны высокие уровни экспрессии dCK, в то время как раковые клетки, в которых отсутствует активность dCK, являются устойчивыми к этим же аналогам. Таким образом, dCK представляет собой особенно предпочтительный фермент для применения в заявляемом подходе.

Предпочтительно предлагаемую в изобретении РНК в содержащей РНК композиции применяют в комбинации с другими компонентами, которые повышают цитотоксическое действие обработки. Наиболее предпочтительно применять РНК в комбинации с РНК, которая кодирует коннексины, и/или с белками семейства коннексинов или их частями или фрагментами. Коннексины представляют собой трансмембранные белки, которые образуют щелевидные соединения (контакты) между клетками. Они могут переносить, например, молекулы между соседними клетками, таким образом, обладая способностью переносить цитотоксические субстанции.

Хотя терапия на основе гена самоубийства представляет собой относительно новый противораковый подход, концепция первоначально была описана более двадцати лет назад в 1986 г. Moolten (Moolten, Cancer Res. 46(10), 1986, cc. 5276-5281). Указанный автор предположил также существование явления, известного в настоящее время как эффект безучастия (эффект «наблюдателя»), который в настоящее время рассматривается как основная причина успеха терапии на основе гена самоубийства. Эффект безучастия проявляется в распространении цитотоксических действий от трансфектированных клеток к нетрансфектированным соседним клеткам, в результате чего наблюдается полный регресс опухоли уже после успешной трансфекции лишь небольшой субпопуляции опухолевых клеток. Это явление в настоящее время имеет решающее значение для эффективности в целом терапии на основе гена самоубийства из-за низкой эффективности трансфекции, которая достигается с помощью доступных систем доставки.

Предполагается, что эффект безучастия проявляется посредством двух основных механизмов: местного и опосредуемого иммунной системой. Местный механизм включает уничтожение (цитолиз) нетрансфектированных соседних клеток в результате переноса токсичных продуктов или ферментов самоубийства через щелевые контакты, апоптозные пузырьки или посредством диффузии растворимых токсичных метаболитов. Щелевые контакты представляют собой важные взаимодействия по типу клетка-клетка, и они ответственны за перенос ионов, нуклеотидов и малых молекул к соседним клеткам. Однако перенос токсичных лекарственных средств через щелевые контакты может быть недоступен в некоторых типах опухолей, в которых имеет место понижающая регуляция внутриклеточной коммуникации посредством щелевых контактов, и которые характеризуются имеющими нарушенную организацию и нефункциональными щелевыми контактами. Для решения этой проблемы в нескольких исследованиях изучали повышенную экспрессию коннексинов, конструктивных элементов щелевых контактов, и в них продемонстрировано достижение эффектов безучастия и клеточного цитолиза.

Совокупность полученных в экспериментах in vivo данных позволила предположить, что опосредуемый иммунной системой эффект безучастия играет также важную роль в регрессе опухолей. Установлено, что присутствие воспалительных инфильтратов, хемокинов и цитокинов повышало регресс опухолей у иммунокомпетентных животных, которых подвергали воздействию генной терапии на основе гена самоубийства. Кроме того, эти цитокины и хемокины индуцировали производство иммунорегуляторных молекул, обладающих способностью стимулировать более сильный противораковый эффект, и дополнительно, поскольку гибель трансфектированных клеток происходит посредством апоптоза, могли вызывать многочисленные иммуновоспалительные сигналы для инициации эффективного иммунного ответа. Таким образом, комбинация предлагаемой в изобретении композиции с коннексинами или с РНК, кодирующей коннексины, является особенно предпочтительной, поскольку она усиливает эффект безучастия, повышая тем самым эффективность композиции, содержащей предлагаемую в изобретении РНК.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления в контексте настоящего изобретения продукты генов самоубийства можно выбирать из любого продукта гена самоубийства, выбранного из группы, состоящей из следующих продуктов: цитозиндеаминаза cod А; цитозиндеаминаза fey 1; дезоксицитидинкиназа dCK; дезоксинуклеозидкиназа dNK; пурин нуклеозидфосфорилаза deoD; тимидинкиназа ТК, предпочтительно, указанных в таблице 4. Наиболее предпочтительными в этом контексте являются последовательности РНК, кодирующие продукт генов самоубийства, которые указаны в таблице 4.

Согласно настоящему изобретению в более предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении композиция содержит по меньшей мере одну РНК, предпочтительно мРНК, содержащую по меньшей мере одну кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один продукт гена самоубийства или его фрагмент или вариант, где по меньшей мере одна кодирующая область содержит последовательность РНК, которая идентична (полностью) или по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентична последовательностям РНК, указанным под SEQ ID NO: в таблице 4.

4. Иммуногенные белки или пептиды

Предпочтительно РНК, предпочтительно мРНК предлагаемой в изобретении содержащей РНК композиции кодирует по меньшей мере один иммуногенный белок или пептид, прежде всего белок или пептид патогена, предпочтительно вирусного патогена, или его фрагмент или вариант. Путем применения РНК, которая кодирует иммуногенный белок или пептид, который предпочтительно представляет собой патогенный антиген, можно использовать ранее существующий иммунитет против указанных антигенов для лечения опухолевых и/или раковых заболеваний. Запускается ответ иммунологической памяти, и иммунная система активизируется для атаки на опухолевые клетки.

Указанный вариант осуществления изобретения базируется на признании того, что в принципе любой организм с иммунной системой проявляет «ответы иммунологической памяти» против определенных чужеродных молекул (антигенов), например, белков, в частности, вирусных или бактериальных белков. Если организм уже инфицирован антигеном в более ранний момент времени, то иммунный ответ против, например, вирусного белка, уже запущен этим заражением. Иммунная система обладает «памятью» на этот ответ и хранит ее. В результате повторного заражения антигеном иммунный ответ реактивируется. Указанная реактивация может начинаться в результате введения РНК, предпочтительно мРНК, кодирующей антиген, при этом предпочтительное внутриопухолевое введение, предлагаемое в изобретении, является особенно эффективным. Путем реактивации ответа иммунологической памяти против, например, вирусных патогенов, можно эффективно разрушать опухолевые клетки.

Предпочтительными примерами иммуногенных белков или пептидов в указанном варианте осуществления изобретения являются белки или пептиды широко распространенных патогенов, т.е. патогенов, которыми каждый организм, в частности, млекопитающие, предпочтительно человек, имеет высокую вероятность заражения по меньшей мере один раз в течение жизни. Они включают, например, любой из следующих структурных или неструктурных белков или пептидов:

- вирус гриппа типа А или В или любой другой ортомикосвирус (вирус гриппа типа С),

- пикорновирусы, такие как риновирус или вирус гепатита А,

- тогавирусы, такие как альфавирус или рубивирус, например, вирус Синдбис, вирус леса Семлики или рубеолавирус (вирус краснухи),

- рубелла вирус (вирус немецкой краснухи),

- коронавирусы, в частности, подтипов HCV-229E или HCV-OC43,

- рабдовирусы, такие как вирус бешенства,

- парамикосвирусы, такие как вирус свинки,

- реовирусы, такие как ротавирус группы А, В или С,

- гепаднавирусы, такие как вирус гепатита В,

- паповирусы, такие как человеческие вирусы папилломы (HPV) любого серотипа, прежде всего с 1 по 75, аденовирусы, в частности, типа 1-47,

- вирусы герпеса, такие как вирус герпеса простого 1, 2 или 3, цитомегаловирус (CMV), предпочтительно CMVpp65, вирус Эпштейна-Барра (EBV), вирусы коровьей оспы и

- бактерия Chlamydophila pneumoniae (Chlamydia pneumoniae).

Другими примерами предпочтительных иммуногенных белков или пептидов являются белки или пептиды патогенов, которые лишь изредка заражают организм. Однако РНК, кодирующая один или несколько этих белков или пептидов, может быть эффективной при использовании в предлагаемом в изобретении подходе. Эти белки или пептиды включают, например, любой следующий структурный или неструктурный белок или пептид:

- флавивирусы, такие как вирус Денге типа 1-4, вирус желтой лихорадки, вирус Западного Нила, вирус японского энцефалита,

- вирус гепатита С,

- калицивирусы,

- филовирусы, такие как вирус Эбола, борнавирусы,

- буниавирусы, такие как вирус лихорадки Рифт-Валли,

- аренавирусы, такие как LCMV (вирус лимфоцитарного хориоменингита) или вирус геморрагической лихорадки, ретровирусы, такие как ВИЧ, и парвовирусы.

Предпочтительно РНК в содержащей предлагаемую в изобретении мРНК композиции кодирует нуклеопротеин вируса гриппа (NP). При создании изобретения было установлено, что применение композиции, содержащей мРНК, которая кодирует нуклеопротеин вируса гриппа, является особенно эффективным в отношении уменьшения размера опухоли при ее применении согласно предлагаемому в изобретении подходу. В этом контексте наиболее предпочтительной является мРНК, которая кодирует нуклеопротеин вируса гриппа, имеющий SEQ ID NO: 6.

5. Индукторы клеточной гибели и индукторы апоптоза:

В наиболее широком смысле под индуктором апоптоза или индуктором клеточной гибели подразумевают молекулу, индуцирующую аутофагию, ороговение, эксайтотоксичность, некроз, Уоллеровскую дегенерацию, энтоз, митотическую катастрофу, некроптоз и пироптоз (обзор Kroemer G. и др. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009». Cell Death & Differentiation 16.1, 2009, cc. 3-11.).

В другом предпочтительном варианте содержащей предлагаемую в изобретении РНК композиции РНК кодирует по меньшей мере один индуктор апоптоза, предпочтительно индуктор апоптоза, выбранный из группы, которая состоит из семейства Вс1-2 и белка-супрессора опухолей р53, и лигандов трансмембранных рецепторов смерти, прежде всего суперсемейства гена рецепторов TNF (фактор некроза опухолей), агонисты проапаптозного рецептора и беклин-1.

В контексте настоящего изобретения наиболее предпочтительным индуктором апоптоза является белок Беклин-1 (полученный из гена BECN1). В данной области известно, что Беклин-1 взаимодействует с Bcl-2, BCL2L2, GOPC и MAP1LC3A, регулируя аутофагию и клеточную гибель.

Апоптоз обеспечивает важный барьер против рака. Однако специфические мутации (например, мутация гена-супрессора опухолей р53) позволяет некоторым опухолевым клеткам избегать обусловленной апоптозом гибели и становиться более злокачественными. Путем применения мРНК, кодирующей по меньшей мере один индуктор апоптоза, можно реактивировать апоптоз, который представляет собой важную и эффективную в отношении элиминации раковых клеток систему организма.

Предпочтительные примеры индукторов апоптоза можно выбирать из следующего перечня: Bcl-10, Вах, Bak, Bid, Bad, Bim, Bik, Blk, цитохром с, каспазы, прежде всего каспаза 3, каспаза 6, каспаза 7, каспаза 8, каспаза 9, домен смерти, прежде всего Fas, предпочтительно FasL, TNFα, Apo2L/TRAIL, агонист DR4 и/или DR5, Apo3L, агонистическое антитело к DR4, агонистическое антитело к DR5, протеинкиназа R (PKR) (предпочтительно обладающая конститутивной активностью PKR), гранзим В.

Апоптоз инициируют два пути передачи сигналов: внутренний путь действует через внутриклеточные белки Вс1-2, внешний путь действует через расположенные на клеточной поверхности проапоптозные рецепторы.

Внутренний путь передачи сигналов запрограммированной гибели клеток включает не опосредуемые рецептором внутриклеточные сигналы, индуцирующие активность в митохондриях, которая инициирует апоптоз. Стимулы для внутреннего пути включают заражения вирусами или повреждение клетки токсинами, свободными радикалами или излучением. Повреждение клеточной ДНК может также индуцировать активацию внутреннего пути запрограммированной гибели клеток. Эти стимулы индуцируют изменения во внутренней мембране митохондрий, что приводит к снижению трансмембранного потенциала, вызывающему высвобождение проапоптозных белков в цитозоль. Проапоптозные белки активируют каспазы, опосредующие деструкцию клеток с использованием различных путей. Эти белки транслоцируются также в ядра клеток, индуцируя фрагментацию ДНК, что является признаком апоптоза. Регуляция проапоптозный событий в митохондриях происходит в результате активности представителей белков семейства Вс1-2 и белка-супрессора р53. Представители белков семейства Вс1-2 могут быть проапоптозными или антиапоптозными. Антиапоптозными белками являются Bcl-2, Bcl-x, Bcl-xL, Bcl-XS, Bcl-w и BAG. Проапоптозные белки включают Bcl-10, Вах, Bak, Bid, Bad, Bim, Bik и Blk (Elmore. Toxicol Pathol. 35(4), 2007, cc. 495-516 (PMID: 17562483)), и они являются особенно предпочтительными для применения в предлагаемом в изобретении подходе.

Внешний путь передачи сигналов, приводящих к апоптозу, включает трансмембранные рецепторы смерти, которые являются представителями суперсемейства генов рецептора фактора некроза опухолей (TNF). Представители этого семейства рецепторов связываются с внутренними лигандами и трансдуцируют внутриклеточные сигналы, которые в конце концов приводят к деструкции клетки. Наиболее хорошо охрактеризованными к настоящему времени лигандами этих рецепторов являются FasL, TNFα, Apo2L и Apo3L. Соответствующие рецепторы представляют собой FasR, TNFR1, DR3 и DR4/DR5. Молекулы, которые стимулируют активность этих проапоптозных белков или активируют эти рецепторы, в настоящее время изучаются в отношении их терапевтического потенциала для лечения рака, включая гематологические злокачественные заболевания (Elmore. Toxicol Pathol. 35(4), 2007, cc. 495-516 (PMID: 17562483)). Эти лиганды внешнего пути являются дополнительными особенно предпочтительными примерами для применения в предлагаемом в изобретении подходе.

Новое понимание на молекулярном уровне привело к разработке агонистов проапоптозных рецепторов (PARA), включая рекомбинантный человеческий белок апоптозного лиганда 2/родственный TNF индуцирующий апоптоз лиганд (Apo2L/TRAIL). Кроме того, изучаются агонистические моноклональные антитела к сигнальным рецепторам DR4 (TRAILR1) и DR5 (TRAILR2). Мапатумумаб является примером агонистического антитела к DR4. Примеры агонистических антител к DR5 включают лексатумумаб, апомаб, AMG655, CS-1008 и LBY-135 (Ashkenazi. Nat. Rev. Drug Discov. 7(12), 2008, cc. 1001-1012 (PMID: 18989337)).

Ниже в таблице 5 обобщены сведения о некоторых предпочтительных индукторах апоптоза.

Согласно предпочтительным вариантам в контексте настоящего изобретения индукторы апоптоза можно выбирать из любых индукторов апоптоза из группы, состоящей из следующих индукторов: Apo2L/TRAIL; Apo3L; Bad; Bak; Bax; Bel-10; Bid; Bik; Bim; Blk; каспаза3; каспазаб; каспаза 7; каспаза 8; каспаза 9; цитохром с; FasL; гранзим В; TNF, предпочтительно, из указанных в таблице 6. Особенно предпочтительными в этом контексте являются последовательности РНК, которые кодируют индукторы апоптоза, указанные в таблице 6.

Согласно настоящему изобретению в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция, предлагаемая в изобретении, содержит по меньшей мере одну РНК, предпочтительно мРНК, которая содержит по меньшей мере одну кодирующую область, кодирующую по меньшей мере один индуктор апоптоза или индуктор клеточной гибели или его фрагмент или вариант, где по меньшей мере одна кодирующая область содержит последовательность РНК, которая идентична (полностью) или по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентична последовательностям РНК, указанным под SEQ ID NO: в таблице 6.

6. Ингибиторы ангиогенеза

В следующем предпочтительном варианте предлагаемой в изобретении содержащей РНК композиции по меньшей мере одна РНК, предпочтительно мРНК, кодирует по меньшей мере один модулятор или ингибитор ангиогенеза, предпочтительно эндогенный ингибитор ангиогенеза или его фрагмент или вариант. Рост и выживание опухолей зависят от ангиогенеза, представляющего собой путь доставки кислорода и питательных веществ к опухолевым клеткам. Путем применения РНК, кодирующей по меньшей мере один ингибитор ангиогенеза, согласно предлагаемому в изобретению подходу можно блокировать ангиогенез локально, а именно, в опухолевой ткани, что является эффективным методом прекращения роста опухолей и снижения объема опухолей. Предпочтительные примеры ингибиторов ангиогенеза согласно изобретению можно выбирать из следующего перечня: интерферон альфа (IFN-α), (интерферон бета) IFN-β, интерферон гамма (IFN-γ), CXCL9, CXCL10, интерлейкин 12 (IL-12), тромбоцитарный фактор 4 (PF-4), фактор некроза опухолей альфа (TNF-α), растворимая fms-подобная тирозинкиназа 1 (sFLT-1), фетальная печеночная киназа 1 (FLK-1), ангиостатин, эндостатин, вазостатин, канстатин, тумстатин, фрагмент пролактина с молекулярной массой 16 кДа, тканевый ингибитор металлопротеиназ 1 (TIMP-1), тканевый ингибитор металлопротеиназ 2 (TIMP-2), тканевый ингибитор металлопротеиназ 3 (TIMP- 3), тромбоспондин 1 (TSP-1), тромбоспондин 2 (TSP-2), маспин, РЕХ, растворимый тирозинпротеинкиназный рецептор 1 (sTie1), растворимый рецептор 2 ангиопоэтина-1 (sTie2), ангиопоэтин-1, ангиопоэтин-2, антитело к рецептору сосудистого эндотелиального фактора роста 2 (VEGFR2) (например, алацизумаб, рамуцикумаб), антитело к сосудистому эндотелиальному фактору роста (VEGF) (например, бролуцизумаб, ранибизумаб, бевацизумаб) и антитело к рецептору сосудистого эндотелиального фактора роста 1 (VEGFR1) (например икрукумаб).

Без указанного процесса рекрутинга кровеносных сосудов рост опухолей ограничивается до 1-2 мм², что зависит от предела диффузии кислорода. Уже в 1971 г. Folkman предположил, что рост опухолей можно прекращать, блокируя ангиогенез (Folkman, N. Engl. J. Med. 285(21), 1972, cc. 1182-1186).

Ангиогенез представляет собой многостадийный процесс формирования новых кровеносных сосудов из ранее существующей сосудистой сети, который включает активацию, пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток (ЕС), нарушение сосудистых базальных мембран, ремоделирование внеклеточного матрикса тканей, формирование сосудистых трубок и сетей, рекрутинг поддерживающих клеток, включая клетки гладких мышц и перициты, и соединение с ранее существующей сосудистой сетью.

В данном микроокружении ангиогенный ответ является результатом баланса между проангиогенными и антиангиогенными факторами, которые секретируются как опухолевыми клетками, так и клетками стромы; превалирование первых определяет «ангиогенный сдвиг», приводящий к активации ангиогенеза, что сопровождается разрастанием опухоли (Hanahan и Folkman. Cell 86(3), 1996, cc. 353-364).

Стратегии генной терапии, базирующиеся на ингибировании ангиогенеза, и прежде всего, на подходе, предлагаемом в настоящем изобретении, имеют несколько преимуществ по сравнению с общепринятыми методами введения антиангиогенных лекарственных средств. Прежде всего, поскольку для эффективного подавления патологического ангиогенеза может, в конце концов, требоваться хроническое лечение, стратегия генной терапии, предлагаемая в изобретении, пригодна для обеспечения избирательной доставки к пораженным тканям и пролонгированной экспрессии терапевтических агентов. Генная терапия также представляет собой метод, позволяющий обойти производственные проблемы, характерные для большого количества рекомбинантных белков, включая их стабильность и растворимость; соответствующее производство антиангиогенных факторов с помощью методов рекомбинантной инженерии является в некоторой степени проблематичным (например, в случае ангиостатина) и может ограничивать их клиническое применение. Кроме того, использование переноса генов позволяет корректировать укладку белковых агентов и их стабильность in vivo, поскольку их сборка происходит в их физиологическом окружении. Особенно привлекательной особенностью предлагаемого в изобретении подхода является возможность осуществлять направленную доставку гена к выбранным тканям, а именно, опухолевым тканям, достигая таким образом локализованной экспрессии генов и высоких местных концентраций лекарственного средства без повышения системных уровней терапевтических агентов, что приводит к повышению терапевтического индекса.

Ингибиторы ангиогенеза являются гетерогенными по происхождению и активности, и их постоянно увеличивающийся список включает продукты протеолиза более крупных молекул с различной функцией, таких как ангиостатин, эндостатин и вазостатин, модуляторы активности сосудистого эндотелиального фактора роста, такие как растворимый FLT-1 (sFLT-1), и некоторые цитокины/хемокины с выраженной антиэндотелиальной активностью, такие как IL-12, IFN-α и CXCL10. В приведенной ниже таблице 8 (адаптирована из статьи Persano и др., Mol. Aspects Med. 28(1), сс.87-114. PMID: 17306361) обобщены данные о предпочтительных ингибиторах ангиогенеза, которые можно использовать в предлагаемом в изобретении подходе.

В контексте настоящего изобретения согласно предпочтительным вариантам осуществления изобретения ингибиторы ангиогенеза можно выбирать из любого ингибиора ангиогенеза, выбранного из группы, состоящей из ангиопоэтина-2; ангиостатина; канстатина; CXCL10; CXCL4; CXCL9; эндостатина; FLK-1; IFNальфа; IFNB; IFNG; IL-12; РЕХ; PRL; SERPINB5; sFLT-1; sTie2; TIMP-1; TIMP-2; TIMP-3; TNF; TSP-1; TSP-2; тумстатина; вазостатина, которые предпочтительно указаны в таблице 7. Особенно предпочтительными в этом контексте являются последовательности РНК, которые кодируют индукторы ангиогенеза, указанные в таблице 7.

Согласно настоящему изобретению в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция, предлагаемая в изобретении, содержит по меньшей мере одну РНК, предпочтительно мРНК, которая содержит по меньшей мере одну кодирующую область, кодирующую по меньшей мере один ингибитор ангиогенеза или его фрагмент или вариант, где по меньшей мере одна кодирующая область содержит последовательность РНК, которая идентична (полностью) или по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентична последовательностям РНК, указанным под SEQ ID NO: в таблице 7.

7. Белки теплового шока

В следующем предпочтительном варианте предлагаемой в изобретении содержащей РНК композиции РНК кодирует по меньшей мере один белок теплового шока (HSP) или его фрагмент или вариант. Предпочтительно белок теплового шока можно выбирать из следующего перечня: HSP27, HSP47 (серпин H1), HSP60, HSP70, HSC70, GRP78 (BiP), HSP90, HSP110, GRP94 (gp96), GRP170 (ORP150), PDI/PDIA, CRT/CALR.

По данным, обобщенным у Graner с соавторами (Graner M.W., Lillehei K.О., Katsanis Е. Endoplasmic reticulum chaperones and their roles in the immunogenicity of cancer vaccines. Front Oncol; 4, 6 января 2015 г., с. 379. doi: 10.3389/fonc.2014.00379), белки теплового шока обладают жизненно важными функциями в клетках в качестве субстанций «домашнего хозяйства» (конститутивных субстанций), и они необходимы в процессе синтеза, фолдинга и транспорта белков через внутриклеточные мембраны, а также для расщепления белков. HSP принадлежат к многочисленному семейству белков шаперонов, которое состоит из (но не ограничиваясь только ими) HSP27, HSP47 (серпин H1), HSP60, HSP70, HSC70, GRP78 (BiP), HSP90, HSP110, GRP94 (gp96), GRP170 (ORP150), PDI/PDIA, CRT/CALR. В дополнение к их внутриклеточным функциям в качестве шаперонов установлено, что HSP играют важную роль вне клеток в качестве стимуляторов иммунных ответов, особенно при образовании опухолей. В различных литературных источниках продемонстрировано, что полученные из опухолей комплексы HSP-пептид очень эффективно индуцируют противоопухолевые иммунные ответы. Молекулярный механизм этих явлений понятен. HSP в качестве шаперонов обладают способностью связывать денатурированные пептиды, включая антигенные пептиды, и указанные комплексы интернализуются антигенпрезентирующими клетками (АРС), что в конце концов приводит к презентации антигенов и индукции иммунитета. Установлено, что помимо их функции в качестве шаперонов HSP запускали сигналы опасности в микроокружении опухоли и таким образом стимулировали производство макрофагами и дендритными клетками (DC) провоспалительных цитокинов и усиление индуцированных иммунных ответов.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления в контексте настоящего изобретения белки теплового шока можно выбирать из любого белка теплового шока, выбранного из группы, состоящей из кальретикулина; GRP170_(ORP150); GRP78_(BiP); GRP94_(gp96); HSC70; HSP110; HSP27; HSP47_(серпин_H1); HSP60; HSP70; HSP90; PDI/PDIA, которые предпочтительно указаны в таблице 8. Особенно предпочтительными в этом контексте являются последовательности РНК, которые кодируют белки теплового шока, указанные в таблице 8.

Согласно настоящему изобретению в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция, предлагаемая в изобретении, содержит по меньшей мере одну РНК, предпочтительно мРНК, которая содержит по меньшей мере одну кодирующую область, кодирующую по меньшей мере один белок теплового шока или его фрагмент или вариант, где по меньшей мере одна кодирующая область содержит последовательность РНК, которая идентична (полностью) или по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентична последовательностям РНК, указанным под SEQ ID NO: в таблице 8.

8. Опухолевые антигены

В следующем предпочтительном варианте содержащей РНК композиции, предлагаемой в изобретении, композиция может содержать РНК, предпочтительно мРНК, кодирующую по меньшей мере один опухолевый антиген или его фрагмент, которые согласно изобретению применяют для вакцинации для индукции адаптивного иммунного ответа.

В этом контексте опухолевые антигены наиболее предпочтительно должны кодироваться РНК, предпочтительно мРНК, которая входит в предлагаемую в изобретении содержащую РНК композицию. Особенно предпочтительно, чтобы предлагаемая в изобретении содержащая РНК композиция содержала по меньшей мере одну РНК, кодирующую по меньшей мере один опухолевый антиген или его фрагмент или вариант.

Опухолевые антигены предпочтительно локализованы на поверхности (опухолевой) клетки. Опухолевые антигены можно выбирать также из белков, для которых характерна сверхэкспрессия в опухолевых клетках по сравнению со здоровыми клетками. Кроме того, опухолевые антигены включают также антигены, экспрессируемые в клетках, которые сами не являются (не были) (или исходно не были сами) перерожденными, но ассоциированы с предполагаемой опухолью. Антигены, связанные с сосудами, которые поставляют кровь в опухоль, или с их (ре)форматированием, в частности антигены, которые ассоциированы с неоваскуляризацией, например, факторы роста, такие как VEGF, bFGF и т.д. подпадают также под объем настоящего изобретения. К антигенам, ассоциированным с опухолью, относятся также антигены из клеток или тканей, как правило, окружающих опухоль. Кроме того, некоторые субстанции (как правило, белки или пептиды) экспрессируются у пациентов, страдающих (установленным или неустановленным) раковым заболеванием, и они присутствуют в повышенных концентрациях в общей воде организма у таких пациентов. Эти субстанции также подпадают под понятие «опухолевые антигены», однако в строгом смысле они не являются антигенами, т.е. индуцирующими иммунный ответ субстанциями. Класс опухолевых антигенов можно подразделять также на специфические для опухоли антигены (TSA) и ассоциированные с опухолью антигены (ТАА). TSA могут презентироваться только опухолевыми клетками и никогда нормальными «здоровыми» клетками. Они, как правило, образуются в результате специфической для опухоли мутации. ТАА, которые являются более общими, как правило, презентируются как опухолевыми, так и здоровыми клетками. Эти антигены распознаются, в результате чего антигенпрезентирующая клетка может разрушаться цитотоксическими Т-клетками. Кроме того, опухолевые антигены могут присутствовать также на поверхности опухоли в форме, например, мутантного рецептора. В этом случае они могут распознаваться антителами.

Кроме того, ассоциированные с опухолью антигены можно классифицировать как тканеспецифические антигены, которые называют также меланоцитспецифическими антигенами, раково-тестикулярные антигены и опухольспецифические антигены. Под раково-тестикулярными антигенами, как правило, понимают пептиды или белки ассоциированных с зародышевой линией генов, которые могут активироваться в широком разнообразии опухолей. Человеческие раково-тестикулярные антигены можно подразделять также на антигены, которые кодируются Х-хромосомой, так называемые СТ-Х-антигены, и антигены, которые не кодируются Х-хромосомой, так называемые (не-Х-СТ-антигены). Раково-тестикулярные антигены, которые кодируются X-хромосомой, включают, например, семейство генов антигенов меланомы, так называемое MAGE-семейство. Гены MAGE-семейства можно охарактеризовать по наличию домена гомологии MAGE (MHD). Каждый из указанных антигенов, т.е. меланоцитспецифических антигенов, раково-тестикулярных антигенов и опухольспецифических антигенов, может вызывать аутологичные клеточные и гуморальные иммунные ответы. Следовательно, опухолевый антиген, кодируемый предлагаемой в изобретении нуклеотидной последовательностью, предпочтительно представляет собой меланоцитспецифический антиген, раково-тестикулярный антиген или опухольспецифический антиген, предпочтительно он может представлять собой СТ-Х-антиген, не-Х-СТ-антиген, партнер, связывающий СТ-Х-антиген, или партнер, связывающий не-Х-СТ-антиген, или опухольспецифический антиген, более предпочтительно СТ-Х-антиген, партнер, связывающий не-Х-СТ-антиген, или опухольспецифический антиген.

Наиболее предпочтительные опухолевые антигены выбирают из перечня, включающего 5Т4, 707-АР, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, альфа-5-бета-1-интегрин, альфа-5-бета-6-интегрин, альфа-актинин-4/m, альфа-метилацил-кофермент А-рацемазу, ART-4, ARTCl/m, В7Н4, BAGE-1, BCL-2, bcr/ab1, бета-катенин/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29, CA 19-9, CA72-4, CA125, кальретикулин, CAMEL, CASP-8/m, катепсин В, катепсин L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, коактозин-подобный белок, коллаген XXIII, СОХ-2, CT-9/BRD6, Cten, циклин В1, циклин D1, сур-В, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEK-CAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, Frau-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, гепсин, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HNE, гомеобокс NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST- 2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, незрелый ламининовый рецептор, каллекреин-2, каллекреин-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-А3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, маммоглобин A, MART-1/мелан-А, MART-2, MART-2/m, матриксный белок 22, MC1R, M-CSF, ME1/m, мезотелин, MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX-антиген, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, миозин класса I/m, NA88-A, N-ацетилглюкозаминилтрансферазу-V, Neo-PAP, Neo-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-B, NY-ESO-1, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, остеокальцин, остеопонтин, p15, p190 минорный bcr-ab1, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PAP, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-киназу, Pin-1, Pml/PARaльфa, POTE, PRAME, PRDX5/m, простеин, протеиназу-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP-1, сурвивин, сурвивин-2В, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGFбета, TGFбетаRII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, тирозиназу, UPA, VEGFR1, VEGFR-2/FLK-1 и WT1. Указанные опухолевые антигены предпочтительно можно выбирать из группы, состоящей из р53, СА125, EGFR, Her2/neu, hTERT, PAP, MAGE-A1, MAGE-А3, мезотелина, MUC-1, GP100, MART-1, тирозиназы, PSA, PSCA, PSMA, STEAP-1, VEGF, VEGFR1, VEGFR2, Ras, CEA или WT1, и более предпочтительно из PAP, MAGE-А3, WT1 и MUC-1. Указанные опухолевые антигены предпочтительно можно выбирать из группы, состоящей из MAGE-A1 (например, MAGE-A1, имеющий регистрационный номер М77481), MAGE-A2, MAGE-А3, MAGE-A6 (например, MAGE-A6, имеющий регистрационный номер NM_005363), MAGE-C1, MAGE-C2, мелан-А (например, мелан-А, имеющий регистрационный номер NM_005511), GP100 (например, GP100, имеющий регистрационный номер М77348), тирозиназы (например, тирозиназа, имеющая регистрационный номер NM_000372), сурвивина (например, сурвивин, имеющий регистрационный номер AF077350), СЕА (например, СЕА, имеющий регистрационный номер NM_004363), Her-2/neu (например, Her-2/neu, имеющий регистрационный номер M11730), WT1 (например, WT1, имеющий регистрационный номер NM_000378), PRAME (например, PRAME, имеющий регистрационный номер NM_006115), EGFRI (рецептор эпидермального фактора роста-1) (например, EGFRI (рецептор эпидермального фактора роста-1), имеющий регистрационный номер AF288738), MUC1, муцина-1 (например, муцин-1, имеющий регистрационный номер NM_002456), SEC61G (например, SEC61G, имеющий регистрационный номер NM_014302), hTERT (например, hTERT, имеющий регистрационный номер NM_198253), 5Т4 (например, 5Т4, имеющий регистрационный номер NM_006670), TRP-2 (например, TRP-2, имеющий регистрационный номер NM_001922), STEAP, РСА, PSA, PSMA и т.д.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления в контексте настоящего изобретения опухолевые антигены можно выбирать из любого опухолевого антигена, выбранного из группы: 1 A01_HLA-A/m; 1А02; 5Т4; ACRBP; AFP; AKAP4; альфа-актинин- 4/m; альфа-метилацил-кофермент_А_-рацемаза; ANDR; ART-4; ARTCl/m; AURKB; B2MG; B3GN5; B4GN1; В7Н4; BAGE-1; BASI; BCL-2; bcr/ab1; бета-катенин/m; BING-4; BIRC7; BRCA1/m; BY55; кальретикулин; CAMEL; CASPA; каспаза_8; катепсин_В; катепсин_L; CD1A; CD1B; CD1C; CD1D; CD1E; CD20; CD22; CD276; CD33; CD3E; CD3Z; CD4; CD44_изоформа_1; CD44_изоформа_6; CD52; CD55; CD56; CD80; CD86; CD8A; CDC27/m; CDE30; CDK4/m; CDKN2A/m; СЕА; CEAM6; CH3L2; CLCA2; CML28; CML66; COA-1/m; коактозин-подобныйбелок; коллаген_XXIII; COX-2; CP1B1; CSAG2; CT-_9/BRD6; CT45A1; CT55; CTAG2_изоформа_LAGE-1A; CTAG2_изоформа_LAGE-1B; CTCFL; Cten; циклин_B1; циклин_D1; cyp-B; DAM-10; DEP1A; E7; EF1A2; EFTUD2/m; EGFR; EGLN3; ELF2/m; EMMPRIN; EpCam; EphA2; EphA3; ErbB3; ERBB4; ERG; ETV6; EWS; EZH2; FABP7; FCGR3 А_версия_1; FCGR3A_версия_2; FGF5; FGFR2; фибронектин; FOS; FOXP3; FUT1; G250; GAGE-1; GAGE-2; GAGE-3; GAGE-4; GAGE-5; GAGE-6; GAGE7b; GAGE-8 (GAGE-2D); GASR; GnT-V; GPC3; GPNMB/m; GRM3; HAGE; гепсин; Her2/neu; HLA-A2/m; гомеобокс NKX3.1; HOM-TES-85; HPG1; HS71A; HS71B; HST-2; hTERT; iCE; IF2B3; IL-10; IL-13Ra2; IL2-RA; IL2-RB; IL2-RG; IL-5; IMP3; ITA5; ITB1; ITB6; калликреин-2; калликреин-4; KI20A; KIAA0205; KIF2C; KK-LC-1; LDLR; LGMN; LIRB2; LY6K; MAGA5; MAGA8; MAGAB; MAGE-B1; MAGE-E1; MAGE-A1; MAGE-A10; MAGE-A12; MAGE-A2; MAGE-А3; MAGE-A4; MAGE-A6; MAGE-A9; MAGE-B10; MAGE-B16; MAGE-B17; MAGE-B2; MAGE-B3; MAGE-B4; MAGE-B5; MAGE-B6; MAGE-C1; MAGE-C2; MAGE-C3; MAGE-D1; MAGE-D2; MAGE-D4; MAGE-E1_(MAGE1); MAGE-E2; MAGE-F1; MAGE-H1; MAGEL2; маммаглобин A; MART-1/мелан-А; MART-2; MC1_R; M-CSF; мезотелин; MITF; MMP1_1; MMP7; MUC-1; MUM-1/m; MUM-2/m; MYO1A; MYO1B; MYO1C; MYO1D; MYO1E; MYO1F; MYO1G; MYO1H; NA17; NA88-A; Neo-PAP; NFYC/m; NGEP; N-myc; NPM; NRCAM; NSE; NUF2; NY-ESO-1; OA1; OGT; OS-9; остеокальцин; остеопонтин; p53; PAGE-4; PAI-1; PAI-2; PAP; PATE; РАХ3; PAX5; PD1L1; PDCD1; PDEF; PECA1; PGCB; PGFRB; Pim-1_-киназа; Pin-1; PLAC1; PMEL; PML; POTE; POTEF; PRAME; PRDX5/m; PRM2; простеин; протеиназа-3; PSA; PSB9; PSCA; PSGR; PSM; PTPRC; RAB8A; RAGE-1; RARA; RASH; RASK; RASN; RGS5; RHAMM/CD168; RHOC; RSSA; RU1; RU2; RUNX1; S-100; SAGE; SART-l; SART-2; SART-3; SEPR; серпинВ5; SIA7F; SIA8A; SIAT9; SIRT2/m; SOX10; SP17; SPNXA; SPXN3; SSX-1; SSX-2; SSX3; SSX-4; ST1A1; STAG2; STAMP-1; STEAP-1; сурвивин; сурвивин-2 В; SYCP1; SYT-SSX-1; SYT-SSX-2; TARP; TCRg; TF2AA; TGFбета1; TGFR2; TGM- 4; TIE2; TKTL1; TPI/m; TRGV11; TRGV9; TRPC1; TRP-p8; TSG10; TSPY1; TVC_(TRGV3); TX101; тирозиназа; TYRP1; TYRP2; UPA; VEGFR1; WT1; XAGE1, которые предпочтительно указаны в таблице 9. Особенно предпочтительными в этом контексте являются последовательности РНК, которые кодируют опухолевые антигены, указанные в таблице 9.

Согласно настоящему изобретению в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция, предлагаемая в изобретении, содержит по меньшей мере одну РНК, предпочтительно мРНК, которая содержит по меньшей мере одну кодирующую область, кодирующую по меньшей мере один опухолевый антиген или его фрагмент или вариант, где по меньшей мере одна кодирующая область содержит последовательность РНК, которая идентична (полностью) или по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентична последовательностям РНК, указанным под SEQ ID NO: в таблице 9.

Кроме того, опухолевые антигены могут включать также идиотипические антигены, ассоциированные с раковым или опухолевым заболеванием, прежде всего с лимфомой или ассоциированным с лимфомой заболеванием, где указанный идиотипический антиген представляет собой идиотип иммуноглобулина лимфоидной кровяной клетки или идиотип Т-клеточного рецептора лимфоидной кровяной клетки.

В особенно предпочтительном варианте предлагаемая в изобретении содержащая РНК композиция содержит по меньшей мере одну РНК, где по меньше мере одна РНК кодирует следующие антигены:

• STEAP (эпителиальный антиген простаты с шестью трансмембранными доменами);

• PSA (простатспецифический антиген),

• PSMA (простатспецифический мембранный антиген),

• PSCA (антиген стволовых клеток предстательной железы),

• РАР (простатическая кислая фосфатаза) и

• MUC1 (муцин 1).

В другом особенно предпочтительном варианте предлагаемая в изобретении содержащая РНК композиция содержит по меньшей мере одну РНК, где по меньше мере одна РНК кодирует следующие антигены:

• 5Т4 (трофобластический гликопротеин, TPBG);

• Сурвивин (бакуловирусный ингибитор мотива апоптозных повторов (IAP) белок 5; BIRC5),

• NY-ESO-1 (Нью-Йоркская плоскоклеточная карцинома пищевода 1; CTAG1B),

• MAGE-C1 (антиген меланомы семейства С1),

• MAGE-C2 (антиген меланомы семейства С2) и

• MUC1 (муцин 1).

9. Ингибиторы β-катенина

В следующем предпочтительном варианте предлагаемой в изобретении содержащей РНК композиции по меньшей мере одна РНК, предпочтительно мРНК, кодирует по меньшей мере один ингибитор β-катенина или его фрагмент или вариант. Предпочтительно РНК, кодирующая по меньшей мере один ингибитор β-катенина, кодирует ингибирующий белок или доминантно-негативный мутант белка пути β-катенина. Наиболее предпочтительные ингибиторы β-катенина, предлагаемые в настоящем изобретении, включают производные TAT-NLS-BLBD-6, аксина-1, TCF-4, GSK-3b, DKK-1, Dvl-1 или их фрагменты.

Согласно обзору Thakur и Mishra (Thakur R., Mishra D.P. Pharmacological modulation of beta-catenin and its applications in cancer therapy. J Cell Mol Med. 17(4), апрель 2013 г., сс. 449-456. doi: 10.1111/jcmm. 12033) бета-катенин (β-катенин) представляет собой многофункциональный белок, который играет важную роль в физиологическом гомеостазе. Он действует и как регулятор транскрипции, и как белок-адаптер для внутриклеточной адгезии, β-катенин необходим для создания и поддержания эпителиальных слоев и он обеспечивает связь между внутриклеточными соединениями и белками цитоскелета. β-катенин регулируется сигнализацией Wnt. В отсутствии передаваемой в прямом направлении сигнализации Wnt β-катенин фосфорилируется, что приводит к его убиквитинизации и в конце концов к расщеплению белка. Согласно различным литературным данным существует связь β-катенина со злокачественной трансформацией здоровых клеток. Например, сигнализация Wnt и ядерная локализация β-катенина ассоциированы с дифференцировкой гепатоцитов в опухолевый фенотип. Аналогично этому, в эпителии легких и клетках поджелудочной железы активации β-катенина достаточно для индукции онкогенной трансформации. В дополнение к способности выступать в качестве движущей силы злокачественной трансформации, аномальная экспрессия и локализация β-катенина ассоциированы с повышенным метастатическим потенциалом. В последние годы установлено, что передача сигналов β-катенина предупреждает Т-клеточную инфильтрацию и противоопухолевый иммунитет, что сильно ограничивает потенциальные эффекты иммунотерапии. Поскольку β-катенин играет важную и вредную роль в туморогенезе, он рассматривается в качестве возможной мишени лекарственных средств.

10. Активаторы STING-пути

В следующем предпочтительном варианте предлагаемой в изобретении содержащей РНК композиции по меньшей мере одна РНК, предпочтительно мРНК, кодирует по меньшей мере один активатор пути STING (стимулятора генов интерферонов) или его фрагмент или вариант. Предпочтительно РНК, кодирующая по меньшей мере один активатор (стимулятор) пути STING, кодирует активирующий белок или конститутивно активный белок пути STING, предпочтительно DDX41, STING, cGAS, IRF3, ТВК1 или STAT6 или его фрагмент или вариант.

Согласно данным, представленным в обзорах Woo с соавторами (Woo S.R., Corrales L., Gajewski T.F. The STING pathway and the T cell-inflamed tumor microenvironment. Trends Immunol., 7 марта 2015 г., pii: S 1471-4906(15)00019-8. doi: 10.1016/j.it.2015.02.003) и Dubensky с соавторами (Dubensky T.W. Jr, Kanne D.B., Leong M.L. Rationale, progress and development of vaccines utilizing STING-activating cyclic dinucleotide adjvants. Ther Adv Vaccines. 1(4), ноябрь 2013 г., cc. 131-143. doi: 10.1177/2051013613501988), так называемый путь STING (STING стимулятор генов интерферонов) ответствен за восприятие цитоплазматической ДНК и индукцию провоспалительных медиаторов. После связывания ДНК в цитоплазме STING активирует передачу сигналов через ось TANK-связывающая киназа 1 (TBK-1)/IRF-3, что приводит к производству IFN-β. Установлено, что этот путь играет важную роль в восприятии ДНК вирусов, а также в некоторых аутоиммунных нарушениях. Согласно полученным в последние годы данным путь STING совершенно необходим для индукции спонтанного Т-клеточного примирования против опухолевых антигенов in vivo. ДНК опухолей обнаружена в инфильтрующих опухоль DC, что приводит к производству IFN-β и Т-клеточной активации. Так, внутриопухолевое введение низкомолекулярных агонистов пути STING продемонстрировало их эффективность на несущих опухоли животных. Агонисты пути STING, изученные в качестве адъювантных вакцин, обладали активностью в отношении индукции клеточного и гуморального иммунитета у вакцинированных хозяев.

11. Модуляторы контрольных «точек»

В следующем предпочтительном варианте предлагаемой в изобретении содержащей РНК композиции по меньшей мере одна РНК, предпочтительно мРНК, кодирует по меньшей мере один модулятор контрольных «точек» или его фрагмент или вариант.

Известны поверхностные молекулы отрицательной регуляции Т-клеток, для которых характерна повышающая регуляция в активированных Т-клетках для ослабления их активности, что приводит к менее эффективному уничтожению опухолевых клеток. Эти ингибирующие молекулы обозначают как отрицательные костимуляторные молекулы из-за их гомологии в Т-клеточной костимуляторной молекулой CD28. Эти белки, которые обозначают также как белки иммунных контрольных «точек», функционируют во многих путях, включая ослабление сигналов ранней активации, конкуренцию с позитивной костимуляцией и непосредственное ингибирование антигенпрезентирующих клеток (Bour-Jordan и др., Immunol Rev. 241(1), 2011, сс. 180-205).

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения модулятор контрольных «точек» представляет собой модулятор B7-1/CD80, В7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, В7-Н2, В7-Н3, В7-Н4, В7-Н6, B7-H7/HHLA2, BTLA, CD28, CD28H/IGPR-1, CTLA-4, ICOS, PD-1, PD-L2/B7-DC, PDCD6, VISTA/B7-H5/PD-1H, BTN1A1/бутирофилина, BTN2A1, BTN2A2/бутировафилина 2А2, BTN3A1/2, BTN3A2, BTN3A3, BTNL2/бутировафилин-подобного 2, BTNL3, BTNL4, BTNL6, BTNL8, BTNL9, BTNL10, CD277/BTN3A1, LAIR1, LAIR2, CD96, CD155/PVR, CRTAM, DNAM-1/CD226, нектина-2/CD112, нектина-3, TIGIT, LILRA3/CD85e, LILRA4/CD85g/ILT7, LILRB1/CD85j/ILT2, LILRB2/CD85d/ILT4, LILRB3/CD85a/ILT5, LILRB4/CD85k/ILT3, 4-1BB/TNFRSF9/CD137, лиганда 4-1BB /TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFFR/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, лиганда CD27/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, лиганда CD30/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, лиганда CD40/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, лиганда GITR/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, лимфотоксина-альфа/TNF-бета, OX40/TNFRSF4, лиганда ОХ40/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-альфа, TNF RII/TNFRSF1B, 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6, SLAM/CD150, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-3, TIM-4, CD7, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, CRTAM, DAP12, дектина-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, интегрина альфа 4 бета 1, интегрина альфа 4 бета 7/LPAM-1, LAG-3, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP R или любой их комбинации.

В контексте настоящего изобретения под модулятором контрольных «точек» подразумевают молекулу, предпочтительно белок, например, антитело, доминантно-негативный рецептор, рецептор-ловушку или их лиганд или фрагмент, или вариант, который модулирует функцию белка иммунной контрольной «точки», например, ингибирует или снижает активность ингибиторов контрольных «точек» (или ингибирующих контрольные «точки» молекул) или стимулирует активность стимуляторов контрольных «точек» (или стимулирующих контрольные «точки» молекул). Таким образом, модуляторы контрольных «точек», указанные в настоящем описании, влияют на активность молекул контрольных «точек».

В этом контексте под ингибирующими контрольные «точки» молекулами подразумеваются ингибиторы контрольных «точек», и эти понятия можно использовать в качестве синонимов. Кроме того, под стимулирующими контрольные «точки» молекулами подразумеваются стимуляторы контрольных «точек», и эти понятия можно использовать в качестве синонимов.

Предпочтительными ингибирующими контрольные «точки» молекулами, которые можно ингибировать с помощью модулятора контрольных «точек», в контексте настоящего изобретения являются PD-1, PD-L1, CTLA-4, PD-L2, LAG3, TIM3/HAVCR2, 2В4, A2aR, В7Н3, В7Н4, BTLA, CD30, CD160, GAL9, HVEM, IDO1, IDO2, KIR, LAIR1 и VISTA.

Предпочтительными стимулирующими контрольные «точки» молекулами, которые можно стимулировать с помощью модулятора контрольных «точек», в контексте настоящего изобретения являются CD2, CD27, CD28, CD40, CD137, CD226, CD276, GITR, ICOS, ОХ-40 и CD70.

Предпочтительно модулятор контрольных «точек» выбирают из агонистических антител, антагонистических антител, лигандов, доминантно-негативных рецепторов и рецепторов-ловушек или их комбинаций.

Методы создания и применения кодируемых мРНК антител известны в данной области (см., например, WO 2008/083949).

Предпочтительно агонистические антитела выбирают из следующего перечня: антитело к 4-1 ВВ, антитело к ОХ40, антитело к GITR, антитело к CD28, антитело к CD27, антитело к CD-40, антитело к ICOS, антитело к TNFRSF25 и антитело к LIGHT.

ОХ40 является представителем суперсемейства рецепторов TNFR, и он экспрессируется на поверхности активируемых антигеном CD4⁺- и CD8⁺ - T-лимфоцитов млекопитающих. Лиганд ОХ40 (OX40L, который обозначают также как gp34, ACT-4-L и CD252) представляет собой белок, который специфически взаимодействует с ОХ40-рецептором. Под понятие OX40L подпадает полный лиганд ОХ40, растворимый лиганд ОХ40 и слитые белки, содержащие функционально активную область лиганда ОХ40, ковалентно связанную со вторым сегментом, например, белковым доменом. Под определение OX40L подпадают также варианты, которые по аминокислотной последовательности отличаются от встречающегося в естественных условиях OX4L, но которые сохраняют способность специфически связываться с ОХ40-рецептором. Кроме того, под определение OX40L подпадают варианты, которые повышают биологическую активность ОХ40. Агонист ОХ40 представляет собой молекулу, которая индуцирует или усиливает биологическую активность ОХ40, например, трансдукцию сигнала, опосредуемого ОХ40. Агонист ОХ40 предпочтительно в контексте настоящего описания рассматривается как связывающая молекула, обладающая способностью специфически связываться с ОХ40. Таким образом, агонист ОХ40 может представлять собой любой агонист, связывающийся с ОХ40 и обладающий способностью стимулировать передачу сигналов ОХ40. В этом контексте агонист ОХ40 может представлять собой агонистическое антитело, которое связывается с ОХ40.

Агонисты ОХ40 и моноклональные антитела к ОХ40 описаны в WO 1995/021251, WO 1995/012673 и WO 1995/21915. Особенно предпочтительным является антитело к ОХ40 9В12, мышиное моноклональное антитело к ОХ40, направленное против внеклеточного домена человеческого ОХ40 (Weinberg и др., J. Immunother. 29(6), 2006, сс. 575-585).

Предпочтительно антагонистическое антитело выбирают из перечня, включающего антитело к CTLA4, антитело к PD1, антитело к PD-L1, антитело к Vista, антитело к Tim-3, антитело к LAG-3 и антитело к BTLA.

Антиген-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA-4) экспрессируется главным образом во внутриклеточном компартменте Т-клеток. После воздействия эффективного или продолжительного стимула на наивную Т-клетку через Т-клеточный рецептор (TCR) CTLA-4 транспортируется к клеточной поверхности и концентрируется на иммунологическом синапсе. После этого CTLA-4 конкурирует с CD28 за CD80/CD86 и осуществляет понижающую модуляцию передачи сигналов TCR, воздействуя на передачу сигналов Akt. Таким образом, CTLA-4 функционирует физиологически в качестве гасителя сигнала (Weber J., Semin. Oncol. 37(5), 2010, сс. 430-439).

Наиболее предпочтительными антителами к CTLA-4 являются ипилимумаб (Yervoy®), тремелимумаб и AGEN-1884.

Представителями пути PD-1 являются все белки, которые ассоциированы с передачей сигналов PD-1. С одной стороны, они могут представлять собой белки, которые индуцируют передачу сигналов PD-1 в обратном направлении относительно PD-1, как, например, лиганды PD-1 PD-L1 и PD-L2 и участвующий в трансдукции сигналов рецептор PD-1. С другой стороны, они могут представлять собой белки, трансдуцирующие сигнал в прямом направлении относительно рецептора PD-1. Особенно предпочтительными в качестве представителей пути PD-1 в контексте настоящего изобретения являются PD-1, PD-L1 и PD-L2.

В контексте настоящего изобретения под антагонистом пути PD-1 предпочтительно подразумевается соединение, обладающее способностью нарушать путь передачи сигналов PD-1, предпочтительно передачу сигналов, опосредуемую рецептором PD-1. Таким образом, антагонист пути PD-1 может представлять собой любой антагонист, направленный против представителя пути PD-1, который обладает способностью оказывать антагонистическое воздействие на путь передачи сигналов PD-1. В этом контексте антагонист может представлять собой антагонистическое антитело, указанное в настоящем описании, мишенью которого является любой представитель пути PD-1, предпочтительно направленное против рецептора PD-1, PD-L1 или PD-L2. Указанное антагонистическое антитело может кодироваться также нуклеиновой кислотой. Кроме того, антагонист пути PD-1 может представлять собой фрагмент рецептора PD-1, который блокирует активность лигандов PD1. В7-1 или его фрагменты могут действовать также в качестве лигандов-антагонистов PD1. Кроме того, антагонист пути PD-1 может представлять собой белок, содержащий аминокислотную последовательность (или кодирующую ее нуклеиновую кислоту), обладающую способностью связываться с PD-1, но препятствующую передаче сигналов PD-1, например, путем ингибирования взаимодействия между PD-1 и В7-Н1 или B7-DL (WO 2014/127917).

Особенно предпочтительными являются антитела к PD1 ниволумаб (MDX-1106/BMS-936558/ONO-4538), (Brahmer и др., J Clin Oncol. 28(19), 2010, сс. 3167-3175; PMID: 20516446); пидилизумаб (СТ-011), (Berger и др., Clin Cancer Res. 14(10), 2008, сс. 3044-3051; PMID: 18483370); и MK-3475 (SCH 900475).

Особенно предпочтительными являются антитела к PD-L1 MDX-1105/BMS-936559 (Brahmer и др., N Engl J Med. 366(26), 2012, сс. 2455-2465; PMID: 22658128); атезолизумаб (MPDL3280A/RG7446); дурвалумаб (MEDI4736) и авелумаб (MSB0010718).

Согласно настоящему изобретению по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции, предлагаемой в изобретении, кодирует по меньшей мере одно антитело или его фрагменты или варианты, указанные в таблице 10. Особенно предпочтительно содержащая РНК композиция содержит по меньшей мере одну РНК, которая кодирует тяжелую цепь конкретного антитела или ее фрагменты или варианты, и по меньшей мере одну дополнительную РНК, которая кодирует легкую цепь этого же конкретного антитела или ее фрагменты или варианты.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения модулятор контрольных «точек» представляет собой рецептор-ловушку (например, растворимый рецептор). Предпочтительно рецептор-ловушка представляет собой растворимый рецептор PD-1. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции, предлагаемой в изобретении, содержит последовательность РНК, которая идентична (полностью) или по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентична последовательности РНК SEQ ID NO: 389, кодирующей растворимый рецептор PD-1.

В дополнительном предпочтительном варианте предлагаемой в изобретении композиции, содержащей РНК, РНК, предпочтительно мРНК, кодирует по меньшей мере один лиганд, который функционирует в качестве модулятора контрольной «точки». Предпочтительно лиганд представляет собой лиганд CD40 (CD40L). В другом предпочтительном варианте предлагаемой в изобретении композиции, содержащей РНК, РНК, предпочтительно мРНК, кодирует по меньшей мере один лиганд, который функционирует в качестве модулятора контрольной «точки». Предпочтительно лиганд представляет собой лиганд CD40 (CD40L). Наиболее предпочтительно по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции, предлагаемой в изобретении, содержит последовательность РНК, которая идентична (полностью) или по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентична последовательности РНК SEQ ID NO: 10073, кодирующей CD40L.

12. Активаторы врожденного иммунитета:

В этом контексте активаторы врожденного иммунитета можно выбирать из адъювантных белков млекопитающих, прежде всего человека, которые, как правило, содержат любой человеческий белок или пептид, который обладает способностью вызывать врожденный иммунный ответ (у млекопитающего), например, в виде реакции связывания экзогенного лиганда TLR с TLR. Более предпочтительно человеческие адъювантные белки выбирают из группы, состоящей из белков, которые являются компонентами и лигандами сигнальных сетей паттерн-распознающих рецепторов, которые включают TLR, NLR и RLH, включая TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11; NOD1, NOD2, NOD3, NOD4, NOD5, NALP1, NALP2, NALP3, NALP4, NALP5, NALP6, NALP6, NALP7, NALP7, NALP8, NALP9, NALP10, NALP11, NALP12, NALP13, NALP14,1 IPAF, NAIP, CIITA, RIG-I, MDA5 и LGP2, сигнальные трансдукторы передачи сигналов TLR, включая адаптерные белки, такие, например, как Trif и Cardif; компоненты передачи сигналов малых ГТФаз (RhoA, Ras, Racl, Cdc42, Rab и т.д.), компоненты передачи сигналов PIP (PI3K, Src-киназы и т.д.), компоненты MyD88-зависимой передачи сигналов (MyD88, IRAK1, IRAK2, IRAK4, TIRAP, TRAF6 и т.д.), компоненты независимой от MyD88 передачи сигналов (TICAM1, TICAM2, TRAF6, ТВК1, IRF3, ТАК1, IRAK1 и т.д.); активирующие киназы, включая, например, Akt, MEKK1, MKK1, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, ERK1, ERK2, GSK3, PKC-киназы, PKD-киназы, GSK3-киназы, JNK, p38MAPK, TAK1, IKK, и TAK1; активирующие факторы транскрипции, включая, например, NF-κВ, c-Fos, c-Jun, с-Мус, CREB, АР-1, Elk-1, ATF2, IRF-3, IRF-7.

Адъювантные белки млекопитающих, прежде всего человека, можно выбирать также из группы, состоящей из белков теплового шока, таких как HSP10, HSP60, HSP65, HSP70, HSP75 и HSP90, gp96, фибриногена, повтора экстра-домена А типа III фибронектина; или компоненты системы комплемента, включая C1q, MBL, C1r, C1s, C2b, Bb, D, MASP-1, MASP-2, C4b, C3b, C5a, C3a, C4a, C5b, C6, C7, C8, C9, CR1, CR2, CR3, CR4, C1qR, C1INH, C4bp, MCP, DAF, H, I, P и CD59, или компоненты, индуцирующие гены-мишени, включая, например, бета-дефензин, белки клеточной поверхности; или человеческие адъювантные белки, включая trif, лиганд fit-3, Gp96 или фибронектин и т.д. или гомолог любого из указанных выше человеческих адъювантных белков из других видов. Кроме того, в качестве адъювантного белка можно использовать HGMB1.

Адъювантные белки млекопитающих, прежде всего человека, могут содержать также цитокины, которые индуцируют или усиливают врожденный иммунный ответ, включая IL-1 альфа, IL1 бета, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-23, ТNFальфа, IFNальфа, IFNбета, IFNгамма, GM-CSF, G-CSF, M-CSF; хемокины, включая IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1альфа, RANTES, эотаксин, CCL21; цитокины, которые высвобождаются из макрофагов, включая IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 и TNF-альфа; а также s IL-1R1 и IL-1 альфа.

Таким образом, в этом контексте особенно предпочтительно, чтобы по меньшей мере одна РНК кодировала по меньшей мере один активатор врожденного иммунного ответа, предпочтительно адъювантный белок, более предпочтительно человеческий адъювантный белок или его фрагмент или вариант.

В этом контексте особенно предпочтительно, чтобы конститутивно активный вариант адъювантного белка кодировался по меньшей мере одной РНК, предпочтительно конститутивно активным вариантом RIG-1 (ΔRIGI).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК кодирует HGMB1 в качестве активатора врожденного иммунитета или его фрагмент или вариант.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения активаторы врожденного иммунитета можно выбирать из любого активатора врожденного иммунитета, выбранного из группы, включающей следующие агенты: CD55; Akt; ATF2; C1QBP; C1QC; Cardif; CCL11; CCL2; CCL21; CCL3; CCL5; CD59, бета-дефенсин; Cdc42; CFAD; CFAH; CFAI; CH60; CIITA; c-Jun; c-myc; CO8A; CO8B; CO8G;

компонент_системы_комплемента_C1INH;

компонент_системы_комплемента_C1qR;

компонент_системы_комплемента_C1s;

компонент_системы_комплемента_C4bp; компонент_системы_комплемента_С6;

компонент_системы_комплемента_С7; компонент_системы_комплемента_С8;

компонент_системы_комплемента_С9; компонент_системы_комплемента_CR2;

компонент_системы_комплемента_CR3;

компонент_системы_комплемента_MASP-1;

компонент_системы_комплемента_MASP-2;

компонент_системы_комплемента_MBL;

компонент_системы_комплемента_МСР; CREB3; CREB3L1; CREB3L3; CREB3L4; CREB5; CRTC2; CXCL10; CXCL8; DJB11; DJB13; DJB14; DJC10; DJC12; DJC14; DJC15; DJC16; DJC17; DJC18; DJC22; DJC24; DJC25; DJC27; DJC28; DJC30; DNAJB12; DNAJC11; DNAJC21; DNJA1; DNJA2; DNJA3; DNJA4; DNJB1; DNJB2; DNJB3; DNJB4; DNJB5; DNJB6; DNJB7; DNJB8; DNJB9; DNJC1; DNJC2; DNJC3; DNJC4; DNJC5; DNJC7; DNJC8; DNJC9; Elk-1; ERK1; ERK2; фибриноген; фибронектин; FLT3_лиганд; FOS; G-CSF; GM-CSF; GRP94_(gp96); GSK3A; GSK3B; HS71A; HS71B; HSC70; HSP10; HSP60; HSP70; HSP75; HSP90; HSP90B1; IFNальфа; IFNB; IFNG; IKK; IL-1; IL-1_альфа; 1b-1_бета; IL-12; IL-13; IL-15; IL-16; IL-17A; IL-18; IL-1R1; IL-2; IL-21; IL-23; IL-6; IL-7; IL-9; IRAK1; IRAK2; IRAK4; IRF3; IRF-7; JNK; KPCB; KPCD; KPCD1; KPCD3; КРСЕ; KPCG; KPCI; KPCL; КРСТ; KPCZ; 1_IPAF; LGP2; M-CSF; MDA5; MK11; MK12; MK13; MK14; MKK1; MKK3; MKK4; MKK6; MKK7; MSTP104; MyD88; NALP10; NALP11; NALP12; NALP13; NALP2; NALP3; NALP4; NALP5; NALP6; NALP7; NALP8; NALP9; NF-каппаВ; NLRP14; NOD1; NOD2; NOD3; PI3K; PKD2; PKN1; PKN2; PKN3; PRKCA; PRKD2; Rab; Rac1; RASH; RASK; RASN; RhoA; RIG-I; Src-киназы; сурфактант_белок_А; сурфактант_белок_D; TAK1; TBK1; TICAM1; TICAM2; TIRAP; TLR1; TLR10; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TRAF6, которые предпочтительно указаны в таблице 11. В этом контексте особенно предпочтительными являются последовательности РНК, кодирующие активатор врожденного иммунитета, указанный в таблице 11.

Согласно настоящему изобретению в более предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении композиция содержит по меньшей мере одну РНК, предпочтительно мРНК, содержащую по меньшей мере одну кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один активатор врожденного иммунитета или его фрагмент или вариант, где по меньшей мере одна кодирующая область содержит последовательность РНК, которая идентична (полностью) или по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентична последовательностям РНК, указанным в SEQ ID NO: в таблице 11.

13. Антитела, рецепторы-ловушки и доминантно-негативные рецепторы:

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в предлагаемой в изобретении содержащей РНК композиции кодирует по меньшей мере одно антитело и/или по меньшей мере один доминантно-негативный рецептор, и/или по меньшей мере один рецептор-ловушку или его фрагмент или вариант, которое/который модулирует (например, ингибирует) функциональную активность белка или пути передачи сигналов, которая ассоциирована с развитием опухоли или рака. Особенно предпочтительно, чтобы содержащая РНК композиция содержала по меньшей мере одну РНК, кодирующую тяжелую цепь конкретного антитела или ее фрагменты или варианты, и по меньшей мере одну дополнительную РНК, кодирующую легкую цепь конкретного антитела или ее фрагменты или варианты.

Особенно предпочтительными в этом контексте являются антитела, указанные в таблице 12.

Предпочтительно нейтрализующее антитело выбирают из перечня, включающего антитело к IL-10 и антитело к ТGFбета.

Кроме того, по меньшей мере одно антитело можно предпочтительно выбирать из антител к CD73 или их фрагментов или вариантов.

В дополнительном особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одно антитело выбирают из антитела, направленного против CCR5/CD195, или из антитела, направленного против него лиганда CCL5/RANTES.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения рецептор-ловушка представляет собой растворимый CCR5 (хемокининовый рецептор типа 5, известный также как CD195).

В другом особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения доминантно-негативный рецептор представляет собой доминантно-ненативный CCR5 (хемокиновый рецептор типа 5, известный также как CD195).

Кроме того, по меньшей мере одно антитело можно предпочтительно выбирать из антител к CD73 или их фрагментов или вариантов.

14. Ингибиторы супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC):

Супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC) представляют собой гетерогенную популяцию незрелых миелоидных клеток, уровень которых возрастает при раке и родственных нарушениях. MDSC индуцируются секретируемыми опухолью факторами роста. MDSC вносят важный вклад в подавление иммунных ответов хозяина посредством нескольких механизмов. Кроме того, MDSC могут также принимать участие в ангиогенезе и инвазии опухолей. Поэтому ингибирование MDSC представляет собой стратегию лечения рака и родственных нарушений.

В контексте изобретения ингибирования MDSC можно достигать путем непосредственной деактивации MDSC (например, антителами к IL-17), путем блокады дифференцировки MDSC в зрелые клетки (например, с помощью IL-12), путем блокады клеточного развития MDSC или путем истощения MDSC (например, с помощью цитотоксических агентов).

Таким образом, особенно предпочтительно применять в качестве ингибиторов MDSC антитела к IL-17 и IL-12.

15. Ингибиторы пути IDO

В другом предпочтительном варианте предлагаемой в изобретении содержащей РНК композиции, РНК, предпочтительно мРНК, кодирует по меньшей мере один ингибитор пути IDO. Предпочтительно РНК, кодирующая по меньшей мере один ингибитор пути IDO, кодирует ингибирующий белок или доминантно-негативный мутантный белок пути IDO.

Согласно данным, обобщенным у Prendergast с соавторами (Prendergast G.C., Smith С., Thomas S., Mandik-Nayak L., Laury-Kleintop L., Metz R., Muller A.J., Indoleamine 2,3-dioxygenase pathways of pathogenic inflammation and immune escape in cancer. Cancer Immunol. Immunother. 63(7), июль 2014 г., cc. 721-735) индолеаминпиррол-2,3-диоксигеназа (IDO или INDO, КФ 1.13.11.52) представляет собой фермент, который у человека кодируется геном IDO1. Этот фермент катализирует расщепление незаменимой аминокислоты L-триптофана с образованием N-формилкинуренина. IDO является первым и скорость-лимитирующим ферментом катаболизма триптофана через путь кинуренина, что приводит к истощению триптофана, которое может вызывать остановку роста микробов, а также Т-клеток. IDO представляет собой иммуномодулирующий фермент, продуцируемый некоторыми альтернативно активируемыми макрофагами и другими иммунорегуляторными клетками (применяемыми также в виде стратегии ускользания от иммунного распознавания многими опухолями). Клиническое исследование ингибиторов IDO может привести к получению нового класса иммуномодуляторов с широким спектром применения для лечения запущенных опухолей у человека.

16. Белки и пептиды, которые связывают ингибиторы апоптоза

Апоптоз представляет собой строго регулируемый клеточный процесс и нарушение регуляции апоптоза является отличительный признаком различных видов рака у человека. Направленное воздействие на ключевые регуляторы апоптоза с целью восстановления апоптоза в опухолевых клетках развивается в качестве новой стратегии терапии рака. XIAP, cIAP1 и с1АР2, представители ингибиторов белков апоптоза (IAP), являются имеющими решающее значение регуляторами гибели и выживания клеток и представляют собой привлекательные мишени для новой противораковой терапии. Белок SMAC/DIABLO представляет собой эндогенный антагонист XIAP, cIAP1 и с1АР2. В последнее десятилетие интенсивные исследования привели к созданию и разработке нескольких низкомолекулярных миметиков SMAC, которые в настоящее время проходят клинические испытания в качестве агентов для лечения рака.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении композиция содержит по меньшей мере одну РНК, содержащую по меньшей мере одну кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один пептид или белок, связывающийся с ингибиторами белков апоптоза (IAP), и таким образом повышают подверженность раковых клеток к смерти в результате апоптоза.

Таким образом, особенно предпочтительно, чтобы по меньшей мере одна РНК в предлагаемой в изобретении содержащей РНК композиции кодировала по меньшей мере один белок или пептид, который связывается с ингибиторами апоптоза, такой как миметики SMAC.

Особенно предпочтительные белки или пептиды, которые связывают IAP, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат Omi/HtrA2, Smac, полученные из Smac пептиды, Smac/DIABLO и XAF1 (XIAP-ассоциированный фактор 1) и их фрагменты или варианты.

Модификации РНК

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в композиции, кодирующая по меньшей мере один из белков и/или пептидов, указанных в настоящем описании, может находиться в форме модифицированной РНК, при этом любая модификация, указанная в настоящем описании, может быть интродуцирована по меньшей мере в одну РНК в композиции. Указанные в настоящем описании модификации предпочтительно приводят к стабилизации по меньшей мере одной РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении.

Таким образом, согласно одному варианту осуществления изобретения по меньшей мере одну РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, можно получать в виде «стабилизированной РНК», т.е. в виде РНК, которая является в значительной степени устойчивой к расщеплению in vivo (например, экзо- или эндонуклеазой). Указанную стабилизацию можно осуществлять, например, путем модификации фосфатного каркаса по меньшей мере одной РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении. Модификация каркаса в контексте настоящего изобретения представляет собой модификацию, при которой фосфаты каркаса нуклеотидов, входящих в РНК, модифицируют химически. Нуклеотиды, которые можно предпочтительно применять в этой связи, содержат, например, модифицированный фосфоротиоатом фосфатный каркас, при этом предпочтительно по меньшей мере один из атомов кислорода фосфата, входящий в фосфатный каркас, заменяют на атом серы. Стабилизированные РНК могут дополнительно включать, например: неионные фосфатные аналоги, такие, например, как алкил- и арилфосфонаты, в которых заряженный кислород фосфоната заменен на алкильную или арильную группу, или сложные фосфодиэфиры и акилфосфотриэфиры, в которых заряженный кислородный остаток присутствует в алкилированной форме. Указанные модификации каркаса, как правило, включают (но, не ограничиваясь только ими) модификации, выбранные из группы, которая состоит из метилфосфонатов, фосфорамидатов и фосфоротиоатов (например, цитидин-5'-O-(1-тиофосфат)).

Ниже описаны конкретные модификации, которые предпочтительно могут «стабилизировать» по меньшей мере одну РНК, указанную в настоящем описании.

Химические модификации:

В контексте настоящего описания понятие «модификация РНК» может относиться к химическим модификациям, включающим модификации каркаса, а также модификации Сахаров или модификации оснований.

В этом контексте модифицированная РНК, указанная в настоящем описании, может содержать нуклеотидные аналоги/модификации, например, модификации каркаса, модификации сахаров или модификации оснований. Модификация каркаса в контексте настоящего изобретения представляет собой модификацию, при которой химически модифицируют фосфаты каркаса нуклеотидов, входящих в РНК, указанную в настоящем описании. Модификация сахаров в контексте настоящего изобретения представляет собой химическую модификацию сахара в нуклеотидах РНК, указанной в настоящем описании. Кроме того, модификация оснований в контексте настоящего изобретения представляет собой химическую модификацию основного фрагмента в нуклеотидах РНК. В этом контексте нуклеотидные аналоги или модификации предпочтительно выбирают из нуклеотидных аналогов, которые можно применять для транскрипции и/или трансляции.

Модификации сахаров:

Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды, которые можно включать в модифицированную РНК, представленную в настоящем описании, можно модифицировать в сахарном фрагменте. Например, 2'-гидроксильную группу (ОН) можно модифицировать или заменять рядом различных «окси»- или «дезокси»-заместителей. Примеры «окси»-модификаций 2'-гидроксильной группы включают (но, не ограничиваясь только ими) алкоксигруппу или арилоксигруппу (-OR, например, R обозначает Н, алкил, циклоалкил, арил, аралкил, гетероарил или сахар); полиэтиленгликоли (ПЭГ),-O(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂OR; «закрытые» нуклеиновые кислоты (ЗНК), в которых 2'-гидроксил соединен, например, с помощью метиленового мостика, с 4'-углеродом этого же сахара рибозы; и аминогруппы (-О-амино, в которых аминогруппа, например, NRR, может представлять собой алкиламиногруппу, диалкиламиногруппу, гетероциклил, ариламиногруппу, диариламиногруппу, гетероариламиногруппу или дигетероариламиногруппу, этилендиамин, полиаминогруппу) или аминоалкоксигруппу.

«Дезокси»-модификации включают водород, аминогруппу (например, NH₂; алкиламиногруппу, диалкиламиногруппу, гетероциклил, ариламиногруппу, диариламиногруппу, гетероариламиногруппу, дигетероариламиногруппу или аминокислоту); или аминогруппа может быть присоединена к сахару через линкер, где линкер содержит один или несколько атомов С, N и О.

Сахарный фрагмент может содержать также один или несколько атомов углерода в противоположной стереохимической конфигурации относительно той, в которой соответствующий атом углерода находится в рибозе. Таким образом, модифицированная РНК может включать нуклеотиды, содержащие, например, арабинозу в качестве сахара.

Модификации каркаса:

Можно также модифицировать фосфатный каркас в модифицированных нуклеозидах и нуклеотидах, которые можно включать в модифицированную РНК, представленную в настоящем описании. Фосфатные группы каркаса можно модифицировать путем замены одного или нескольких атомов кислорода на другой заместитель. Кроме того, модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды могут включать полную замену немодифицированного фосфатного фрагмента на модифицированный фосфат, указанный в настоящем описании. Примеры модифицированных фосфатных групп включают (но, не ограничиваясь только ими) фосфоротиоат, фосфороселенаты, боранофосфаты, сложные эфиры боранофосфатов, кислые фосфонаты, фосфороамидаты, алкил- или арилфосфонаты и фосфотриэфиры. В фосфородитиоатах оба несвязанных кислорода замещены серой. Фосфатную связь можно модифицировать путем замены связанного кислорода на азот (связанные мостиком фосфороамидаты), серу (связанные мостиком фосфоротиоаты) и углерод (связанные мостиком метиленфосфонаты).

Модификации оснований:

Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды, которые можно включать в модифицированную РНК, представленную в настоящем описании, можно модифицировать также во включающем нуклеотидное основание фрагменте.

Примерами нуклеотидных оснований, встречающихся в РНК, являются (но, не ограничиваясь только ими) аденин, гуанин, цитозин и урацил. Например, нуклеозиды и нуклеотиды, указанные в настоящем описании, можно модифицировать химически на поверхности большой бороздки. В некоторых вариантах осуществления изобретения химические модификации большой бороздки могут включать аминогруппу, тиольную группу, алкильную группу или галогеновую группу.

В наиболее предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеотидные аналоги/модификации выбирают из модификаций оснований, которые предпочтительно выбирают из 2-амино-6-хлорпуринрибозид-5'-трифосфата, 2-аминопуринрибозид-5'-трифосфата, 2-аминоаденозин-5'-трифосфата, 2'-амино-2'-дезоксицитидинтрифосфата, 2-тиоцитидин-5'-трифосфата, 2-тиоуридин-5'-трифосфата, 2'-фтортимидин-5'-трифосфата, 2'-O-метилинозин5'-трифосфата, 4-тиоуридин-5'-трифосфата, 5-аминоаллилцитидин-5'-трифосфата, 5-аминоаллилуридин-5'-трифосфата, 5-бромцитидин-5'-трифосфата, 5-бромуридин-5'-трифосфата, 5-бром-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата, 5-бром-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата, 5-йодцитидин-5'-трифосфата, 5-йод-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата, 5-йодуридин-5'-трифосфата, 5-йод-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата, 5-метилцитидин-5'-трифосфата, 5-метилуридин-5'-трифосфата, 5-пропинил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата, 5-пропинил-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата, 6-азацитидин-5'-трифосфата, 6-азауридин-5'-трифосфата, 6-хлорпуринрибозид-5'-трифосфата, 7-деазааденозин-5'-трифосфата, 7-деазагуанозин5'-трифосфата, 8-азааденозин-5'-трифосфата, 8-азидоаденозин-5'-трифосфата, бензимидазолрибозид-5'-трифосфата, N1-метиладенозин-5'-трифосфата, N1-метилгуанозин-5'-трифосфата, N6-метиладенозин-5'-трифосфата, O6-метилгуанозин-5'-трифосфата, псевдоуридин-5'-трифосфата или пуромицин-5'-трифосфата, ксантозин-5'-трифосфата. Наиболее предпочтительные нуклеотиды для модификаций оснований выбирают из группы нуклеотидов с модифицированными основаниями, включающей 5-метилцитидин-5'-трифосфат, 7-деазагуанозин-5'-трифосфат, 5-бромцитидин-5'-трифосфат и псевдоуридин-5'-трифосфат.

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированные нуклеозиды включают пиридин-4-онрибонуклеозид, 5-азауридин, 2-тио-5-аза-уридин, 2-тиоуридин, 4-тиопсевдоуридин, 2-тиопсевдоуридин, 5-гидроксиуридин, 3-метилуридин, 5-карбоксиметилуридин, 1-карбоксиметилпсевдоуридин, 5-пропинилуридин, 1-пропинилпсевдоуридин, 5-тауринометилуридин, 1-тауринометилпсевдоуридин, 5-тауринометил-2-тиоуридин, 1-тауринометил-4-тиоуридин, 5-метилуридин, 1-метилпсевдоуридин, 4-тио-1-метилпсевдоуридин, 2-тио-1-метилпсевдоуридин, 1-метил-1-деазапсевдоуридин, 2-тио-1-метил-1-деазапсевдоуридин, дигидроуридин, дигидропсевдоуридин, 2-тиодигидроуридин, 2-тиодигидропсевдоуридин, 2-метоксиуридин, 2-метокси-4-тиоуридин, 4-метоксипсевдоуридин и 4-метокси-2-тиопсевдоуридин.

В некоторых вариантах осуществления модифицированные нуклеозиды включают 5-азацитидин, псевдоизоцитидин, 3-метилцитидин, N4-ацетилцитидин, 5-формилцитидин, N4-метилцитидин, 5-гидроксиметилцитидин, 1-метил-псевдоизоцитидин, пирролоцитидин, пирролопсевдоизоцитидин, 2-тиоцитидин, 2-тио-5-метилцитидин, 4-тиопсевдоизоцитидин, 4-тио-1-метилпсевдоизоцитидин, 4-тио-1-метил-1-деазапсевдоизоцитидин, 1-метил-1-деазапсевдоизоцитидин, зебуларин, 5-азазебуларин, 5-метилзебуларин, 5-аза-2-тиозебуларин, 2-тиозебуларин, 2-метоксицитидин, 2-метокси-5-метилцитидин, 4-метоксипсевдоизоцитидин и 4-метокси-1-метилпсевдоизоцитидин.

В других вариантах осуществления изобретения модифицированные нуклеозиды включают 2-аминопурин, 2,6-диаминопурин, 7-деазааденин, 7-деаза-8-азааденин, 7-деаза-2-аминопурин, 7-деаза-8-аза-2-аминопурин, 7-деаза-2,6-диаминопурин, 7-деаза-8-аза-2,6-диаминопурин, 1-метиладенозин, N6-метиладенозин, N6-изопентениладенозин, N6-(цис-гидроксиизопентенил)аденозин, 2-метилтио-N6-(цис-гидроксиизопентенил)аденозин, N6-глицинилкарбамоиладенозин, N6-треонилкарбамоиладенозин, 2-метилтио-N6-треонилкарбамоиладенозин, N6,N6-диметиладенозин, 7-метиладенин, 2-метилтиоаденин и 2-метоксиаденин.

В других вариантах осуществления изобретения модифицированные нуклеозиды включают инозин, 1-метилинозин, виозин, вибутозин, 7-деазагуанозин, 7-деаза-8-азагуанозин, 6-тиогуанозин, 6-тио-7-деазагуанозин, 6-тио-7-деаза-8-азагуанозин, 7-метилгуанозин, 6-тио-7-метилгуанозин, 7-метилинозин, 6-метоксигуанозин, 1-метилгуанозин, N2-метилгуанозин, N2,N2-диметилгуанозин, 8-оксогуанозин, 7-метил-8-оксогуанозин, 1-метил-6-тиогуанозин, N2-метил-6-тиогуанозин и N2,N2-диметил-6-тиогуанозин. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотид можно модифицировать на поверхности большой бороздки, и он может включать замену водорода на С-5 урацила на метильную группу или галогеновую группу.

В конкретных вариантах осуществления изобретения модифицированный нуклеозид представляет собой 5'-O-(1-тиофосфат)аденозин, 5'-O-(1-тиофосфат)цитидин, 5'-O-(1-тиофосфат)гуанозин, 5'-O-(1-тиофосфат)уридин или 5'-O-(1-тиофосфат)псевдоуридин.

В других конкретных вариантах осуществления модифицированная РНК может содержать модификации нуклеозидов, выбранные из 6-азацитидина, 2-тиоцитидина, α-тиоцитидина, псевдоизоцитидина, 5-аминоаллилуридина, 5-йодуридина, N1-метилпсевдоуридина, 5,6-дигидроуридина, α-тиоуридина, 4-тиоуридина, 6-азауридина, 5-гидроксиуридина, дезокситимидина, 5-метилуридина, пирролоцитидина, инозина, α-тиогуанозина, 6-метилгуанозина, 5-метилцитидина, 8-оксогуанозина, 7-деазагуанозина, N1-метиладенозина, 2-амино-6-хлорпурина, N6-метил-2-аминопурина, псевдоизоцитидина, 6-хлорпурина, N6-метиладенозина, α-тиоаденозина, 8-азидоаденозина, 7-деазааденозина.

Липидная модификация:

Согласно другому варианту осуществления изобретения модифицированная РНК, указанная в настоящем описании, может содержать липидную модификацию. Такая модифицированная липидами РНК, как правило, содержит указанную в настоящем описании РНК. Такая модифицированная липидами РНК, как правило, дополнительно содержит по меньшей мере один линкер, ковалентно связанный с РНК, и по меньшей мере один липид, ковалентно связанный с соответствующим линкером. Альтернативно этому, модифицированная липидами РНК содержит по меньшей мере одну РНК, указанную в настоящем описании, и по меньшей мере один (бифункциональный) липид, ковалентно связанный (без линкера) с указанной РНК. Согласно третьей альтернативе модифицированная липидами РНК содержит молекулу РНК, указанную в настоящем описании, по меньшей мере один линкер, ковалентно связанный с указанной РНК, и по меньшей мере один липид, ковалентно связанный с соответствующим линкером, и также по меньшей мере один (бифункциональный) липид, ковалентно связанный (без линкера) с указанной РНК. В этом контексте наиболее предпочтительно, чтобы липидная модификация присутствовала на концах линейной последовательности РНК.

Модификация содержания G/C:

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения модифицируют РНК в предлагаемой в изобретении композиции. Предпочтительно РНК стабилизируют путем модификации и предпочтительно повышения содержания G (гуанозин)/С (цитозин) в кодирующей области РНК. Таким образом, содержание G/C в кодирующей области РНК повышают по сравнению с содержанием G/C в кодирующей области ее конкретной кодирующей последовательности дикого типа, т.е. немодифицированной РНК. Однако кодируемая РНК аминокислотная последовательность предпочтительно является немодифицированной по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой конкретной РНК дикого типа/немодифицированной РНК.

Модификация содержания G/C в РНК в композиции, предлагаемой в изобретении, основана на том факте, что последовательности РНК, имеющие повышенное содержание G (гуанозин)/С (цитозин), являются более стабильными, чем последовательности, имеющие повышенное содержание А (аденозин)/и (урацил). Таким образом, кодоны кодирующей последовательности или полной РНК могут быть изменены по сравнению с кодирующей последовательностью или РНК дикого типа таким образом, чтобы они содержали большее количество G/C-нуклеотидов, с сохранением транслируемой аминокислотной последовательности. Учитывая тот факт, что несколько кодонов кодируют одну и ту же аминокислоту (так называемая вырожденность генетического кода), можно определять наиболее предпочтительные с точки зрения стабильности кодоны (так называемые альтернативные наиболее часто встречающиеся кодоны). В зависимости от аминокислоты, которая должна кодироваться по меньшей мере одной РНК, существуют различные возможности модификации последовательности РНК по сравнению с соответствующей кодирующей последовательностью дикого типа. В случае аминокислот, которые кодируются кодонами, содержащими исключительно нуклеотиды G или С, никакая модификация кодона не является необходимой. Так, кодоны Pro (ССС или CCG), Arg (CGC или CGG), Ala (GCC или GCG) и Gly (GGC или GGG) не нуждаются в модификации, поскольку в них не присутствует А или U. В противоположность этому, кодоны, которые содержат нуклеотиды А и/или U, можно модифицировать путем замены на другие кодоны, которые кодируют эти же аминокислоты, но не содержат А и/или U. Их примерами являются: кодоны CCU или ССА, кодирующие Pro, можно заменять на ССС или CCG; кодоны CGU или CGA или AGA или AGG, кодирующие Arg, можно заменять на CGC или CGG; кодоны GCU или GCA, кодирующие Ala, можно заменять на GCC или GCG; кодоны GGU или GGA, кодирующие Gly, можно заменять на GGC или GGG. В других случаях, когда нуклеотиды А или U нельзя элиминировать из кодонов, можно снижать содержание А и U с использованием кодонов, которые содержат нуклеотиды А и/или U в более низком количестве. Примерами указанных колонов являются: кодон UUU, кодирующий Phe, можно заменять на UUC; кодоны UUA, UUG, CUU или CUA, кодирующие Leu, можно заменять на CUC или CUG; кодоны UCU или UCA или AGU, кодирующие Ser, можно заменять на UCC, UCG или AGC; кодон UAU, кодирующий Tyr, можно заменять на UAC; кодон UGU, кодирующий Cys, можно заменять на UGC; кодон CAU, кодирующий His, можно заменять на САС; кодон САА, кодирующий Gln, можно заменять на CAG; кодоны AUU или AUA, кодирующие Ile, можно заменять на AUC; кодоны ACU или АСА, кодирующие Thr, можно заменять АСС или ACG; кодон AAU, кодирующий Asn, можно заменять на ААС; кодон AAA, кодирующий Lys, можно заменять на AAG; кодоны GUU или GUA, кодирующие Val, можно заменять на GUC или GUG; кодон GAU, кодирующий Asp, можно заменять на GAC; кодон GAA, кодирующий Glu, можно заменять на GAG; стоп-кодон UAA можно заменять на UAG или UGA. С другой стороны, в случае кодонов Met (AUG) и Trp (UGG), отсутствует возможность модификации последовательности. Перечисленные выше замены можно использовать либо индивидуально, либо в любых возможных комбинациях для повышения содержания G/C по меньшей мере в одной мРНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, по сравнению с конкретной мРНК дикого типа (т.е. исходной последовательностью). Так, например, все кодоны Thr, встречающиеся в последовательности дикого типа, можно модифицировать на АСС (или ACG). Однако предпочтительно, например, использовать комбинации указанных выше возможных замен:

замена всех кодонов, кодирующих Thr в исходной последовательности (мРНК дикого типа), на АСС (или ACG) и

замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Ser, на UCC (или UCG или AGC); замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Не, на AUC, и

замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Lys, на AAG, и

замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Tyr, на UAC; замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Val, на GUC (или GUG), и

замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Glu, на GAG, и

замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Ala, на GCC (или GCG), и

замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Arg, на CGC (или CGG); замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Val, на GUC (или GUG), и

замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Glu, на GAG, и

замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Ala, на GCC (или GCG), и

замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Gly, на GGC (или GGG), и

замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Asn, на ААС; замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Val, на GUC (или GUG),

замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Phe, на UUC, и

замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Cys, на UGC, и

замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Leu, на CUG (или CUC), и

замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Gln, на CAG, и

замена всех кодонов, кодирующих в исходной последовательности Pro, на ССС (или CCG) и т.д.

Предпочтительно содержание G/C в кодирующей области по меньшей мере одной РНК, предлагаемой в изобретении, повышают по меньшей мере на 7%, более предпочтительно по меньшей мере на 15%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 20%, по сравнению с содержанием G/C в кодирующей области РНК дикого типа. В конкретном варианте осуществления изобретения заменяют по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90%, 95% или даже 100% пригодных для замены кодонов в области, кодирующей белок или пептид, указанный в настоящем описании, или его фрагмент или вариант, или всю последовательность РНК дикого типа или кодирующую последовательность, повышая тем самым содержание G/C в указанной последовательности. В этом контексте наиболее предпочтительно повышать содержание G/C по меньшей мере в одной РНК в композиции, предлагаемой в изобретении, до максимума (т.е. до 100% пригодных для замещения кодонов), прежде всего в кодирующей области, по сравнению с последовательностью дикого типа.

Согласно изобретению дополнительная предпочтительная модификация кодирующей последовательности по меньшей мере одной РНК в композиции основана на открытии того факта, что эффективность трансляции определяется также различной частотой встречаемости тРНК в клетках. Таким образом, если по меньшей мере в одной кодирующей области по меньшей мере одной РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, присутствуют в повышенном количестве так называемые «редкие кодоны», то уровень трансляции соответствующей модифицированной по меньшей мере одной РНК является значимо более низким, чем в том случае, когда присутствуют кодоны, соответствующие относительно «часто встречающейся» тРНК. Согласно изобретению в модифицированной по меньшей мере одной РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, область, которая кодирует по меньшей мере один из указанных пептидов или белков, модифицируют по сравнению с соответствующей областью РНК дикого типа так, что по меньшей мере один кодон последовательности дикого типа, который соответствует тРНК, которая является относительно редкой в клетке, заменяют на кодон, который соответствует тРНК, которая относительно часто встречается в клетке и «несет» такую же аминокислоту, что и относительно редко встречающаяся тРНК. Посредством такой модификации последовательность по меньшей мере одной кодирующей области по меньшей мере одной РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, модифицируют таким образом, чтобы встраивать кодоны, для которых доступны часто встречающиеся тРНК. Другими словами, согласно изобретению с помощью такой модификации все кодоны последовательности дикого типа, которые соответствуют тРНК, являющейся относительно редкой в клетке, в каждом случае можно заменять на кодон, который соответствует тРНК, относительно часто встречающейся в клетке, и которая в каждом случае «несет» такую же аминокислоту, что и относительно редкая тРНК. тРНК, встречающиеся относительно часто в клетке, и наоборот, встречающиеся относительно редко, известны специалистам в данной области, см., например, Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev., 11(6), 2001, сс.660-666. Особенно предпочтительными являются кодоны, которые применяют для наиболее часто встречающейся тРНК конкретной аминокислоты, например кодон Gly, который использует тРНК, наиболее часто встречающуюся в (человеческой) клетке. Согласно изобретению наиболее предпочтительным является объединение повышения, предпочтительно до максимума, содержания G/C в последовательности модифицированной по меньшей мере одной РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, с «часто встречающимися» кодонами без модификации аминокислотой последовательности белка, кодируемого кодирующей областью РНК. Этот предпочтительный вариант осуществления изобретения позволяет наиболее эффективно транслировать и стабилизировать (модифицированную) по меньшей мере одну РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении.

Определение модифицированной по меньшей мере одной РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, описанной выше (повышенное содержание G/C; замена тРНК), можно осуществлять с использованием компьютерной программы, описанной в WO 02/098443, содержание которой включено в полном объеме в настоящее изобретение. С использованием указанной компьютерной программы нуклеотидную последовательность любой требуемой кодирующей РНК можно модифицировать с помощью генетического кода или его вырожденной природы так, чтобы получать максимальное содержание G/C, в сочетании с применением кодонов, которые соответствуют тРНК, встречающейся по возможности наиболее часто в клетке, аминокислотная последовательность, кодируемая модифицированной по меньшей мере одной РНК, предпочтительно не является модифицированной по сравнению с немодифицированной последовательностью. В альтернативном варианте можно также модифицировать только содержание G/C или только часто встречающиеся кодоны по сравнению с исходной последовательностью. Исходный код в Visual Basic 6.0 (используемая операционная среда разработки: Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0 с Servicepack 3) также описан в WO 02/098443. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения содержание A/U в окружении сайта связывания рибосом по меньшей мере одной РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, повышают по сравнению с содержанием A/U в окружении сайта связывания рибосом соответствующей ей РНК дикого типа. Указанная модификация (повышенное содержание A/U вокруг сайта связывания рибосом) повышает эффективность связывания рибосом по меньшей мере с одной РНК. Эффективность связывания рибосом с сайтом связывания рибосом (последовательность Козака: GCCGCCACCAUGG (SEQ ID NO: 10071), AUG образует стартовый кодон) в свою очередь влияет на эффективность трансляции по меньшей мере одной РНК. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одну РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, можно модифицировать в отношении потенциально дестабилизирующих элементов последовательности. В частности, кодирующую область и/или 5'- и/или 3'-нетранслируемую область указанной РНК можно модифицировать по сравнению с конкретной РНК дикого типа так, чтобы она не содержала дестабилизирующие элементы последовательности, при этом кодируемую аминокислотную последовательность модифицированной по меньшей мере одной РНК предпочтительно не изменяют по сравнению с соответствующей последовательностью РНК дикого типа. Известно, что, например, в последовательностях РНК эукариотических организмов присутствуют дестабилизирующие элементы последовательности (ДЭП), с которыми связываются сигнальные белки и регулируют ферментативное расщепление РНК in vivo. Следовательно, для дополнительной стабилизации по меньшей мере одной РНК можно осуществлять одну или несколько указанных модификаций, необязательно в области, которая кодирует белок или пептид, указанный в настоящем описании, по сравнению с соответствующей областью РНК дикого типа таким образом, чтобы полностью или в значительной степени удалять дестабилизирующие элементы последовательности. Согласно изобретению с использованием указанных модификаций по меньшей мере одной РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретению, можно также удалять ДЭП, присутствующие в нетранслируемых областях (3'-UTR и/или 5'-UTR). Указанные дестабилизирующие последовательности представляют собой, например, богатые AU последовательности (AURES), которые присутствуют в областях 3'-UTR многочисленных нестабильных РНК (Caput и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1986, cc. 1670-1674). Поэтому по меньшей мере одну РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, предпочтительно модифицируют по сравнению с РНК дикого типа, так, чтобы по меньшей мере одна РНК не содержала указанных дестабилизирующих последовательностей. Указанное также относится к тем мотивам последовательностей, которые распознаются возможными эндонуклеазами, например, к последовательности GAACAAG, которая присутствует в сегменте 3'-UTR гена, который кодирует рецептор трансферрина (Binder и др., EMBO J., 13, 1994, сс.1969-1980). Указанные мотивы последовательности также предпочтительно удаляют по меньшей мере из одной РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении.

Адаптация к человеческим часто встречающимся кодонам:

Согласно изобретению дополнительная предпочтительная модификация по меньшей мере одной РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, базируется на открытии того, что кодоны, кодирующиеся одну и ту же аминокислоту, встречаются с различной частотой. Согласно изобретению в модифицированной по меньшей мере одной РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, область, которая кодирует один из вышеуказанных пептидов или белков (кодирующая последовательность), предпочтительно модифицируют по сравнению с соответствующей областью РНК дикого типа так, чтобы частота кодонов, кодирующих одну и ту же аминокислоту, соответствовала встречающейся в естественных условиях частоте встречаемости кодона, часто встречающегося в человеческой кодирующей области, которые представлены в таблице 13.

Это означает, например, что в случае аминокислоты аланина (Ala), присутствующей в аминокислотной последовательности кодируемого белка, предлагаемого в изобретении, кодирующая последовательность дикого типа адаптирована так, что кодон «GCC» применяют с частотой 0,40, кодон «GCT» применяют с частотой 0,28, кодон «GCA» применяют с частой 0,22 и кодон «GCG» применяют с частотой 0,10 и т.д. (см. таблицу 13).

Оптимизация кодонов:

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения предпочтительно все кодоны последовательности дикого типа кодирующей области по меньшей мере одной РНК в предлагаемой в изобретении композиции, соответствующие тРНК, которые являются относительно редкими в клетке, в каждом случае заменяли на кодоны, соответствующие тРНК, которая часто встречается в клетке и которая в каждом случае «несет» такую же аминокислоту, что и относительно редкая тРНК. Таким образом, особенно предпочтительно применять наиболее часто встречающиеся кодоны для каждой кодируемой аминокислоты (см. таблицу 13, в которой наиболее часто встречающиеся кодоны обозначены звездочкой).

Это означает, например, что в случае аминокислоты аланина (Ala), присутствующей в аминокислотной последовательности кодируемого пептида или белка, предлагаемого в изобретении, кодирующая последовательность дикого типа адаптирована таким образом, что для указанной аминокислоты всегда применяют наиболее часто встречающийся человеческий кодон «GCC», или в случае аминокислоты цистеина (Cys), последовательность дикого типа адаптирована таким образом, что для указанной аминокислоты всегда применяют наиболее часто встречающийся человеческий кодон «TGC» и т.д.

С-обогащение:

Согласно другому варианту осуществления изобретения по меньшей мере одну РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, можно модифицировать путем повышения содержания С в РНК, предпочтительно в кодирующей области по меньшей мере одной РНК.

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения содержание С в кодирующей области по меньшей мере одной РНК композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, модифицируют, предпочтительно повышают, по сравнению с содержанием С в кодирующей области конкретной РНК дикого типа, т.е. немодифицированной мРНК. Аминокислотная последовательность, кодируемая по меньшей мере одной РНК, предпочтительно не модифицируют по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой конкретной РНК дикого типа.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения модифицированная РНК модифицирована таким образом, чтобы достигалось по меньшей 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% или по меньшей мере 90% от теоретического максимального содержания цитозина или даже максимальное содержание цитозина.

В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или даже 100% кодонов последовательности дикого типа РНК-мишени, в которой «можно оптимизировать содержание цитозина» заменяют кодонами с более высоким содержанием цитозина по сравнению с присутствующими в последовательности дикого типа.

В более предпочтительном варианте осуществления некоторые из кодонов кодирующей последовательности дикого типа можно дополнительно модифицировать таким образом, чтобы кодоны относительно редкой тРНК в клетке заменять на кодон относительно часто встречающейся тРНК в клетке, при условии, что замененный кодон относительно часто встречающейся тРНК «несет» такую же аминокислоту, что и исходный кодон, соответствующий относительно редкой тРНК дикого типа. Предпочтительно все кодоны, соответствующие относительно редкой тРНК, заменяют на кодоны, соответствующие относительно часто встречающейся в клетке тРНК, за исключением кодонов, кодирующих аминокислоты, которые исключительно кодируются кодонами, не содержащими цитозин, или за исключением глутамина (Gln), который кодируется двумя кодонами, каждый из которых содержит одинаковое количество цитозина.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения модифицированная РНК-мишень модифицирована таким образом, чтобы достигалось по меньшей 80% или по меньшей мере 90% от теоретического максимального содержания цитозина или даже максимальное содержание цитозина, с использованием кодонов, которые соответствуют относительно часто встречающимся тРНК в клетке, при этом аминокислотная последовательность остается неизмененной.

Из-за встречающейся в естественных условиях вырожденности генетического кода несколько кодонов могут кодировать конкретную аминокислоту. Так, 18 из 20 встречающихся в естественных условиях аминокислот кодируются более чем 1 кодоном (кроме Tryp и Met), например, 2 кодонами (например, Cys, Asp, Glu), 3 кодонами (например, Ile), 4 кодонами (например, Al, Gly, Pro) или 6 кодонами (например, Leu, Arg, Ser). Однако не все кодоны, кодирующие одну и ту же аминокислоту, используются с одинаковой частотой в условиях in vivo. В зависимости от каждого отдельного организма, как правило, устанавливается профиль типичных часто встречающихся кодонов.

Понятие «кодон, в котором можно оптимизировать содержание цитозина (оптимизируемый кодон)» в контексте настоящего описания относится к кодонам, в которых присутствует более низкое количество цитозинов, чем в других кодонах, кодирующих такую же аминокислоту. Таким образом, любой кодон дикого типа, который можно заменять другим кодоном, кодирующим ту же самую аминокислоту и имеющим более высокое количество цитозинов внутри кодона, рассматривается в качестве кодона, в котором можно оптимизировать содержание цитозина (оптимизируемый по содержанию С). Любая такая замена кодона дикого типа, который можно оптимизировать по содержанию С, на конкретный кодон с оптимизированным содержанием С в кодирующей последовательности дикого типа повышает общее содержание С и соответствует обогащенной С модифицированной последовательности РНК. Последовательность РНК с увеличенными до максимума количеством С содержит кодоны с оптимизированным количеством С во всех потенциально оптимизируемых по содержанию С кодонах. Таким образом, 100% или все теоретическим поддающиеся замене оптимизируемые по содержанию С кодоны в указанных условиях фактически заменены на кодоны с оптимизированным содержанием С по всей длине кодирующей области.

В этом контексте кодоны, оптимизируемые по содержанию цитозина, представляют собой кодоны, которые содержат меньшее количество цитозина, чем другие кодоны, кодирующие ту же самую аминокислоту.

Любой из кодонов GCG, GCA, GCU, которые кодируют аминокислоту Ala, можно заменять на кодон GCC, кодирующий эту же аминокислоту, и/или

кодон UGU, который кодирует Cys, можно заменять на кодон UGC, кодирующий эту же аминокислоту, и/или

кодон GAU, который кодирует Asp, можно заменять на кодон GAC, кодирующий эту же аминокислоту, и/или

кодон UUU, который кодирует Phe, можно заменять на кодон UUC, кодирующий эту же аминокислоту, и/или

любой из кодонов GGG, GGA, GGU, которые кодируют Gly, можно заменять на кодон GGC, кодирующий эту же аминокислоту, и/или

кодон CAU, который кодирует His, можно заменять на кодон САС, кодирующий эту же аминокислоту, и/или

любой из кодонов AUA, AUU, которые кодируют Ile, можно заменять на кодон AUC, и/или

любой из кодонов UUG, UUA, CUG, CUA, CUU, которые кодируют Leu, можно заменять на кодон CUC, кодирующий эту же аминокислоту, и/или

кодон AAU, который кодирует Asn, можно заменять на кодон ААС, кодирующий эту же аминокислоту, и/или

любой из кодонов CCG, CCA, CCU которые кодируют Pro, можно заменять на кодон ССС, кодирующий эту же аминокислоту, и/или

любой из кодонов AGG, AGA, CGG, CGA, CGU, которые кодируют Arg, можно заменять на кодон CGC, кодирующий эту же аминокислоту, и/или

любой из кодонов AGU, AGC, UCG, UCA, UCU, которые кодируют Ser, можно заменять на кодон UCC, кодирующий эту же аминокислоту, и/или

любой из кодонов ACG, АСА, ACU, которые кодируют Thr, можно заменять на кодон АСС, кодирующий эту же аминокислоту, и/или

любой из кодонов GUG, GUA, GUU, которые кодируют Val, можно заменять на кодон GUC, кодирующий эту же аминокислоту, и/или

кодон UAU, который кодирует r Tyr, можно заменять на кодон UAC, кодирующий эту же аминокислоту.

В любом из указанных выше случаев количество цитозинов повышают на 1 в каждом заменяемом кодоне. Замена всех кодонов с неоптимизированным содержанием С (которые соответствуют кодоном, которые можно оптимизировать по содержанию С) кодирующей последовательности приводит к получению кодирующей последовательности с повышенным до максимума содержанием С. В контексте изобретения по меньшей мере 70% кодонов в кодирующей области, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% кодонов, неоптимизированных по содержанию С заменяют на кодоны с оптимизированным содержанием С в последовательности дикого типа.

Может оказаться предпочтительным, чтобы для некоторых аминокислот процент кодонов, в которых можно оптимизировать содержание С, замененных на кодоны с оптимизированным содержанием С, составляет менее чем 70%, в то время как для других аминокислот процент заменяемых кодонов превышает 70% для того, чтобы общий процент оптимизации содержания С составлял по меньшей мере 70% для кодонов кодирующей области дикого типа, в которых можно оптимизировать содержание С.

Предпочтительно в РНК с оптимизированным содержанием С, предлагаемых в изобретении, по меньшей мере 50% кодонов дикого типа, в которых можно оптимизировать содержание С, для любой конкретной аминокислоты заменяют на кодоны с оптимизированным содержанием С, например, любая модифицированная обогащенная С РНК предпочтительно содержит по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60% кодонов с оптимизированным содержанием С в положениях кодонов дикого типа, в которых можно оптимизировать содержание С, кодирующих любую одну из указанных выше аминокислот Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val и Tyr.

В этом контексте кодоны, кодирующие аминокислоты, в которых нельзя оптимизировать содержание цитозина, и которые при этом кодируются по меньшей мере двумя кодонами, можно применять без какого-либо дополнительного процесса отбора. Однако кодон последовательности дикого типа, который соответствует относительно редко встречающейся тРНК в клетке, например, человеческой клетке, можно заменять на кодон, который соответствует относительно часто встречающейся тРНК в клетке, если оба кодируют одну и ту же аминокислоту. Таким образом, относительно редкий кодон GAA, кодирующий Glu, можно заменять на относительно часто встречающийся кодон GAG, кодирующий эту же аминокислоту, и/или относительно редкий кодон AAA, кодирующий Lys, можно заменять на относительно часто встречающийся кодон AAG, кодирующий эту же аминокислоту, и/или

относительно редкий кодон САА, кодирующий Gln, заменяют на относительно часто встречающийся кодон CAG, кодирующий эту же аминокислоту.

В этом контексте аминокислоты Met (AUG) и Trp (UGG), каждая из которых кодируется только одним кодоном, остаются неизмененными. В стоп-кодонах нельзя оптимизировать содержание цитозина, однако относительно редкие стоп-кодоны амбер-кодон, охра-кодон (UAA, UAG) можно заменять на относительно часто встречающийся стоп-кодон опал (UGA).

Очевидно, что указанные выше замены можно применять индивидуально, но можно использовать также все возможные их комбинации для оптимизации содержания цитозина в модифицированной РНК по сравнению с последовательностью РНК дикого типа.

Таким образом, область модифицированной РНК, которая кодирует пептид или белок, можно изменять по сравнению с кодирующей областью РНК дикого типа таким образом, чтобы аминокислота, кодируемая по меньшей мере двумя или большим количеством кодонов, из который один содержит один дополнительный цитозин, указанный кодон можно изменять на кодон с оптимизированным содержанием С, который содержит по меньшей мере один дополнительный цитозин, при этом аминокислота не изменяется по сравнению с последовательностью дикого типа.

Замены, добавления или элиминации оснований предпочтительно осуществляют с использованием ДНК-матрицы для получения молекулы нуклеиновой кислоты с помощью хорошо известных методик сайтнаправленного мутагенеза или лигирования олигонуклеотидов. В указанном процессе для получения по меньшей мере одной, указанной в настоящем описании, соответствующую молекулу ДНК можно транскрибировать in vitro. Указанная ДНК-матрица предпочтительно содержит пригодный промотор, например, промотор Т7 или SP6, для транскрипции in vitro, за которым располагается требуемая нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере одну РНК, которую нужно получить, и сигнал терминации для транскрипции in vitro. Молекулу ДНК, которая служит матрицей по меньшей мере для одной представляющей интерес РНК, можно получать путем ферментативной пролиферации и последующего выделения в виде части плазмиды, которая может реплицироваться в бактериях. Плазмиды, которые можно рассматривать в качестве приемлемых для осуществления настоящего изобретения, представляют собой, например, плазмиды рТ7Т (GenBank, регистрационный номер U26404; Lai и др., Development, 121, 1995, сс.2349-2360), серии pGEM^®, например, pGEM^®-1 (GenBank, регистрационный номер Х65300; фирма Promega) и pSP64 (GenBank, регистрационный номер Х65327); ср. также Mezei и Storts, Purification of PCR Products в: PCR Technology: Current Innovation, под ред. Griffin и Griffin, изд-во CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.

Фрагменты и варианты

Под объем изобретения в дополнение к указанным в настоящем описании подпадают пептиды и белки, характеризующиеся определенной степенью идентичности последовательности. Таким образом, в контексте настоящего изобретения под его объем подпадают фрагменты и варианты белков и пептидов, указанных в настоящем описании.

Кроме того, в контексте настоящего изобретения под его объем подпадают фрагменты и варианты нуклеиновых кислот, указанных в настоящем описании.

Моно-, би-, полицистронные РНК, саморасщепляющиеся пептиды и т.д.:

Кодирующая область по меньшей мере одной предлагаемой в изобретении РНК может присутствовать в виде моно-, би- или даже полицистронной РНК, т.е. последовательности РНК, которая несет кодирующую(ие) последовательность(и) одного, двух или большего количества белков или пептидов. Указанные кодирующие последовательности би- или даже полицистронных РНК могут быть разделены по меньшей мере одной последовательностью участка внутренней посадки (связывания) рибосомы (IRES). Таким образом, по меньшей мере одна РНК, предлагаемая в изобретении, может содержать также одну или несколько последовательностей участка внутреннего связывания рибосомы (IRES) или IRES-мотивов, которые могут разделять открытее рамки считывания, прежде всего, если РНК кодирует два или большее количество пептидов или белков (би- или полицистронная РНК). Например, последовательность участка внутреннего связывания рибосомы можно получать из EMCV (вирус энцефаломиокардита) или из FMDV (вирус ящера). Кроме того, можно применять саморасщепляющиеся сигнальные пептиды, которые индуцируют расщепление образовавшегося полипептида, который содержит несколько белков или пептидов, например, последовательность саморасщепляющегося сигнального пептида, полученную из пептида F2A из FMDV.

Комбинации различных кодирующих последовательностей

В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция, предлагаемая в изобретении, содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или большее количество РНК, каждая из которых содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или большее количество кодирующих областей, которые кодируют по меньшей мере один или несколько указанных выше цитокинов и/или по меньшей мере один или несколько указанных выше хемокинов, и/или по меньшей мере один или несколько указанных выше продуктов гена самоубийства, и/или по меньшей мере один или несколько указанных выше иммуногенных пептидов или белков, и/или по меньшей мере один или несколько указанных выше индукторов апоптоза, и/или по меньшей мере один или несколько указанных выше ингибиторов ангиогенеза, и/или по меньшей мере один указанный выше белок теплового шока, и/или по меньшей мере один или несколько указанных выше опухолевых антигенов, и/или по меньшей мере один или несколько указанных выше ингибиторов β-катенина, и/или по меньшей мере один или несколько указанных выше активаторов пути STING, и/или по меньшей мере один или несколько указанных выше модуляторов контрольных «точек», и/или по меньшей мере один или несколько указанных выше активаторов врожденного иммунитета, и/или по меньшей мере один или несколько указанных выше антител, и/или по меньшей мере один или несколько доминантно-негативных рецепторов, и/или по меньшей мере один или несколько рецепторов-ловушек, и/или по меньшей мере один или несколько супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC), и/или по меньшей мере один или несколько ингибиторов пути IDO, и/или по меньшей мере один или несколько белков или пептидов, которые связываются с указанными выше ингибиторами апоптоза, или их варианты или фрагменты.

Нетранслируемые области (UTR)

Согласно другому варианту осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в предлагаемой в изобретении композиции предпочтительно содержит по меньшей мере один из следующих структурных элементов: элемент, представляющий собой 5'- и/или 3'- нетранслируемую область (UTR-элемент), прежде всего 5'-UTR-элемент, который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, полученной из 5'-UTR гена ТОР или его фрагмента, гомолога или варианта, или 5'- и/или 3'-UTR-элемент, который можно получать из гена, из которого получают стабильную мРНК, или из его гомолога, фрагмента или варианта; гистоновую структуру типа «стебель-петля», предпочтительно гистоновую структуру типа «стебель-петля» в ее 3'-нетранслируемой области; 5'-кэп-структуру; поли-А-хвост (поли(А)-последовательность) или поли(С)-последовательность.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК содержит по меньшей мере один 5'- или 3'-UTR-элемент. В этом контексте UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 5'- или 3'-UTR любого встречающегося в естественных условиях гена, или которую получают из фрагмента, гомолога или варианта 5'- или 3'UTR гена. Предпочтительно 5'- или 3'UTR-элемент, применяемый согласно настоящему изобретению, является гетерологичным относительно кодирующей области РНК предлагаемой в изобретении композиции. Хотя предпочтительными являются 5'- или 3'-UTR-элементы, полученные из встречающихся в естественных условиях генов, в контексте настоящего изобретения можно применять также созданные путем синтеза UTR-элементы.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК содержит по меньшей мере один элемент, представляющий собой 5'-нетранслируемую область (5'-UTR-элемент), который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 5'-UTR ТОР-гена, или которую получают из фрагмента, гомолога или варианта 5'-UTR ТОР-гена.

Наиболее предпочтительно, чтобы 5'-UTR-элемент не содержал ТОР-мотив или 5'-ТОР, указанный выше.

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность 5'-UTR-элемента, которую получают из 5'-UTR ТОР-гена, оканчивается на ее 3'-конце нуклеотидом, локализованным в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 в обратном направлении относительно стартового кодона (например, A(U/T)G) гена или полученной из него мРНК. Таким образом, 5'-UTR-элемент не содержит никакой части кодирующей белок области. Таким образом, предпочтительно только кодирующий белок участок мРНК предлагаемой в изобретении композиции представляет собой кодирующую область.

Нуклеотидную последовательность, полученную из 5'-UTR ТОР-гена, предпочтительно получают из эукариотического ТОР-гена, предпочтительно ТОР-гена растений или животных, более предпочтительно ТОР-гена хордовых животных, еще более предпочтительно ТОР-гена позвоночных животных, наиболее предпочтительно ТОР-гена млекопитающих, например, ТОР-гена человека.

Например, 5'-UTR-элемент предпочтительно выбирают из 5'-UTR-элементов, содержащих или состоящих из нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, описание которой полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки, из гомологов SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422 указанных в заявке на патент WO 2013/143700, из ее вариантов, или предпочтительно из соответствующей РНК-последовательности. Понятие «гомологи SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700» относится к последовательностям из видов, отличных от человека (Homo sapiens), которые являются гомологами последовательностей SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения S'-UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из нуклеотидной последовательности, простирающейся от нуклеотидного положения 5 (т.е. нуклеотида, локализованного в положении 5 в последовательности) до нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к стартовому кодону (локализованному на 3'-конце последовательностей), например, до нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к ATG-последовательности нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, из гомологов SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, из ее вариантов или соответствующей РНК-последовательности. Наиболее предпочтительным является, если 5'-UTR-элемент получают из нуклеотидной последовательности, простирающейся от нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего с 3'-стороны к 5'-ТОР, до нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к стартовому кодону (локализованному на 3'-конце последовательностей), например, до нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к ATG последовательности нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, из гомологов SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, из ее вариантов или соответствующей РНК-последовательности.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения 5'-UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 5'-UTR ТОР-гена, кодирующего рибосомный белок, или из варианта 5'-UTR ТОР-гена, кодирующего рибосомный белок. Например, 5'-UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 5'-UTR нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 67, 170, 193, 244, 259, 554, 650, 675, 700, 721, 913, 1016, 1063, 1120, 1138 и 1284-1360, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, соответствующей РНК-последовательности, ее гомолога или варианта, указанного в настоящем описании, предпочтительно лишенного 5'ТОР-мотива. Как описано выше, последовательность, простирающаяся от положения 5 до нуклеотида, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к ATG (локализованному на 3'-конце последовательностей), соответствует 5'-UTR указанных последовательностей.

Предпочтительно 5'-UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, полученной из 5'-UTR ТОР-гена, кодирующего белок большой субъединицы рибосомы (RPL), или из гомолога или варианта 5'-UTR ТОР-гена, кодирующего белок большой субъединицы рибосомы (RPL). Например, 5'-UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, полученной из 5'-UTR нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 67, 259, 1284-1318, 1344, 1346, 1348-1354, 1357, 1358, 1421 и 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, соответствующей РНК-последовательности, ее гомолога или варианта, указанного в настоящем описании, предпочтительно без 5'ТОР-мотива.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения 5'-UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, полученной из 5'-UTR, происходящей из 5'-UTR гена белка большой субъединицы рибосомы 32, предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) позвоночных животных, более предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) млекопитающих, наиболее предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) человека, или из варианта 5'-UTR гена белка большой субъединицы рибосомы 32, предпочтительно гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) позвоночных животных, более предпочтительно гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) млекопитающих, наиболее предпочтительно гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) человека, при этом предпочтительно 5'-UTR-элемент не содержит 5'ТОР указанного гена.

Предпочтительная последовательность 5'-UTR-элемента соответствует SEQ ID NO: 1368, указанной в заявке на патент WO 2013/143700.

Таким образом, согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения 5'-UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 20%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% указанной выше нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 10051 (5'-UTR человеческого белка большой субъединицы рибосомы 32 без 5'-концевого олигопримидинового тракта: GGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC; которая соответствует SEQ ID NO: 1368 в заявке на патент WO 2013/143700) или предпочтительно соответствующей РНК-последовательности, или в которой по меньшей мере один 5'-UTR-элемент содержит или состоит из фрагмента нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 10052, или более предпочтительно соответствующей РНК-последовательности, при этом предпочтительно описанный выше фрагмент представляет собой непрерывный сегмент нуклеотидов, на долю которого приходится по меньшей мере 20% и т.д. полноразмерной 5'-UTR.

Предпочтительно фрагмент состоит по меньшей мере примерно из 20 нуклеотидов или более, предпочтительно по меньшей мере примерно из 30 нуклеотидов или более, более предпочтительно по меньшей мере примерно из 40 нуклеотидов или более. Предпочтительно фрагмент представляет собой функциональный фрагмент, указанный в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мРНК, входящая в предлагаемую в изобретении композицию, содержит 5'-UTR-элемент, который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, полученной из 5'-UTR ТОР-гена позвоночных, таких как млекопитающие, например, человеческого ТОР-гена, выбранного из RPSA, RPS2, RPS3, RPS3A, RPS4, RPS5, RPS6, RPS7, RPS8, RPS9, RPS10, RPS11, RPS12, RPS13, RPS14, RPS15, RPS15A, RPS16, RPS17, RPS18, RPS19, RPS20, RPS21, RPS23, RPS24, RPS25, RPS26, RPS27, RPS27A, RPS28, RPS29, RPS30, RPL3, RPL4, RPL5, RPL6, RPL7, RPL7A, RPL8, RPL9, RPL10, RPL10A, RPL11, RPL12, RPL13, RPL13A, RPL14, RPL15, RPL17, RPL18, RPL18A, RPL19, RPL21, RPL22, RPL23, RPL23A, RPL24, RPL26, RPL27, RPL27A, RPL28, RPL29, RPL30, RPL31, RPL32, RPL34, RPL35, RPL35A, RPL36, RPL36A, RPL37, RPL37A, RPL38, RPL39, RPL40, RPL41, RPLP0, RPLP1, RPLP2, RPLP3, RPLP0, RPLP1, RPLP2, EEF1A1, EEF1B2, EEF1D, EEF1G, EEF2, EIF3E, EIF3F, EIF3H, EIF2S3, EIF3C, EIF3K, EIF3EIP, EIF4A2, РАВРС1, HNRNPA1, ТРТ1, TUBB1, UBA52, NPM1, ATP5G2, GNB2L1, NME2, UQCRB или из их гомолога или варианта, в которых предпочтительно 5'-UTR-элемент не содержит ТОР-мотив или 5'-ТОР указанных генов и в которых необязательно 5'-конец 5'-UTR-элемента начинается с нуклеотида, локализованного в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 в прямом направлении относительно 5'-концевого олигопримидинового тракта (ТОР), и в которых также необязательно 5'-UTR-элемент, полученный из 5'-UTR ТОР-гена, оканчивается на его 3'-конце нуклеотидом, локализованным в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 в обратном направлении относительно стартового кодона (A(U/T)G) гена, из которого он получен.

Согласно следующим особенно предпочтительным вариантам осуществления изобретения 5'-UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 5'-UTR гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (RPL32), гена белка большой субъединицы рибосомы 35 (RPL35), белка большой субъединицы рибосомы 21 (RPL21), гена АТФ-синтазы, Н⁺-транспортирующей, митохондриального комплекса F1, альфа-субъединицы 1, сердечной мышцы (АТР5А1), гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4), индуцируемого андрогеном гена 1 (AIG1), гена субъединицы VIc оксидазы цитохрома с (СОХ6С) или гена N-ацилсфингозин-амидогидролазы (кислая церамидаза) 1 (ASAH1), или из их варианта, предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (RPL32) позвоночных животных, гена белка большой субъединицы рибосомы 35 (RPL35) позвоночных животных, гена белка большой субъединицы рибосомы 21 (RPL21) позвоночных животных, гена АТФ-синтазы, Н⁺-транспортирующей, митохондриального комплекса F1, альфа-субъединицы 1, сердечной мышцы (АТР5А1) позвоночных животных, гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4) позвоночных животных, индуцируемого андрогеном гена 1 (AIG1) позвоночных животных, гена субъединицы VIc оксидазы цитохрома с (СОХ6С) позвоночных животных или гена N-ацилсфингозин-амидогидролазы (кислая церамидаза) 1 (ASAH1) позвоночных животных, или из их варианта, более предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (RPL32) млекопитающих, гена белка большой субъединицы рибосомы 35 (RPL35) млекопитающих, гена белка большой субъединицы рибосомы 21 (RPL21) млекопитающих, гена АТФ-синтазы, Н⁺-транспортирующей, митохондриального комплекса F1, альфа-субъединицы 1, сердечной мышцы (АТР5А1) млекопитающих, гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4) млекопитающих, индуцируемого андрогеном гена 1 (AIG1) млекопитающих, гена субъединицы VIc оксидазы цитохрома с (СОХ6С) млекопитающих или гена N-ацилсфингозин-амидогидролазы (кислая церамидаза) 1 (ASAH1) млекопитающих, наиболее предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (RPL32) человека, гена белка большой субъединицы рибосомы 35 (RPL35) млекопитающих, гена белка большой субъединицы рибосомы 21 (RPL21) человека, гена АТФ-синтазы, Н⁺-транспортирующей, митохондриального комплекса F1, альфа-субъединицы 1, сердечной мышцы (АТР5А1) человека, гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4) человека, индуцируемого андрогеном гена 1 (AIG1) человека, гена субъединицы VIc оксидазы цитохрома с (СОХ6С) человека или гена N-ацилсфингозин-амидогидролазы (кислая церамидаза) 1 (ASAH1) человека, или из их варианта, в которых предпочтительно 5'-UTR-элемент не содержит 5'-ТОР указанного гена.

В этом контексте наиболее предпочтительными являются 5'-UTR-элементы, содержащие нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 10051-10054.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения 5,-UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1368 или SEQ ID NO: 1412-1420, которые указаны в заявке на патент WO 2013/143700, или соответствующей РНК-последовательности, или в которых по меньшей мере один 5'-UTR-элемент содержит или состоит из фрагмента нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 20%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1368 или SEQ ID NO: 1412-1420, которые указаны в заявке на патент WO 2013/143700, при этом предпочтительно фрагмент представляет собой описанный выше фрагмент, т.е. является непрерывным состоящим из нуклеотидов сегментом, на долю которого приходится по меньшей мере 20% и т.д. от полноразмерной 5'-UTR. Предпочтительно фрагмент состоит по меньшей мере примерно из 20 нуклеотидов или более, предпочтительно по меньшей мере примерно из 30 нуклеотидов или более, более предпочтительно по меньшей мере примерно из 40 нуклеотидов или более. Предпочтительно фрагмент представляет собой функциональный фрагмент, указанный в настоящем описании.

В этом контексте особенно предпочтительными являются 5'-UTR-элементы, содержащие нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 10051-10054.

Таким образом, в особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения 5,-UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 20%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 10053 (5'-UTR АТР5А1, лишенная 5'-концевого олигопиримидинового тракта:

GCGGCTCGGCCATTTTGTCCCAGTCAGTCCGGAGGCTGCGGCTGCAGAAGTACCGCCTGCG-GAGTAACTGCAAAG; соответствует SEQ ID NO: 1414 в заявке на патент WO 2013/143700 (5'-UTR АТР5А1, лишенная 5'-концевого олигопиримидинового тракта) или предпочтительно соответствующей РНК-последовательности, или в которой по меньшей мере один 5'-UTR-элемент содержит или состоит из фрагмента нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 26 (указанной в заявке на патент WO 2013/143700) или более предпочтительно соответствующей РНК-последовательности, в которой предпочтительно фрагмент представляет собой описанный выше фрагмент, т.е. является непрерывным состоящим из нуклеотидов сегментом, на долю которого приходится по меньшей мере 20% и т.д. от полноразмерной 5'-UTR. Предпочтительно фрагмент состоит по меньшей мере примерно из 20 нуклеотидов или более, предпочтительно по меньшей мере примерно из 30 нуклеотидов или более, более предпочтительно по меньшей мере примерно из 40 нуклеотидов или более. Предпочтительно фрагмент представляет собой функциональный фрагмент, указанный в настоящем описании.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения РНК в композиции, предлагаемой в изобретении, содержит также по меньшей мере один 3'- UTR-элемент, который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, полученной из 3'-UTR гена хордовых животных, предпочтительно гена позвоночных животных, более предпочтительно гена млекопитающих, наиболее предпочтительно человеческого гена, или из варианта 3'-UTR гена хордовых животных, предпочтительно гена позвоночных животных, более предпочтительно гена млекопитающих, наиболее предпочтительно человеческого гена.

Понятие «3'-UTR-элемент» относится к нуклеотидной последовательности, которая содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, полученной из 3'-UTR или из варианта 3'-UTR. 3'-UTR-элемент в контексте настоящего изобретения может представлять собой 3'-UTR мРНК. Таким образом, в контексте настоящего изобретения предпочтительно 3'-UTR-элемент может представлять собой 3'-UTR мРНК, предпочтительно искусственной мРНК, или может представлять собой матрицу для транскрипции 3'-UTR мРНК. Таким образом, 3'-UTR-элемент предпочтительно представляет собой нуклеотидную последовательность, которая соответствует 3'-UTR мРНК, предпочтительно 3'-UTR искусственной мРНК, такой как мРНК, полученная путем транскрипции созданной с помощью генной инженерии векторной конструкции.

Предпочтительно 3'-UTR-элемент выполняет функцию 3'-UTR или кодирует последовательность, которая выполняет функцию 3'-UTR.

Предпочтительно предлагаемая в изобретении мРНК содержит 3'-UTR-элемент, который может быть получен из гена, который соответствует мРНК с удлиненным временем полужизни (представляющей собой стабильную мРНК), например, 3'UTR-элемент указанный и описанный ниже. Предпочтительно 3'-UTR-элемент представляет собой нуклеотидную последовательность, полученную из 3'-UTR гена, который предпочтительно кодирует стабильную мРНК, или из гомолога, фрагмента или варианта указанного гена.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения 3'-UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 3'-UTR гена, выбранного из группы, состоящей из гена альбумина, гена α-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), или из варианта 3'-UTR гена, выбранного из группы, состоящей из гена альбумина, гена α-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена альфа, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 1369-1390 в заявке на патент WO 2013/143700, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 3'-UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 3'-UTR гена альбумина, предпочтительно гена альбумина позвоночных животных, более предпочтительно гена альбумина млекопитающих, наиболее предпочтительно человеческого гена альбумина, которая имеет SEQ ID NO: 10063 (соответствует SEQ ID NO: 1369 в заявке на патент WO 2013/143700). Последовательность мРНК может содержать или состоять из нуклеотидной последовательности, которая получена из 3'-UTR человеческого гена альбумина, имеющий код доступа в GenBank NM_000477.5, или из его фрагмента или варианта.

В этом контексте особенно предпочтительно мРНК в предлагаемой в изобретении композиции содержит 3'-UTR-элемент, который содержит соответствующую последовательность РНК, полученную из нуклеиновых кислот, имеющих SEQ ID NO: 1369-1390, которые указаны в заявке на патент WO 2013/143700, или их фрагмента, гомолога или варианта.

Наиболее предпочтительно 3'-UTR-элемент содержит нуклеотидную последовательность, полученную из фрагмента гена человеческого альбумина (3'-UTR альбумина7), представленную в SEQ ID NO: 10065 (соответствует SEQ ID NO: 1376 в заявке на патент WO 2013/143700).

В этом контексте особенно предпочтительно S'-UTR-элемент по меньшей мере одной РНК в предлагаемой в изобретении композиции содержит или состоит из соответствующей последовательности РНК, нуклеотидная последовательность которой соответствует SEQ ID NO: 10066.

В другом особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения 3'-UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, полученной из 3'-UTR гена α-глобина, предпочтительно гена α- или β-глобина позвоночных животных, более предпочтительно гена β- или β-глобина млекопитающих, наиболее предпочтительно человеческого гена α- или β-глобина, представленной в SEQ ID NO: 10055 (соответствует SEQ ID NO: 1370 в заявке на патент WO 2013/143700 (3'-UTR альфа-цепи гемоглобина 1 (НВА1) Homo sapiens)), или представленной в SEQ ID NO: 10057 (соответствует SEQ ID NO: 1371 в заявке на патент WO 2013/143700 (3'-UTR альфа-цепи гемоглобина 2 (НВА2) Homo sapiens)), и/или представленной в SEQ ID NO: 10059 (соответствует SEQ ID NO: 1372 в заявке на патент WO 2013/143700 (3'-UTR бета-цепи гемоглобина (НВВ) Homo sapiens).

Например, 3'-UTR-элемент может содержать или состоять из центральной, связывающей α-комплекс области 3'-UTR гена α-глобина, имеющей SEQ ID NO: 10061 (соответствует SEQ ID NO: 1393 в заявке на патент WO 2013/143700).

В этом контексте особенно предпочтительно 3'-UTR-элемент по меньшей мере одной РНК в предлагаемой в изобретении композиции содержит или состоит из соответствующей последовательности РНК, нуклеотидная последовательность которой соответствует SEQ ID NO: 10062, указанной выше, или ее гомолога, фрагмента или варианта.

Понятие «нуклеотидная последовательность, происходящая из 3'-UTR […] гена» предпочтительно относится к нуклеотидной последовательности, основой которой является 3'-UTR-последовательность […] гена или ее часть, например, 3'-UTR гена альбумина, гена α-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), предпочтительно гена альбумина или его части. Указанное понятие включает последовательности, соответствующие полной 3'-UTR-последовательности, т.е. полноразмерной 3'-UTR-последовательности гена, и последовательности, соответствующие фрагменту 3'-UTR-последовательности гена, например, гена альбумина, гена α-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), предпочтительно гена альбумина.

Понятие ««нуклеотидная последовательность, полученная из варианта 3'-UTR […] гена» предпочтительно относится к нуклеотидной последовательности, основой которой является вариант 3'-UTR-последовательности гена, например, вариант 3'-UTR гена альбумина, гена α-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), или его части, как указано выше. Указанное понятие включает последовательности, соответствующие полной последовательности варианта 3'-UTR гена, т.е. полноразмерной 3'-UTR-последовательности варианта гена, и последовательности, соответствующие фрагменту варианта 3'-UTR-последовательности гена. Фрагмент в этом контексте предпочтительно состоит из непрерывного нуклеотидного сегмента, соответствующего непрерывному нуклеотидному сегменту полноразмерного варианта 3'UTR, на долю которого приходится по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% полноразмерного варианта 3'-UTR. Указанный фрагмент варианта в контексте настоящего изобретения предпочтительно представляет собой функциональный фрагмент варианта, указанного в настоящем описании.

Предпочтительно по меньшей мере один 5'-UTR-элемент и по меньшей мере один 3'-UTR-элемент действуют синергетически в отношении повышения производства белка с указанной выше РНК в композиции, предлагаемой в изобретении.

Гистоновая структура типа «стебель-петля»:

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в предлагаемой в изобретении композиции содержит гистоновую последовательность/структуру типа «стебель-петля». Указанные последовательности гистоновой структуры типа «стебель-петля» предпочтительно выбирают из последовательностей гистоновой структуры типа «стебель-петля», которые представлены в WO 2012/019780, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», которую можно применять в настоящем изобретении, предпочтительно выбирают по меньшей мере из одной из следующих формул (I) или (II):

формула (I) (последовательность структуры типа «стебель-петля» без пограничных элементов стебля):

формула (II) (последовательность структуры типа «стебель-петля» с пограничными элементами стебля):

в которых:

пограничные элементы стебель 1 или стебель 2 N_1-6 обозначают непрерывную последовательность, состоящую из 1-6, предпочтительно 2-6, более предпочтительно 2-5, еще более предпочтительно 3-5, наиболее предпочтительно 4-5 или 5 N, где N каждый независимо друг от друга выбран из нуклеотида, выбранного из A, U, Т, G и С или их нуклеотидного аналога;

стебель 1 [N_0-2GN_3-5] обозначает последовательность, обратно комплементарную или частично обратно комплементарную элементу стебель 2, и представляет собой непрерывную последовательность, состоящую из 5-7 нуклеотидов;

в которой N_0-2 обозначает непрерывную последовательность, состоящую из 0-2, предпочтительно 0-1, более предпочтительно 1 N, где N каждый независимо друг от друга выбран из нуклеотида, выбранного из A, U, Т, G и С или его нуклеотидного аналога;

в которой N_3-5 обозначает непрерывную последовательность, состоящую из 3-5, предпочтительно 4-5, более предпочтительно 4 N, где N каждый независимо друг от друга выбран из нуклеотида, выбранного из A, U, Т, G и С или его нуклеотидного аналога, и

в которой G обозначает гуанозин или его аналог и необязательно может быть заменен на цитидин или его аналог при условии, что комплементарный ему нуклеотид цитидин в стебель 2 заменен на гуанозин;

последовательность «петли» [N_0-4(U/T)N_0-4] локализована между элементами стебель 1 и стебель 2 и обозначает непрерывную последовательность, состоящую из 3-5 нуклеотидов, более предпочтительно 4 нуклеотидов;

в которой N_0-4 каждый независимо друг от друга обозначает непрерывную последовательность, состоящую из 0-4, предпочтительно 1-3, более предпочтительно 1-2 N, где N каждый независимо друг от друга выбран из нуклеотида, выбранного из A, U, Т, G и С или его нуклеотидного аналога; и

в которой U/T обозначает уридин или необязательно тимидин;

стебель 2 [N_3-5CN_0-2] обозначает последовательность, обратно комплементарную или частично обратно комплементарную элементу стебель 1, и представляет собой непрерывную последовательность, состоящую из 5-7 нуклеотидов;

в которой N_3-5 обозначает непрерывную последовательность, состоящую из 3-5, предпочтительно 4-5, более предпочтительно 4 N, где N каждый независимо друг от друга выбран из нуклеотида, выбранного из A, U, Т, G и С или его нуклеотидного аналога;

в которой N_0-2 обозначает непрерывную последовательность, состоящую из 0-2, предпочтительно 0-1, более предпочтительно 1 N, где N каждый независимо друг от друга выбран из нуклеотида, выбранного из A, U, Т, G или С или его нуклеотидного аналога; и

в которой С обозначает цитидин или его аналог и необязательно может быть заменен на гуанозин или его аналог при условии, что комплементарный ему нуклеозид гуанозин в стебель 1 заменен на цитидин;

где

у элементов стебель 1 и стебель 2 может происходить спаривание оснований друг с другом с образованием обратно комплементарной последовательности, где спаривание оснований может иметь место между стебель 1 и стебель 2, например, посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику нуклеотидов А и U/T или G и С, или посредством спаривания оснований не по Уотсону-Крику, например, посредством спаривания «качающихся» оснований («качающегося» спаривания оснований), обратного спариванию оснований по Уотсону-Крику, посредством хугстиновского спаривания оснований, посредством обратного хугстиновскому спаривания оснований, или у них может происходить спаривание оснований друг с другом с образованием частично обратно комплементарной последовательности, при этом неполное спаривание оснований может иметь место между стебель 1 и стебель 2, вследствие того, что для одного или нескольких оснований в одном стебле не имеется комплементарного основания в обратно комплементарной последовательности другого стебля.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения первого объекта изобретения предлагаемая в изобретении последовательность мРНК, может содержать по меньшей мере одну последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», соответствующую по меньшей мере одной из следующих конкретных формул (Ia) или (IIa):

формула (Ia) (последовательность структуры типа «стебель-петля» без пограничных элементов стебля):

формула (IIa) (последовательность структуры типа «стебель-петля» с пограничными элементами стебля):

в которой:

N, С, G, Т и U имеют указанные выше значения,

в которой N, С, G, Т и U имеют указанные выше значения.

Согласно другому более предпочтительном варианту осуществления первого объекта изобретения по меньшей мере одна РНК может содержать по меньшей мере одну последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», соответствующую по меньшей мере одной из следующих конкретных формул (Ib) или (IIb):

формула (Ib) (последовательность структуры типа «стебель-петля» без пограничных элементов стебля):

формула (IIb) (последовательность структуры типа «стебель-петля» с пограничными элементами стебля):

в которой:

N, С, G, Т и U имеют указанные выше значения.

Наиболее предпочтительная последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля» имеет последовательность SEQ ID NO: 8.

Более предпочтительно последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля» соответствует последовательности РНК нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 9.

Поли(А)-последовательность

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в предлагаемой в изобретении композиции содержит в дополнение к кодирующей области, которая кодирует по меньшей мере один пептид или белок, указанный выше, или его фрагмент или вариант, поли (А)-последовательность, так называемый поли-А-хвост, предпочтительно на 3'-конце РНК. Когда она присутствует, то указанная поли(А)-последовательность содержит последовательность, содержащую от примерно 25 до примерно 400 аденозиновых нуклеотидов, предпочтительно последовательность, содержащую от примерно 50 до примерно 400 аденозиновых нуклеотидов, более предпочтительно последовательность, содержащую от примерно 50 до примерно 300 аденозиновых нуклеотидов, еще более предпочтительно последовательность, содержащую от примерно 50 до примерно 250 аденозиновых нуклеотидов, наиболее предпочтительно последовательность, содержащую от примерно 60 до примерно 250 аденозиновых нуклеотидов. В этом контексте понятие «примерно» относится к отклонению, составляющему ±10% от величины(н), к которой(ым) оно относится. Указанная поли(А)-последовательность предпочтительно локализована на 3'- конце кодирующей области, которая содержится в предлагаемой в изобретении РНК.

Предпочтительно поли(А)-последовательность по меньшей мере в одной РНК в композиции получают из ДНК-матрицы путем транскрипции РНК in vitro. Альтернативно этому, поли(А)-последовательность можно получать также in vitro путем объединения методов химического синтеза без необходимости ее транскрипции с ДНК-предшественника. Кроме того, поли (А)-последовательности или поли(А)-хвосты можно получать путем ферментативного полиаденилирования по меньшей мере одной РНК, используя поступающие в продажу наборы для полиаденилирования и соответствующие протоколы, известные в данной области.

Альтернативно этому, по меньшей мере одна РНК в предлагаемой в изобретении композиции необязательно содержит сигнал полиаденилирования, указанный в настоящем описании, представляющий собой сигнал, который обеспечивает полиаденилирование (транскрибируемой) мРНК посредством специфических белковых факторов (таких, например, как специфический фактор расщепления и полиаденилирования (CPSF), стимулирующий расщепление фактор (CstF), факторы расщепления I и II (CF I и CF II), поли(А)-полимераза (РАР)). В этом контексте консенсусный сигнал полиаденилирования предпочтительно содержит консенсусную последовательность NN(U/T)ANA. В наиболее предпочтительном объекте изобретения сигнал полиаденилирования содержит одну из следующих последовательностей: AA(U/T)AAA или A(U/T)(U/T)AAA (в которых уридин, как правило, присутствует в РНК, а тимидин, как правило, присутствует в ДНК).

Поли(С)-последовательность

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения РНК в предлагаемой в изобретении композиции можно модифицировать с помощью последовательности, состоящей по меньшей мере из 10 цитозинов, предпочтительно по меньшей мере из 20 цитозинов, более предпочтительно по меньшей мере из 30 цитозинов (так называемая «поли(С)-последовательность»). В частности, РНК может содержать поли(С)-последовательность, которая, как правило, содержит примерно от 10 до 200 цитозиновых нуклеотидов, предпочтительно примерно от 10 до 100 цитозиновых нуклеотидов, более предпочтительно примерно от 10 до 70 цитозиновых нуклеотидов или еще более предпочтительно примерно от 20 до 50 или даже от 20 до 30 цитозиновых нуклеотидов. Указанная поли(С)-последовательность предпочтительно локализована с 3'-стороны относительно кодирующей области, более предпочтительно с 3'-стороны относительно необязательной поли(А)-последовательности, которая входит в предлагаемую в настоящем изобретении РНК.

5'-кэп

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения модифицированная молекула РНК, указанная в настоящем описании, может быть модифицирована путем добавления структуры так называемого «5'-кэпа», которая предпочтительно стабилизирует РНК, указанную в настоящем описании. 5'-кэп представляет собой структуру, которая, как правило, «кэпирует» модифицированную нуклеотидную структуру на 5'-конце зрелой мРНК. 5'-кэп может, как правило, быть образован модифицированным нуклеотидом, прежде всего производным гуанинового нуклеотида. Предпочтительно 5'-кэп связан с 5'-концом через 5'-5'-трифосфатную связь. 5'-кэп может быть метилирован, например, представлять собой m7GpppN, где N обозначает концевой 5'-нуклеотид нуклеиновой кислоты, несущей 5'-кэп, как правило, 5'-конец мРНК. m7GpppN представляет собой структуру 5'-кэпа, которая встречается в естественных условиях в мРНК, которая транскрибируется с помощью полимеразы II, и поэтому предпочтительно в этом контексте не рассматривается в качестве модификации, которая содержится в модифицированной РНК. Это означает, что модифицированная РНК, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать m7GpppN в качестве 5'-кэпа, но кроме этого модифицированная РНК содержит по меньшей мере одну дополнительную модификацию, указанную в настоящем описании.

Другими примерами структур 5'-кэпа являются глицерил, инвертированная дезоксигруппа (фрагмент), лишенная азотистого основания, 4',5'-метиленовый нуклеотид, 1-(бета-D-эритрофуранозильный) нуклеотид, 4'-тионуклеотид, карбоциклический нуклеотид, 1,5-ангидрогекситольный нуклеотид, L-нуклеотиды, альфа-нуклеотид, нуклеотид с модифицированным основанием, треопентофуранозильный нуклеотид, ациклический 3',4'-секонуклеотид, ациклический 3,4-дигидроксибутильный нуклеотид, ациклический 3,5-дигидроксипентильный нуклеотид, 3'-3'-инвертированный нуклеотидный фрагмент, 3'-3'-инвертированный лишенный азотистого основания фрагмент, 3'-2'-инвертированный нуклеотидный фрагмент, 3'-2'-инвертированный лишенный азотистого основания фрагмент, 1,4-бутандиолфосфатный, 3'-фосфороамидатный, гексилфосфатный, аминогексилфосфатный, 3'-фосфатный, 3'-фосфоротиоатный, фосфородитиоатный или связанный мостиком или несвязанный мостиком метилфосфонатный фрагмент. В этом контексте указанные модифицированные структуры 5'-кэпа рассматриваются в качестве по меньшей мере одной модификации.

Особенно предпочтительными модифицированными структурами 5'-кэпа являются САР1 (метилирование рибозы нуклеотида, примыкающего к m7G), САР2 (метилирование рибозы 2-ого нуклеотида, расположенного в прямом направлении относительно m7G), САР3 (метилирование рибозы 3-его нуклеотида, расположенного в прямом направлении относительно m7G), САР4 (метилирование рибозы 4-ого нуклеотида, расположенного в прямом направлении относительно m7G), ARCA (аналог кэп-структуры с правильной ориентацией), модифицированный ARCA (например, модифицированный фосфоротиоатом ARCA), инозин, N1-метилгуанозин, 2'-фторгуанозин, 7-деазагуанозин, 8-оксогуанозин, 2-аминогуанозин, ЗНК-гуанозин и 2-азидогуанозин.

Секреторная сигнальная последовательность:

Согласно другому особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в композиции в дополнительном или в альтернативном варианте может кодировать секреторный сигнальный пептид. Указанные секреторные сигнальные последовательности представляют собой (но, не ограничиваясь только ими) пептидные сегменты, длина которых обычно составляет приблизительно 15-30 аминокислот, и которые предпочтительно расположены на N-конце кодируемого пептида. Сигнальные пептиды, указанные в настоящем описании, предпочтительно обеспечивают перенос пептида или белка, кодируемого по меньшей мере одной кодирующей последовательностью по меньшей мере одной РНК, которая входит в композицию, в определенный компартмент клетки, предпочтительно на клеточную поверхность, в эндоплазматический ретикулум (ЭР) или в эндосомальный-липосомальный компартмент. Примеры секреторных сигнальных последовательностей, указанных в настоящем описании, включают (но, не ограничиваясь только ими), секреторные сигнальные последовательности классических или неклассических молекул ГКГС (например, сигнальные последовательности молекул ГКГС I и ГКГС II, например, HLA-A*0201 ГКГ класса I), секреторные сигнальные последовательности цитокинов или иммуноглобулинов, указанных в настоящем описании, секреторные сигнальные последовательности инвариантной цепи иммуноглобулинов или антител, указанных в настоящем описании, сигнальные последовательности Lamp1, тапазина, Erp57, калретикулина, калнексина и других мембранно-ассоциированных белков или белков, ассоциированных с эндоплазматическим ретикулумом (ЭР) или с эндосомальным-лизосомальным компартментом.

Любую из указанных выше модификаций, касающихся кодирующей последовательности и/или касающихся РНК, указанной выше, можно использовать для кодирующей последовательности и/или РНК в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, а также для любой РНК, применяемой в контексте настоящего изобретения, и можно, если это возможно или необходимо, объединять друг с другом в любой комбинации при условии, что указанные комбинации модификаций не оказывают отрицательного действия друг на друга в отношении по меньшей мере одной РНК. Соответствующий выбор может сделать специалист в данной области.

Получение мРНК и РНК

РНК можно получать с использованием любого метода, известного в данной области, включая методы синтеза (химический синтез РНК), такие как твердофазный синтез, а также методы in vitro, такие как реакции транскрипции РНК in vitro.

Комбинации:

Согласно настоящему изобретению особенно предпочтительно объединять РНК, кодирующие пептиды или белки. В этом контексте особенно предпочтительными являются следующие комбинации:

• РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, +РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один хемокин,

• РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, +РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один продукт гена самоубийства,

• РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, +РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один иммуногенный белок или пептид,

• РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, +РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один индуктор апоптоза,

• РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, +РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один ингибитор ангиогенеза,

• РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, +РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один белок теплового шока,

• РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, +РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один опухолевый антиген,

• РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, +РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один ингибитор β-катенина,

• РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, +РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один активатор пути STING,

• РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, +РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один модулятор контрольной «точки»,

• РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, +РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один активатор врожденного иммунитета,

• РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, +РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере одно антитело,

• РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, +РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один рецептор-ловушку,

• РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, +РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один ингибитор супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC),

• РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, +РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один ингибитор пути IDO,

• РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, +РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один белок или пептид, который связывается с ингибиторами апоптоза.

Кроме того, особенно предпочтительными являются следующие варианты:

- РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая IL-2, и/или РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая IL-12, + мРНК, кодирующая тимидинкиназу (подход: цитокины + продукт гена самоубийства),

- РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая IL-2, и/или РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая IL-12,

- РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая IL-12, и/или РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая CD40L,

- РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая IL-15, и/или РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая IL-12,

- РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая IL-2, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая NP-белок вируса гриппа,

- РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая IL-2, и/или РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая IL-12, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая цитохром с/каспазу 3 (цитокины + индукция апоптоза),

- РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая CD40L, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая IL-12, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая ΔRIGI.

Очевидно, что молекулы РНК в предлагаемой в изобретении композиции, могут кодировать один или несколько различных пептидов или белков (таких, например, как цитокины, хемокины, продукты генов самоубийства, иммуногенные белки или пептиды, индукторы апоптоза, ингибиторы ангиогенеза, белки теплового шока, опухолевые антигены, ингибиторы β-катенина, активаторы пути STING, модуляторы контрольных «точек», активаторы врожденного иммунитета, антитела, доминантно-негативные рецепторы и рецепторы-ловушки, ингибиторы супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC), ингибиторы пути IDO и белки или пептиды, которые связываются с ингибиторами апоптоза), которые описаны выше. Несколько последовательностей РНК можно объединять в одной композиции, содержащей предлагаемую в изобретении РНК. Кроме того, возможно, чтобы последовательность или последовательности РНК, содержащиеся в предлагаемой в изобретении композиции, кодировали варианты или фрагменты белковой последовательности дикого типа или один или несколько участков или фрагментов белковой последовательности дикого типа или ее вариантов.

Некодирующая РНК

Согласно изобретению по меньшей мере одна РНК в предлагаемой в изобретении композиции, содержащей РНК, может содержать по меньшей мере одну некодирующую РНК, которую предпочтительно выбирают из группы, состоящей из малой интерферирующей РНК (siPHK), антисмысловой РНК (asPHK), кольцевой РНК (circPHK), рибозимов, аптамеров, рибопереключателей, иммуностимулирующей/иммуностимуляторной РНК, транспортной РНК (тРНК), рибосомной РНК (рРНК), малой ядерной РНК (snPHK), малой ядрышковой РНК (snoPHK), микроРНК (miPHK) и взаимодействующей с Piwi-комплексом РНК (piPHK).

Иммуностимуляторная/иммуностимулирующая РНК (isPHK):

Кроме того, согласно дополнительному альтернативному варианту по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК предлагаемой в изобретении композиции представляет собой иммуностимуляторную/иммуностимулирующую РНК, которая предпочтительно вызывает врожденный иммунный ответ. Указанная иммуностимуляторная РНК может представлять собой любую (двухцепочечную или одноцепочечную) РНК, например, кодирующую РНК, указанную в настоящем описании. В предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуностимуляторная РНК представляет собой некодирующую РНК. Предпочтительно иммуностимуляторная РНК может представлять собой одноцепочечную, двухцепочечную или частично двухцепочечную РНК, более предпочтительно одноцепочечную РНК, и/или кольцевую или линейную РНК, более предпочтительно линейную РНК. Более предпочтительно иммуностимуляторная РНК может представлять собой (линейную) одноцепочечную РНК. Еще более предпочтительно иммуностимуляторная РНК может представлять собой (длинную) (линейную) (одноцепочечную) некодирующую РНК. В этом контексте особенно предпочтительно, чтобы isPHK несла трифосфат на ее 5'-конце, что имеет место в случае транскрибируемой in vitro РНК. Иммуностимуляторная РНК может находиться также в форме короткого РНК-олигонуклеотида, указанного в настоящем описании.

Иммуностимуляторную РНК, применяемую согласно настоящему описанию, можно выбирать также из любого класса молекул РНК, присутствующих в природе или полученных путем синтеза, и которые могут индуцировать врожденный иммунный ответ и могут поддерживать адаптивный иммунный ответ, индуцированный антигеном. В этом контексте иммунный ответ может вырабатываться любыми путями. Существенным фактором для получения соответствующего (адаптивного) иммунного ответа является стимуляция различных Т-клеточных субпопуляций. Т-лимфоциты, как правило, подразделяют на две субпопуляции, Т-клетки-хелперы типа 1 (Th1) и Т-клетки-хелперы типа 2 (Th2), с помощью которых иммунная система способна разрушать внутриклеточные (Th1) и внеклеточные (Th2) патогены (например, антигены). Две популяции Т-клеток-хелперов различаются схемой продуцируемых ими эффекторных белков (цитокинов). Так, Th1-клетки стимулируют клеточный иммунный ответ путем активации макрофагов и цитотоксических Т-клеток. С другой стороны, Th2-клетки инициируют гуморальный иммунный ответ путем стимуляции конверсии В-клеток в плазматические клетки и путем образования антител (например, против антигенов). Таким образом, соотношение Th1-клетки/Th2-клетки имеет важное значение для индукции и поддержания адаптивного иммунного ответа. В контексте настоящего изобретения соотношение Th1-клетки/Th2-клетки при (адаптивном) иммунном ответе предпочтительно сдвигается в сторону клеточного ответа (Th1-ответ) и тем самым индуцируется клеточный иммунный ответ. Согласно одному из примеров врожденная иммунная система, которая может поддерживать адаптивный иммунный ответ, может активироваться лигандами Толл-подобных рецепторов (TLR). TLR представляют собой семейство высоко консервативных полипептидов паттерн-распознающего рецептора (PRR), которые распознают патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (РАМР) и играют решающую роль во врожденном иммунитете у млекопитающих. В настоящее время идентифицировано по меньшей мере 13 представителей семейства, обозначенных TLR1 TLR13 (Толл-подобные рецепторы: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 или TLR13). Кроме того, идентифицирован ряд специфических лигандов TLR. Кроме того, установлено, что лиганды для определенных TLR включают определенные молекулы нуклеиновых кислот и что определенные типы РНК обладают иммуностимуляторной активностью независимым от последовательности образом или зависимым от последовательности образом, причем, эти различные иммуностимуляторные РНК могут, например, стимулировать TLR3, TLR7 или TLR8 или внутриклеточные рецепторы, такие как RIG-I, MDA-5 и т.д.

Предпочтительно иммуностимуляторная нуклеиновая кислота, предпочтительно иммуностимуляторная РНК (isPHK), которую применяют согласно настоящему описанию, может содержать любую последовательность РНК, для которой известно, что она обладает иммуностимуляторной активностью, включая (но, не ограничиваясь только ими) последовательности РНК, представляющие и/или кодирующие лиганды TLR, предпочтительно выбранные из представителей семейства человеческих TLR1-TLR10 или представителей семейства мышиных TLR1-TLR13, более предпочтительно выбранные из представителей семейства (человеческих) TLR1 TLR10, еще более предпочтительно из TLR7 и TLR8, лигандов для внутриклеточных рецепторов РНК (таких как RIG-I или MDA-5 и т.д.) (см., например, Meylan, Е., Tschopp, J., Toll-like receptors и RNA helicases: two parallel ways to trigger antiviral responces. Mol. Cell 22, 2006, cc. 561-569), или любых других иммуностимуляторных последовательностей РНК. Кроме того, (классы) иммуностимуляторных молекул РНК, которые применяют в качестве дополнительного соединения в предлагаемой в изобретении вакцине, могут включать любую другую РНК, обладающую способностью вызывать иммунный ответ. Указанная иммуностимуляторная РНК может включать (но, не ограничиваясь только ими) рибосомную РНК (рРНК), транспортную РНК (тРНК), матричную РНК (мРНК) и вирусную РНК (вРНК). Указанная иммуностимуляторная РНК может содержать от 1000 до 5000, от 500 до 5000, от 5 до 5000 или от 5 до 1000, от 5 до 500, от 5 до 250, от 5 до 100, от 5 до 50 или от 5 до 30 нуклеотидов.

Иммуностимуляторную РНК, применяемую согласно настоящему описанию, можно выбирать также из любого класса молекул РНК, присутствующих в природе или полученных путем синтеза, и которые могут индуцировать врожденный иммунный ответ и могут поддерживать адаптивный иммунный ответ, индуцированный антигеном. В этом контексте иммунный ответ может вырабатываться любыми путями. Существенным фактором для получения соответствующего (адаптивного) иммунного ответа является стимулирование различных Т-клеточных субпопуляций. Т-лимфоциты, как правило, подразделяют на две субпопуляции, Т-клетки-хелперы типа 1 (Th1) и Т-клетки-хелперы типа 2 (Th2), с помощью которых иммунная система способна разрушать внутриклеточные (Th1) и внеклеточные (Th2) патогены (например, антигены). Две популяции Т-клеток-хелперов различаются схемой продуцируемых ими эффекторных белков (цитокинов). Так, Th1-клетки стимулируют клеточный иммунный ответ путем активации макрофагов и цитотоксических Т-клеток. С другой стороны, Th2-клетки инициируют гуморальный иммунный ответ путем стимуляции конверсии В-клеток в плазматические клетки и путем образования антител (например, против антигенов). Таким образом, соотношение Th1-клетки/Th12-клетки имеет важное значение для индукции и поддержания адаптивного иммунного ответа. В контексте настоящего изобретения соотношение Th1-клетки/Th2-клетки при (адаптивном) иммунном ответе предпочтительно сдвигается в сторону клеточного ответа (Th1-ответ) и тем самым индуцируется клеточный иммунный ответ. Согласно одному из примеров врожденная иммунная система, которая может поддерживать адаптивный иммунный ответ, может активироваться лигандами Толл-подобных рецепторов (TLR). TLR представляют собой семейство высоко консервативных полипептидов паттерн-распознающего рецептора (PRR), которые распознают патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (РАМР) и играют решающую роль во врожденном иммунитете у млекопитающих. В настоящее время идентифицировано по меньшей мере 13 представителей семейства, обозначенных TLR1 TLR13 (Толл-подобные рецепторы: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 или TLR13). Кроме того, идентифицирован ряд специфических лигандов TLR. Установлено, например, что неметилированная бактериальная ДНК и ее синтетические аналоги (CpG-ДНК) являются лигандами TLR9 (Hemmi Н. и др., Nature 408, 2000, сс. 740-745; Bauer S. и др., Proc NatlAcadSci USA 98, 2001, сс. 9237-9242). Кроме того, опубликованы данные о том, что лиганды для определенных TLR включают определенные молекулы нуклеиновых кислот и что определенные типы РНК являются иммуностимуляторами, и они действуют независимым от последовательности или зависимым от последовательности образом, при этом указанные различные иммуностимуляторные РНК могут, например, стимулировать TLR3, TLR7 или TLR8 или внутриклеточные рецепторы, такие как RIG-I, MDA-5 и т.д.

Например, Lipford с соавторами установили, что определенные G,U-содержащие олигорибонуклеотиды являются иммуностимуляторными по их действию через TLR7 и TLR8 (см. WO 03/086280). Иммуностимуляторные G,U-содержащие олигорибонуклеотиды, описанные у Lipford с соавторами, вероятно, можно получать, используя в качестве источников РНК, включая рибосомную РНК, транспортную РНК, матричную РНК и вирусную РНК.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения указанные последовательности иммуностимуляторной нуклеиновой кислоты представляют собой РНК, которая предпочтительно состоит из или содержит нуклеиновую кислоту следующей формулы (III) или (IV):

в которой:

G обозначает гуанозин, урацил или аналог гуанозина или урацила;

X обозначает гуанозин, урацил, аденозин, тимидин, цитозин или аналог указанных выше нуклеотидов;

1 обозначает целое число от 1 до 40, где

когда 1=1, G обозначает гуанозин или его аналог,

когда 1>1, то по меньшей мере 50% нуклеотидов представляют собой гуанозин или его аналог;

m обозначает целое число и составляет по меньшей мере 3;

где

когда m=3, то X обозначает урацил или его аналог,

когда m>3, то присутствуют по меньшей мере 3 последовательно расположенных урацила или аналога урацила;

n обозначает целое число от 1 до 40,

где

когда n=1, то G обозначает гуанозин или его аналог,

когда n>1, то по меньшей мере 50% нуклеотидов представляют собой гуанозин или его аналог.

в которой:

С обозначает цитозин, урацил или аналог цитозина или урацила;

X обозначает гуанозин, урацил, аденозин, тимидин, цитозин или аналог указанных выше нуклеотидов;

1 обозначает целое число от 1 до 40, где

когда 1=1, то С обозначает цитозин или его аналог,

когда 1>1, то по меньшей мере 50% нуклеотидов представляют собой цитозин или его аналог;

m обозначает целое число и составляет по меньшей мере 3;

где

когда m=3, то X обозначает урацил или его аналог,

когда m>3, то присутствуют по меньшей мере 3 последовательно расположенных урацила или аналога урацила;

n обозначает целое число от 1 до 40, где

когда n=1, то С обозначает цитозин или его аналог,

когда n>1, то по меньшей мере 50% нуклеотидов представляют собой цитозин или его аналог.

Нуклеиновые кислоты формулы (II) или (III), которые можно применять в качестве иммуностимуляторной РНК, могут представлять собой относительно короткие молекулы нуклеиновых кислот, состоящие, как правило, примерно из 5-100 (но в конкретных вариантах осуществления изобретения они могут состоять более чем из 100 нуклеотидов, например, вплоть до 200 нуклеотидов), из 5-90 или из 5-80 нуклеотидов, предпочтительно могут иметь длину примерно от 5 до 70, более предпочтительно длину примерно от 8 до 60 и более предпочтительно длину примерно от 15 до 60 нуклеотидов, более предпочтительно от 20 до 60, наиболее предпочтительно от 30 до 60 нуклеотидов. Если нуклеиновая кислота, входящая в предлагаемый в изобретении комплекс, содержащий предлагаемую в изобретении нуклеиновую кислоту в качестве карго-молекулы, имеет максимальную длину, например, 100 нуклеотидов, то т, как правило, ≤98. Количество нуклеотидов G в нуклеиновой кислоте формулы (III) определяется величиной 1 или n. Символ 1 и n каждый независимо друг от друга обозначает целое число от 1 до 40, при этом, когда 1 или n=1, то G обозначает гуанозин или его аналог, и когда 1 или n>1, то по меньшей мере 50% нуклеотидов представляют собой гуанозин или его аналог. Например (но, не ограничиваясь только указанным), когда 1 или n=4, то G₁ или G_n может обозначать, например, GUGU, GGUU, UGUG, UUGG, GUUG, GGGU, GGUG, GUGG, UGGG or GGGG и т.д.; когда 1 или n=5, то G₁ или G_n может обозначать, например, GGGUU, GGUGU, GUGGU, UGGGU, UGGUG, UGUGG, UUGGG, GUGUG, GGGGU, GGGUG, GGUGG, GUGGG, UGGGG или GGGGG и т.д. Нуклеотид, примыкающий к X_m в нуклеиновой кислоте формулы (III), согласно изобретению предпочтительно не представляет собой урацил. Аналогично этому, количество нуклеотидов С в нуклеиновой кислоте формулы (IV) согласно изобретению определяется величиной 1 или n. Символ 1 и n каждый независимо друг от друга обозначает целое число от 1 до 40, при этом, когда 1 или n=1, то С обозначает цитозин или его аналог, и когда 1 или n>1, то по меньшей мере 50% нуклеотидов представляют собой цитозин или его аналог. Например (но, не ограничиваясь только указанным), когда 1 или n=4, то C₁ или C_n может обозначать, например, CUCU, CCUU, UCUC, UUCC, CUUC, CCCU, CCUC, CUCC, UCCC или СССС и т.д.; когда 1 или n=5, то C₁ или C_n может обозначать, например, CCCUU, CCUCU, CUCCU, UCCCU, UCCUC, UCUCC, UUCCC, CUCUC, CCCCU, CCCUC, CCUCC, CUCCC, UCCCC или ССССС и т.д. Нуклеотид, примыкающий к X_m в нуклеиновой кислоте формулы (III), согласно изобретению предпочтительно не представляет собой урацил. Предпочтительно в формуле (II), когда 1 или n>1, то по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90% или даже 100% нуклеотидов представляют собой гуанозин или его аналог, как указано выше. Остальные нуклеотиды, необходимые до достижения 100% (когда на долю составляющих, представляющий собой гуанозин, приходится менее 100% от всех нуклеотидов), во фланкирующих последовательностях G₁ и/или G_n представляют собой урацил или его аналог, как указано выше. Предпочтительно также 1 и n каждый независимо друг от друга обозначает целое число от 2 до 30, более предпочтительно целое число от 2 до 20 и еще более предпочтительно целое число от 2 до 15. Нижний предел 1 или n при необходимости можно варьировать, и он представляет собой по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2, более предпочтительно по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Вышесказанное применимо соответствующим образом и к формуле (III).

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения нуклеиновую кислоту, имеющую любую из указанных выше формул (III) или (IV), которую можно применять в качестве иммуностимуляторной РНК, можно выбирать из последовательности, которая состоит из или содержит любую из указанных ниже последовательностей SEQ ID NO: 298-381,

или из последовательности, идентичной по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 90% или даже 95% любой из указанных последовательностей.

Согласно другому особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения последовательности указанных иммуностимуляторных нуклеиновых кислот, прежде всего isPHK, состоят из или содержат нуклеиновую кислоту формулы (V) или (VI):

в которой:

G обозначает гуанозин (гуанин), уридин (урацил) или аналог гуанозина (гуанина) или уридина (урацила), предпочтительно гуанозин (гуанин) или его аналог;

X обозначает гуанозин (гуанин), уридин (урацил), аденозин (аденин), тимидин (тимин), цитидин (цитозин) или аналог указанных нуклеотидов (нуклеозиды), предпочтительно уридин (урацил) или его аналог;

N обозначает нуклеотидную последовательность, состоящую примерно из 4-50, предпочтительно примерно из 4-40, более предпочтительно примерно из 4-30 или 4-20 нуклеиновых кислот, при этом каждый N независимо друг от друга выбран из гуанозина (гуанина), уридина (урацила), аденозина (аденина), тимидина (тимина), цитидина (цитозина) или аналога этих нуклеотидов (нуклеозидов);

а обозначат целое число от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 15, наиболее предпочтительно от 1 до 10;

1 обозначает целое число от 1 до 40,

где

когда 1=1, то G обозначает гуанозин (гуанин) или его аналог,

когда 1>1, то по меньшей мере 50% указанных нуклеотидов (нуклеозидов) представляют собой гуанозин (гуанин) или его аналог;

m обозначает целое число и обозначает по меньшей мере 3;

где

когда m=3, то X обозначает уридин (урацил) или его аналог, и

когда m>3, то присутствуют по меньшей мере 3 последовательно расположенных уридина (урацила) или аналогов уридина (урацила);

n обозначает целое число от 1 до 40,

где когда n=1, то G обозначает гуанозин (гуанин) или его аналог,

когда n>1, то по меньшей мере 50% этих нуклеотидов (нуклеозидов) представляют собой гуанозин (гуанин) или его аналог;

u, v могут независимо друг от друга обозначать целое число от 0 до 50,

предпочтительно при этом, когда u=0, то v>1 или

когда v=0, то u≥1;

при этом молекула нуклеиновой кислоты формулы (IV) состоит по меньшей мере из 50 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 100 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 150 нуклеотидов, еще более предпочтительно по меньшей мере 200 нуклеотидов и наиболее предпочтительно по меньшей мере 250 нуклеотидов.

в которой:

С обозначает цитидин (цитозин), уридин (урацил) или аналог цитидина (цитозина) или уридина (урацила), предпочтительно цитидин (цитозин) или его аналог;

X обозначает гуанозин (гуанин), уридин (урацил), аденозин (аденин), тимидин (тимин), цитидин (цитозин) или аналог вышеуказанных нуклеотидов (нуклеозидов), предпочтительно уридин (урацил) или его аналог;

N обозначает нуклеотидную последовательность, состоящую примерно из 4-50, предпочтительно примерно из 4-40, более предпочтительно примерно из 4-30 или 4-20 нуклеиновых кислот, при этом N каждый независимо друг от друга выбран из гуанозина (гуанина), уридина (урацила), аденозина (аденина), тимидина (тимина), цитидина (цитозина) или аналога указанных нуклеотидов (нуклеозидов);

а обозначает целое число от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 15, наиболее предпочтительно о 1 до 10;

1 обозначает целое число от 1 до 40,

где

когда 1=1, то С обозначает цитидин (цитозин) или его аналог,

когда 1>1, то по меньшей мере 50% этих нуклеотидов (нуклеозидов) представляют собой цитидин (цитозин) или его аналог;

m обозначает целое число и обозначает по меньшей мере 3;

где

когда m=3, то X обозначает уридин (урацил) или его аналог,

когда m>3, то присутствуют по меньшей мере 3 последовательно расположенных уридина (урацила) или аналогов уридина (урацила);

n обозначает целое число от 1 до 40,

где

когда n=1, то С обозначает цитидин (цитозин) или его аналог,

когда n>1, то по меньшей мере 50% этих нуклеотидов (нуклеозидов) представляют собой цитидин (цитозин) или его аналог;

u, v могут независимо друг от друга обозначать целое число от 0 до 50,

предпочтительно при этом, когда u=0, то v>1 или

когда v=0, то u≥1;

при этом молекула нуклеиновой кислоты формулы (V) состоит по меньшей мере из 50 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 100 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 150 нуклеотидов, еще более предпочтительно по меньшей мере 200 нуклеотидов и наиболее предпочтительно по меньшей мере 250 нуклеотидов.

В формуле (VI) любое из определений, указанных выше для элементов N (т.е. N_u и N_v) и X (X_m), прежде всего для указанной выше коровой структуры, а также для целых чисел а, l, m, n, и и v, применимо также к элементам формулы (VI) соответственно, при этом в формуле (VI) коровая структура описывается формулой C_lX_mC_n. Определение пограничных элементов N_u и N_v идентично определениям, указанным выше для N_u и N_v.

Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно иммуностимулирующей РНК формулы (V), можно выбирать из любой из последовательностей SEQ ID NO: 382-395 или из последовательности, идентичной по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 90% или даже 95% указанным последовательностям.

В этом контексте особенно предпочтительными являются иммуностимулирующие РНК, имеющие SEQ ID NO: 5, 394 и 10072.

Согласно другому наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения молекулу нуклеиновой кислоты формулы (VI) можно выбирать, например, из любой из последовательностей SEQ ID NO: 396 или 397 или из любой из последовательностей, идентичных по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90% или даже 95% любой из указанных последовательностей.

Все модификации, указанные в кодирующей РНК, можно применять также в контексте некодирующей РНК, если это является приемлемым.

Комбинация кодирующей и некодирующей РНК

В особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения содержащая РНК предлагаемая в изобретении композиция содержит по меньшей мере одну РНК, кодирующую по меньшей мере один пептид или белок, и по меньшей мере одну некодирующую РНК, указанную выше, предпочтительно по меньшей мере одну иммуностимулирующую РНК.

Особенно предпочтительными являются следующие варианты осуществления изобретения:

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, предпочтительно IL-2, IL-12, IL-15 или CD40L,

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один хемокин,

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один продукт гена самоубийства, предпочтительно тимидинкиназу вируса герпеса простого,

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один иммуногенный белок или пептид, предпочтительно NP-белок вируса гриппа,

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один индуктор апоптоза, предпочтительно цитохром с или каспазу 3,

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один индуктор ангиогенеза,

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один белок теплового шока,

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один опухолевый антиген,

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один ингибитор β-катенина,

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один активатор пути STING,

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один модулятор контрольных «точек», предпочтительно антитело против PD-1, PD-L1 или CTLA4,

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один активатор врожденного иммунитета, предпочтительно конститутивно активный вариант RIG-1,

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере одно антитело,

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один рецептор-ловушку, предпочтительно растворимый PD-1-рецептор,

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один ингибитор супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC),

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один ингибитор пути IDO;

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: XY или YY, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один белок или пептид, который связывается с ингибиторами апоптоза.

Наиболее предпочтительными являются следующие варианты осуществления изобретения:

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, предпочтительно IL-2, IL-12, IL-15 или CD40L, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один иммуногенный белок или пептид, предпочтительно NP-белок вируса гриппа,

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, предпочтительно IL-2, IL-12, IL-15 или CD40L, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один активатор врожденного иммунитета, предпочтительно конститутивно активный вариант RIG-1,

• иммуностимулирующая РНК, предпочтительно имеющая SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один цитокин, предпочтительно IL-2, IL-12 или IL-15, + РНК, предпочтительно мРНК, кодирующая по меньшей мере один дополнительный цитокин, предпочтительно CD40L.

Получение препаративных форм и комплексов

По меньшей мере одну РНК в предлагаемой в изобретении композиции можно вводить в виде «голой» РНК без ассоциации с каким-либо дополнительным наполнителем, носителем, агентом для трансфекции или комплексообразования.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения РНК в предлагаемой в изобретении композиции включают в препаративную форму в сочетании с дополнительными соединениями для повышения эффективности трансфекции и/или иммуностимуляторных свойств РНК. Указанные соединения в контексте настоящего описания называют носителями, наполнителями или агентами для трансфекции или комплексообразования. Предпочтительно включают в препаративную форму РНК в сочетании с одним или несколькими катионными или поликатионными соединениями, предпочтительно катионными или поликатионными полимерами, катионными или поликатионными пептидами или белками, катионными или поликатионными полисахаридами, катионными или поликатионными липидами и/или с полимерным носителем. В контексте настоящего изобретения указанные катионные или поликатионные полимеры, катионные или поликатионные пептиды или белки, катионные или поликатионные полисахариды, катионные или поликатионные липиды или полимерные носители можно применять в качестве носителей, наполнителей, агентов для трансфекции или комплексообразования нуклеиновых кислот. Таким образом, в следующем варианте осуществления изобретения предпочтительно, чтобы по меньшей мере одна РНК или любая другая нуклеиновая кислота, содержащаяся в предлагаемой в изобретении композиции, была ассоциирована с или входила в комплекс с катионным или поликатионным соединением или полимерным носителем, необязательно в массовом соотношении РНК или нуклеиновой кислоты и катионного или поликатионного соединения и/или полимерного носителя, выбранном из диапазона, составляющего от примерно 6:1 до примерно 0,25:1 (мас./мас.), более предпочтительно от примерно 5:1 до примерно 0,5:1 (мас./мас.), еще более предпочтительно от примерно 4:1 до примерно 1:1 (мас./мас.) или от примерно 3:1 до примерно 1:1 (мас./мас.), и наиболее предпочтительно в соотношении, составляющем от примерно 3:1 до примерно 2:1 (мас./мас.); или необязательно в соотношении азота/фосфата в РНК или нуклеиновой кислоте и катионном или поликатионном соединении и/или полимерном носителе, в диапазоне, составляющем по меньшей мере примерно 0,1-10, предпочтительно в диапазоне примерно. 0,3-4 или 0,3-1 и наиболее предпочтительно в диапазоне примерно 0,5-1 или 0,7-1, и даже наиболее предпочтительно в диапазоне примерно 0,3-0.9 или 0,5-0,9.

Соотношение между по меньшей мере одной РНК, указанной выше, и катионным или поликатионным соединением можно рассчитывать на основе соотношения азота/фосфата (N/P-соотношение) всех указанных компонентов. В контексте настоящего изобретения N/P-соотношение предпочтительно находится в диапазоне, составляющем примерно 0,01-4, 0,01-2, 0,1-2 или 0,1-1.5 касательно соотношения нуклеиновые кислоты: катионный или поликатионный пептид, входящий в предлагаемую в настоящем изобретении вакцину, и наиболее предпочтительно в диапазоне примерно 0,1-1. Указанное соотношение N/P предпочтительно создают для получения высокой способности к трансфекции in vivo и транспорта в клеточные мембраны и через них. Предпочтительно для этой цели основой катионного или поликатионного соединения и/или полимерных носителей, применяемых согласно настоящему описанию, являются пептидные последовательности.

Катионные или поликатионные соединения, предлагаемые в изобретении, которые являются наиболее предпочтительными агентами в указанном контексте, включают протамин, нуклеолин, спермин или спермидин или другие катионные пептиды или белки, такие как поли-L-лизин (PLL), полиаргинин, основные полипептиды, обладающие способностью проникать в клетку пептиды (СРР), такие как ВИЧ-связывающие пептиды, Tat ВИЧ-1 (ВИЧ), происходящие из Tat пептиды, пенетратин, полученные из VP22 пептиды или аналоги, VP22 HSV (вирус герпеса простого), MAP, KALA или домены трансдукции белков (PTD), РрТ620, богатые пролином пептиды, богатые аргинином пептиды, богатые лизином пептиды, МРО-пептид(ы), Рер-1, L-олигомеры, пептид(ы) кальцитонина, происходящие из Antennapedia пептиды (прежде всего, происходящие из Drosophila antennapedia), pAntp, pIsl, FGF, лактоферрин, транспортан, буфорин-2, Вас715-24, SynB, SynB(l), pVEC, происходящие из hCT пептиды, SAP или гистоны. В этом контексте наиболее предпочтительным является протамин.

Кроме того, предпочтительные катионные или поликатионные белки или пептиды можно выбирать из следующих белков или пептидов, которые имеют представленную ниже общую формулу (VII):

в которой 1 + m + n + о + х обозначают 8-15 и 1, m, n или о каждый независимо друг от друга могут представлять собой любые числа, выбранные из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, при условии, что общее содержание Arg, Lys, His и Orn составляет по меньшей мере 50% от общего содержания аминокислот в олигопептиде; а Хаа может обозначать любую аминокислоту, выбранную из нативных (т.е. встречающихся в естественных условиях) или не встречающихся в естественных условиях аминокислот за исключением Arg, Lys, His или Orn; и x может обозначать любое число, выбранное из 0, 1, 2, 3 или 4, при условии, что общее содержание Хаа не превышает 50% от общего содержания аминокислот в олигопептиде. В этом контексте наиболее предпочтительными катионными пептидами являются, например, Arg₇, Arg₈, Arg₉, H₃R₉, R₉H₃, H₃R₉H₃, YSSR₉SSY, (RKH)₄, Y(RKH)₂R и т.д. В этом контексте содержание WO 2009/030481 включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Полимерный носитель, применяемый согласно изобретению, может представлять собой полимерный носитель, образованный посредством соединения катионных компонентов дисульфидными мостиками.

Согласно другому особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения катионные или поликатионные пептиды или белки полимерного носителя, имеющего эмпирическую общую формулу (VII), указанную выше, и которые содержат или которые дополнительно модифицированы так, что содержат по меньшей мере одну -SH-группу, можно выбирать из (но, не ограничиваясь только ими), подгруппы общих формул Arg₇ (обозначают также как R₇), Arg₉ (обозначают также как R₉), Arg₁₂ (обозначают также как R₁₂).

Согласно другому особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения катионные или поликатионные пептиды или белки полимерного носителя, когда они описываются формулой {(Arg)₁;(Lys)_m;(His)_n;(Orn)_o;(Xaa)_x} (формула (VII)), представленной выше, и которые содержат или дополнительно модифицированы так, что они содержат по меньшей мере одну -SH-группу, можно выбирать из подформулы (VIIa) (но, не ограничиваясь только ею):

в которой (Arg)_l;(Lys)_m;(His)_n;(Orn)_o и х имеют значения, указанные в настоящем описании, Хаа' обозначает любую аминокислоту, выбранную из нативных (т.е. встречающихся в естественных условиях) или не встречающихся в естественных условиях аминокислот за исключением Arg, Lys, His, Orn или Cys, и у обозначает любое число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80 и 81-90, при условии, что общее содержание Arg (аргинин), Lys (лизин), His (гистидин) и Orn (орнитин) составляет по меньшей мере 10% от всех аминокислот олигопептида.

Этот вариант осуществления изобретения можно применять к ситуациям, когда катионный или поликатионный пептид или белок полимерного носителя, например, подпадающий по эмпирическую формулу

,

представленную выше, содержит или модифицирован так, что содержит по меньшей мере один остаток цистеина в качестве SH-группы, указанной выше, в результате чего указанный катионный или поликатионный пептид в качестве катионного компонента носителя содержит по меньшей мере один остаток цистеина, который может образовывать дисульфидную связь с другими компонентами полимерного носителя.

Их примеры могут включать любую из следующих последовательностей: Cys(Arg₇), Cys(Arg₈), Cys(Arg₉), Cys(Arg₁₀), Cys(Arg₁₁), Cys(Arg₁₂), Cys(Arg₁₃), Cys(Arg₁₄), Cys(Arg₁₅), Cys(Arg₁₆), Cys(Arg₁₇), Cys(Arg₁₈), Cys(Arg₁₉), Cys(Arg₂₀).

Согласно другому наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения катионные или поликатионные пептиды или белки полимерного носителя, когда они описываются формулой {(Arg)_l;(Lys)_m;(His)_n;(Orn)_o;(Xaa)_x} (формула (VII)), представленной выше, можно выбирать из подформулы (VIIb) (но, не ограничиваясь только ею):

в которой эмпирическая формула {(Arg)_l;(Lys)_m;(His)_n;(Orn)_o;(Xaa)_x} (формула (VII)) определена в настоящем описании и образует ядро аминокислотной последовательности, соответствующей (полуэмпирической) формуле (I), и в которой Cys₁ и Cys₂ представляют собой остатки цистеина, расположенные проксимально или терминально относительно (Arg)_l;(Lys)_m;(His)_n;(Orn)_o;(Xaa)_x. Репрезентативные примеры могут содержать любую из вышеуказанных последовательностей, фланкированных двумя остатками Cys, и имеют следующие последовательности:

Cys(Arg₇)Cys, Cys(Arg₈)Cys, Cys(Arg₉)Cys, Cys(Arg₁₀)Cys, Cys(Arg₁₁)Cys, Cys(Arg₁₂)Cys, Cys(Arg₁₃)Cys, Cys(Arg₁₄)Cys, Cys(Arg₁₅)Cys, Cys(Arg₁₆)Cys, Cys(Arg₁₇)Cys, Cys(Arg₁₈)Cys, Cys(Arg₁₉)Cys, Cys(Arg₂₀)Cys (SEQ ID NO: 10-23).

Этот вариант осуществления изобретения можно применять к ситуациям, когда катионный или поликатионный пептид или белок полимерного носителя, например, описываемый эмпирической формулой

,

которая представлена выше, модифицирован с помощью по меньшей мере двух остатков цистеина в качестве -SH-групп, как указано выше, в результате чего указанный катионный или поликатионный пептид, который входит в предлагаемый в изобретении комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу, в качестве катионного компонента, содержит по меньшей мере два остатка (терминальных) цистеина, которые могут образовывать дисульфидную связь с другими компонентами полимерного носителя.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения полимерный носитель образован, содержит или состоит из пептида CysArg₁₂Cys (SEQ ID NO: 15) или CysArg₁₂ (CRRRRRRRRRRRR).

Согласно второму альтернативному варианту по меньшей мере один катионный (или поликатионный) компонент полимерного носителя можно выбирать, например, из любого (непептидного) катионного или поликатионного полимера, пригодного для указанной цели, при условии, что этот (непептидный) катионный или поликатионный полимер содержит или модифицирован так, что содержит по меньшей мере одну SH-группу, которая пригодна для образования дисульфидной связи, соединяющей катионный или поликатионный полимер с другим компонентом полимерного носителя, указанного в настоящем описании. Таким образом, согласно настоящему изобретению полимерный носитель может содержать одинаковые или различные катионные или поликатионные полимеры.

В конкретном варианте, когда катионный компонент полимерного носителя содержит (непептидный) катионный или поликатионный полимер, то катионные свойства (непептидного) катионного или поликатионного полимера могут определяться уровнем катионных зарядов по сравнению с общим уровнем зарядов компонентов катионного полимера. Предпочтительно уровень катионных зарядов в катионном полимере при (физиологическом) значении рН, указанном в настоящем описании, составляет по меньшей мере 10%, 20% или 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, 60% или 70%, но также предпочтительно по меньшей мере 80%, 90% или даже 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, или может находиться в диапазоне примерно от 10% до 90%, более предпочтительно в диапазоне примерно от 30% до 100%, еще более предпочтительно в диапазоне примерно от 50% до 100%, например, 50, 60, 70, 80%, 90% или 100%, или в диапазоне, границами которого являются любые два из указанных выше значений, при условии, что уровень всех зарядов, например, положительных и отрицательных зарядов при (физиологическом) значении рН, указанном в настоящем описании, во всем катионном полимере составляет 100%.

Предпочтительно (непептидный) катионный компонент полимерного носителя представляет собой катионный или поликатионный полимер, как правило, имеющий молекулярную массу примерно от 0,1 или 0,5 кДа до примерно 100 кДа, предпочтительно от примерно 1 до примерно 75 кДа, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 50 кДа, еще более предпочтительно от примерно 5 до примерно 30 кДа, или молекулярную массу от примерно 10 до примерно 50 кДа, еще более предпочтительно от примерно 10 до примерно 30 кДа. Кроме того, (непептидный) катионный или поликатионный полимер, как правило, несет по меньшей мере одну -SH-группу, которая может образовывать дисульфидную связь при конденсации либо с любыми другими катионными компонентами, либо с другими компонентами полимерного носителя, указанного в настоящем описании.

В вышеуказанном контексте (непептидный) катионный компонент полимерного носителя можно выбирать из группы, включающей акрилаты, модифицированные акрилаты, такие как pDMAEMA (поли(диметиламиноэтилметилакрилат)), хитозаны, азиридины или 2-этил-2-оксазолин (образующий олигоэтиленимины или модифицированные олигоэтиленимины), полимеры, получаемые взаимодействием бисакрилатов с аминами, которые образуют олиго-бета-аминоэфиры или полиамидоамины, или другие полимеры типа сложных полиэфиров, поликарбонатов и т.д. Каждая молекула указанных (непептидных) катионных или поликатионных полимеров, как правило, несет по меньшей мере одну SH-группу, при этом по меньшей мере одну SH-группу можно интродуцировать в (непептидный) катионный или поликатионный полимер посредством химических модификаций, например, с использованием иминотиолана, 3-тиопропионовой кислоты, или интродуцировать содержащие -SH-группы аминокислоты, такие как цистеин, или любую другую (модифицированную) аминокислоту. Указанные -SH-группы предпочтительно представляют собой уже описанные выше группы.

Перекрестно сшитые дисульфидными связями катионные компоненты могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Полимерный носитель может содержать также дополнительные компоненты. Кроме того, особенно предпочтительно, когда полимерный носитель, применяемый согласно настоящему изобретению, содержит смеси катионных пептидов, белков или полимеров и необязательно другие компоненты, указанные в настоящем описании, которые перекрестно сшиты дисульфидными связями, как указано в настоящем описании. В этом контексте описание WO 2012/013326 включено в настоящее описание в качестве ссылки.

В этом контексте катионные компоненты, которые формируют основу полимерного носителя путем перекрестного сшивания с помощью дисульфидной связи, как правило, выбирают из любого пригодного катионного или поликатионного пептида, белка или полимера, приемлемого для этой цели прежде всего любого катионного или поликатионного пептида, белка или полимера, который обладает способностью образовывать комплекс с РНК или нуклеиновой кислотой, предлагаемой в настоящем изобретении, и тем самым предпочтительно конденсирует РНК или нуклеиновую кислоту. Катионный или поликатионный пептид, белок или полимер предпочтительно представляет собой линейную молекулу, однако можно применять также разветвленные катионные или поликатионные пептиды, белки или полимеры.

Каждый перекрестно сшитый дисульфидными связями катионный или поликатионный белок, пептид или полимер полимерного носителя, который можно применять для получения комплекса, например, с РНК, входящей в предлагаемую в изобретении композицию, или любой дополнительной нуклеиновой кислотой, входящей в композицию, предлагаемую в изобретении, содержит по меньшей мере одну -SH-группу, наиболее предпочтительно по меньшей мере один цистеиновый остаток или любую другую химическую группу, несущую SH-группу, которая может образовывать дисульфидную связь при конденсации по меньшей мере с одним другим катионным или поликатионным белком, пептидом или полимером в качестве катионного компонента полимерного носителя, указанного в настоящем описании.

Как указано выше, полимерный носитель, который можно применять для образования комплекса, например, с РНК, входящей в предлагаемую в изобретении композицию, или любой дополнительной нуклеиновой кислотой, входящей в предлагаемую в изобретении композицию, может быть образован из сшитых дисульфидами катионных (или поликатионных) компонентов.

Нуклеиновые кислоты, входящие в комплексы с указанными полимерными носителями, обозначают также как «комплексы полимерного носителя и карго-молекул».

В этом контексте особенно предпочтительно, чтобы, если иммуностимулирующую РНК применяют в контексте настоящего изобретения, то эта иммуностимулирующая РНК находится в комплексе с полимерным носителем, указанным выше. Предпочтительно иммуностимулирующая РНК, (например, содержащая последовательность РНК, соответствующую любой из формул III-VI), наиболее предпочтительно содержащая последовательность РНК SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, находится в комплексе с полимерным носителем, содержащим или образованным перекрестно сшитыми с помощью дисульфидной связи пептидами формул VII, VIIa или VIIb, предпочтительно полимерным носителем, образованным Cys(Arg₁₂)Cys или Cys(Arg₁₂). Указанный особенно предпочтительный вариант в контексте настоящего описания обозначают также как «РНК-адъювант».

В другом конкретном варианте осуществления изобретения полимерный носитель, который можно применять для получения комплекса с РНК или любой дополнительной нуклеиновой кислотой, входящей в предлагаемую в изобретении композицию, можно выбирать из молекулы полимерного носителя общей формулы (VIII):

в которой

Р¹ и Р³ являются различными или идентичными друг другу и представляют собой линейную или разветвленную гидрофильную полимерную цепь, каждый Р¹ и Р³ несет по меньшей мере одну SH-группу, способную образовывать дисульфидную связь при конденсации с компонентом Р², или альтернативно этому с (АА) (аминокислотный компонент), (АА)_x или [(AA)_x]_z, если указанные компоненты используются в качестве линкера между Р¹ и Р² или Р³ и Р²) и/или с другими компонентами (например, (АА), (АА)Х, [(AA)X]Z или L), линейную или разветвленную гидрофильную полимерную цепь, выбранную независимо друг от друга из полиэтиленгликоля (ПЭГ), поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламида, поли-2-(метакрилоилокси)этилфосфорилхолинов, поли(гидроксиалкил-L-аспарагина), поли(2-(метакрилоилокси)этилфосфорилхолина), гидроксиэтилкрахмала или поли(гидроксиалкид-L-глутамина), где гидрофильная полимерная цепь имеет молекулярную массу от примерно 1 до примерно 100 кДа, предпочтительно от примерно 2 до примерно 25 кДа или более предпочтительно от примерно 2 до примерно 10 кДа, например, от примерно 5 до примерно 25 кДа или от 5 до примерно 10 кДа;

Р² обозначает катионный или поликатионный пептид или белок, например, указанный выше для полимерного носителя, сформированного перекрестно сшитыми дисульфидами катионными компонентами, и предпочтительно имеющий длину от примерно 3 до примерно 100 аминокислот, более предпочтительно имеющий длину от примерно 3 до примерно 50 аминокислот, еще более предпочтительно имеющий длину от примерно 3 до примерно 25 аминокислот, например, имеющий длину примерно от 3 до 10, от 5 до 15, от 10 до 20 или от 15 до 25 аминокислот, более предпочтительно имеющий длину от примерно 5 до примерно 20 и еще более предпочтительно имеющий длину от примерно 10 до примерно 20 аминокислот; или

обозначает катионный или поликатионный полимер, например, указанный выше для полимерного носителя, сформированного перекрестно сшитыми дисульфидами катионными компонентами, как правило, имеющий молекулярную массу от примерно 0,5 до примерно 30 кДа, включая молекулярную массу от примерно 1 до примерно 20 кДа, еще более предпочтительно от примерно 1,5 до примерно 10 кДа, или имеющий молекулярную массу от примерно 0,5 до примерно 100 кДа, включая молекулярную массу от примерно 10 до примерно 50 кДа, еще более предпочтительно от примерно 10 до примерно 30 кДа;

каждый Р² несет по меньшей мере две SH-группы, способные образовывать дисульфидную связь при конденсации с другими компонентами Р² или с компонентом(ами) Р¹ и/или Р³, или альтернативно этому с другими компонентами (например, (АА), (АА)_x или [(AA)_x]_z);

-S-S- обозначает (обратимую) дисульфидную связь (для удобочитаемости скобки опущены), в которой S предпочтительно представляет собой серу или несущую -SH-группу, которая образует (обратимую) дисульфидную связь. (Обратимую) дисульфидную связь предпочтительно получают путем конденсации SH-групп либо компонентов Р¹ и Р², либо Р² и Р², либо Р² и Р³, либо необязательно других компонентов, указанных в настоящем описании (например, L, (АА), (АА)_x, [(AA)_x]_z и т.д.); -SH-группа может представлять собой часть структуры указанных компонентов или может быть добавлена путем модификации, как указано ниже;

L обозначает необязательный лиганд, который может присутствовать или отсутствовать, и его можно выбирать независимо друг от друга из RGD, трансферрина, фолата, сигнального пептида или сигнальной последовательности, сигнала или последовательности локализации, сигнала или последовательности ядерной локализации (NLS), антитела, проникающего в клетку пептида (например, ТАТ или KALA), лиганда рецептора (например, цитокинов, гормонов, факторов роста и т.д.), малых молекул (например, углеводов типа маннозы или галактозы, или синтетических лигандов), низкомолекулярных агонистов, ингибиторов или антагонистов рецепторов (например, аналогов RGD-пептидомиметиков) или любых других белков, указанных в настоящем описании, и т.д.;

n обозначает целое число, как правило выбранное из диапазона примерно от 1 до 50, предпочтительно из диапазона примерно от 1, 2 или 3 до 30, более предпочтительно из диапазона примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 25, или диапазона примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 20, или диапазона примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 15, или диапазона примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 10, включая, например, диапазон примерно от 4 до 9, от 4 до 10, от 3 до 20, от 4 до 20, от 5 до 20 или от 10 до 20, или диапазон примерно от 3 до 15, от 4 до 15, от 5 до 15 или от 10 до 15, или диапазон примерно от 6 до 11 или от 7 до 10. Наиболее предпочтительно n находится в диапазоне примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 10, более предпочтительно в диапазоне примерно от 1, 2, 3 или 4 до 9, в диапазоне примерно от 1, 2, 3 или 4 до 8, или в диапазоне примерно от 1, 2 или 3 до 7.

В этом контексте описание WO 2011/026641 и WO 2012/116811 включено в настоящее описание в качестве ссылки. Каждый из гидрофильных полимеров Р¹ и Р³, как правило, несет по меньшей мере одну -SH-группу, где по меньшей мере одна SH-группа может образовывать дисульфидную связь при взаимодействии с компонентом Р² или с компонентом (АА) или (АА)_x, если его используют в качестве линкера между Р¹ и Р² или Р³ и Р², как указано ниже, и необязательно с другим компонентом, например, L и/или (АА) или (АА)_x, например, если он несет две или большее количество -SH-групп. Следующие подформулы «Р¹-S-S-P²» и «Р²-S-S-P³» в представленной выше общей формуле, 1 3 в которой все S, Р¹ и Р³ имеют указанные выше значения, как правило, описывают ситуацию, когда одна SH-группа гидрофильных полимеров Р¹ и Р³ сконденсирована с одной -SH-группой компонента Р² в представленной выше общей формуле, где оба атома серы в указанных SH-группах образуют дисульфидную связь S-S-. Указанные SH-группы, как правило, присутствуют в каждом из гидрофильных полимеров Р¹ и Р³, например, присутствуют в локализованном внутри него цистеине или любой другой (модифицированной) аминокислоте или соединении, которая/которое несет -SH-группу. Следовательно, подформулы «Р¹-S-S-P²» и «Р²-S-S-P³» можно записать также в виде «Р¹-Cys-Cys-P²» и «Р²-Cys-Cys-P³», если SH-группа присутствует в цистеине, где понятие Cys-Cys обозначает два цистеина, сцепленных дисульфидной связью, но не пептидной связью. В этом случае понятие «-S-S-» в указанных формулах можно записать также в виде «-S-Cys», в виде «-Cys-S» или в виде «-Cys-Cys-». В этом контексте понятие «-Cys-Cys-» описывает не пептидную связь, а сцепление двух цистеинов через их SH-группы с образованием дисульфидной связи. Таким образом, понятие «-Cys-Cys-» можно записать также в общем виде как «-(Cys-S)-(S-Cys)-», где в рассматриваемом конкретном случае S обозначает атом серы SH-группы цистеина. Аналогично этому понятия «-S-Cys» и «-Cys-S» обозначают дисульфидную связь между содержащим SH-группу фрагментом и цистеином, которые можно записать также как «-S-(S-Cys)» и «-(Cys-S)-S». Альтернативно этому гидрофильные полимеры Р¹ и Р³ можно модифицировать -SH-группой, предпочтительно посредством химического взаимодействия с соединением, несущим SH-группу, так, чтобы каждый из гидрофильных полимеров Р¹ и Р³ нес по меньшей мере одну указанную -SH-группу. Такое соединение, несущее -SH-группу, может представлять собой, например, (дополнительный) цистеин или любую другую (модифицированную) аминокислоту, которая несет -SH-группу. Такое соединение может представлять собой также отличное от аминокислоты соединение или группу, которое/которая содержит или дает возможность интродуцировать SH-группу в гидрофильные полимеры Р¹ и Р³, представленные в настоящем описании. Такие отличные от аминокислот соединения можно присоединять к гидрофильным полимерам Р¹ и Р³ полимерного носителя посредством химических взаимодействий или путем связывания с соединениями, например, путем связывания с 3-тиопропионовой кислотой или тиоимоланом, путем образования амида (например, карбоновые кислоты, сульфоновые кислоты, амины и т.д.), путем реакции присоединения по Михаэлю (например, малеимидные группы, ненасыщенные карбонилы и т.д.), с помощью клик-химии (например, азиды или алкины), с помощью метатезиса алкенов/алкинов (например, алкены или алкины), формирования иминов или гидрозонов (альдегиды или кетоны, гидразины, гидроксиламины, амины), реакций комплексообразования (авидин, биотин, белок G) или с компонентами, которые допускают реакции замещения Sn-типа (например, галогеналканы, тиолы, спирты, амины, гидразины, гидразиды, эфиры сульфоновых кислот, соли оксифосфония) или другими химическими группами, которые можно использовать для присоединения других компонентов. В этом контексте наиболее предпочтительным производным ПЭГ является альфа-метокси-омега-меркапто-поли(этиленгликоль). В каждом случае SH-группа, например, цистеина или любой другой (модифицированной) аминокислоты или соединения, может присутствовать на концах или в любом положении внутри гидрофильных полимеров Р¹ и Р³. Как указано в настоящем описании, каждый из гидрофильных полимеров Р¹ и Р³, как правило, несет по меньшей мере одну SH-группу, предпочтительно на одном конце, но может содержать также две или даже большее количество -SH-групп, которые можно использовать для дополнительного присоединения других компонентов, указанных в настоящем описании, предпочтительно других функциональных пептидов или белков, например, лиганда, аминокислотного компонента (АА) или (АА)_x, антител, проникающих в клетку пептидов или энхансерных пептидов (например, ТАТ, KALA) и т.д.

Как указано выше, лиганды (L) можно необязательно применять в молекуле полимерного носителя общей формулы (VIII), например, для направления предлагаемого в изобретении полимера-носителя и его полной «карго-молекулы» (адъювантый компонент и/или антиген в предлагаемой в изобретении композиции или композиции вакцины) в конкретные клетки. Их можно независимо друг от друга выбирать из RGD, трансферрина, фолата, сигнального пептида или сигнальной последовательности, сигнала или последовательности локализации, сигнала или последовательности ядерной локализации (NLS), антитела, проникающего в клетку пептида (например, ТАТ или KALA), лиганда рецептора (например, цитокинов, гормонов, факторов роста и т.д.), малых молекул (например, углеводов типа маннозы или галактозы, или синтетических лигандов), низкомолекулярных агонистов, ингибиторов или антагонистов рецепторов (например, аналогов RGD-пептидомиметиков) или любых других таких молекул, которые указаны ниже, и т.д. Особенно предпочтительными являются обладающие способностью проникать в клетку пептиды (СРР), которые индуцируют опосредуемое значением рН конформационное изменение в эндосоме и приводят к улучшенному высвобождению полимерного носителя (в комплексе с нуклеиновой кислотой) из эндосомы путем встраивания в липидный слой липосомы. Указанные так называемые СРР или катионные пептиды для транспортации могут представлять собой (но, не ограничиваясь только ими) протамин, нуклеолин, спермин или спермидин, поли-L-лизин (PLL), полипептиды, химерные СРР, такие как транспортан, или MPG-пептиды, ВИЧ-связывающие пептиды, Tat, ВИЧ-1 Tat (ВИЧ), происходящие из Tat пептиды, олигоаргинины, представители семейства пенетратина, например, пенетратин, происходящие из Antennapedia пептиды (прежде всего из Drosophila antennapedia), pAntp, pIsl и т.д., происходящие из антимикробных пептидов СРР, например, буфорин-2, Вас715-24, SynB, SynB(l), pVEC, происходящие из hCT пептиды, SAP, MAP, KALA, PpTG20, богатые пролином пептиды, L-олигомеры, богатые аргинином пептиды, пептиды кальцитонина, FGF, лактоферрин, поли-L-лизин, полиаргинин, гистоны, полученные из VP22 пептиды или аналоги, Erns пестивирусов, HSV, VP22 (вирус герпеса простого), MAP, KALA или домены трансдукции белков (PTD), РрТ620, богатые пролином пептиды, богатые аргинином пептиды, богатые лизином петиды, Рер-1, L-олигомеры, пептид(ы) кальцитонина и т.д. Особенно предпочтительной в этом контексте является манноза в качестве лиганда для антигенпрезентирующих клеток-мишеней, которые несут на их клеточной поверхности рецепторы маннозы. В другом предпочтительном аспекте первого варианта осуществления настоящего изобретения в качестве оптимального лиганда можно применять галактозу для направленного переноса к гепатоцитам. Указанные лиганды можно присоединять к компоненту Р¹ и/или Р³ с помощью обратимых дисульфидных связей, указанных ниже, или с помощью других возможных путей химического присоединения, путем образования амида (например, карбоновые кислоты, сульфоновые кислоты, амины и т.д.), путем реакции присоединения по Михаэлю (например, малеимидные группы, α,β-ненасыщенные карбонилы и т.д.), с помощью клик-химии (например, азиды или алкины), с помощью метатезиса алкенов/алкинов (например, алкены или алкины), формирования иминов или гидрозонов (альдегиды или кетоны, гидразины, гидроксиламины, амины), реакций комплексообразования (авидин, биотин, белок G) или с компонентами, которые допускают реакции замещения S_n-типа (например, галогеналканы, тиолы, спирты, амины, гидразины, гидразиды, эфиры сульфоновых кислот, соли оксифосфония) или другими химическими группами, которые можно использовать для присоединения других компонентов.

В контексте формулы (VIII) в настоящем изобретении компоненты Р¹ и Р³ представляют собой линейную или разветвленную гидрофильную полимерную цепь, содержащую по меньшей мере одну-SH-группу, каждый Р¹ и Р³ выбирают независимо друг от друга из полиэтиленгликоля (ПЭГ), поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламида, поли-2-(метакрилоилокси)этилфосфорилхолинов, поли(гидроксиалкил-L-аспарагина), поли(2-(метакрилоилокси)этилфосфорилхолина), гидроксиэтилкрахмала или поли(гидроксиалкид-L-глутамина). Р¹ и Р³ могут быть идентичными или отличаться друг от друга. Предпочтительно каждый из гидрофильных полимеров Р¹ и Р³ имеет молекулярную массу от примерно 1 до примерно 100 кДа, предпочтительно от примерно 1 до примерно 75 кДа или более предпочтительно от примерно 5 до примерно 50 кДа, еще более предпочтительно от примерно 5 до примерно 25 кДа. Кроме того, каждый из гидрофильных полимеров Р¹ и Р³, как правило, несет по меньшей мере одну -SH-группу, где по меньшей мере одна -SH-группа может образовывать дисульфидную связь при взаимодействии с компонентом Р² или с компонентом (АА) или (АА)_x, если его используют в качестве линкера между Р¹ и Р² или Р³ и Р², как указано ниже, и необязательно с другим компонентом, например, L и/или (АА) или (АА)_x, например, если он несет две или большее количество -SH-групп. Следующие подформулы «Р¹-S-Р²» и «Р²-S-S-P³» в представленной выше общей формуле (VII) (для удобочитаемости скобки опущены), в которой все S, Р¹ и Р³ имеют указанные выше значения, как правило, описывают ситуацию, когда одна -SH-группа гидрофильных полимеров Р¹ и Р³ сконденсирована с одной SH-группой компонента Р в представленной выше общей формуле (VII), где оба атома серы в указанных -SH-группах образуют дисульфидную связь -S-S-. Указанные -SH-группы, как правило, присутствуют в каждом из гидрофильных полимеров Р¹ и Р³, например, присутствуют в локализованном внутри него цистеине или любой другой (модифицированной) аминокислоте или соединении, которая/которое несет SH-группу. Следовательно, подформулы «Р¹-S-S-P²» и «Р²-S-S-P³» можно записать также в виде «Р¹-Cys-Cys-P²» и «Р²-Cys-Cys-P³», если -SH-группа присутствует в цистеине, где понятие Cys-Cys обозначает два цистеина, сцепленных дисульфидной связью, но не пептидной связью. В этом случае понятие «-S-S-» в указанных формулах можно записать также в виде «-S-Cys», в виде «-Cys-S» или в виде «-Cys-Cys-». В этом контексте понятие «-Cys-Cys-» описывает не пептидную связь, а сцепление двух цистеинов через их -SH-группы с образованием дисульфидной связи. Таким образом, понятие «-Cys-Cys-» можно записать также в общем виде как «-(Cys-S)-(S-Cys)-», где в рассматриваемом конкретном случае S обозначает атом серы -SH-группы цистеина. Аналогично этому понятия «-S-Cys» и «-Cys-S» обозначают дисульфидную связь между содержащим -SH-группу фрагментом и цистеином, которые можно записать также как «-S-(S-Cys)» и «-(Cys-S)-S». Альтернативно этому гидрофильные полимеры Р¹ и Р³ можно модифицировать -SH-группой, предпочтительно посредством химического взаимодействия с соединением, несущим -SH-группу, так, чтобы каждый из гидрофильных полимеров Р¹ и Р³ нес по меньшей мере одну указанную SH-группу. Такое соединение, несущее -SH-группу, может представлять собой, например, (дополнительный) цистеин или любую другую (модифицированную) аминокислоту, которая несет -SH-группу. Такое соединение может представлять собой также отличное от аминокислоты соединение или группу, которое/которая содержит или дает возможность интродуцировать SH-группу в гидрофильные полимеры Р¹ и Р³, представленные в настоящем описании. Такие отличные от аминокислот соединения можно присоединять к гидрофильным полимерам Р¹ и Р³ формулы (VII) полимерного носителя, предлагаемого в настоящем изобретении, посредством химических взаимодействий или путем связывания с соединениями, например, путем связывания с 3-тиопропионовой кислотой или тиоимоланом, путем образования амида (например, карбоновые кислоты, сульфоновые кислоты, амины и т.д.), путем реакции присоединения по Михаэлю (например, малеимидные группы, α,β-ненасыщенные карбонилы и т.д.), с помощью клик-химии (например, азиды или алкины), с помощью метатезиса алкенов/алкинов (например, алкены или алкины), формирования иминов или гидрозонов (альдегиды или кетоны, гидразины, гидроксиламины, амины), реакций комплексообразования (авидин, биотин, белок G) или с компонентами, которые допускают реакции замещения S_n-типа (например, галогеналканы, тиолы, спирты, амины, гидразины, гидразиды, эфиры сульфоновых кислот, соли оксифосфония) или другими химическими группами, которые можно использовать для присоединения других компонентов. В этом контексте наиболее предпочтительным производным ПЭГ является альфа-метокси-омега-меркапто-поли(этиленгликоль). В каждом случае SH-группа, например, цистеина или любой другой (модифицированной) аминокислоты или соединения, может присутствовать на концах или в любом положении внутри гидрофильных полимеров Р¹ и Р³. Как указано в настоящем описании, каждый из гидрофильных полимеров Р¹ и Р³, как правило, несет по меньшей мере одну -SH-группу, предпочтительно на одном конце, но может содержать также две или даже большее количество SH-групп, которые можно использовать для дополнительного присоединения других компонентов, указанных в настоящем описании, предпочтительно других функциональных пептидов или белков, например, лиганда, аминокислотного компонента (АА) или (АА)_x, антител, проникающих в клетку пептидов или энхансерных пептидов (например, ТАТ, KALA) и т.д.

Согласно одному предпочтительному альтернативному варианту указанные дополнительные функциональные пептиды или белки могут содержать так называемые обладающие способностью проникать в клетку пептиды (СРР) или атионные пептиды для транспортации. Наиболее предпочтительными являются СРР, которые индуцируют опосредуемое значением рН конформационное изменение в эндосоме и приводят к улучшенному высвобождению полимерного носителя (в комплексе с нуклеиновой кислотой) из эндосомы путем встраивания в липидный слой липосомы. Указанные так называемые СРР или катионные пептиды для транспортации могут представлять собой (но, не ограничиваясь только ими) протамин, нуклеолин, спермин или спермидин, поли-L-лизин (PLL), основные полипептиды, полиаргинин, химерные СРР, такие как транспортан, или MPG-пептиды, ВИЧ-связывающие пептиды, Tat, ВИЧ-1 Tat (ВИЧ), происходящие из Tat пептиды, олигоаргинины, представители семейства пенетратина, например, пенетратин, происходящие из Antennapedia пептиды (прежде всего из Drosophila antennapedia), pAntp, pIsl и т.д., происходящие из антимикробных пептидов СРР, например, буфорин-2, Вас715-24, SynB, SynB(l), pVEC, происходящие из hCT пептиды, SAP, MAP, KALA, PpTG20, богатые пролином пептиды, L-олигомеры, богатые аргинином пептиды, пептиды кальцитонина, FGF, лактоферрин, поли-L-лизин, полиаргинин, гистоны, полученные из VP22 пептиды или аналоги, Erns пестивирусов, HSV, VP22 (вирус герпеса простого), MAP, KALA или домены трансдукции белков (PTD), РрТ620, богатые пролином пептиды, богатые аргинином пептиды, богатые лизином пептиды, Рер-1, L-олигомеры, пептид(ы) кальцитонина и т.д.

Согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения каждый из гидрофильных полимеров Р¹ и Р³ формулы (VIII) полимерного носителя, применяемого согласно настоящему изобретению, может содержать также по меньшей мере одну дополнительную функциональную группу, которая обеспечивает присоединение дополнительных компонентов, указанных в настоящем описании, например, указанного выше лиганда, или функциональности, которые обеспечивают присоединение дополнительных компонентов, например, путем образования амида (например, карбоновые кислоты, сульфоновые кислоты, амины и т.д.), путем реакции присоединения по Михаэлю (например, малеимидные группы, ненасыщенные карбонилы и т.д.), с помощью клик-химии (например, азиды или алкины), с помощью метатезиса алкенов/алкинов (например, алкены или алкины), формирования иминов или гидрозонов (альдегиды или кетоны, гидразины, гидроксиламины, амины), реакций комплексообразования (авидин, биотин, белок G), или с компонентами, которые допускают реакции замещения S_n-типа (например, галогеналканы, тиолы, спирты, амины, гидразины, гидразиды, эфиры сульфоновых кислот, соли оксифосфония), или другие химические группы, которые можно использовать для присоединения других компонентов. Дополнительные функциональные группы могут содержать аминокислотный компонент (АА), указанный в настоящем описании, или (АА)_x, где (АА) предпочтительно представляет собой содержащий аминогруппу компонент, указанный выше. В указанном выше контексте х предпочтительно обозначает целое число и его можно выбирать из диапазона, составляющего примерно от 1 до 100, предпочтительно из диапазона, составляющего примерно от 1 до 50, более предпочтительно от 1 до 30, и еще более предпочтительно можно выбирать из числа 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15-30, например, из диапазона, составляющего примерно от 1 до 30, из диапазона, составляющего примерно от 1 до 15, или из числа 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, или можно выбирать из диапазона, образованного любыми двумя из вышеуказанных величин. Наиболее предпочтительно х равно 1. Указанный аминокислотный компонент (АА) или (АА)_x может содержаться в каждой части предлагаемого в изобретении полимерного носителя указанной выше формулы (VIII) и поэтому может присоединяться ко всем компонентам предлагаемого в изобретении полимерного носителя формулы (VII). Особенно предпочтительно аминокислотный компонент (АА) или (АА)_x присутствует в качестве лиганда или части повторяющегося компонента [S-P²-S]_n в формуле (VIII) предлагаемого в изобретении полимерного носителя.

В контексте полной формулы (VIII) предпочтительный полимерный носитель может определяться следующей формулой:

L-P¹-S-[Cys-P²-Cys]_n-S-P³-L

в которой L, Р¹, Р², Р³ и n имеют указанные в настоящем описании значения, S обозначает атом серы и каждый Cys несет одну SH-группу для образования дисульфидной связи.

Согласно конкретному варианту осуществления изобретения полимерный носитель формулы (VII), указанной выше, может содержать по меньшей мере один аминокислотный компонент (АА) или (АА)_x, указанный выше. Указанный аминокислотный компонент (АА) или (АА)_x может содержаться в каждой части предлагаемого в изобретении полимерного носителя указанной выше формулы (VIII), и поэтому может быть присоединен ко всем компонентам полимерного носителя формулы (VIII). Особенно предпочтительно аминокислотный компонент (АА) или (АА)_x присутствует в качестве лиганда или части повторяющегося компонента [S-P²-S]_n в формуле (VIII) полимерного носителя. Аминокислотный компонент (АА) или (АА)_x предпочтительно содержит или фланкирован (например, на конце) по меньшей мере одной содержащей -SH группой, что позволяет интродуцировать этот компонент (АА) или (АА)_x с помощью дисульфидной связи в полимерный носитель формулы (VIII), указанной в настоящем описании. Указанная содержащая SH группа может представлять собой любую содержащую-SH группу (или, естественно, один атом серы дисульфидной связи), например, остаток цистеина. В конкретном случае, когда указанная содержащая -SH группа относится к цистеину, аминокислотный компонент (АА)_x можно обозначать также как -Cys-(AA)_x- или -Cys-(AA)_x-Cys-, где Cys обозначает цистеин и содержит необходимую для образования дисульфидной связи группу SH. Содержащую SH группу можно интродуцировать также в аминокислотный компонент (АА)_x с помощью любой из модификаций или реакцией, описанных выше для компонентов Р¹, Р² или Р³. В конкретном случае, когда аминокислотный компонент (АА)_x связан с двумя компонентами полимерного носителя формулы (VIII), предпочтительно, чтобы (АА) или (АА)_x содержали по меньшей мере две -SH-группы, например, по меньшей мере два цистеина, предпочтительно на их концах. Особенно предпочтительно, если (АА) или (АА)_x является частью повторяющегося компонента [S-P²-S]_n. Альтернативно этому, аминокислотный компонент (АА) или (АА)_x интродуцируют в полимерный носитель формулы (VIII), указанный в настоящем описании, с помощью любой химически возможной реакции присоединения. Для этого аминокислотный компонент (АА) или (АА)_x содержит по меньшей мере одну дополнительную функциональную группу, которая обеспечивает присоединение его к дополнительному компоненту, указанному в настоящем описании, например, компоненту Р¹ или Р³, P², L, или другому аминокислотному компоненту (АА) или (АА)_x и т.д. Указанные функциональные группы можно выбирать из функциональностей, которые обеспечивают присоединение дополнительных компонентов, например, указанных в настоящем описании функциональностей, например, путем образования амида (например, карбоновые кислоты, сульфоновые кислоты, амины и т.д.), путем реакции присоединения по Михаэлю (например, малеимидные группы, α,β-ненасыщенные карбонилы и т.д.), с помощью клик-химии (например, азиды или алкины), с помощью метатезиса алкенов/алкинов (например, алкены или алкины), формирования иминов или гидрозонов (альдегиды или кетоны, гидразины, гидроксиламины, амины), реакций комплексообразования (авидин, биотин, белок G) или с компонентами, которые допускают реакции замещения S_n-типа (например, галогеналканы, тиолы, спирты, амины, гидразины, гидразиды, эфиры сульфоновых кислот, соли оксифосфония), или других химических групп, которые можно использовать для присоединения других компонентов.

Аминокислотный компонент (АА) или (АА)_x в полимерном носителе формулы (VIII) может находиться также в форме смешанного повторяющегося аминокислотного компонента [(AA)_x]_z, в котором количество аминокислотных компонентов (АА) или (АА)_x дополнительно определяется целым числом z. В этом контексте z можно выбирать из диапазона, составляющего примерно от 1 до 30, предпочтительно из диапазона, составляющего примерно от 1 до 15, более предпочтительно от 1 до 10 или от 1 до 5 и еще более предпочтительно выбирать из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, или можно выбирать из диапазона, границы которого определяются любыми двумя из указанных выше величин.

В конкретном и наиболее предпочтительном варианте аминокислотный компонент (АА) или (АА)_x, который предпочтительно обозначают как S-(AA)_x-S или [S-(AA)_x-S], можно применять для модификации компонента Р, прежде всего содержания компонента S-P²-S в повторяющемся компоненте [S-P²-S]_n полимерного носителя представленной выше формулы (VIII). Это можно обозначать в контексте всего полимерного носителя формулы (VIII), например, с помощью следующей формула (VIIIa):

в которой х, S, L, АА, Р¹, Р² и Р³ предпочтительно имеют значения, указанные в настоящем описании. В представленной выше формуле (VIIIa) любой из индивидуальных компонентов [S-P²-S] и [S-(AA)_x-S] может присутствовать в любом порядке в подформуле {[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b}. Количества индивидуальных компонентов [S-P²-S] и [S-(AA)_x-S] в подформуле {[S-P²-S]_a[S-(AA)_x-S]_b} определяются целыми числами а и b, где а+b=n. n обозначает целое число и имеет значения, указанные выше для формулы (VIII).

Символ а обозначает целое число, как правило, выбранное независимо из целого числа b, из диапазона, составляющего примерно от 1 до 50, предпочтительно из диапазона, составляющего примерно от 1, 2 или 3 до 30, более предпочтительно из диапазона, составляющего примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 25, или диапазона, составляющего примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 20, или диапазона, составляющего примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 15, или диапазона, составляющего примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 10, включая, например, диапазон, составляющий примерно от 3 до 20, от 4 до 20, от 5 до 20 или от 10 до 20, или диапазон, составляющий примерно от 3 до 15, от 4 до 15, от 5 до 15 или от 10 до 15, или диапазон, составляющий примерно от 6 до 11 или от 7 до 10. Наиболее предпочтительно а находится в диапазоне, составляющем примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 10, более предпочтительно в диапазоне, составляющем примерно от 1, 2, 3 или 4 до 9, в диапазоне, составляющем примерно от 1, 2, 3 или 4 до 8, или в диапазоне, составляющем примерно от 1, 2 или 3 до 7.

Символ b обозначает целое число, как правило, выбранное независимо из целого числа а, из диапазона, составляющего примерно от 0 до 50 или от 1 до 50, предпочтительно диапазона, составляющего примерно от 0, 1, 2 или 3 до 30, более предпочтительно из диапазона, составляющего примерно от 0, 1, 2, 3, 4 или 5 до 25, или диапазона, составляющего примерно от 0, 1, 2, 3, 4 или 5 до 20, или диапазона, составляющего примерно от 0, 1, 2, 3, 4 или 5 до 15, или диапазона, составляющего примерно от 0, 1, 2, 3, 4 или 5 до 10, включая, например, диапазон, составляющий примерно от 3 до 20, от 4 до 20, от 5 до 20, или от 10 до 20, или диапазон, составляющий примерно от 3 до 15, от 4 до 15, от 5 до 15 или от 10 до 15, или диапазон, составляющий примерно от 6 до 11 или от 7 до 10. Наиболее предпочтительно, b находится в диапазоне, составляющем примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 10, более предпочтительно в диапазоне, составляющем примерно от 1, 2, 3 или 4 до 9, в диапазоне, составляющем примерно от 1, 2, 3 или 4 до 8, или в диапазоне, составляющем примерно от 1, 2 или 3 до 7.

В этом контексте особенно предпочтительно, чтобы РНК, предпочтительно мРНК предлагаемой в изобретении композиции, образовывала комплекс по меньшей мере частично с катионным или поликатионный соединением и/или полимерным носителем, предпочтительно катионными белками или пептидами. В этом контексте содержание WO 2010/037539 и содержание WO 2012/113513 включены в настоящее описание в качестве ссылки. «Частично» означает, что только часть РНК входит в состав комплекса с катионным соединением и что остальная РНК (входящая в предлагаемую в изобретении композицию) не входит в состав комплекса (т.е. находится в «свободной» форме). Предпочтительно соотношение входящая в комплекс РНК:свободная РНК (в предлагаемой в изобретении композиции) выбирают из диапазона, составляющего от примерно 5:1 до примерно 1:10 (мас./мас.), более предпочтительно из диапазона, составляющего от примерно 4:1 до примерно 1:8 (мас./мас.), еще более предпочтительно из диапазона, составляющего от примерно 3:1 до примерно 1:5 (мас./мас.) или 1:3 (мас./мас.), и наиболее предпочтительно соотношение входящая в комплекс РНК:свободная РНК в предлагаемой в изобретении композиции или вакцине выбирают из соотношения, составляющего примерно 1:1 (мас./мас).

Так называемый «(адъювантный) компонент», который можно применять в сочетании с РНК, предпочтительно мРНК, в предлагаемой в изобретении композиции предпочтительно получают, формируя на первой стадии комплекс по меньшей мере одной (м)РНК (адъювантного) компонента с катионным или поликатионным соединением и/или с полимерным носителем, предпочтительно указанным в настоящем описании, в определенном соотношении для создания стабильного комплекса. В этом контексте наиболее предпочтительно, чтобы после включения в комплекс (м)РНК не оставалось свободного катионного или поликатионного соединения или полимерного носителя, или оно/он присутствовало/присутствовал лишь в незначительном количестве в (адъювантном) компоненте. Следовательно, соотношение между (м)РНК и катионным или поликатионным соединением и/или полимерным носителем в (адъювантном) компоненте, выбирают таким образом, чтобы (м)РНК была полностью включена в комплекс и в композиции не оставалось свободного катионного или поликатионного соединения, или полимерного носителя или оно/он присутствовал лишь в незначительном количестве. Предпочтительно соотношение в адъювантном компоненте, т.е. соотношение между (м)РНК и катионным или поликатионным соединением и/или полимерным носителем, предпочтительно указанным в настоящем описании, выбирают из диапазона, составляющего от примерно 6:1 до примерно 0,25:1 (мас/мас.), более предпочтительно от примерно 5:1 до примерно 0,5:1 (мас./мас.), еще более предпочтительно от примерно 4:1 до примерно 1:1 (мас/мас.) или от примерно 3:1 до примерно 1:1 (мас/мас.), и наиболее предпочтительно соотношение составляет от примерно 3:1 до примерно 2:1 (мас/мас.). Альтернативно этому, соотношение между (м)РНК и катионным или поликатионным соединением и/или полимерным носителем, предпочтительно, указанным в настоящем описании, в (адъювантном) компоненте можно рассчитывать также на основе соотношения азот/фосфат (N/P-соотношение) для всего комплекса. В контексте настоящего изобретения N/P-соотношение предпочтительно находится в диапазоне, составляющем примерно 0,1-10, предпочтительно в диапазоне, составляющем примерно 0,3-4, и наиболее предпочтительно диапазоне, составляющем примерно 0,5-2 или 0,7-2, касательно соотношения РНК: катионное или поликатионное соединение и/или полимерный носитель, указанные в настоящем описании, в комплексе и наиболее предпочтительно в диапазоне, составляющем примерно 0,7-1,5, предпочтительно при условии, что катионное или поликатионное соединение в комплексе представляет собой катионный или поликатионный белок или пептид, и/или полимерный носитель, указанный выше. Указанные соотношения, прежде всего массовые соотношения и/или N/P, можно применять также в качестве соотношений по меньшей мере одной РНК, указанной в настоящем описании, и катионного или поликатионного полимера или полимерного носителя, указанного в настоящем описании, который применяют для образования комплекса по меньшей мере с одной РНК.

В этом контексте соотношение N/P является мерой ионного заряда катионного (боковая цепь) компонента катионного или поликатионного соединения. В частности, если катионные свойства катионного компонента обусловлены атомами азота (например, боковых цепей аминокислот), то величина соотношения N/P отражает соотношение между основными атомами азота и остатками фосфата в нуклеотидном каркасе, с учетом того, что атомы азота (боковой цепи) в катионном компоненте катионного или поликатионного соединения или полимерного носителя вносят вклад в положительные заряды, а фосфат фосфатного каркаса нуклеиновой кислоты вносит вклад в отрицательный заряд. Величину соотношения N/P определяют как отношение азота/фосфата (N/P-соотношение) во всем предлагаемом в изобретении комплексе, содержащем нуклеиновую кислоту и катионное или поликатионное соединение. Оно, как правило, отражает содержание/количество катионных соединений и характеризует содержание /количество связанных или входящих в комплекс нуклеиновых кислот. Его можно рассчитывать на основе того, что, например, 1

мкг РНК, как правило, содержит примерно 3 нмоля остатков фосфата, при условии, что для РНК характерно статистическое распределение оснований. Кроме того, 1 нмоль пептида, как правило, содержит примерно х нмолей остатков азота в зависимости от молекулярной массы и количества его (катионных) аминокислот.

Таким образом, согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения предлагаемая в изобретении композиция содержит включающий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс, который состоит из или содержит

а) в качестве носителя полимерный носитель, образованный перекрестно сшитыми дисульфидом катионными компонентами, предпочтительно указанными выше, более предпочтительно формул VII, VIIa, VIIb или VIII, и

б) в качестве карго-молекулы по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно иммуностимулирующей РНК, наиболее предпочтительно РНК, которая содержит РНК-последовательность SEQ ID NO: 5, 394 или 10072,

предпочтительно для применения в качестве лекарственного средства, более предпочтительно для применения в качестве иммуностимулирующего агента или адъюванта, предпочтительно для лечения раковых или опухолевых заболеваний, при этом включающий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс предпочтительно вводят внутрь опухоли.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения содержащая РНК предлагаемая в изобретении композиция содержит включающий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс, содержащий:

а) в качестве носителя полимерный носитель, образованный перекрестно сшитыми дисульфидом катионными компонентами, предпочтительно указанными выше, более предпочтительно формул VII, VIIa, VIIb или VIII, и

б) в качестве карго-молекулы по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно иммуностимулирующей РНК, наиболее предпочтительно РНК, которая содержит РНК-последовательность SEQ ID NO: 5, 394 или 10072,

для применения в качестве иммуностимулирующего агента или в качестве адъюванта,

и по меньшей мере одну вторую молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно РНК и более предпочтительно мРНК, которая кодирует по меньшей мере один белок или пептид, наиболее предпочтительно указанный выше для кодирующей РНК, и

при этом предлагаемую в изобретении композицию предпочтительно вводят внутрь опухоли.

Предпочтительным вариантом осуществления изобретения является включающий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс, содержащий:

а) в качестве носителя полимерный носитель, образованный перекрестно сшитыми дисульфидом катионными компонентами, предпочтительно указанными выше, более предпочтительно формул VII, VIIa, VIIb или VIII, и

б) в качестве карго-молекулы по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно иммуностимулирующей РНК, наиболее предпочтительно РНК, которая содержит РНК-последовательность SEQ ID NO: 5, 394 или 10072,

для применения в качестве иммуностимулирующего агента или в качестве адъюванта,

где включающий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс вводят в сочетании по меньшей мере с одной второй молекулой нуклеиновой кислоты, предпочтительно РНК и более предпочтительно мРНК, которая кодирует по меньшей мере один белок или пептид, наиболее предпочтительно указанный выше для кодирующей РНК, и

при этом включающий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс и вторую молекулу нуклеиновой кислоты предпочтительно вводят внутрь опухоли.

Указанные предпочтительные комбинации по меньшей мере одной первой нуклеиновой кислоты, предпочтительно иммуностимулирующей РНК, и по меньшей мере одной второй нуклеиновой кислоты, предпочтительно РНК и наиболее предпочтительно мРНК, которая кодирует по меньшей мере один белок или пептид, описаны выше в контексте «комбинаций кодирующей и некодирующей РНК».

В контексте настоящего описания понятие «первая молекула нуклеиновой кислоты» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которую применяют в качестве карго-молекулы во включающем полимерный носитель и карго-молекулу комплексе, и ассоциированной в нем с полимерным носителем. Понятие «вторая молекула нуклеиновой кислоты» в контексте настоящего описания, как правило, относится к нуклеиновой кислоте, которая не является частью включающего полимерный носитель и карго-молекулу комплекса и которая кодирует по меньшей мере один пептид или белок.

В контексте настоящего изобретения под иммуностимулирующими агентами или адъювантами подразумеваются соединения, действие которых предпочтительно состоит в индукции врожденного иммунного ответа, прежде всего в индукции противовирусного цитокина IFN-альфа.

Действие адъювантов или иммуностимулирующих агентов, как правило, основано на их способности индуцировать врожденный иммунный ответ. Врожденная иммунная система образует доминантную систему защиты хозяина у большинства организмов и включает барьеры, такие как гуморальные и химические барьеры, включая, например, воспаление, систему комплемента и клеточные барьеры. Основой врожденной иммунной системы, как правило, является небольшое количество рецепторов, которые называют паттерн-распознающими рецепторами. Они распознают консервативные молекулярные структуры (паттерны), отличая тем самым чужеродные организмы типа вирусов, бактерий, грибов и паразитов, от клеток хозяина. Указанные ассоциированные с патогенами молекулярные паттерны (РАМР) включают вирусные нуклеиновые кислоты, компоненты оболочек бактерий и грибов, флагеллярные белки и т.д. Первое подробно изученное семейство паттерн-распознающих рецепторов (РАМР-рецепторы) представляло собой семейство Толл-подобных рецепторов (TLR). TLR представляют собой трансмембранные белки, которые распознают лиганды внеклеточной окружающей среды или полости эндосом. После связывания с лигандом они трансдуцируют сигнал через цитоплазматические белки-адаптеры, что приводит к запуску защитного ответа хозяина и влечет за собой производство антимикробных пептидов, провоспалительных хемокинов и цитокинов, антивирусных цитокинов и т.д. (см., например, Meylan E., J. Tschopp и др., Nature 442(7098), 2006, сс. 39-44). Другие важные компоненты иммунной системы включают, например, эндосомальные TLR, цитоплазматические рецепторы, интерфероны типа I и цитоплазматические рецепторы. Таким образом, в контексте настоящего описания иммуностимулирующие агенты или адъюванты рассматриваются предпочтительно как индукторы врожденного иммунного ответа, которые активируют паттерн-распознающие рецепторы (РАМР-рецепторы). При этом возникает каскад сигналов, который может приводить, например, к высвобождению цитокинов (например, IFN-альфа), поддерживая врожденный иммунный ответ. Таким образом, предпочтительной особенностью иммуностимулирующего агента или адъюванта является способность связываться с указанными рецепторами и активировать такие РАМР-рецепторы. В идеальном варианте агент или адъювант дополнительно поддерживает адаптивный иммунный ответ, например, сдвигая иммунный ответ таким образом, что активируется предпочтительный класс Th-клеток. В зависимости от заболевания или нарушения, подлежащего лечению, может быть предпочтительным сдвиг в сторону основанного на Th1 иммунного ответа, или в других случаях может оказаться предпочтительным сдвиг в сторону Th2-иммунного ответа. Кроме того, адъюванты, как правило, рассматриваются как соединения, которые могут повышать и/или модулировать присущую антигену иммуногенность.

Как правило, подразумевается, что понятие «иммуностимулирующий агент» не относится к агентам, например, антигенам (вне зависимости от их химической структуры), которые вызывают адаптивный/цитотоксический иммунный ответ, например, «гуморальный» или «клеточный» иммунный ответ, другими словами, вызывают иммунные ответы (и тем самым придает иммунитет), которые характеризуются специфическим ответом на структурные свойства антигена, распознаваемого как чужеродный иммунокомпетентными клетками. Скорее, под «иммуностимулирующим агентом», как правило, подразумеваются агенты/соединения/комплексы, которые сами не запускают какой-либо адаптивный иммунный ответ, но которые могут только повышать указанный адаптивный иммунный ответ неспецифическим образом, например, путем активации «РАМР»-рецепторов, и тем самым запускать высвобождение цитокинов, которые поддерживают фактически существующий адаптивный иммунный ответ. Таким образом, никакая иммуностимуляция агентами (например, антигенами), которые сами вызывают адаптивный иммунный ответ (которые сами прямо или косвенно придают иммунитет), как правило, исключается из объема, охватываемого понятием «иммуностимулирующий агент».

Подразумевается также, что под понятие «адъювант» не подпадают агенты, которые сами придают иммунитет. Таким образом, адъюванты не придают иммунитет сами по себе, но помогают иммунной системе различными путями усиливать антигенспецифический иммунный ответ, например, способствуя презентации антигена иммунной системе. Таким образом, адъювант предпочтительно может, например, модулировать антигенспецифический иммунный ответ, например, сдвигая доминирующий антигенспецифический иммунный ответ по Th1-типу в сторону преобладания антигенспецифического ответа по Th2-типу, или наоборот. Таким образом, понятия «иммунистимулирующий агент» и «адъювант» в контексте настоящего изобретения, как правило, относятся к агентам, соединениям или комплексам, которые сами не могут придавать иммунитет, но исключительно поддерживают иммунный ответ неспецифическим образом (в противоположность антигенспецифическому иммунному ответу) с помощью действий, которые модулируют антигенспецифический (адаптивный клеточный и/или гуморальный иммунный ответ) неспецифическими путями, например, с помощью экспрессии/секреции цитокинов, улучшая презентацию антигенов, сдвигая природу «плечей» иммунного ответа и т.д. Таким образом, любые агенты, которые сами вызывают иммунитет, как правило, не подпадают под понятия «адъювант» или «иммуностимулирующий агент».

Применение комплекса, содержащего полимерный носитель и карго-молекулу, необязательно в сочетании со второй молекулой нуклеиновой кислоты, предпочтительно РНК, позволяет получать более эффективное и безопасное лекарственное средство. Целесообразно применять комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу, для введения in vivo нуклеиновых кислот, в частности для уплотнения и стабилизации нуклеиновой кислоты для применения в трансфекции нуклеиновыми кислотами без обсужденных выше отрицательных побочных действий высокомолекулярных полимеров, таких как отсутствие или плохая биоразложимость, или даже высокая токсичность, агломерирование, низкая трансфецирующая активность in vivo и т.д. Комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу, обеспечивает также улучшенный перенос нуклеиновых кислот in vivo, прежде всего при использовании внутриопухолевых путей, в том числе, стабильность в сыворотке, стабильность в солевых условиях, эффективное поглощение, пониженную активацию комплемента, высвобождение нуклеиновых кислот и т.д. Указанный комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу, может обеспечивать также индукцию и поддержание адаптивного иммунного ответа путем параллельной инициации или усиления врожденного иммунного ответа. Установлено, что улучшенный адаптивный иммунный ответ можно получать также, в частности, когда содержащий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс вводят в комбинации со второй молекулой нуклеиновой кислоты, предпочтительно РНК, которая кодирует белок или пептид, или когда содержащий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс включают в фармацевтическую композицию вместе со второй молекулой нуклеиновой кислоты, предпочтительно РНК, которая кодирует белок или пептид, предпочтительно антигенный пептид или белок. Установлено, что в этом аспекте для получения наиболее благоприятного действия следует вводить предлагаемую в изобретении композицию, которая содержит включающий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс необязательно в комбинации со второй молекулой нуклеиновой кислоты, указанной в настоящем описании, внутриопухолевым путем. Кроме того, комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу, может обладать улучшенной стабильностью при хранении, прежде всего в процессе лиофилизации.

В конкретных вариантах осуществления изобретения содержащий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс, указанный выше, усиливает иммунный ответ против белка или пептида, который кодируется второй молекулой нуклеиновой кислоты, предпочтительно РНК, более предпочтительно мРНК, которую вводят в комбинации с содержащим полимерный носитель и карго-молекулу комплексом, предпочтительно с использованием внутриопухолевого пути введения.

Содержащий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс и/или вторую молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептид или белок, предпочтительно приготавливают в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и/или наполнителем. В контексте настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель, как правило, включает жидкий или нежидкий материал, который смешивают с содержащим полимерный носитель и карго-молекулу комплексом и/или второй молекулой нуклеиновой кислоты. Если содержащий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс и/или вторая молекула нуклеиновой кислоты находятся в жидкой форме, то носитель, как правило, представляет собой свободную от пирогенов воду; изотонический соляной раствор или забуференные (водные) растворы, например, растворы, забуференные фосфатом, цитратом и т.д. Раствор Рингера или лактированный раствор Рингера является особенно предпочтительным в качестве жидкой основы.

Понятие «введение в комбинации (в сочетании)» в контексте настоящего описания относится к ситуации, когда содержащий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс вводят индивидууму до, одновременно или после введения этому же индивидууму второй молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок или пептид. Предпочтительно интервал времени между введением содержащего полимерный носитель и карго-молекулу комплекса и по меньшей мере одной второй молекулы нуклеиновой кислоты, предпочтительно РНК, которая кодирует белок или пептид, составляет менее примерно 48 ч, более предпочтительно менее примерно 24, 12, 6, 4, 2, 1 ч, наиболее предпочтительно менее примерно 30, 15 или 5 мин. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения понятие «введение в комбинации» относится к сопутствующему введению содержащего полимерный носитель и карго-молекулу комплекса и по меньшей мере одной второй молекулы нуклеиновой кислоты, т.е. одновременному введению обоих компонентов или введению обоих компонентов во временной рамке, которая, как правило, составляет менее 5 мин. Понятие «введение в комбинации» относится не только к ситуации, когда включающий фармацевтический носитель и карго-молекулу комплекс находится в физическом контакте по меньшей мере с одной второй молекулой нуклеиновой кислоты или приготовлен в виде формы в сочетании со второй молекулой нуклеиновой кислоты. Понятие «введение в комбинации» в контексте настоящего описания применяют также для раздельного введения содержащего полимерный носитель и карго-молекулу комплекса и второй молекулы нуклеиновой кислоты (например, с использованием двух отдельных инъекций), если интервал времени между двумя введениями не превышает указанный выше интервал. Альтернативно этому, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс и вторую молекулу нуклеиновой кислоты можно вводить в комбинации, например, смешивая содержащий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс и вторую молекулу нуклеиновой кислоты до введения и осуществляя введение индивидууму смеси. Когда содержащий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс приготавливают в виде формы в сочетании со второй молекулой нуклеиновой кислоты, или когда применяют композицию, указанную в настоящем описании, то содержащий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс и вторую молекулу нуклеиновой кислоты можно дополнительно независимо друг от друга вводить в комбинации с помощью любого из путей введения, указанных в настоящем описании.

Содержащий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс содержит в качестве карго-молекулы по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты. В контексте настоящего изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой любую приемлемую нуклеиновую кислоту, выбранную, например, из любой (одноцепочечной или двухцепочечной) ДНК, предпочтительно (но, не ограничиваясь только ими), например, геномной ДНК, одноцепочечных молекул ДНК, двухцепочечных молекул ДНК, кодирующей ДНК, ДНК-праймеров, ДНК-зондов, иммуностимуляторной/иммуностимулирующей ДНК, (короткого) ДНК-олигонуклеотида ((короткие) олигодезоксирибонуклеотиды), вирусной ДНК, или ее можно выбирать из любой ПНК (пептидная нуклеиновая кислота), или ее можно выбирать, например, из любой из (одноцепочечной или двухцепочечной) РНК, предпочтительно (но, не ограничиваясь только ими) (короткого) РНК-олигонуклеотида ((короткий) олигорибонуклеотид), кодирующей РНК, матричной РНК (мРНК), вирусной РНК, репликонов, иммуностимуляторной/иммуностимулирующей РНК, малой интерферирующей РНК (siPHK), антисмысловой РНК, микроРНК, малой ядерной РНК (snPHK), малой РНК, образующей шпильку (shPHK), или рибопереключателей, рибозимов или аптамеров и т.д. Молекула нуклеиновой кислоты, которая входит в содержащий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс, может представлять собой также рибосомную РНК (рРНК), транспортную РНК (тРНК), матричную РНК (мРНК) или вирусную РНК (вРНК). Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты, которая входит в содержащий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс, представляет собой РНК. Более предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты, которая входит в содержащий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс, представляет собой (линейную) одноцепочечную РНК, еще более предпочтительно мРНК или иммуностимуляторную/иммуностимулирующую РНК.

Кроме того, нуклеиновая кислота, входящая в содержащий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс, может представлять собой молекулу одно- или двухцепочечной нуклеиновой кислоты или частично двухцепочечной или частично одноцепочечной нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере частично является самокомплементраной (указанные как частично двухцепочечные, так и частично одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот, как правило, образуются с помощью более длинной или более короткой молекулы нуклеиновой кислоты или с помощью двух одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот, которые имеют примерно одинаковую длину, при этом одна одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты является частично комплементарной другой одноцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты, и вместе образуют двухцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты в этой области, т.е. частично двухцепочечную или частично одноцепочечную нуклеиновую кислоту). Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой одноцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты. Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой кольцевую или линейную молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно линейную молекулу нуклеиновой кислоты.

Согласно одному из альтернативных вариантов молекула нуклеиновой кислоты, которая входит в предлагаемый в изобретении комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу, может представлять собой кодирующую нуклеиновую кислоту, например, ДНК или РНК. Кроме того, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу комплекс можно вводить в комбинации по меньшей мере с одной второй молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок или пептид.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения по меньшей мере одна первая молекула нуклеиновой кислоты и по меньшей мере одна вторая молекула нуклеиновой кислоты обе представляют собой молекулы кодирующей нуклеиновой кислоты. Предпочтительно по меньшей мере одна первая и по меньшей мере одна вторая молекула нуклеиновой кислоты каждая кодирует отличный от другой пептид или белок. В одном из вариантов осуществления изобретения первая молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность, отличную от последовательности второй молекулы нуклеиновой кислоты, которую вводят в комбинации с содержащим полимерный носитель и карго-молекулу комплексом. Альтернативно этому, первая молекула нуклеиновой кислоты и вторая молекула нуклеиновой кислоты могут содержать одинаковую последовательность или они являются идентичными.

Касательно по меньшей мере одной первой молекулы нуклеиновой кислоты и/или второй молекулы нуклеиновой кислоты указанная кодирующая ДНК или РНК может представлять собой любую ДНК или РНК, указанную в настоящем описании. Предпочтительно указанная кодирующая ДНК или РНК может представлять собой одно- или двухцепочечную ДНК или РНК, более предпочтительно одноцепочечную ДНК или РНК, и/или кольцевую или линейную ДНК или РНК, более предпочтительно линейную ДНК или РНК. Кроме того, указанная кодирующая ДНК или РНК может представлять собой геномную ДНК, вирусную РНК или ДНК, репликон, плазмидную ДНК или мРНК. Еще более предпочтительно кодирующая ДНК или РНК может представлять собой (линейную) одноцепочечную ДНК или РНК. Наиболее предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты, предлагаемая в настоящем изобретении, может представлять собой линейную одноцепочечную матричную РНК (мРНК). Указанная мРНК может присутствовать в виде моно-, ди- или даже полицистронной РНК, т.е. РНК, которая несет кодирующие последовательности одного, двух или большего количества белков или пептидов. Указанные кодирующие последовательности в ди- или даже полицистронной мРНК могут быть разделены по меньшей мере одной IRES-последовательностью, указанной в настоящем описании.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна вторая молекула нуклеиновой кислоты кодирует терапевтически активный белок или антиген, указанный в настоящем описании, предпочтительно описанный в контексте «кодирующей РНК». В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна вторая молекула нуклеиновой кислоты, которую вводят в комбинации с содержащим полимерный носитель и карго-молекулу комплексом, кодирует пептид или белок, который может вызывать иммунный ответ, предпочтительно адаптивный иммунный ответ, после введения хозяину, прежде всего внутриопухолевого введения. Альтернативно этому, по меньшей мере одна вторая молекула нуклеиновой кислоты кодирует по меньшей мере один терапевтически активный пептид или белок, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из цитокинов, хемокинов, продуктов гена самоубийства, иммуногенных белков или пептидов, индукторов апоптоза, ингибиторов ангиогенеза, белков теплового шока, опухолевых антигенов, ингибиторов β-катенина, активаторов пути STING, модуляторов контрольных «точек», активаторов врожденного иммунитета, антител, доминантно-негативных рецепторов и рецепторов-ловушек, ингибиторов супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC), ингибиторов пути IDO и белков или пептидов, которые связываются с ингибиторами апоптоза.

В конкретном варианте осуществления изобретения первая молекула нуклеиновой кислоты указанного в настоящем описании содержащего полимерный носитель и карго-молекулу комплекса и/или вторая молекула нуклеиновой кислоты, которую вводят в комбинации с содержащим полимерный носитель и карго-молекулу комплексом, может содержать модификации каркаса, модификации сахаров или модификации оснований. Модификация каркаса согласно настоящему изобретению представляет собой модификацию, при которой фосфаты каркаса нуклеотидов, входящие в молекулу нуклеиновой кислоты, которая входит в предлагаемый в изобретении комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу, модифицируют химически. Модификация сахара согласно настоящему изобретению представляет собой химическую модификацию сахара нуклеотидов первой молекулы нуклеиновой кислоты, которая входит в предлагаемый в изобретении комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу, и/или второй молекулы нуклеиновой кислоты, которую вводят в комбинации с комплексом, содержащим полимерный носитель и карго-молекулу. Кроме того, модификация оснований согласно настоящему изобретению представляет собой химическую модификацию основного фрагмента нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты, которая входит в предлагаемый в изобретении комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу, и/или второй молекулы нуклеиновой кислоты, которую вводят в комбинации с комплексом, содержащим полимерный носитель и карго-молекулу. Указанные модификации описаны выше в разделе, касающемся модификаций РНК.

Согласно следующему варианту осуществления изобретения первая молекула нуклеиновой кислоты указанного в настоящем описании содержащего полимерный носитель и карго-молекулу комплекса и/или вторая молекула нуклеиновой кислоты, которую вводят в комбинации с содержащим полимерный носитель и карго-молекулу комплексом, может нести липидную модификацию. Указанная модифицированная липидом нуклеиновая кислота, как правило, представляет собой нуклеиновую кислоту, указанную в настоящем описании. Указанная модифицированная липидом первая молекула нуклеиновой кислоты, которая входит в комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу, или модифицированная липидом вторая молекула нуклеиновой кислоты, которую вводят в комбинации с комплексом, содержащим полимерный носитель и карго-молекулу, как правило, содержит также по меньшей мере один линкер, ковалентно связанный с указанной молекулой нуклеиновой кислоты, и по меньшей мере один липид, ковалентно связанный с соответствующим линкером. В альтернативном варианте модифицированная липидом молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одну из молекул нуклеиновых кислот, указанных в настоящем описании, и по меньшей мере один (бифункциональный) липид, ковалентно связанный (без линкера) с указанной молекулой нуклеиновой кислоты. Согласно третьему альтернативному варианту модифицированная липидом молекула нуклеиновой кислоты содержит молекулу нуклеиновой кислоты, указанную в настоящем описании, по меньшей мере один линкер, ковалентно связанный с указанной молекулой нуклеиновой кислоты, и по меньшей мере один липид, ковалентно связанный с соответствующим линкером, а также по меньшей мере один (бифункциональный) липид, ковалентно связанный (без линкера) с молекулой нуклеиновой кислоты.

Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в предлагаемой в изобретении композиции образует комплекс с липидами с образованием одной или нескольких липосом, липоплексов или липидных наночастиц. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения предлагаемая в изобретении композиция ссодержит липосомы, липоплексы и/или липидные наночастицы, содержащие по меньшей мере одну РНК.

Возрастает количество данных о том, что препаративные формы на основе липидов следует рассматривать в качестве наиболее перспективных систем доставки РНК благодаря их биосовместимости и простоты крупномасштабного производства. Катионные липиды широко изучены в качестве синтетических материалов для доставки РНК. После перемешивания нуклеиновые кислоты конденсируются катионными липидами с образованием комплексов липид/нуклеиновая кислота, известных как липоплексы. Указанные липидные комплексы могут защищать генетический материал от воздействия нуклеаз и доставляться в клетки путем взаимодействия с отрицательно заряженной клеточной мембраной. Липоплексы можно получать непосредственно путем смешения положительно заряженных липидов при физиологических значениях рН с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами.

Общепринятые липосомы состоят из липидного бислоя, который может состоять из катионных, анионных или нейтральных (фосфо)липидов и холестерина, который окружает водное ядро. Как липидный бислой, так и водное пространство могут включать гидрофобные или гидрофильные соединения соответственно. Характеристики и поведение липосом in vivo можно модифицировать путем добавления гидрофильного полимерного покрытия, например, из полиэтиленгликоля (ПЭГ), на поверхность липосом для придания стерической стабилизации. Кроме того, липосомы можно применять для специфического таргетинга путем присоединения лигандов (например, антител пептидов и углеводов) к их поверхности или к концам присоединенных цепей ПЭГ (Front Pharmacol.,6, 1 декабря 2015 г., с. 286).

Липосомы представляют собой коллоидные системы доставки на основе липидов и на основе поверхностно-активных веществ, состоящие из фосфолипидного бислоя, окружающего водный компартмент. Они могут иметь форму сферических пузырьков, и диапазон их размера может составлять от 20 нм до нескольких мкм. Липосомы на основе катионных липидов могут образовывать комплекс с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами посредством электростатических взаимодействий, что приводит к образованию комплексов, отличающихся биосовместимостью, низкой токсичностью и возможностью их крупномасштабного производства, необходимого для клинических применений in vivo. Липосомы могут сливаться с плазматической мембраной для проникновения; находясь внутри клетки липосомы, они процессируются посредством эндоцитозного пути и после этого генетический материал высвобождается из эндосомы/носителя в цитоплазму. Липосомы в течение долгого времени рассматриваются в качестве носителей для доставки лекарственных средств благодаря их очень высокой биосовместимости, основанной на том, что липосомы являются в целом аналогами биологических мембран и их можно получать из встречающихся в естественных условиях и синтетических фосфолипидов (Int J Nanomedicine. 9, 2014, сс. 1833-1843).

Катионные липосомы традиционно наиболее широко применяли в качестве невирусных систем доставки для олигонуклеотидов, включая плазмидную ДНК, антисмысловые олигонуклеотиды и siPHK/малую РНК-шпильку (shPHK)). Катионные липиды, такие как DOTAP (1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан) и DOTMA (метилсульфат N-[1-(2,3- диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония) могут образовывать комплексы или липоплексы с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами с образованием наночастиц посредством электростатического взаимодействия, что обеспечивает высокую эффективность трансфекции in vitro. Кроме того, разработаны нанолипосомы для доставки РНК на основе нейтрального липида, например, нанолипосомы на основе нейтрального 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолина (DOPC) (Adv Drug Deliv Rev. 66, февраль 2014 г., cc. 110 116.).

Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в предлагаемой в изобретении композиции образует комплекс с катионными липидами и/или нейтральными липидами и тем самым образует липосомы, липидные наночастицы, липоплексы или нанолипосомы на основе нейтральных липидов.

Предпочтительные катионные или поликатионные соединения, которые можно применять в качестве агентов для трансфекции или комплексообразования, могут включать катионные полисахариды, например, хитозан, полибрен, катионные полимеры, например, полиэтиленимин (PEI), катионные липиды, например, DOTMA: хлорид [1-(2,3-диолеилокси)пропил)]-N,N,N-триметиламмония, DMRIE, ди-C14-амидин, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, СТАР, DOPC, DODAP, DOPE: диолеилфосфатидилэтаноламин, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: диоктадециламидоглицилспермин, DIMRI: бромид димиристооксипропилдиметилгидроксиэтиламмония, DOTAP: диолеоилокси-3-(триметиламмоний)пропан, DC-6-14: хлорид O,O-дитетрадеканоил-N-(α-триметиламмонийацетил)диэтаноламина, CLIP1: хлорид рац[(2,3-диоктадецилоксипропил)(2-гидроксиэтил)]диметиламмония, CLIP6: рац[2(2,3-дигексадецилоксипропилоксиметилокси)этил]триметиламмоний, CLIP9: рац[2(2,3-дигексадецилоксипропилоксисукцинилокси)этил]триметиламмоний, олигофектамин, или катионные или поликатионные полимеры, например, модифицированные полиаминокислоты, такие как полимеры β-аминокислот или обращенные полиамиды и т.п., модифицированные полиэтилены, такие как PVP (поли(N-этил-4-винилпириднийбромид)) и т.п., модифицированные акрилаты, такие как pDMAEMA (поли(диметиламиноэтилметилакрилат)) и т.п., модифицированные амидоамины, такие как рАМАМ (поли(амидоамин)) и т.п., модифицированные сложные поли-β-аминоэфиры (рВАЕ), такие как модифицированные в диаминоконцевом фрагменте сополимеры 1,4-бутандиолдиакрилата и 5-амино-1-пентанола и т.п., дендримеры, такие как дендримеры полипропиламина или дендримеры на основе рАМАМ и т.п., полиимин(ы), такие как поли(этиленимин) (PEI), поли(пропиленимин) и т.п., полиаллиламин, полимеры на основе сахарного каркаса, такие как полимеры на основе циклодекстрина, полимеры на основе декстрана, хитозан и т.п., силановые полимеры, такие как сополимеры PMOXA-PDMS и т.п., блокполимеры, включающие комбинацию одного или более катионных блоков (например, выбранных из катионных полимеров, указанных выше) и одного или нескольких гидрофильных или гидрофобных блоков (таких, например, как полиэтиленгликоль) и т.п.

Дополнительные фармацевтически активные соединения:

Кроме того, предлагаемая в изобретении композиция может содержать по меньшей мере один дополнительный фармацевтически активный компонент/соединение. В альтернативном или дополнительном варианте по меньшей мере один дополнительный фармацевтически активный компонент/соединение можно вводить совместно с композицией, предлагаемой в изобретении. Таким образом, по меньшей мере один дополнительный фармацевтически активный компонент/соединение можно вводить в комбинации по меньшей мере с одной РНК, входящей в предлагаемую в изобретении композицию, или с содержащей РНК композицией, предлагаемой в изобретении.

Понятия «введение в комбинации», «совместное введение» или «сопутствующее введение» в контексте настоящего описания относятся к ситуации, когда предлагаемую в изобретении композицию или ее ингредиент вводят индивидууму до, одновременно или после введения дополнительного фармацевтически активного компонента этому же индивидууму. Интервал времени между введением предлагаемой в изобретении композиции или ее ингредиента и по меньшей мере одного второго фармацевтически активного компонента зависит от природы и биологического действия конкретного фармацевтически активного компонента и его может определять лечащий врач. Предпочтительно интервал времени составляет менее примерно 48 ч, более предпочтительно менее примерно 24 ч, 12 ч, 6 ч, 4 ч, 2 ч, 1 ч, наиболее предпочтительно менее примерно 30 мин, 15 мин или 5 мин. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения понятие «введение в комбинации» относится к сопутствующему введению предлагаемой в изобретении композиции или ее ингредиента и по меньшей мере одного второго фармацевтически активного компонента, т.е. одновременному введению обоих соединений или введению обоих соединений во временной рамке, которая, как правило, составляет менее 5 мин. Понятие «введение в комбинации» относится не только к ситуации, когда предлагаемая в изобретении композиция или ее ингредиент находится в физическом контакте по меньшей мере с одним фармацевтически активным компонентом или приготовлена в виде формы в сочетании со вторым фармацевтически активным компонентом. Понятие «введение в комбинации» в контексте настоящего описания включает также раздельное введение предлагаемой в изобретении композиции или ее ингредиента и второго фармацевтически активного компонента (например, с помощью двух отдельных инъекций). Альтернативно этому, предлагаемую в изобретении композицию или ее ингредиент и второй фармацевтически активный компонент можно вводить в комбинации путем смешения предлагаемой в изобретении композиции или ее ингредиента и второго фармацевтически активного компонента до введения и осуществлять введение смеси индивидууму. Когда предлагаемую в изобретении композицию или ее ингредиент приготавливают совместно со вторым фармацевтически активным компонентом или когда применяют композицию, указанную в настоящем описании, то предлагаемую в изобретении композицию или ее ингредиент и второй фармацевтически активный компонент можно дополнительно независимо друг от друга вводить в комбинации с использованием любых путей введения, указанных в настоящем описании.

В этом контексте фармацевтически активный компонент/соединение представляет собой соединение, которое обладает терапевтическим действием, заживляя, облегчая или предотвращая конкретный признак или заболевание, а именно, опухолевое или раковое заболевание. Указанные соединения включают (но, не ограничиваясь только ими) пептиды или белки, предпочтительно указанные в настоящем описании, нуклеиновые кислоты, предпочтительно указанные в настоящем описании, (терапевтически активные) низкомолекулярные органические или неорганические соединения (с молекулярной массой менее 5000, предпочтительно менее 1000), сахара, антигены или антитела, предпочтительно указанные в настоящем описании, терапевтические средства, уже известные из существующего уровня техники, антигенные клетки, антигенные клеточные фрагменты, клеточные фракции; компоненты клеточной оболочки (например, полисахариды), модифицированные, ослабленные или дезактивированные (например, химически или путем облучения) патогены (вирус, бактерии и т.д.), адъюванты и т.д.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении композиция дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный фармацевтически активный компонент/соединение, в которой по меньшей мере один дополнительный фармацевтически активный компонент выбран из цитокинов, хемокинов, продуктов гена самоубийства, иммуногенных белков или пептидов, индукторов апоптоза, ингибиторов ангиогенеза, белков теплового шока, опухолевых антигенов, ингибиторов β-катенина, активаторов пути STING, модуляторов контрольных «точек», активаторов врожденного иммунитета, антител, доминантно-негативных рецепторов и рецепторов-ловушек, ингибиторов супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC), ингибиторов пути IDO и белков или пептидов, которые связываются с ингибиторами апоптоза, антибактериальных агентов, адъювантов, химиотерапевтических средств и ингибиторов киназ.

В альтернативном или дополнительном варианте по меньшей мере один дополнительный фармацевтически активный компонент можно вводить совместно по меньшей мере с одной РНК содержащей РНК композиции или с предлагаемой в изобретении композицией или можно применять в комбинации по меньшей мере с одной РНК содержащей РНК композиции или с предлагаемой в изобретении композицией.

В этом контексте имеющие белковую основу цитокины, хемокины, продукты гена самоубийства, иммуногенные белки или пептиды, индукторы апоптоза, ингибиторы ангиогенеза, белки теплового шока, опухолевые антигены, ингибиторы β-катенина, активаторы пути STING, модуляторы контрольных «точек», активаторы врожденного иммунитета, антитела, доминантно-негативные рецепторы и рецепторы-ловушки, ингибиторы супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC), ингибиторы пути IDO и белки или пептиды, которые связываются с ингибиторами апоптоза, или их фрагменты и варианты, описанные выше в контексте «кодирующей РНК», можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Альтернативно этому, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки или их фрагменты или варианты, можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента.

1. Цитокины:

В этом контексте имеющие белковую основу цитокины или их фрагменты и варианты, которые описаны выше в контексте «кодирующей РНК», можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Альтернативно этому, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки или их фрагменты, или варианты, можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента.

Предпочтительно цитокин представляет собой интерлейкин (IL). Один или несколько интерлейкинов можно выбирать, например, из следующего перечня: IL-1α, IL-1β, IL-1ra (антагонист), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10; IL-11, IL-12, IL-13, IL14, IL-15, IL-16, IL-17A, IL-17B, EL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28A/B, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35. Кроме того, цитокин может представлять собой один или несколько цитокинов, выбранных из семейства TNF, например, выбранных из следующего перечня: TNF, предпочтительно TNFα, LTα, LTβ, LIGHT, TWEAK, APRIL, BAFF, TL1A, GITRL, OX40L, CD40L (CD154), FASL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, TRAIL, лиганд RANK. Дополнительные примеры предпочтительных цитокинов можно выбирать из следующего перечня: лиганд FLT3, G-CSF, GM-CSF, IFNα/β/ω, IFNγ, LIF, M-CSF, MIF, OSM, Stem Cell Factor, TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, лиганд TSLP.

Наиболее предпочтительными являются цитокины, выбранные из следующего перечня: IL-12, IL-15, IL-2, IFNγ, TNFα, IL-18, IFNα, IL-1β, IL-32, IL-7, IL-21, IL-8, GM-CSF.

В этом контексте особенно предпочтительными являются цитокины, представленные выше в таблице 1.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции представляет собой иммуностимулирующую РНК, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, и ее объединяют по меньшей мере с одним указанным выше цитокином, предпочтительно IL-2, IL-12, CD40L или IL-15, или его фрагментом или вариантом.

1. Хемокины

В этом контексте имеющие белковую основу хемокины или их фрагменты и варианты, которые описаны выше в контексте «кодирующей РНК», можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Альтернативно этому, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки или их фрагменты или варианты, можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента.

Предпочтительно хемокины можно выбирать из следующего перечня: CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, XCL1, XCL2, CX3CL1.

В этом контексте особенно предпочтительными являются хемокины, представленные выше в таблице 2.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции представляет собой иммуностимулирующую РНК, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, и ее объединяют по меньшей мере с одним указанным выше хемокином или его фрагментом или вариантом.

2. Ферменты самоубийства

В этом контексте имеющие белковую основу ферменты самоубийства или их фрагменты и варианты, которые описаны выше в контексте «кодирующей РНК», можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Альтернативно этому, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки или их фрагменты или варианты, можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента.

Фермент самоубийства предпочтительно представляет собой метаболизирующий нуклеотиды фермент. Предпочтительно фермент самоубийства применяют в комбинации с пролекарством, которое является субстратом для фермента самоубийства и которое превращается в цитотоксическое соединение с помощью фермента самоубийства. Один или несколько предпочтительных ферментов самоубийства можно выбирать из следующего перечня: тимидинкиназа, предпочтительно вирусная тимидинкиназа, более предпочтительно тимидинкиназа вируса Herpes simplex, тимидинкиназа Varicella zoster; растительная тимидинкиназа, предпочтительно тимидинкиназа томатов; цитозиндеаминаза, предпочтительно бактериальная цитозиндеаминаза или цитозиндеаминаза дрожжей; дезоксинуклеозидкиназа, предпочтительно дезоксинуклеозидкиназа Drosophila melanogaster; дезоксицитидинкиназа, предпочтительно дезоксицитидинкиназа млекопитающих, фосфорилаза пуриновых нуклеозидов, предпочтительно бактериальная фосфорилаза пуриновых нуклеозидов.

В этом контексте особенно предпочтительными являются ферменты самоубийства, представленные выше в таблицах 3 и 4.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции представляет собой иммуностимулирующую РНК, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, и ее объединяют по меньшей мере с одним указанным выше ферментом самоубийства или его фрагментом или вариантом.

3. Иммуногенные белки или пептиды

В этом контексте имеющие белковую основу иммуногенные белки или пептиды или их фрагменты и варианты, которые описаны выше в контексте «кодирующей РНК», можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Альтернативно этому, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки или их фрагменты, или варианты, можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента.

Иммуногенный белок или пептид предпочтительно представляет собой патогенный антиген для использования ранее существующего иммунитета против указанных антигенов для лечения опухолевых и/или раковых заболеваний. Запускается ответ иммунологической памяти, и иммунная система активизируется для атаки на опухолевые клетки.

Предпочтительными примерами иммуногенных белков или пептидов в указанном варианте осуществления изобретения являются белки или пептиды широко распространенных патогенов, т.е. патогенов, которыми каждый организм, в частности, млекопитающие, предпочтительно человек, имеет высокую вероятность заражения по меньшей мере один раз в течение жизни.

Они включают, например, любой следующий структурный или неструктурный белок или пептид:

- вирус гриппа типа А или В или любой другой ортомикосвирус (вирус гриппа типа С),

- пикорновирусы, такие как риновирус или вирус гепатита А,

- тогавирусы, такие как альфавирус или рубивирус, например, вирус Синдбис, вирус леса Семлики или рубеолавирус (вирус краснухи),

- рубелла вирус (вирус немецкой краснухи),

- коронавирусы, в частности, подтипов HCV-229E или HCV-OC43,

- рабдовирусы, такие как вирус бешенства,

- парамиксовирусы, такие как вирус свинки,

- реовирусы, такие как ротавирус группы А, В или С,

- гепаднавирусы, такие как вирус гепатита В,

- паповирусы, такие как человеческие вирусы папилломы (HPV) любого серотипа, прежде всего с 1 по 75,

- аденовирусы, в частности, типа 1-47,

- вирусы герпеса, такие как вирус герпеса простого 1, 2 или 3,

- цитомегаловирус (CMV), предпочтительно CMVpp65,

- вирус Эпштейна-Барра (EBV),

- вирусы коровьей оспы и

- бактерия Chlamydophila pneumoniae (Chlamydia pneumoniae).

Другими примерами предпочтительных иммуногенных белков или пептидов являются белки или пептиды патогенов, которые лишь изредка заражают организм. Эти белки или пептиды включают, например, любой следующий структурный или неструктурный белок или пептид:

- флавивирусы, такие как вирус Денге типа 1-4, вирус желтой лихорадки, вирус Западного Нила, вирус японского энцефалита,

- вирус гепатита С,

- калицивирусы,

- филовирусы, такие как вирус Эбола,

- борнавирусы,

- буниавирусы, такие как вирус лихорадки Рифт-Валли,

- аренавирусы, такие как LCMV (вирус лимфоцитарного хориоменингита) или вирус геморрагической лихорадки,

- ретровирусы, такие как ВИЧ, и

- парвовирусы.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции представляет собой иммуностимулирующую РНК, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, и ее объединяют по меньшей мере с одним указанным выше иммуногенным белком или пептидом, предпочтительно нуклеопротеином вируса гриппа (NP) или его фрагментом или вариантом.

4. Индукторы апоптоза

В этом контексте имеющие белковую основу индукторы апоптоза или их фрагменты и варианты, которые описаны выше в контексте «кодирующей РНК», можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Альтернативно этому, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки или их фрагменты или варианты, можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента.

Предпочтительно индуктор апоптоза выбирают из группы, которая состоит из семейства Bcl-2 и белка-супрессора опухолей р53, и лигандов трансмембранных рецепторов смерти, прежде всего суперсемейства гена рецепторов TNF (фактор некроза опухолей), агонистов проапаптозного рецептора и беклина-1.

Наиболее предпочтительным индуктором апоптоза в контексте настоящего изобретения является белок беклин-1 (полученный из гена BECN1).

Другие предпочтительные примеры индукторов апоптоза можно выбирать из следующего перечня: Bcl-10, Bax, Bak, Bid, Bad, Bim, Bik, Blk, цитохром с, каспазы, прежде всего каспаза 3, каспаза 6, каспаза 7, каспаза 8, каспаза 9, домен смерти, прежде всего Fas, предпочтительно FasL, TNFα, Apo2L/TRAIL, агонист DR4 и/или DR5, Apo3L, агонистическое антитело к DR4, агонистическое антитело к DR5, протеинкиназа R (PKR) (предпочтительно обладающая конститутивной активностью PKR), гранзим В.

В этом контексте особенно предпочтительными являются индукторы апоптоза, представленные выше в таблицах 5 и 6.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции представляет собой иммуностимулирующую РНК, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, и ее объединяют по меньшей мере с одним указанным выше индуктором апоптоза или его фрагментом или вариантом.

5. Ингибиторы ангиогенеза

В этом контексте имеющие белковую основу ингибиторы ангиогенеза или их фрагменты и варианты, которые описаны выше в контексте «кодирующей РНК», можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Альтернативно этому, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки или их фрагменты или варианты, можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента.

Предпочтительные примеры ингибиторов ангиогенеза согласно изобретению можно выбирать из следующего перечня: интерферон альфа (IFN-α), (интерферон бета) IFN-β, интерферон гамма (IFN-γ), CXCL9, CXCL10, интерлейкин 12 (IL-12), тромбоцитарный фактор 4 (PF-4), фактор некроза опухолей альфа (TNF-α), растворимая fms-подобная тирозинкиназа 1 (sFLT-1), фетальная печеночная киназа 1 (FLK-1), ангиостатин, эндостатин, вазостатин, канстатин, тумстатин, фрагмент пролактина с молекулярной массой 16 кДа, тканевый ингибитор металлопротеиназ 1 (TIMP-1), тканевый ингибитор металлопротеиназ 2 (TIMP-2), тканевый ингибитор металлопротеиназ 3 (TIMP-3), тромбоспондин 1 (TSP-1), тромбоспондин 2 (TSP-2), маспин, РЕХ, растворимый тирозинпротеинкиназный рецептор 1 (sTie1), растворимый рецептор 2 ангиопоэтина-1 (sTie2), ангиопоэтин-1, ангиопоэтин-2, антитело к рецептору сосудистого эндотелиального фактора роста 2 (VEGFR2) (например, алацизумаб, рамуциркумаб), антитело к сосудистому эндотелиальному фактору роста (VEGF) (например, бролуцизумаб, ранибизумаб, бевацизумаб) и антитело к рецептору сосудистого эндотелиального фактора роста 1 (VEGFR1) (например, икрукумаб).

В этом контексте особенно предпочтительными являются ингибиторы ангиогенеза, представленные выше в таблице 7.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции представляет собой иммуностимулирующую РНК, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, и ее объединяют по меньшей мере с одним указанным выше ингибитором ангиогенеза или его фрагментом или вариантом.

6. Белки теплового шока

В этом контексте имеющие белковую основу белки теплового шока или их фрагменты и варианты, которые описаны выше в контексте «кодирующей РНК», можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Альтернативно этому, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки или их фрагменты или варианты, можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента.

Предпочтительно белки теплового шока можно выбирать из следующего перечня: HSP27, HSP47 (серпин HI), HSP60, HSP70, HSC70, GRP78 (BiP), HSP90, HSP110, GRP94 (gp96), GRP170 (ORP150), PDI/PDIA, CRT/CALR.

В этом контексте особенно предпочтительными являются белки теплового шока, представленные выше в таблице 8.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции представляет собой иммуностимулирующую РНК, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, и ее объединяют по меньшей мере с одним указанным выше белком теплового шока или его фрагментом или вариантом.

7. Опухолевые антигены:

В этом контексте имеющие белковую основу опухолевые антигены или их фрагменты и варианты, которые описаны выше в контексте «кодирующей РНК», можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Альтернативно этому, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки или их фрагменты или варианты, можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента.

В этом контексте особенно предпочтительными являются опухолевые антигены, представленные выше в таблице 9.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции представляет собой иммуностимулирующую РНК, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, и ее объединяют по меньшей мере с одним указанным выше опухолевым антигеном или его фрагментом или вариантом.

8. Ингибиторы В-катенина:

В этом контексте имеющие белковую основу ингибиторы р-катенина или их фрагменты и варианты, которые описаны выше в контексте «кодирующей РНК», можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Альтернативно этому, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки или их фрагменты или варианты, можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента.

Наиболее предпочтительные ингибиторы β-катенина согласно настоящему изобретению содержат TAT-NLS-BLBD-6, аксин-1, TCF-4, GSK-3b, DKK-1, производные Dvl-1 или их фрагменты.

Химические ингибиторы 3-катенина:

Согласно настоящему изобретению по меньшей мере один дополнительный фармацевтический ингредиент, который может содержаться в предлагаемой в изобретении композиции и/или который можно совместно вводить, или который можно объединять с предлагаемой в изобретении композицией, может представлять собой химический ингибитор β-катенина. Химические ингибиторы β-катенина, которые можно вводить согласно настоящему изобретению, известны в данной области. Предпочтительно химический ингибитор β-катенина выбирают из следующего перечня: PKF118-310, CGP049090, PKF115-584, PKF222-815, PKF118-744, ICG001, ССТ036477, XAV939, ацилгидразоны (HQBA), молекулы с 2,3,6-тризамещенным пиридо[2,3,-b]пиразиновым ядром, карнозиновая кислота, ССТ031374, iCRT-3,5,14, NC043, ибупрофен, аспирин.

Ниже в таблице 13А обобщены примеры низкомолекулярных ингибиторов передачи сигналов β-катенина, которые являются особенно предпочтительными в этом контексте.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции представляет собой иммуностимулирующую РНК, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, и ее объединяют по меньшей мере с одним указанным выше ингибитором β-катенина или его фрагментом или вариантом.

9. Активаторы пути STING

В этом контексте имеющие белковую основу активаторы пути STING или их фрагменты и варианты, которые описаны выше в контексте «кодирующей РНК», можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Альтернативно этому, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки или их фрагменты или варианты, можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Предпочтительно по меньшей мере один активатор (стимулятор) пути STING выбирают из активирующего белка или конститутивно активного белка пути STING, предпочтительно DDX41, STING, cGAS, IRF3, TBK1 или STAT6 или его фрагмента или варианта.

Химические активаторы пути STING

В следующем предпочтительном варианте предлагаемой в изобретении необязательный дополнительный фармацевтически активный компонент можно выбирать из химических активаторов пути STING, которые предпочтительно выбирают из циклических динуклеотидов и ксантеноновых аналогов.

В таблице 14 представлены примеры химических агонистов STING. Дополнительные примеры агонистов STING описаны в WO 2014/189805.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции представляет собой иммуностимулирующую РНК, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, и ее объединяют по меньшей мере с одним указанным выше активатором пути STING или его фрагментом или вариантом.

10. Модуляторы контрольных «точек»

В этом контексте имеющие белковую основу модуляторы контрольных «точек» или их фрагменты и варианты, которые описаны выше в контексте «кодирующей РНК», можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Альтернативно этому, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки или их фрагменты или варианты, можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения модулятор контрольных «точек» представляет собой модулятор B7-1/CD80, В7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, В7-Н2, В7-Н3, В7-Н4, В7-Н6, B7-H7/HHLA2, BTLA, CD28, CD28H/IGPR-1, CTLA-4, ICOS, PD-1, PD-L2/B7-DC, PDCD6, VISTA/B7-H5/PD-1H, BTN1A1/бутирофилина, BTN2A1, BTN2A2/бутировафилина 2А2, BTN3A1/2, BTN3A2, BTN3A3, BTNL2/бутировафилин-подобного 2, BTNL3, BTNL4, BTNL6, BTNL8, BTNL9, BTNL10, CD277/BTN3A1, LAIR1, LAIR2, CD96, CD155/PVR, CRTAM, DNAM-1/CD226, нектина-2/CD112, нектина-3, TIGIT, LILRA3/CD85e, LILRA4/CD85g/ILT7, LILRB1/CD85j/ILT2, LILRB2/CD85d/ILT4, LILRB3/CD85a/ILT5, LILRB4/CD85k/ILT3, 4-1BB/TNFRSF9/CD137, лиганда 4-1BB/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, лиганда CD27/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, лиганда CD30/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, лиганда CD40/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, лиганда GITR/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, лимфотоксина-альфа/ТНР-бета, OX40/TNFRSF4, лиганда OX40/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-альфа, TNF RII/TNFRSF1B, 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6, SLAM/CD150, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-3, TIM-4, CD7, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, CRTAM, DAP12, дектина-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, интегрина альфа 4 бета 1, интегрина альфа 4 бета 7/LPAM-l, LAG-3, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP R или любой их комбинации.

Предпочтительно модулятор контрольных «точек» выбирают из агонистических антител, антагонистических антител, лигандов, доминантно-негативных рецепторов и рецепторов-ловушек или их комбинаций.

Предпочтительно агонистические антитела выбирают из следующего перечня: антитело к 4-1ВВ, антитело к OX40, антитело к GITR, антитело к CD28, антитело к CD27, антитело к CD-40, антитело к ICOS, антитело к TNFRSF25 и антитело к LIGHT.

Предпочтительно антагонистическое антитело выбирают из перечня, включающего антитело к CTLA4, антитело к PD1, антитело к PD-L1, антитело к Vista, антитело к Tim-3, антитело к LAG-3 и антитело к BTLA.

Наиболее предпочтительными антителами к CTLA-4 являются ипилимумаб (Yervoy®), тремелимумаб и AGEN-1884.

Особенно предпочтительными являются антитела к PD1 ниволумаб (MDX-1106/BMS-936558/ONO-4538), (Brahmer и др., J Clin Oncol. 28(19), 2010, cc. 3167-3175; PMID: 20516446); пидилизумаб (CT-011), (Berger и др., Clin Cancer Res. 14(10), 2008, cc. 3044-3051; PMID: 18483370); пембролизумаб (МК-3475, SCH 900475); АМР-224 и MEDI0680 (AMP-514).

Особенно предпочтительными являются антитела к PD-L1 MDX-1105/BMS-936559 (Brahmer и др., N Engl J Med. 366(26), 2012, сс. 2455-65; PMID: 22658128); атезолизумаб (MPDL3280A/RG7446); дурвалумаб (MEDI4736) и авелумаб (MSB0010718).

Согласно настоящему изобретению особенно предпочтительными являются модуляторы контрольных «точек», указанные в таблице 15:

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения модулятор контрольных «точек» представляет собой рецептор-ловушку (например, растворимый рецептор). Предпочтительно рецептор-ловушка представляет собой растворимый рецептор PD1. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность РНК, кодирующая растворимый рецептор PD-1, содержит последовательность РНК SEQ ID NO: 389.

Еще в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения модулятор контрольных «точек» представляет собой лиганд белка иммунной контрольной «точки». Предпочтительно лиганд представляет собой лиганд CD40 (CD40L).

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции представляет собой иммуностимулирующую РНК, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, и ее объединяют по меньшей мере с одним указанным выше модулятором контрольных «точек», предпочтительно выбранным из антитела к CTLA4, антитела к PD1, антитела к PD-L1, лиганда CD4, растворимого рецептора PD1 или его фрагмента или варианта.

11. Активаторы врожденного иммунитета:

В этом контексте имеющие белковую основу активаторы врожденного иммунитета или их фрагменты и варианты, которые описаны выше в контексте «кодирующей РНК», можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Альтернативно этому, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки или их фрагменты или варианты, можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента.

В этом контексте активаторы врожденного иммунитета можно выбирать из адъювантных белков млекопитающих, прежде всего человека, которые, как правило, содержат любой человеческий белок или пептид, который обладает способностью вызывать врожденный иммунный ответ (у млекопитающего), например, в виде реакции связывания экзогенного лиганда TLR с TLR. Более предпочтительно человеческие адъювантные белки выбирают из группы, состоящей из белков, которые являются компонентами и лигандами сигнальных сетей паттерн-распознающих рецепторов, которые включают TLR, NLR и RLH, включая TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11; NOD1, NOD2, NOD3, NOD4, NOD5, NALP1, NALP2, NALP3, NALP4, NALP5, NALP6, NALP6, NALP7, NALP7, NALP8, NALP9, NALP10, NALP11, NALP12, NALP13, NALP14,1 IPAF, NAIP, CIITA, RIG-I, MDA5 и LGP2, сигнальные трансдукторы передачи сигналов TLR, включая адапторные белки, такие, например, как Trif и Cardif; компоненты передачи сигналов малых ГТФаз (RhoA, Ras, Rac1, Cdc42, Rab и т.д.), компоненты передачи сигналов PIP (PI3K, Src-киназы и т.д.), компоненты Му088-зависимой передачи сигналов (MyD88, IRAKI, IRAK2, IRAK4, TIRAP, TRAF6 и т.д.), компоненты независимой от MyD88 передачи сигналов (TICAM1, TICAM2, TRAF6, TBK1, IRF3, TAK1, IRAKI и т.д.); активирующие киназы, включая, например, Akt, MEKK1, MKK1, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, ERK1, ERK2, GSK3, PKC-киназы, PKD-киназы, GSK3-киназы, JNK, р38МАРК, TAK1, IKK, и TAK1; активирующие факторы транскрипции, включая, например, NF-κB, c-Fos, c-Jun, с-Мус, CREB, АР-1, Elk-1, ATF2, IRF-3, IRF-7.

Адъювантные белки млекопитающих, прежде всего человека, можно выбирать также из группы, состоящей из белков теплового шока, таких как HSP10, HSP60, HSP65, HSP70, HSP75 и HSP90, gp96, фибриногена, повтора экстра-домена А типа III фибронектина; или компонентов системы комплемента, включая C1q, MBL, C1r, C1s, C2b, Bb, D, MASP-1, MASP-2, C4b, C3b, C5a, C3a, C4a, C5b, C6, C7, C8, C9, CR1, CR2, CR3, CR4, C1qR, C1INH, C4bp, MCP, DAF, H, I, P и CD59, или компонентов, индуцирующих гены-мишени, включая, например, бета-дефензин, белки клеточной поверхности; или человеческих адъювантных белков, включая trif, лиганд flt-3, Gp96 или фибронектин и т.д. или гомологов любого из указанных выше человеческих адъювантных белков из других видов. Кроме того, в качестве адъювантного белка можно использовать HGMB1.

Адъювантные белки млекопитающих, прежде всего человека, могут содержать также цитокины, которые индуцируют или усиливают врожденный иммунный ответ, включая IL-1 альфа, IL1 бета, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-23, TNFальфа, IFNальфа, IFN6ета, IFNгамма, GM-CSF, G-CSF, M-CSF; хемокины, включая IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1альфа, RANTES, эотаксин, CCL21; цитокины, которые высвобождаются из макрофагов, включая IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 и TNF-альфа; а также s IL-1R1 и IL-1 альфа.

Таким образом, в этом контексте особенно предпочтительно, чтобы по меньшей мере один активатор врожденного иммунного ответа представлял собой предпочтительно адъювантный белок, более предпочтительно человеческий адъювантный белок или его фрагмент или вариант.

В этом контексте особенно предпочтительно в качестве активатора врожденного иммунитета применять по меньшей мере конститутивно активный вариант адъювантного белка, предпочтительно конститутивно активный вариант RIG-1 (ΔRIGI).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один активатор врожденного иммунитета представляет собой HGMB1 или его фрагмент или вариант.

В этом контексте особенно предпочтительными являются активаторы врожденного иммунитета, указанные выше в таблице 11.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции представляет собой иммуностимулирующую РНК, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, и ее объединяют по меньшей мере с одним указанным выше активатором иммунного ответа или его фрагментом или вариантом.

12. Антитела, рецепторы-ловушки и доминантно-негативные рецепторы

В этом контексте имеющие белковую основу антитела, рецепторы-ловушки и доминантно-негативные рецепторы или их фрагменты и варианты, которые описаны выше в контексте «кодирующей РНК», можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Альтернативно этому, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки или их фрагменты или варианты, можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента.

Согласно настоящему изобретению особенно предпочтительными являются антитела, указанные в таблице 16:

Предпочтительно нейтрализующее антитело выбирают из перечня, включающего антитело к IL-10 и антитело к TGFбета.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции представляет собой иммуностимулирующую РНК, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, и ее объединяют по меньшей мере с одним антителом, предпочтительно антителом к CD73, или по меньшей мере с одним указанным выше рецептором-ловушкой, или его фрагментом или вариантом.

Кроме того, по меньшей мере одно антитело можно предпочтительно выбирать из антител к CD73 или их фрагментов или вариантов.

В следующем особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одно антитело выбирают из антитела к CCR5/CD195 или антитела к лиганду CCL5/RANTES, или их фрагментов или вариантов.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения рецептор-ловушка представляет собой растворимый CCR5 (хемокиновый рецептор типа 5, известный также как CD195).

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения доминантно-негативный рецептор представляет собой доминантно-негативный CCR5 (хемокиновый рецептор типа 5, известный также как CD195).

13. Ингибиторы супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC):

В этом контексте имеющие белковую основу супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC) или их фрагменты и варианты, которые описаны выше в контексте «кодирующей РНК», можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Альтернативно этому, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки или их фрагменты или варианты, можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента.

Особенно предпочтительно применять в качестве ингибиторов MDSC антитела к IL-17 и IL-12.

В контексте изобретения для достижения ингибирования MDSC можно использовать непосредственную деактивацию MDSC (например, с помощью химических ингибиторов NO (PDE-5-ингибиторы, NO-аспирины, L-NAME), ингибиторов аргиназы (PDE-5-ингибиторы, СОХ2-ингибиторы, NOHA, L-NAME), ингибиторов ROS (синтетические тритерпеноиды)), путем блокады дифференцировки MDSC в зрелые клетки (например, ATRA, витамин А, витамин D3, CpG), путем блокады клеточного развития MDSC (например, бисфофонаты (золедроновая кислота), модуляторы клеточных сигналов (ингибиторы JAK2/STAT3, мультикиназные ингибиторы, ингибиторы VEGF)), или путем истощения MDSC (например, цитотоксические агенты (гемцитабин, цисплатин, паклитаксел, 5-фторурацил) или ингибиторы HSP 90 (17-DMAG)). Таким образом, эти соединения можно применять также в качестве дополнительного фармацевтически активного соединения.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции представляет собой иммуностимулирующую РНК, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, и ее объединяют по меньшей мере с одним указанным выше ингибитором MDSC или его фрагментом или вариантом.

14. Ингибиторы пути IDO

В этом контексте имеющие белковую основу ингибиторы пути IDO или их фрагменты и варианты, которые описаны выше в контексте «кодирующей РНК», можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Альтернативно этому, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки или их фрагменты или варианты, можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента.

Химический ингибитор пути IDO:

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения дополнительный фармацевтически активный компонент можно выбирать из ингибитора пути IDO, который предпочтительно выбирают из низкомолекулярного ингибитора. Предпочтительно ингибитор пути IDO выбирают из следующего перечня: индоксимод (D-изомер 1-метилтриптофана) и NLG919).

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции представляет собой иммуностимулирующую РНК, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, и ее объединяют по меньшей мере с одним указанным выше ингибитором пути IDO или его фрагментом или вариантом.

15. Белки или пептиды, которые связываются с ингибиторами апоптоза

Апоптоз представляет собой строго регулируемый клеточный процесс и нарушение регуляции апоптоза является отличительным признаком различных видов рака у человека. Направленное воздействие на ключевые регуляторы апоптоза с целью нарушения апоптоза в опухолевых клетках развивается в качестве новой стратегии терапии рака. XIAP, cIAP1 и cIAP2, представители ингибиторов белков апоптоза (IAP), являются имеющими решающее значение регуляторами гибели и выживания клеток и представляют собой привлекательные мишени для новой противораковой терапии. Белок SMAC/DIABLO представляет собой эндогенный антагонист XIAP, cIAP1 и cIAP2. В последнее десятилетие интенсивные исследования привели к созданию и разработке нескольких низкомолекулярных миметиков SMAC, которые в настоящее время проходят клинические испытания в качестве агентов для лечения рака.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении композиция содержит по меньшей мере одну молекулу, которая связывается с ингибиторами белков апоптоза (IAP) и тем самым повышает подверженность раковых клеток к смерти в результате апоптоза.

Таким образом, особенно предпочтительно, чтобы РНК в предлагаемой в изобретении композиции кодировала по меньшей мере один белок или пептид, который связывается с ингибиторами апоптоза, такой как миметики SMAC.

Особенно предпочтительные белки или пептиды, которые связывают IAP, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат Omi/HtrA2, Smac, полученные из Smac пептиды, Smac/DIABLO и XAF1 (XIAP-ассоциированный фактор 1) и их фрагменты или варианты.

В этом контексте белки или пептиды, которые связываются с ингибиторами апоптоза, или их фрагменты и варианты, которые описаны выше в контексте «кодирующей РНК», можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента. Альтернативно этому, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные белки или их фрагменты или варианты, можно применять в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента.

Таким образом, особенно предпочтительно дополнительный фармацевтически активный компонент выбирать из белков или пептидов, которые связываются с ингибиторами апоптоза, таких как миметики SMAC. Кроме того, особенно предпочтительно, чтобы указанные миметики SMAC, применяемые в качестве дополнительного фармацевтически активного компонента, представляли собой малые молекулы, ингибирующие ингибиторы апоптоза.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна РНК в содержащей РНК композиции представляет собой иммуностимулирующую РНК, предпочтительно имеющую SEQ ID NO: 5, 394 или 10072, и ее объединяют по меньшей мере с одним указанным выше белком или пептидом, который связывается с ингибитором апоптоза, или его фрагментом или вариантом.

16. Антибактериальный агент:

Согласно настоящему изобретению по меньшей мере один дополнительный фармацевтически активный компонент, который может входить в предлагаемую в изобретении композицию, и/или который можно вводить совместно, может представлять собой антибактериальный агент. В этом контексте любой из известных специалисту в данной области антибактериальных агентов можно применять в комбинации с компонентами предлагаемой в изобретении композиции, указанной в настоящем описании. Примерами антибактерильных агентов являются (но, не ограничиваясь только ими) амикацин, амоксиллин, амоксиллин-клавулановая кислота, амфотерицин-В, ампициллин, ампициллин-сульбактам, апрамицин, азитромицин, азтреонам, бацитрацин, бензилпенициллин, каспофунгин, цефаклор, цефадроксил, цефалексин, цефалотин, цефазолин, цефдинир, цефепим, цефиксим, цефменоксим, цефоперазон, цефоперазон-сульбактам, цефотаксим, цефокситин, цефбиром, цефподоксим, цефподоксим-клавулановая кислота, цефподоксим-сульбактам, цефброзил, цефквином, цефтазидим, цефтибутин, цефтиофур, цефтобипрол, цефтриаксон, цефуроксим, хлорамфеникол, флорфеникол, ципрофлоксацин, кларитромицин, клинафлоксацин, клиндамицин, клоксациллин, колистин, котримоксазол (тримтоприм/сульфаметоксазол), далбаванцин, дальфопристин/хинопристин, даптомицин, дибекацин, диклоксациллин, дорипенем, доксициклин, энрофлоксацин, эртапенем, эритромицин, флуклоксациллин, флуконазол, флуцитозин, фосфомицин, фузидовая кислота, гареноксацин, гатифлоксацин, гемифлоксацин, гентамицин, имипенем, итраконазол, канамицин, кетоконазол, левофлоксацин, линкомицин, линезолид, лоракарбеф, мециллнам (амдиноциллин), меропенем, метронидазол, мезиоциллин, мезлоциллин-сульбактам, миноциклин, моксифлоксацин, мупироцин, налидиксовая кислота, неомицин, нетилмицин, нитрофурантоин, норфлоксацин, офлоксацин, оксациллин, пефлоксацин, пенициллин V, пиперациллин, пиперациллин-сульбактам, пиперациллин-тазобактам, рифампицин, рокситромицин, спарфлоксацин, спектиномицин, спирамицин, стрептомицин, сульбактам, сульфаметоксазол, тейкопланин, телаванцин, телитромицин, темоциллин, тетрациклин, тикарциллин, тикарциллин-клавулановая кислота, тигециклин, тобрамицин, триметоприм, тровафлоксацин, тилозин, ванкомицин, виргиниамицин и вориконазол.

17. Антивирусные агенты:

Согласно настоящему изобретению по меньшей мере один дополнительный фармацевтически активный компонент/соединение, который/которое может содержаться в предлагаемой в изобретении композиции и/или который/которое можно вводить совместно, может представлять собой антивирусный агент, предпочтительно (но, не ограничиваясь только ими) нуклеозидные аналоги (например, зидовудин, ацикловир, ганцикловир, видарабин, идоксуридин, трифлуридин и рибавирин), фоскарнет, амантадин, перамивир, римантадин, саквинавир, индинавир, ритонавир, альфа-интерфероны и другие интерфероны, AZT, t-705, занамивир (Relenza^®) и оселтамивир (Tamiflu^®). Другие антивирусные агенты включают вакцины против вируса грипп, например, Fluarix^® (фирма Glaxo SmithKline), FluMist^® (фирма Medlmmune Vaccines), Fluvirin^® (фирма Chiron Corporation), Flulaval^® (фирма GlaxoSmithKline), Afluria^® (фирма CSL Biotherapies Inc.), Agriflu^® (фирма Novartis) или Fluzone^® (фирма Aventis Pasteur).

18. Лекарственные средства:

В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительный фармацевтически активный компонент/соединение может включать по меньшей мере одно лекарственное средство. Подразумевается, что понятие «лекарственное средство» включает любую субстанцию, которая после интродукции или абсорбции в живой организм, изменяет обычную функцию организма или клетки. Некоторыми примерами приемлемых лекарственных средств являются (но, не ограничиваясь только ими) комбинации и альтернативные формы лекарственных средств, такие как альтернативные формы солей, формы свободных кислот, формы свободных оснований, пролекарства и гидраты, включая следующие средства:

анальгетики/антипиретики (например, аспирин, ацетаминофен, ибупрофен, напроксен натрия, бупренорфин, пропоксифена гидрохлорид, пропоксифена напсилат, меперидина гидрохлорид, гидроморфона гидрохлорид, морфин, оксикодон, кодеин, дигидрокодеина битартрат, пентазоцин, гидрокодона битартрат, леворфанол, дифлунизал, троламина салицилат, налбуфина гидрохлорид, мефенаминовая кислота, буторфанол, холина салицилат, буталбитал, фенилтолоксамина цитрат, дифенгидрамина цитрат, метотримепразин, циннамедрина гидрохлорид и мепробамат); противоастматические средства (например, кетотифен и траксанокс); антибиотики (например, неомицин, стрептомицин, хлорамфеникол, цефалоспорин, ампициллин, пенициллин, тетрациклин и ципрофлоксацин); антидепрессанты (например, нефопам, оксипертин, доксепин, амоксапин, тразодон, амитриптилин, мапротилин, фенелзин, дезипрамин, нортриптилин, транилципромин, флуоксетин, имипрамин, имипрамина памоат, изокарбоксазид, тримипрамин и протриптилин); антидиабетические средства (например, бигуаниды и производные сульфонилмочевины); противогрибковые агенты (например, гризеофулвин, кетоконазол, итраконазол, амфотерицин В, нистатин и кандицидин); гипотензивные агенты (например, пропанолол, пропафенон, оксипренолол, нифедипин, резерпин, триметафан, феноксибензамин, паргилина гидрохлорид, десерпидин, диазоксид, гуанетидина моносульфат, миноксидил, ресциннамин, нитропруссид натрия, раувольфия змеиная, алсероксилон и фентоламин); противовоспалительные средства (например, (нестероидные) индометацин, кетопрофен, флурбипрофен, напроксен, ибупрофен, рамифеназон, пироксикам, (стероидные) кортизон, дексаметазон, флуазакорт, дефлазакорт, целекоксиб, рофекоксиб, гидрокортизон, преднизолон и преднизон); антинеопластические средства (например, циклофосфамид, актиномицин, блеомицин, дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, митомицин, метотрексат, фторурацил, гемцитабин, карбоплатин, кармустин (BCNU), метил-CCNU, цисплатин, этопозид, камптотецин и его производные, фенестерин, паклитаксел и его производные, доцетаксел и его производные, винбластин, винкристин, госерелин, леупролид, тамоксифен, интерферон альфа, ретиноевая кислота (ATRA), алкилирующие агенты на основе азотистых аналогов горчичного газа и пипосульфан); успокоительные лекарственные средства (например, лоразепам, буспирон, празепам, хлордиазепоксид, оксазепам, дикалий клоразепат, диазепам, гидроксизина памоат, гидроксизина гидрохлорид, алпразолам, дроперидол, галазепам, хлормезалон и дантролен); иммунодепрессанты (например, циклоспорин, азатиоприн, мизорибин и FK506 (такролимус)); противомигреневые лекарственные средства (например, эрготамин, пропанолол, изометептена мукат и дихлоралфеназон); седативные/снотворные средства (например, барбитураты, такие как пентобарбитал, пентобарбитал и секобарбитал; и бенздиазапины, такие как флуразепама гидрохлорид, триазолам и мидазолам); антиангинальные агенты (например, бета-адренергические блокаторы; блокаторы кальциевых каналов, такие как нифедипин и дилтиазем; и нитраты, такие как нитроглицерин, изосорбида динитрат, пентеаритритола тетранитрат и эритритила тетранитрат); антипсихотические агенты (например, галопиридол, локсапина сукцинат, локсапина гидрохлорид, тиоридазин, тиоридазина гидрохлорид, тиотиксен, флуфеназин, флуфеназина деканоат, флуфеназина энантат, трифлуоперазин, хлорпромазин, перфеназин, лития цитрат и прохлорперазин); антиманиакальные агенты (например, лития карбонат); противоаритмические средства (например, бретилиума тозилат, эсмолол, верапамил, амиодарон, энкамид, дигоксин, дигитоксин, мексилетин, дизопирамида фосфат, прокаинамид, квинидина сульфат, квинидина глюконат, квинидина полигалактуронат, флекамида ацетат, токамид и лидокаин); противоартритные агенты (например, фенилбутазон, сулиндак, пеницилланин, сальсалат, пироксикам, азатиоприн, индометацин, меклофенамат, ауротиомалат натрия, кетопрофен, ауранофин, ауротиоглюкоза и натрия толметин); противоподагрические агенты (например, колхицин и аллопуринол); антикоагулянты (например, гепарин, гепарин натрия и варфарин натрия); тромболитические агенты (например, урокиназа, стрептокиназа и алтеплаза); антифибринолитические агенты (например, аминокапроновая кислота); гемореологические средства (например, пентофиксиллин); противотромбоцитарные агенты (например, аспирин); противосудорожные средства (например, вальпроевая кислота, дивальпроекс натрия, фенилоин, фенилоин натрия, клоназепам, примидон, фенобарбитал, карбамазепин, амобарбитал натрия, метсуксимид, метарбитал, мефобарбитал, мефенилоин, фенсуксимид, параметадион, этотоин, фенацемид, секобарбитал натрия, клоразепат дикалия и триметадион); средства против болезни Паркинсона (например, этосуксимид); антигистаминные средства/средства против зуда (например, гидроксизин, дифенгидрамин, хлорфенирамин, бромфенирамина малеат, ципрогептадина гидрохлорид, терфенадин, клемастина фумарат, трипролидин, карбиноксамин, дифенилпиралин, фениндамин, азатидин, трипеленамин, дексхлорфенирамина малеат, метдилазин); агенты, которые можно применять для регуляции кальция (например, кальцитонин и паратиреоидные гормоны); антибактериальные агенты (например, амикацина сульфат, азтреонам, хлорамфеникол, хлорамфеникола пальмитат, ципрофлоксацин, клиндамицин, клиндамицина пальмитат, клиндамицина фосфат, метронидазол, метронидазола гидрохлорид, гентамицина сульфат, линкомицина гидрохлорид, тобрамицина сульфат, ванкомицина гидрохлорид, полимиксина В сульфат, колистиметат натрия и колистина сульфат); противовирусные агенты (например, интерферон альфа, бета или гамма, зидовудин, амантадина гидрохлорид, рибавирин и ацикловир); противомикробные средства (например, цефалоспорины, такие как цефазолин натрия, цепрадин, цефаклор, цефапирин натрия, цефтизоксим натрия, цефоперазон натрия, цефотетана динатриевая соль, цефуроксима аксетил, цефотаксим натрия, цефадроксила моногидрат, цефалексин, цефалотин натрия, моногидрат гидрохлорида цефалексина, цефамандола нафат, цефокситин натрия, цефонисид натрия, цефоранид, цефтриаксон натрия, цефтазидим, цефадроксил, цефрадин и цефуроксим натрия; пенициллины, такие как ампициллин, амоксициллин, бензатин пенициллина G, циклациллин, ампициллин натрия, калиевая соль пенициллина G, калиевая соль пенициллина V, пиперациллин натрия, оксациллин натрия, бакампициллина гидрохлорид, клоксациллин натрия, динатриевая соль тикарциллина, азлоциллин натрия, карбенициллина инданил натрия, прокаин пенициллина G, метициллин натрия и нафциллин натрия; макролиды, такие как азитромицин, кларитромицин, и эритромицины, такие как эритромицина этилсукцинат, эритромицин, эритромицина эстолат, эритромицина лактобионат, эритромицина стеарат и эритромицина этилсукцинат; и тетрациклины, такие как тетрациклина гидрохлорид, доксициклина гиклат и миноциклина гидрохлорид); антиинфекционные средства (например, GM-CSF); бронходилататоры (например, симпатомиметики, такие как эпинефрина гидрохлорид, метапротеренола сульфат, тербуталина сульфат, изоэтарин, изоэтарина мезилат, изоэтарина гидрохлорид, альбутерола сульфат, альбутерол, битолтеролмезилат, изопротеренола гидрохлорид, тербуталина сульфат, эпинефрина битартрат, метапротеренола сульфат, эпинефрин и эпинефрина битартрат; антихолинергические агенты, такие как ипратропия бромид; ксантины, такие как аминофиллин, дифиллин, метапротеренола сульфат и теофиллин; стабилизаторы тучных клеток, такие как кромолин натрия; ингаляционные кортикостероиды, такие как беклометазона дипропионат (BDP) и моногидрат беклометазона дипропионата; сальбутамол; ипратропия бромид; будесонид; сальметерол; ксинафоат; триамцинолон; недокромил натрия; флунизолид; флутиказона пропионат; стероидные соединения и гормоны (например, андрогены, такие как даназол, тестостерона ципионат, флуоксиместерон, этилтестостерон, тестостерона энатат, метилтестостерон; эстрогены, такие как эстрадиол, эстропипат, и конъюгированные эстрогены; прогестины, такие как метоксипрогестерона ацетат и норэтиндрона ацетат; кортикостероиды, такие как триамцинолон, бетаметазон, бетаметазона натрия фосфат, дексаметазон, дексаметазона натрия фосфат, дексаметазона ацетат, преднизон, суспензия метилпреднизолона ацетата, триамцинолона ацетонид, метилпреднизолон, преднизолона натрия фосфат, метилпреднизолона натрия сукцинат, гидрокортизона натрия сукцинат, триамцинолона гексацетонид, гидрокортизон, гидрокортизона ципионат, преднизолон, флудрокортизона ацетат, параметазона ацетат, преднизолона тебутат, преднизолона ацетат, преднизолона натрия фосфат, и тиреоидные гормоны, такие как левотироксин натрия); гипогликемические агенты (например, человеческий инсулин, очищенный бычий инсулин, очищенный свиной инсулин, глибурид, метформин, хлорпропамид, глипизид, толбутамид и толазамид); гиполипидемические агенты (например, клофибрат, декстротироксин натрия, пробукол, праваститин, аторвастатин, ловастатин и ниацин); белки (например, ДНКаза, альгиназа, супероксиддисмутаза и липаза); нуклеиновые кислоты (например, антисмысловые нуклеиновые кислоты); агенты, применяемые для стимуляции эритропоэза (например, эритропоэтин); противоязвенные/антирефлюксные агенты (например, фамотидин, циметидин и ранитидина гидрохлорид); противотошнотные/противорвотные средства (например, меклизина гидрохлорид, набилон, прохлорперазин, дименгидринат, прометазина гидрохлорид, тиэтилперазин и скополамин); а также другие лекарственные средства, которые можно применять в композициях и способах, указанных в настоящем описании, такие как митотан, галонитрозомочевины, антроциклины, эллиптицин, цефтриаксон, кетоконазол, цефтазидим, оксапрозин, валацикловир, урофоллитропин, фамцикловир, флутамид, эналаприл, итраконазол, буспирон, габапентин, фозиноприл, трамадол, акарбоза, лоразепам, фоллитропин, омепразол, флуоксетин, лизиноприл, трамадол, левофлоксацин, зафирлукаст, интерферон, гормон роста, интерлейкин, эритропоэтин, гранулоцит-стимулирующий фактор, низатидин, бупропион, периндоприл, эрбумин, аденозин, алендронат, алпростадил, беназеприл, бетаксолол, блеомицина сульфат, дексфенфлурамин, дилтиазем, фентанил, флекамид, гемцитабин, глатирамера ацетат, гранисетрон, ламивудин, мангафодипир тринатрия, мезаламин, метопролола фумарат, метронидазол, миглитол, моэксиприл, монтелеукаст, октреотида ацетат, олопатадин, парикальцитол, соматропин, суматриптана сукцинат, такрин, верапамил, набуметон, тровафлоксацин, доласетрон, зидовудин, финастерид, тобрамицин, исрадипин, толкапон, эноксапарин, флуконазол, лансопразол, тербинафин, памидронат, диданозин, диклофенак, цизаприд, венлафаксин, троглитазон, флувастатин, лозартан, имиглюцераза, донепезил, оланзапин, валсартан, фексофенадин, кальцитонин и ипратопия бромид. В некоторых вариантах осуществления изобретения лекарственное средство может быть водорастворимым. В некоторых вариантах осуществления изобретения лекарственное средство может не быть водорастворимым.

19. Комбинация со стандартной терапией

Согласно настоящему изобретению по меньшей мере один дополнительный фармацевтически активный компонент/соединение, который/которое может содержаться в предлагаемой в изобретении композиции и/или который/которое можно вводить совместно, можно выбирать из стандартной терапии, которую применяют для лечения конкретного опухолевого или ракового заболевания, например, любой химиотерапии, модулятора контрольных «точек», ингибитора киназ и т.д.

Адъюванты и другие компоненты:

Согласно настоящему изобретению по меньшей мере один дополнительный фармацевтически активный компонент/соединение, который/которое может содержаться в предлагаемой в изобретении композиции и/или который/которое можно вводить совместно, может представлять собой адъювант. Согласно конкретному варианту осуществления изобретения предлагаемая в изобретении композиция может содержать адъювант. В этом контексте под адъювантом можно понимать любое соединение, которое может инициировать или повышать иммунный ответ врожденной иммунной системы, т.е. неспецифический иммунный ответ. Другими словами, предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция, когда ее вводят, предпочтительно вызывает врожденный иммунный ответ благодаря адъюванту, который необязательно содержится в ней. Предпочтительно указанный адъювант можно выбирать из адъювантов, известных специалисту в данной области и пригодных для рассматриваемого случая, т.е. для поддержания индукции врожденного иммунного ответа у млекопитающего.

Особенно предпочтительными в качестве адъювантов, пригодных для запасания и доставки, являются катионные или поликатионные соединения, описанные выше в качестве наполнителя, агента для трансфекции или комплексообразования для описанной выше предлагаемой в изобретении РНК. Кроме того, предлагаемая в изобретении композиция может содержать один или несколько дополнительных адъювантов, пригодных для инициации или усиления иммунного ответа врожденной иммунной системы, т.е. неспецифического иммунного ответа, прежде всего посредством связывания с патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (РАМР). Другими словами, при введении фармацевтическая композиция предпочтительно вызывает врожденный иммунный ответ благодаря адъюванту, который необязательно содержится в ней. Предпочтительно указанный адъювант можно выбирать из адъювантов, известных специалисту в данной области и пригодных для рассматриваемого случая, т.е. для поддержания индукции врожденного иммунного ответа у млекопитающего.

Кроме того, указанный адъювант можно выбирать из адъюванта, известного специалисту в данной области и пригодного для рассматриваемого случая, т.е. для поддержания индукции врожденного иммунного ответа у млекопитающего и/или пригодного для запасания и доставки компонентов предлагаемой в изобретении композиции. Предпочтительными в качестве пригодных для запасания и доставки адъювантов являются катионные или поликатионные соединения, указанные выше. Аналогично этому, адъювант можно выбирать из группы, состоящей, например, из катионных или поликатионных соединений, указанных выше, таких как хитозан, TDM, MDP, мурамилдипептид, плюроники, раствор квасцов, гидроксид алюминия, ADJUMER™ (полифосфазен); гель фосфата алюминия; глюканы, выделенные из водорослей; алгаммулин; гель гидроксида алюминия (квасцы); высокоадсорбирующий белки гель гидроксида алюминия; обладающий низкой вязкостью гель гидроксида алюминия; AF или SPT (эмульсия, содержащая сквалан (5%), Твин 80 (0.2%), плюроник L121 (1,25%), забуференный фосфатом физиологический раствор, рН 7,4); AVRIDINE™ (пропандиамин); BAY R1005™ ((N-(2-дезокси-2-L-леуциламиноб-D-глюкопиранозил)-N-октадециламида гидроацетат); CALCITRIOL™ (1-альфа,25-дигидрокси-витамин D3); гель фосфата кальция; САР™ (наночастицы фосфата кальция); холерный голотоксин, слитый белок холерный токсин-А1-белок-А-D-фрагмент, субъединица В холерного токсина; CRL 1005 (блок-сополимер P1205); содержащие цитокин липосомы; DDA (диметилдиоктадециламмония бромид); DHEA (дегидроэпиандростерон); DMPC (димиристоилфосфатидилхолин); DMPG (димиристоилфосфатидилглицерин); комплекс DOC/квасцы (натриевая соль дезоксихолиновой кислоты); полный адъювант Фрейнда; неполный адъювант Фрейнда; инулин-гамма; адъювант Гербу (смесь, содержащая: I) N-ацетилглюкозаминил-(Р1-4)-N-ацетилмурамоил-L-аланил-D35 глутамин (GMDP), II) диметилдиоктадециламмония хлорид (DDA), III) комплекс цинк-соль L-пролина (ZnPro-8); GM-CSF); GMDP (N-ацетилглюкозаминил-(b1-4)-N-ацетилмурамил-L47 аланил-D-изоглутамин); имиквимод (1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин); ImmTher™ (N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-А1а-D-изоGlu-Ь-Ala-глицерина дипальмитат); DRV (иммунолипосомы, приготовленные из везикул, полученных методом гидратации-регидратации); интерферон-гамма; интерлейкин-1бета; интерлейкин-2; интерлейкин-7; интерлейкин-12; ISCOMS™; ISCOPREP 7.0.3™; липосомы; LOXORIBINE™ (7-аллил-8-оксогуанозин); оральный адъювант LT 5 (лабильный энтеротоксин-протоксин из E.coli); микросферы и микрочастицы любого состава; MF59TM; (водная эмульсия сквалена); MONTANIDE ISA 51™ (очищенный неполный адъювант Фрейнда); MONTANIDE ISA 720™ (метаболизируемый масляный адъювант); MPL™ (3-Q-дезацил-4'-монофосфорил-липид А); липосомы МТР-РЕ и МТР-РЕ ((N-ацетил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-(гидроксифосфорилокси))этиламид, однонатриевая соль); MURAMETIDE™ (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3); MURAPALMITINE™ и DMURAPALMITINE™ (Nac-Mur-L-Thr-D-изоGIn-sn-глицериндипальмитоил); NAGO (нейраминидаза-галактозооксидаза); наносферы или наночастицы любого состава; NISV (везикулы из неионогенного поверхностно-активного вещества); PLEURAN™ (β-глюкан); PLGA, PGA и PLA (гомо- и сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты; микросферы/наносферы); ПЛЮРОНИК L121™; РММА (полиметилметакрилат); PODDS™ (протеноидные микросферы); полиэтиленкарбаматные производные; поли-rA:поли-rU (комплекс полиадениловая кислота-полиуридиновая кислота); полисорбат 80 (Твин 80); белковые кохлеаты (фирма Avanti Polar Lipids, Inc., Алабастер, шт. Алабама); STIMULON™ (QS-21); Quil-A (сапонин Quil-A); S-28463 (4-аминоотекдиметил-2-этоксиметил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-1-этанол); SAF-1™ («композиция адъювантов фирмы Syntex»); протеолипосомы вируса Сендаи и липидные матрицы, содержащие вирус Сендаи; Спан-85 (сорбитантриолеат); Specol (эмульсия Marcol 52, Спан 85 и Твин 85); сквален или Robane® (2,6,10,15,19,23-гексаметилтетракозан и 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексан); стеарилтирозин (октадецилтирозина гидрохлорид); Theramid^® (М-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-дипальмитоксипропиламид); Theronyl-MDP (Termurtide™ или [thr 1]-MDP; N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин); Ту-частицы (Ту-ВПЧ или вирусоподобные частицы); липосомы Уолтера-Рида (липосомы, содержащие липид А, адсорбированный на гидроксиде алюминия) и липопептиды, включая Pam3Cys, прежде всего соли алюминия, такие как адъю-фос (Adju-phos), алгидрогель, регидрагель и т.д., эмульсии, такие как CFA, SAF, IFA, MF59, провакс, TiterMax, монтанид, ваксфектин и т.д., сополимеры, такие как оптивакс (Optivax, CRL1005), L121, полоксамер 4010) и т.д., липосомы, такие как «липосомы-невидимки (Stealth)» и т.д., кохлеаты, такие как BIORAL, и т.д., адъюванты растительного происхождения, такие как QS21, Quil A, Iscomatrix, ISCOM; адъюванты, пригодные для костимуляции, включая томатин, биополимеры, такие как PLG, РММ, инулин и т.д., адъюванты микробного происхождения, такие как ромуртид, DETOX, MPL, CWS, манноза, нуклеотидные последовательности CpG, CpG7909, лиганды человеческого TLR 1-13, ISS-1018, 35 IC31, имидазохинолины, амплиген, Ribi529, IMOxine, IRIV, ВПЧ, холерный токсин, термолабильный токсин, Pam3Cys, флагеллин, GPI (гликозилфосфатидилинозитол)-якорь, LNFPIII/Левиса X, противомикробные пептиды, UC-1V150, слитый белок RSV, cdiGMP; и адъюванты, пригодные в качестве антагонистов, включая нейропептид CGRP.

Адъювант наиболее предпочтительно можно выбирать из адъювантов, которые поддерживают индукцию Th1-иммунного ответа или созревание наивных Т-клеток, таких как GM-CSF, IL-12, IFNg, любой РНК, указанной выше, предпочтительно иммуностимулирующей РНК, ДНК-CpG и т.д.

Предлагаемая в изобретении композиция может содержать помимо по меньшей мере одной РНК, указанной выше, также другие компоненты, которые выбирают из группы, включающей: другие антигены или другие обеспечивающие образование антигена нуклеиновые кислоты; другой иммунотерапевтический агент; одну или несколько вспомогательных субстанций; или любое другое соединение, в отношении которого известно, что оно обладает иммуностимулирующим действием благодаря его аффинности связывания (как лиганда) с человеческими Толл-подобными рецепторами; и/или адъювантную нуклеиновую кислоту, предпочтительно иммуностимуляторную РНК (isPHK).

Предлагаемая в изобретении композиция может дополнительно содержать одну или несколько вспомогательных субстанций, предназначенных для повышения при необходимости иммуногенности или иммуностимулирующей способности. Тем самым предпочтительно достигается синергетическое действие по меньшей мере одной РНК, представленной в настоящем описании, и вспомогательной субстанции, которая необязательно может содержаться в предлагаемой в изобретении композиции. В зависимости от различных типов вспомогательных субстанций в этом контексте можно рассматривать различные механизмы. Например, соединения, ускоряющие созревание дендритных клеток (DC), например липополисахариды, TNF-альфа или лиганд CD40, образуют первый класс пригодных вспомогательных веществ. В целом, в качестве вспомогательного вещества можно использовать в качестве вспомогательной субстанции любой агент, который оказывает влияние на иммунную систему по типу «сигнала опасности» (LPS, GP96, и т.п.), или можно использовать цитокины, такие как GM-CSF, которые позволяют целенаправленно усиливать иммунный ответ или целенаправленно влиять на него. Наиболее предпочтительными вспомогательными субстанциями являются цитокины, такие как монокины, лимфокины, интерлейкины или хемокины, которые дополнительно стимулируют врожденный иммунный ответ, такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, INF-альфа, IFN-бета, INF-гамма, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-бета или TNF-альфа, факторы роста, такие как hGH.

Предлагаемая в изобретении композиция может содержать любое дополнительное соединение, у которого известна способность оказывать иммуностимулирующее действие в результате его аффинности связывания (в качестве лиганда) с человеческими Толл-подобными рецепторами TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10 или в результате его аффинности связывания (в качестве лиганда) с мышиными Толл-подобными рецепторами TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 или TLR13.

Другими добавками, которые можно включать в состав предлагаемой в изобретении композиции, являются эмульгаторы, такие, например, как Твин; смачивающие вещества, такие, например, как лаурилсульфат натрия; красители; улучшающие вкус вещества; фармацевтические носители; наполнители для приготовления таблеток; стабилизаторы; антиоксиданты; консерванты.

Фармацевтическая композиция:

Следующим объектом настоящего изобретения является также фармацевтическая композиция, которая содержит содержащую РНК композицию, указанную в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель. Предпочтительно фармацевтическую композицию приготавливают для внутриопухолевого введения, предпочтительно путем инъекции в опухолевую ткань. Стерильные инъецируемые формы предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции могут представлять собой водную или масляную суспензию. Такие суспензии можно приготавливать с помощью методов, известных в данной области, с использованием пригодных диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов.

Фармацевтически приемлемый носитель, как правило, включает жидкую или нежидкую основу композиции, содержащую компоненты предлагаемой в изобретении композиции. Если композиция находится в жидкой форме, то носитель, как правило, может представлять собой свободную от пирогенов воду; изотонический соляной раствор или забуференные (водные) растворы, например, растворы, забуференные фосфатом, цитратом и т.д. Предназначенный для инъекции буфер может быть гипертоническим, изотоническим или гипотоническим относительно конкретной референс-среды, т.е. содержание в буфере солей может быть выше, идентичным или ниже их содержания в конкретной референс-среде, при этом предпочтительно можно применять такие концентрации вышеуказанных солей, которые не приводят к повреждению клеток в результате осмоса или других связанных с концентрацией воздействий. Референс-среды могут представлять собой, например, жидкости, применяемые в методах «in vivo», такие как кровь, лимфа, цитозольные жидкости или другие жидкости организма, или, например, жидкости, которые можно использовать в качестве референс-сред в методах «in vitro», такие как обычные буферы или жидкости. Указанные обычные буферы или жидкости известны специалисту в данной области. Наиболее предпочтительной жидкой основой является лактированный раствор Рингера.

Однако в предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции можно использовать также один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей или разбавителей или капсулирующих соединений, которые можно применять для введения пациенту, подлежащему лечению. Понятие «совместимые» в контексте настоящего описания означает, что указанные компоненты предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции можно смешивать с компонентами предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции таким образом, чтобы не происходило взаимодействие, которое могло бы существенно снижать фармацевтическую эффективность фармацевтической композиции в обычных условиях применения.

Введение:

Предлагаемую в изобретении композицию или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить с помощью общепринятой игольной инъекции или безыгольной струйной инъекции в опухолевую ткань. В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемую в изобретении композицию или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию вводят путем струйной инъекции. Понятие «струйная инъекция» относится к методу безыгольной инъекции, при котором жидкость, содержащую по меньшей мере одну предлагаемую в изобретении композицию и необязательно дополнительные приемлемые эксципиенты, принудительно пропускают через отверстие, создавая тем самым ультратонкую жидкую струю под высоким давлением, которая обладает способностью проникать через кожу млекопитающего. В принципе жидкая струя образует отверстие в коже, через которое жидкая струя проходит в ткань-мишень, а именно, опухолевую ткань. Согласно изобретению струйную инъекцию можно применять для внутриопухолевого введения предлагаемой в изобретении композиции.

Предлагаемую в изобретении композицию можно вводить с помощью общепринятой игольной инъекции или безыгольной струйной инъекция по соседству и/или в непосредственной близости от опухолевой ткани. В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию вводят путем струйной инъекции по соседству и/или в непосредственной близости от опухолевой ткани. Понятие «струйная инъекция» относится к методу безыгольной инъекции, при котором жидкость, содержащую по меньшей мере одну предлагаемую в изобретении композицию и необязательно дополнительные приемлемые эксципиенты, принудительно пропускают через отверстие, создавая тем самым ультратонкую жидкую струю под высоким давлением, которая обладает способностью проникать через кожу млекопитающего. В принципе жидкая струя образует отверстие в коже, через которое жидкая струя проходит в ткань-мишень, а именно, опухолевую ткань. Согласно изобретению струйную инъекцию можно применять для внутриопухолевого введения (по соседству и/или в непосредственной близости от опухолевой ткани), прежде всего для инъекции предлагаемой в изобретении композиции.

В других вариантах осуществления изобретения предлагаемую в изобретении композицию или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить орально, парентерально, с помощью спрея для ингаляции, местно, ректально, назально, трансбуккально, вагинально или с помощью имплантируемого резервуара. Понятие «парентеральный» в контексте настоящего описания включает подкожную, внутривенную, внутримышечную, внутрисуставную, интранодальную, интрасиновиальную, надчревную, внутриоболочечную, внутрипеченочную, в пораженный участок, внутричерепную, чрескожную, внутрикожную, внутрилегочную, внутрибрюшинную, внутрисердечную, внутриартериальную и подъязычную инъекцию или инфузию.

Кроме того, особенно предпочтительными путями введения являются внутрикожная и внутримышечная инъекция.

Кроме того, предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может содержать дополнительные компоненты, которые ускоряют введение и поглощение компонентов фармацевтической композиции. Указанные дополнительные компоненты могут представлять собой соответствующий носитель или наполнитель, дополнительные адъюванты, поддерживающие любой иммунный ответ, антибактериальные и/или противовирусные агенты.

Дополнительным компонентом предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции может быть иммунотерапевтический агент, который можно выбирать из иммуноглобулинов, предпочтительно IgG-типа, моноклональных или поликлональных антител, поликлональной сыворотки или сывороток и т.д. Предпочтительно указанный дополнительный иммунотерапевтический агент может находиться в виде пептида/белка или может кодироваться нуклеиновой кислотой, предпочтительно ДНК или РНК, наиболее предпочтительно мРНК.

Предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция, как правило, содержит в «безопасном и эффективном количестве» компоненты предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции, прежде всего молекулу(ы) РНК, указанную(ые) в настоящем описании. В контексте настоящего описания под «безопасным и эффективным количеством» подразумевается количество молекулы(л) РНК, указанной(ых) в настоящем описании, которое является достаточным для значимой индукции положительной модификации опухолевого или ракового заболевания. Однако в то же время «безопасное и эффективное количество» является достаточно небольшим, чтобы избегать серьезных побочных действий и обеспечивать разумное соотношение между преимуществом и риском. Определение этих пределов, как правило, находится в компетенции осуществляющего лечение врача.

Предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно применять для лечения человека, а также для целей медицинской ветеринарии, предпочтительно в медицине для лечения человека в общем случае в виде фармацевтической композиции.

Вакцина:

Согласно другому особенно предпочтительному объекту изобретения предлагаемую в изобретении композицию или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно получать или применять в качестве вакцины. Как правило, указанная вакцина представляет собой вакцину, указанную выше при описании фармацевтических композиций. Кроме того, указанная вакцина, как правило, содержит по меньшей мере одну РНК, указанную в настоящем описании, или предлагаемую в изобретении композицию, которая содержит несколько РНК. Предпочтительно по меньшей мере одна РНК кодирует по меньшей мере один опухолевый антиген или по меньшей мере один активатор иммунитета, указанный выше. Предлагаемая в изобретении вакцина может содержать также фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и/или наполнитель, указанный в настоящем описании для предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции. В конкретном варианте предлагаемой в изобретении вакцины выбор фармацевтически приемлемого носителя определяет в принципе путь, которым вводят предлагаемую в изобретении вакцину. Предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить место в опухолевую ткань.

Предлагаемая в изобретении вакцина может дополнительно содержать одну или несколько вспомогательных субстанций, предназначенных для повышения при необходимости иммуногенности или иммуностимулирующей способности. Особенно предпочтительными в качестве вспомогательных субстанций являются адъюванты или добавки, указанные для фармацевтической композиции.

Набор или набор компонентов:

Следующим объектом изобретения является набор или набор компонентов, содержащий описанную выше композицию, содержащую РНК, или содержащий описанную выше фармацевтическую композицию или ее компоненты и необязательно технические инструкции с информацией о введении и дозировании компонентов.

Помимо компонентов предлагаемой в изобретении содержащей РНК композиции набор может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель, адъювант и по меньшей мере один дополнительный компонент, например, указанный в настоящем описании дополнительный фармацевтически активный компонент/соединение, а также средства для его введения и технические инструкции. Компоненты композиции и возможные дополнительные компоненты могут находиться в лиофилизированной форме. В предпочтительном варианте осуществления изобретения перед применением набора к лиофилизированным компонентам добавляют наполнитель в предварительно определенном количестве, которое прописано, например, в прилагаемых технических инструкциях.

Медицинские показания:

Настоящее изобретение относится также к некоторым вариантам введения и применения предлагаемой в изобретении содержащей РНК композиции или фармацевтической композиции, или вакцины, или набора, или набора компонентов, которые указаны в настоящем описании. Согласно основному объекту изобретения композицию или фармацевтическую композицию, или набор или набор компонентов можно применять в качестве лекарственного средства, а именно, для лечения опухолевых или раковых заболеваний. В этом контексте лечение предпочтительно осуществляют путем внутриопухолевого введения, прежде всего инъекции в опухолевую ткань. Другой объект настоящего изобретения относится ко второму медицинскому применению содержащей РНК композиции или фармацевтической композиции, или вакцины, или набора, или набора компонентов, которые указаны выше, в котором указанные рассматриваемые субстанции применяют для приготовления лекарственного средства, прежде всего для внутриопухолевого применения (введения) для лечения опухолевых или раковых заболеваний.

Предпочтительно указанные выше заболевания выбирают из опухолевых или раковых заболеваний, которые предпочтительно включают, например, острый лимфобластный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, адренокортикальную карциному, связанные со СПИДом виды рака, связанную со СПИДом лимфому, рак анального канала, рак аппендикса, астроцитому, базальноклеточную карциному, рак желчных протоков, рак мочевого пузыря, рак кости, остеосаркому/злокачественную фиброзную гистиоцитому, глиому ствола головного мозга, опухоль головного мозга, астроцитому/злокачественную глиому мозжечка, эпендимому, медуллобластому, супратенториально расположенные примитивные нейроэктодермальные опухоли, глиому зрительных путей и гипоталамуса, рак молочной железы, бронхиальные аденомы/карциноиды, лимфому Беркитта, карциноидную опухоль у детей, карциноидную опухоль желудочно-кишечного тракта, карциному неизвестного происхождения, первичную лимфому центральной нервной системы, астроцитому мозжечка у детей, астроцитому/злокачественную глиому мозжечка у детей, рак шейки матки, различные виды детского рака, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, хронические миелопролиферативные нарушения, рак ободочной кишки, кожную Т-клеточную лимфому, дермапластическую мелкокругоклеточную опухоль, рак эндометрия, эпендимому, рак пищевода, саркому Юинга из семейства опухолей Юинга, опухоль из экстракраниальных зародышевых клеток у детей, опухоль из экстрагонадальных зародышевых клеток, рак внепеченочных желчных протоков, внутриглазную меланому, ретинобластому, рак желчного пузыря, гастральный рак (рак желудка), карциноидную опухоль желудочно-кишечного тракта, стромальную опухоль желудочно-кишечного тракта (GIST), опухоль из экстракраниальных, экстрагонадальных или овариальных зародышевых клеток, гестационную трофобластическую опухоль, глиому ствола головного мозга, церебральную астроцитому у детей, глиому зрительного пути и гипоталамуса у детей, желудочный карциноид, волосатоклеточный лейкоз, рак головы и шеи, рак сердца, печеночно-клеточный (печени) рак, лимфому Ходжкина, рак гипофаринкса, глиому гипоталамуса и зрительного пути у детей, внутриглазную меланому, карциному из островковых клеток (эндокринная карцинома поджелудочных желез), саркому Капоши, рак почек (почечно-клеточный рак), рак гортани, лейкозы, острый лимфобластный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, рак губ и ротовой полости, липосаркому, рак печени, немелкоклеточный рак легких, мелкоклеточный рак легких, лимфомы, связанную со СПИДом лимфому, лимфому Беркитта, кожную Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина, неходжкинские лимфомы, первичную лимфому центральной нервной системы, макроглобулинемию Вальденстрема, злокачественную фиброзную гистиоцитому кости/остеосаркому, медуллобластому у детей, меланому, внутриглазную (глазную) меланому, карциному из клеток Меркеля, злокачественную мезотелиому взрослых, мезотелиому у детей, метастатический плоскоклеточный рак шеи с бессимптомным началом, рак ротовой полости, синдром детской множественной эндокринной неоплазии, множественную миелому/неоплазму из плазматических клеток, грибовидный микоз, миелодиспластические синдромы, миелодиспластические/миелопролиферативные заболевания, хронический миелогенный лейкоз, острый миелоидный лейкоз взрослых, острый миелоидный лейкоз у детей, множественную миелому (рак костного мозга), хронические миелопролиферативные нарушения, рак носовой полости и параназального синуса, носоглоточную карциному, нейробластому, оральный рак, ротоглоточный рак, остеосаркому/злокачественную фиброзную гистиоцитому кости, рак яичников, эпителиальный рак яичников (поверхностная стромально-эпителиальная опухоль), рак из овариальных зародышевых клеток, опухоль яичников с низким потенциальном злокачественности, рак поджелудочной железы, рак из островковых клеток поджелудочной железы, рак паранозального синуса и носовой полости, рак паращитовидной железы, рак пениса, рак глотки, феохромоцитому, пинеальную астроцитому, пинеальную герминому, пинеалобластому и супратенториально расположенные примитивные нейроэктодермальные опухоли у детей, аденому гипофиза, неоплазии из плазматических клеток/множественную миелому, плевролегочную бластому, первичную лимфому центральной нервной системы, рак предстательной железы, ректальный рак, почечно-клеточную карциному (рак почек), рак почечной лоханки и мочеточника, ретинобластому, рабдомиосаркому у детей, рак слюнных желез, саркому из семейства опухолей Юинга, саркому Капоши, саркому мягких тканей, саркому матки, синдром Сезари, рак кожи (не относящийся к меланоме), рак кожи (меланома), карцинома кожи из клеток Меркеля, рак тонкого кишечника, плоскоклеточную карциному, метастатический плоскоклеточный рак шеи с бессимптомным началом, супратенториально расположенную примитивную нейроэктодермальную опухоль у детей, тестикулярный рак, рак гортани, тимому у детей, тимому и карциному тимуса, рак щитовидной железы, рак щитовидной железы у детей, переходноклеточный рак почечной лоханки и мочеточника, гестационную трофобластическую опухоль, рак мочеиспускательного канала, рак эндометрия матки, саркому матки, вагинальный рак, глиому зрительного пути и гипоталамуса у детей, рак вульвы, макроглобулинемию Вальденстрема и опухоль Вильмса (рак почек) у детей.

Особенно предпочтительные примеры опухолей или рака, в которые можно осуществлять внутриопухолевое введение, представляют собой рак предстательной железы, рак легкого, рак молочной железы, рак головного мозга, рак головы и шеи, рак щитовидной железы, рак ободочной кишки, рак желудка, рак печени, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак кожи, рак мочевого пузыря, матки и шейки матки.

Согласно конкретному варианту осуществления изобретения лекарственное средство можно вводить пациенту в виде однократной дозы или в виде нескольких доз. В некоторых вариантах осуществления изобретения лекарственное средство можно вводить пациенту в виде однократной дозы с последующим введением еще второй дозы и необязательно даже третьей, четвертой (или еще большего количества) следующих доз и т.д.

Предпочтительно предлагаемая в изобретении композиция содержит по меньшей мере 40 мкг РНК на дозу. Более конкретно количество мРНК, содержащееся в однократной дозе, как правило, составляет по меньшей мере 200 мкг, предпочтительно от 200 до 1000 мкг, более предпочтительно от 300 до 850 мкг, еще более предпочтительно от 300 до 700 мкг.

Лечение дополнительными (фармацевтическими) соединениями:

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения индивидуум, получающий предлагаемую в изобретении композицию или фармацевтическую композицию, или вакцину, может представлять собой пациента, имеющего рак или опухоль, которого подвергают или подвергали стандартному противораковому лечению. Предпочтительно у пациента был достигнут частичный ответ или стабилизация заболевания после получения стандартного лечения.

Стандартное лечение рака включает химиотерапию, лучевую терапию, хеморадиацию и хирургию в зависимости от конкретного типа рака или опухоли, подлежащего/подлежащей лечению, причем, эти варианты лечения применяют индивидуально или в комбинации.

В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум, получающий предлагаемую в изобретении композицию, фармацевтическую композицию или вакцину, может представлять собой пациента, имеющего рак или опухоль, которого подвергали или подвергают химиотерапии (например, химиотерапии первой линии или второй линии), лучевой терапии, хеморадиации (комбинация химиотерапии и лучевой терапии), лечению ингибиторами киназ, антителами и/или модуляторами контрольных «точек» (например, ингибиторы CTLA4, ингибиторы пути PD1), или пациента, у которого был достигнут частичный ответ или стабилизация заболевания после получения одного или нескольких вариантов лечения, указанных выше.

В другом варианте осуществления изобретения индивидуум, получающий предлагаемую в изобретении композицию, фармацевтическую композицию или вакцину, может представлять собой пациента, имеющего рак или опухоль, которого подвергали или подвергают воздействию дополнительного фармацевтически активного компонента/соединения, указанного выше. Предпочтительно индивидуум представляет собой пациента, у которого был достигнут частичный ответ или стабилизация заболевания после получения одного или нескольких вариантов лечения, указанных выше.

Следующим объектом изобретения является способ лечения опухолевых или раковых заболеваний, в котором содержащую РНК композицию, указанную выше, или фармацевтическую композицию, указанную выше, или вакцину, указанную выше, или набор или набор компонентов, указанный выше, предпочтительно вводят внутрь опухоли, прежде всего с помощью инъекции в опухолевую ткань. Выше описаны дополнительные особенности способа лечения.

Предпочтительные внутриопухолевые обработки:

В этом контексте особенно предпочтительно объединять внутриопухолевое введение содержащей РНК композиции или фармацевтической композиции, или вакцины, указанной выше, с обработкой другими агентами/фармацевтически активными компонентами/соединениями. Особенно предпочтительными являются антитела (например, модуляторы контрольных «точек», такие, например, как антитело к CTLA4, антитело к OX40, антитело к PD1 или антитело к PD-L1) или лиганды (например, CD40L).

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения особенно предпочтительными являются следующие комбинации:

RNAdjuvant® (комплекс, содержащим полимерный носитель и карго-молекулу, предлагаемый в изобретении) (i.t.) + антитело к CTLA4 в качестве белка (i.p./i.v.),

RNAdjuvant® (i.t.) + антитело к CTLA4 в качестве белка (i.t.),

RNAdjuvant® (i.t.) + антитело к PD1 в качестве белка (i.p./i.v.),

RNAdjuvant® (i.t.) + антитело к PD1 в качестве белка (i.t.),

RNAdjuvant® (i.t.) + антитело к PD-L1 в качестве белка (i.p./i.v.),

RNAdjuvant® (i.t.) + антитело к PD-L1 в качестве белка (i.t.),

RNAdjuvant® (i.t.) + CD40L (i.t.) в качестве белка или кодируемый нуклеиновой кислотой, предпочтительно РНК, более предпочтительно мРНК,

RNAdjuvant® (i.t.) + мРНК, кодирующая IL-12, + мРНК, кодирующая растворимый рецептор PD-1, + антитело к CD73 (i.p./i.v.),

RNAdjuvant® (i.t.) + мРНК, кодирующая IL-12, + мРНК, кодирующая растворимый рецептор PD-1, + антитело к CD137 (i.p./i.v.),

RNAdjuvant® (i.t.)

(i.t. = внутриопухолевое, i.p. = внутрибрюшинное, i.v. = внутривенное)

В настоящем изобретении, если не указано иное, различные отличительные признаки альтернатив и вариантов осуществления изобретения можно объединять друг с другом, если это возможно. Кроме того, понятие «содержащий» не следует рассматривать, как узко ограниченное только понятием «состоящий из», если специально не указано иное. Однако в контексте настоящего изобретения понятие «состоящий из» является вариантом, который в контексте изобретения рассматривается как подпадающий под понятие «содержащий», в любом месте, где в настоящем описании используется понятие «содержащий».

Все публикации, патенты и заявки на патент, процитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылки, как если бы каждая индивидуальная публикация или заявка на патент была специально и индивидуально включена в качестве ссылки. Хотя вышеуказанное изобретение было достаточно подробно описано для целей более ясного понимания с помощью иллюстраций и примера, обычным специалистам в данной области должно быть очевидно в свете доктрины настоящего изобретения, что могут быть сделаны определенные изменения и модификации без отклонения от сущности или объема, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.

Представленные ниже примеры и чертежи даны только с целью иллюстрации и дополнительного описания настоящего изобретения. Указанные чертежи и примеры не следует рассматривать, как ограничивающие настоящее изобретение.

Краткое описание чертежей:

На чертежах показано:

на фиг.1 - соотношения выживаемости мышей, несущих опухоли E.G7-OVA, после внутриопухолевой обработки мРНК, кодирующей IL-12 (мРНК IL-12), или рекомбинантным белком IL-12 (белок rIL-12). Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 1. Представлены кривые выживаемости Каплана-Мейера;

на фиг.2 - данные, демонстрирующие, что внутриопухолевая обработка мышей комбинацией мРНК IL-12 (R2763, SEQ ID NO: 1) и комплекса, (R) содержащего полимерный носитель и карго-молекулу (R2391, RNAdjuvant®, полученный с помощью описанных способов) приводит к существенному уменьшению объема опухолей по сравнению с контрольными группами. Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 2. На фиг.2 представлен средний объем опухолей в день 21 после интродукции опухолей (последний день, когда все животные были живы). Статистический анализ осуществляли с помощью программы GraphPad Prism, версия 5.04, используя критерий Манна-Уитни;

на фиг.3 - соотношения выживаемости мышей, несущих опухоли СТ26, после внутриопухолевой обработки комбинацией мРНК IL-12 и комплекса, CR) содержащего полимерный носитель и карго-молекулу (RNAdjuvant®), описанного в примере 2 и в примечании к фиг.2. Представлены кривые выживаемости Каплана-Мейера. Статистический анализ осуществляли с помощью программы GraphPad Prism, версия 5.04, используя логранговый критерий;

на фиг.4 - соотношения выживаемости мышей, несущих опухоли СТ26, после внутриопухолевой обработки мРНК, кодирующей нуклеопротеин вируса гриппа. Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 3. Представлены кривые выживаемости Каплана-Мейера;

на фиг.5 - на панели (А) результаты анализа медианы роста опухолей у мышей, несущих опухоли СТ26, после внутриопухолевой обработки мРНК, кодирующей IL-12, RNAdjuvant и мРНК, кодирующей растворимый PD-1. Тестировали соответствующие комбинации указанных соединений, включая контрольные группы, как указано на чертеже. Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 4.

На панели (Б) - соотношения выживаемости мышей, несущих опухоли СТ26, после внутриопухолевой обработки мРНК, кодирующей IL-12, RNAdjuvant и мРНК, кодирующей растворимый PD-1. Тестировали соответствующие комбинации указанных соединений, включая контрольные группы, как указано на чертеже. Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 4. Представлены кривые выживаемости Каплана-Мейера;

на фиг.6 - соотношения выживаемости мышей, несущих опухоли СТ26, после внутриопухолевой обработки мРНК, кодирующей IL-12, RNAdjuvant и мРНК, кодирующей растворимый PD-1, и внутрибрюшинной обработки антителом к CD73. Соответствующие комбинации указанных соединений, включая контрольные группы, тестировали в соответствии с указанным на чертеже. Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 5. Представлены кривые выживаемости Каплана-Мейера;

на фиг.7 - соотношения выживаемости мышей, несущих опухоли СТ26, после внутриопухолевой обработки мРНК, кодирующей IL-12, RNAdjuvant и мРНК, кодирующей растворимый PD-1, и внутрибрюшинной обработки антителом к CD 173. Тестировали соответствующие комбинации указанных соединений, включая контрольные группы, как указано на чертеже. Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 6. Представлены кривые выживаемости Каплана-Мейера;

на фиг.8 - соотношения выживаемости мышей, несущих опухоли СТ26, после внутриопухолевой обработки RNAdjuvant и внутрибрюшинной обработки антителом к PD-1. Тестировали соответствующие комбинации указанных соединений, включая контрольные группы, как указано на чертеже. Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 7. Представлены кривые выживаемости Каплана-Мейера;

на фиг.9 - соотношения выживаемости мышей, несущих опухоли СТ26, после внутриопухолевой обработки мРНК, кодирующей IL-12, RNAdjuvant, мРНК, кодирующей CD40L, при сравнении с внутриопухолевой обработкой только мРНК, кодирующей IL-12. Тестировали соответствующие комбинации указанных соединений, включая контрольные группы, как указано на чертеже. Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 8. Представлены кривые выживаемости Каплана-Мейера;

на фиг.10 - последовательность мРНК R3571, которая кодирует мышиный CD40L (MmCD40L), представленная в SEQ ID NO: 10073.

Примеры:

Методы: Получение РНК

1. Получение конструкций ДНК и РНК

В представленных примерах последовательности ДНК, кодирующие указанные РНК (см. таблицу 17), получали и применяли в последующих реакциях транскрипции РНК in vitro.

Конструкции MmIL-12(GC), NP вируса гриппа (GC), solPD-1 и PpLuc(GC)) получали путем интродукции 5'-TOP-UTR из рибосомного белка 32L, модификации кодирующей последовательности дикого типа путем интродукции GC-оптимизированной последовательности для стабилизации, затем стабилизирующей последовательности, полученной из альбумина-3'-UTR, сегмента, состоящего из 64 аденозинов (поли(А)-последовательность), сегмента, состоящего из 30 цитозинов (поли(С)-последовательность) и гистоновой структуры типа «стебель-петля». Большинство последовательностей ДНК получали путем модификации кодирующих последовательностей ДНК дикого типа путем интродукции GC-оптимизированной последовательности для стабилизации, используя алгоритм in silico для увеличения содержания GC в соответствующей кодирующей последовательности по сравнению с кодирующей последовательностью дикого типа (в таблице 12 обозначено как «GC»).

В настоящем примере получали последовательность ДНК, которая кодирует некодирующую иммуностимуляторную РНК (isPHK) R2025, и затем применяли для реакций транскрипции РНК in vitro.

2. Транскрипции РНК in vitro

Соответствующие ДНК-плазмиды, получение которых описано выше в разделе 1, транскрибировали in vitro, используя Т7-полимеразу. Реакции транскрипции РНК in vitro конструкций, кодирующих IL-12, NP, PpLuc, CD40L и растворимый PD-1, осуществляли в присутствии аналога кэпа (m⁷GpppG). isPHK R2025 получали без аналога кэпа. Затем РНК очищали с помощью PureMessenger® (фирма Cure Vac, Тюбинген, Германия; WO 2008/077592A1).

3. Получение комплекса полимерный носитель:карго-молекула («RNAdiuvant»)

Применяли следующий катионный пептид в качестве катионного компонента полимерного носителя (Cys-Arg₁₂-Cys или CR₁₂C), имеющий SEQ ID NO: 7.

Для синтеза комплексов, содержащих полимерный носитель и карго-молекулу, молекулу РНК, имеющую РНК-последовательность R2025, указанную выше в разделе 1, смешивали с катионным пептидным компонентом CR₁₂C, указанным выше. Требуемое количество РНК смешивали с соответствующим катионным компонентом в указанных ниже массовых соотношениях, получая комплекс. Если согласно настоящему изобретению применяли полимеризующиеся катионные компоненты, то полимеризация катионных компонентов происходила одновременно с комплексообразованием нуклеиновой кислоты в качестве карго-молекулы. Затем объем полученного раствора доводили водой до конечного объема 50 мкл и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Дополнительные детали описаны в WO 2012/013326.

Массовое соотношение пептид:РНК составляло 1:3,7. Комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу, образовывался с помощью перекрестно сшитого дисульфидом катионного пептида CR₁₂C в качестве носителя и иммуностимуляторной нуклеиновой кислоты R2025 в качестве карго-молекулы. Этот комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу R2025/CR₁₂C (обозначен как R2391), применяли в качестве адъюванта в следующих примерах (обозначен как «RNAdjuvant»).

4. Получение препарата вакцины, кодирующей нуклеопротеин вируса гриппа (H1N1(PR8)-NP(GC))(R2651)

Получали комплекс мРНК (R2650) с протамином путем добавления протамина к мРНК в соотношении (1:2) (мае./мае.) (адъювантный компонент). После инкубации в течение 10 мин добавляли такое же количество свободной мРНК, применяемой в качестве обеспечивающей образование антигена мРНК. Этот препарат вакцины обозначали как R2651 (согласно WO 2010/037539). Вакцину вводили в лактированном растворе Рингера.

5. Получение РНК для введения

«Голую» (т.е. не включенную в препарат) мРНК PpLuc (R2244, R491)), мРНК IL-12 (R2763, R1328), мРНК растворимого PD-1 (R3971), мРНК CD40L (R3571) вводили в лактированном растворе Рингера (RiLa). Совместно приготовленные формы «голых» мРНК и комплекса, содержащего полимерный носитель и карго-молекулу «RNAdjuvant» (R2391), также вводили в лактированном растворе Рингера (RiLa) после смешения обоих компонентов непосредственно перед инъекцией.

Пример 1: Внутриопухолевое введение мРНК, кодирующей IL-12

5 самкам мышей линии C57BL/6 в подопытной группе инокулировали 10⁶ клеток E.G7-OVA за 5 дней до первой обработки. В каждой подопытной группе обрабатывали 5 развившихся (примерно 100 мм³) подкожно имплантированных опухолей EG.7-OVA. Для обработки опухолей использовали 16 мкг мРНК, кодирующей MmIL-12 (MmIL-12(GC))-sc-Flag) (R1328), или 0,5 мкг белка MmIL-12 в день (d) 0, 2, 4, 21, 23 и 25 (50 мкг, 1 мкг/мл). Применяемых в качестве контроля мышей обрабатывали нерелевантной мРНК (pPLuc) (R491).

День опыта 0 принимали за первый день эксперимента. Осуществляли частый мониторинг роста опухоли (каждые 2-3 дня). Мышей с объемом опухолей > 3 см³ умерщвляли.

Результаты примера 1

На фиг.1 продемонстрировано, что внутриопухолевое введение мРНК, кодирующей IL-12 (мРНК IL-12), приводило к существенному повышению выживаемости по сравнению с контрольной группой. Кроме того, повышенная выживаемость обнаружена по сравнению с внутриопухолевым введением рекомбинантного белка IL-12 (белок rIL-12).

Пример 2: Внутриопухолевая обработка мРНК, кодирующей IL-12, в (R) комбинации с иммуностимулирующей РНК (RNAdjuvant®)

Ниже в таблице 18 обобщены данные о конструкциях РНК, которые применяли в примере 2.

Мышам линии Balb/c (n=6 или 7, см. таблицу 14) инъецировали подкожно (s.c.) 1×10⁶ клеток линии СТ26 (клеточная линии карциномы ободочной кишки) на мышь (в объеме 100 мкл ЗФР) в правую боковую область в день 0 эксперимента. В день 9 после введения опухолей мышей сортировали в зависимости от размера опухолей, получая группы со средним объемом опухолей примерно 60 мм³. Внутриопухолевую (i.t.) терапию начинали в день 9 и продолжали, осуществляя дополнительные 4 инъекции каждые 3-4 дня. Мышам инъекцировали комбинацию мРНК, кодирующей IL-12 (25 мкг R2763)+RNAdjuvant® (25 мкг R2391) (группа А). Для контроля местного воспаления, связанного с введением РНК или процедурой инъекции, мышам инъецировали контрольную мРНК, кодирующую люциферазу (PpLuc, R2244, группа Б) или буфер (RiLa, группа В) соответственно. Необработанные мыши служили в качестве дополнительного контроля (группа Г).

Мониторинг роста опухолей осуществляли путем измерения размера опухолей в трех направлениях с помощью кронциркуля. Объем опухолей рассчитывали с помощью следующей формулы:

В дни 9, 11, 14, 17 и 21 эксперимента мышам инъецировали внутрь опухоли (i.t.) РНК, указанную ниже в таблице 19. Объем внутриопухолевой инъекции составлял 50 мкл.

Результаты примера 2

На фиг.2 продемонстрировано, что внутриопухолевое введение комбинации мРНК, кодирующей IL-12 (R2763) и RNAdjuvant® (R2391), приводило к статистически значимому снижению опухолей в день 21 после введения опухолей по сравнению со всеми контрольными группами.

На фиг.3 продемонстрировано, что внутриопухолевое введение комбинации мРНК, кодирующей IL-12 (R2763), и RNAdjuvant® (R2391) приводило к статистически значимому увеличению выживаемости по сравнению со всеми тремя контрольными группами (группа А относительно группы Б* р=0,0104, группа А относительно группы В** р=0,0035, группа А относительно группы Г * р==0,0263).

Пример 3: Вакцинация мышей мРНК, кодирующей нуклеопротеин вируса гриппа (NP), и последующее внутриопухолевое введение кодирующей NP мРНК

Целью настоящего эксперимента было решение вопроса о том, может ли уже существующий иммунный ответ использоваться против созданной опухоли. Для этого мышей сначала вакцинировали RNActive (препарат вакцины в виде комплекса с протамином), кодирующей нуклеопротеин вируса гриппа (NP) (R2651), которая индуцировала высокий уровень анти-NP CD8⁺ -Т-клеточных ответов, затем интродуцировали опухолевые клетки линии СТ26, после чего осуществляли внутриопухолевое введение «голой» РНК, кодирующей NP (R2650).

27 мышей линии Balb/c вакцинировали внутрикожно (i.d.) 40 мкг H1N1(PR8)-NP(GC) RNActive (R2651) (2×50 мкл) или лактированным буфером Рингера (RiLa) в качестве контроля в день 0, день 7 и день 16 эксперимента. В день 14 всем мышам вводили подкожно (s.c.) 1×10⁶ клеток СТ26 на мышь (в объеме 100 мкл ЗФР) в правую боковую область. В день 22 мышей разделяли на различные группы, указанные в таблице 20.

В день 23, через 7 дней после второй бустерной инъекции, начинали внутриопухолевое (i.t.) введение 50 мкг «голой» мРНК H1N1(PR8)-NP(GC) (R2650) (только группа В) и продолжали, осуществляя дополнительно четыре инъекции (в день 25, день 28, день 31 и день 35). Объем внутриопухолевой инъекции составлял 50 мкл. Детальная схема обработки представлена в таблице 21.

Мониторинг роста опухолей осуществляли путем измерения размера опухолей в трех направлениях с помощью кронциркуля. Объем опухолей рассчитывали с помощью следующей формулы:

Результаты примера 3

На фиг.4 продемонстрировано, что уже существующий иммунитет (индуцированный на этой модели вакцинацией NP) повышал медианную продолжительности жизни (MST) мышей, которым вводили внутрь опухоли кодирующую NP мРНК, по сравнению с мышами, которых обрабатывали только буфером (MST-28 относительно MST-21 соответственно).

Пример 4: Внутриопухолевая обработка иммуностимулирующей РНК («RNAdjuvant») и мРНК, кодирующей растворимый PD-1, и мРНК, кодирующей IL-12

В таблице 22 обобщены данные о вариантах обработки, которые применяли в настоящем примере. RNAdjuvant и конструкции мРНК, кодирующие IL-12 и растворимый PD-1, вводили внутрь опухоли (i.t.). Анализировали уровни выживаемости и медиану роста опухолей у мышей, которым интродуцировали опухоль СТ26.

Интродукция опухоли и введение предлагаемой в изобретении композиции:

60 мышам линии Balb/c вводили подкожно 1×10⁶ клеток СТ26 на мышь (в объеме 100 мкл ЗФР) в правую боковую область в день 0 эксперимента. В день 8 мышей сортировали в зависимости от размера опухолей. В зависимости от размера опухолей первую вакцинацию осуществляли в день 8 или 9 (опухоли должны иметь размер примерно 40-50 мм³). Мышей вакцинировали различными комбинациями мРНК и RNAdjuvant в соответствии с изложенным выше в таблице. Осуществляли шесть вакцинаций. Объем внутриопухолевой инъекции составлял 50 мкл.

Мышей обрабатывали с использованием инъекций согласно схеме, представленной в таблице 22. Медиану роста опухолей определяли согласно методу, описанному в примере 3. Результаты эксперимента представлены на фиг.5, при этом на фиг.5А представлены данные о действии предлагаемой в изобретении композиции на рост опухолей, а на фиг.5Б представлены данные о действии предлагаемой в изобретении композиции на выживаемость.

Результаты:

Результаты, представленные на фиг.5А, продемонстрировали, что предлагаемая в изобретении композиция, содержащая мРНК, которая кодирует IL-12, и мРНК, которая кодирует растворимый PD-1, в комбинации с RNAdjuvant (группа «А» в таблице 22) сильно снижала медианный объем опухолей по сравнению с другими обработками (группы Б-Г в таблице 22). Кроме того, результаты, представленные на фиг.5Б, продемонстрировали, что предлагаемая в изобретении композиция, содержащая мРНК, которая кодирует IL-12, и мРНК, которая кодирует растворимый PD-1, в комбинации с RNAdjuvant (группа «А» в таблице 22) увеличивала выживаемость несущих опухоли мышей по сравнению с другими вариантами обработки (группы Б-Г в таблице 22).

Пример 5: Внутриопухолевая обработка мРНК, кодирующей IL-12, в комбинации с иммуностимулирующей РНК («RNAdjuvant») и мРНК, кодирующей растворимый PD-1, и антителом к CD73

В таблице 23 обобщены варианты обработки, которые применяли в настоящем примере. Помимо RNAdjuvant и конструкций мРНК, кодирующих IL-12 и растворимый PD-1 (которые вводили внутрь опухолей (i.t.)), совместно внутрибрюшинно (i.p.) вводили антитело к CD73 (фирма BioXCell). У мышей, обработанных опухолевыми клетками СТ26, анализировали уровни выживаемости.

Интродукция опухоли и введение предлагаемой в изобретении композиции:

Интродукцию опухолей осуществляли согласно ранее описанным экспериментам (см. пример 4).

Мышей обрабатывали путем инъекции согласно схеме, представленной в таблице 23.

Результаты эксперимента представлены на фиг.6.

Результаты:

На фиг.6 продемонстрировано, что внутриопухолевая обработка мРНК, кодирующей IL-12 (R2763), мРНК, кодирующей sol-PD-1 (R3971) и RN Adjuvant® (R2391), в комбинации с i.р.-введением антитела к CD73 (группа «А» в таблице 23) приводила к статистически значимому увеличению выживаемости по сравнению с релевантной контрольной группой, которую обрабатывали только антителом к CD73 (группа «В» в таблице 23), и к повышению уровней выживаемости о сравнению с обработкой IL-12 + RNAdjuvant + растворимый PD-1 и контрольным антителом (крысиный IgG2a, фирма BioXCell) (группа «Б» в таблице 23).

Пример 6: Внутриопухолевая обработка мРНК, кодирующей IL-12, в комбинации с иммуностимулирующей РНК («RNAdjuvant») и антителом к CD137

В таблице 24 обобщены варианты обработки, которые применяли в настоящем примере. Помимо RNAdjuvant и конструкций мРНК, кодирующих IL-12 и растворимый PD-1 (внутриопухолевое введение (i.t.)), совместно вводили внутрибрюшинно (i.p.) антитело к CD137 (фирма BioXCell). У мышей, обработанных опухолевыми клетками СТ26, анализировали уровни выживаемости.

Интродукция опухоли и введение предлагаемой в изобретении композиции:

Интродукцию опухолей осуществляли согласно ранее описанным экспериментам (см. пример 4).

Мышей обрабатывали путем инъекции согласно схеме, представленной в таблице 24.

Результаты эксперимента представлены на фиг.7.

Результаты:

На фиг.7 продемонстрировано, что внутриопухолевая обработка мРНК, кодирующей IL-12 (R2763), sol-PD-1 (R3971), и RNAdjuvant® (R2391), в комбинации с i.р.-введением антитела к CD137 (группа «А» в таблице 24) приводила к существенному увеличению выживаемости по сравнению с релевантной контрольной группой, которую обрабатывали только антителом к CD-137 (группа «В» в таблице 24), к повышению уровней выживаемости по сравнению с обработкой IL-12 + RNAdjuvant + растворимый PD-1 и контрольным антителом (крысиный IgG2a, фирма BioXCell) (группа «Б» в таблице 24).

Пример 7: Обработка иммуностимулирующей РНК («RN Adjuvant») в комбинации с антителом к PD-1, являющимся ингибитором контрольных «точек»

В таблице 25 обобщены варианты обработки, которые применяли в настоящем примере. Помимо RNAdjuvant (i.t.-введение), вводили i.p.в качестве ингибитора контрольных «точек» антитело к PD-1 (фирма BioXCell). У мышей, обработанных опухолевыми клетками СТ26, анализировали уровни выживаемости.

Интродукция опухоли и введение предлагаемой в изобретении композиции:

Интродукцию опухолей осуществляли согласно ранее описанным экспериментам (см. пример 4).

Мышей обрабатывали путем инъекции согласно схеме, представленной в таблице 25.

Результаты эксперимента представлены на фиг.8.

Результаты:

На фиг.8 продемонстрировано, что внутриопухолевая (i.t.) обработка RNAdjuvant® (R2391) в комбинации с i.p. обработкой антителом к PD-1 (группа «В» в таблице 25) приводила к существенному увеличению выживаемости по сравнению с релевантной контрольной группой, которую обрабатывали только ингибитором контрольных «точек», т.е. антителом к PD-1 (группа «Г» в таблице 25), и к повышению уровней выживаемости по сравнению с обработкой RNAdjuvant и контрольным антителом (антитело к IgG хомяка, фирма BioXCell) (группа «Б» в таблице 25).

Пример 8: Внутриопухолевая обработка иммуностимулирующей РНК («RNAdiuvant») и мРНК, кодирующей лиганд CD40 (CD40L), и мРНК, кодирующей IL-12

В таблице 26 обобщены варианты обработки, которые применяли в настоящем примере. RNAdjuvant и конструкции мРНК, кодирующие IL-12 и мышиный CD40L, вводили внутрь опухолей (i.t.-введение). У мышей, обработанных опухолевыми клетками СТ26, анализировали уровни выживаемости.

Интродукция опухоли и введение предлагаемой в изобретении композиции:

Интродукцию опухолей осуществляли согласно ранее описанным экспериментам (см. пример 4).

Мышей обрабатывали путем инъекции согласно схеме, представленной в таблице 26.

Результаты эксперимента представлены на фиг.9.

Результаты:

Результаты, представленные в таблице 9, продемонстрировали, что предлагаемая в изобретении композиция, содержащая мРНК, которая кодирует IL-12, и мРНК, которая кодирует CD40L, в комбинации с RN Adjuvant (группа «А» в таблице 26), сильно повышала медиану выживаемости у несущих опухоли мышей по сравнению с другими вариантами обработки (группы Б-В в таблице 26).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CureVac AG

<120> mRNA containing composition for treatment of tumor diseases

<130> CU01P175WO-1

<160> 10071

<210> 1

<211> 1815

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R1328 coding for the mouse IL-12 protein

<400> 1

gggagaaagc uuaccaugug cccccagaag cugaccauca gcugguucgc caucgugcuc 60

cuggucuccc cgcugauggc caugugggag cucgagaagg acguguacgu ggucgaggug 120

gacuggaccc ccgacgcgcc cggcgagacg gugaaccuga ccugcgacac ccccgaggag 180

gacgacauca ccuggacgag cgaccagcgg cacgggguca ucggcuccgg gaagacccug 240

accaucaccg ugaaggaguu ccucgacgcc ggccaguaca cgugccacaa gggcggcgag 300

acccugagcc acucccaccu gcuccugcac aagaaggaga acgggaucug gagcaccgag 360

auccugaaga acuucaagaa caagaccuuc cucaagugcg aggccccgaa cuacuccggg 420

cgcuucacgu gcagcuggcu ggugcagcgg aacauggacc ugaaguucaa caucaagucc 480

agcuccagcu cccccgacag ccgcgccguc accugcggca uggccucccu cagcgcggag 540

aaggugaccc uggaccagcg ggacuacgag aaguacuccg ugagcugcca ggaggacguc 600

accugcccca cggccgagga gacccugccc aucgagcucg cccuggaggc ccgccagcag 660

aacaaguacg agaacuacuc caccagcuuc uucauccggg acaucaucaa gccggacccc 720

cccaagaacc ugcagaugaa gccccucaag aacagccagg uggagguguc cugggaguac 780

ccggacagcu gguccacccc gcacagcuac uucucccuga aguucuucgu ccgcauccag 840

cggaagaagg agaagaugaa ggagacggag gaggggugca accagaaggg cgcguuccug 900

guggagaaga ccagcaccga ggugcagugc aagggcggga acgucugcgu gcaggcccag 960

gaccgguacu acaacuccag cugcuccaag ugggccugcg ugcccugccg gguccgcagc 1020

cgcgugaucc ccgucagcgg cccggcccgg ugccuguccc agagccgcaa ccugcucaag 1080

accacggacg acauggugaa gaccgcccgg gagaagcuga agcacuacuc cugcaccgcc 1140

gaggacaucg accacgagga caucacccgc gaccagacga gcacccugaa gaccugccuc 1200

ccccuggagc ugcacaagaa cgaguccugc cucgccaccc gggagacgag cuccaccacc 1260

cgcgggagcu gccugccgcc ccagaagacc ucccugauga ugacgcucug ccugggcagc 1320

aucuacgagg accugaagau guaccagacc gaguuccagg cgaucaacgc cgcccuccag 1380

aaccacaacc accagcagau cauccuggac aaggggaugc ugguggccau cgacgagcuc 1440

augcaguccc ugaaccacaa cggcgagacc cugcggcaga agccgcccgu cggggaggcg 1500

gaccccuacc gcgugaagau gaagcucugc auccugcugc acgccuucag cacccgggug 1560

gucacgauca accgcgugau gggcuaccuc uccagcgccg acuacaagga cgacgacgac 1620

aagugaggac uaguuauaag acugacuagc ccgaugggcc ucccaacggg cccuccuccc 1680

cuccuugcac cgagauuaau aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaauauucc cccccccccc cccccccccc ccccccccuc 1800

uagacaauug gaauu 1815

<210> 2

<211> 1857

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R491 coding for the Photinus pyralis luciferase protein

<400> 2

gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60

cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120

ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180

guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240

ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300

ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360

gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420

gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480

gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540

cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600

caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660

cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720

cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780

ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840

gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900

cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960

gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020

cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080

ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140

ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200

gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260

cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320

cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380

gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440

cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500

gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560

cgugguguuc guggacgagg ucccgaaggg ccugaccggg aagcucgacg cccggaagau 1620

ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguuaua 1680

agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740

auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800

aaaaaauauu cccccccccc cccccccccc cccccccccc ucuagacaau uggaauu 1857

<210> 3

<211> 2023

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R2763 coding for the mouse IL-12 protein

<400> 3

ggggcgcugc cuacggaggu ggcagccauc uccuucucgg caucaagcuu accaugugcc 60

cccagaagcu gaccaucagc ugguucgcca ucgugcuccu ggucuccccg cugauggcca 120

ugugggagcu cgagaaggac guguacgugg ucgaggugga cuggaccccc gacgcgcccg 180

gcgagacggu gaaccugacc ugcgacaccc ccgaggagga cgacaucacc uggacgagcg 240

accagcggca cggggucauc ggcuccggga agacccugac caucaccgug aaggaguucc 300

ucgacgccgg ccaguacacg ugccacaagg gcggcgagac ccugagccac ucccaccugc 360

uccugcacaa gaaggagaac gggaucugga gcaccgagau ccugaagaac uucaagaaca 420

agaccuuccu caagugcgag gccccgaacu acuccgggcg cuucacgugc agcuggcugg 480

ugcagcggaa cauggaccug aaguucaaca ucaaguccag cuccagcucc cccgacagcc 540

gcgccgucac cugcggcaug gccucccuca gcgcggagaa ggugacccug gaccagcggg 600

acuacgagaa guacuccgug agcugccagg aggacgucac cugccccacg gccgaggaga 660

cccugcccau cgagcucgcc cuggaggccc gccagcagaa caaguacgag aacuacucca 720

ccagcuucuu cauccgggac aucaucaagc cggacccccc caagaaccug cagaugaagc 780

cccucaagaa cagccaggug gagguguccu gggaguaccc ggacagcugg uccaccccgc 840

acagcuacuu cucccugaag uucuucgucc gcauccagcg gaagaaggag aagaugaagg 900

agacggagga ggggugcaac cagaagggcg cguuccuggu ggagaagacc agcaccgagg 960

ugcagugcaa gggcgggaac gucugcgugc aggcccagga ccgguacuac aacuccagcu 1020

gcuccaagug ggccugcgug cccugccggg uccgcagcgg caguacuucg ggcaguggua 1080

agccugguag uggugagggu aguacuaagg gucgcgugau ccccgucagc ggcccggccc 1140

ggugccuguc ccagagccgc aaccugcuca agaccacgga cgacauggug aagaccgccc 1200

gggagaagcu gaagcacuac uccugcaccg ccgaggacau cgaccacgag gacaucaccc 1260

gcgaccagac gagcacccug aagaccugcc ucccccugga gcugcacaag aacgaguccu 1320

gccucgccac ccgggagacg agcuccacca cccgcgggag cugccugccg ccccagaaga 1380

ccucccugau gaugacgcuc ugccugggca gcaucuacga ggaccugaag auguaccaga 1440

ccgaguucca ggcgaucaac gccgcccucc agaaccacaa ccaccagcag aucauccugg 1500

acaaggggau gcugguggcc aucgacgagc ucaugcaguc ccugaaccac aacggcgaga 1560

cccugcggca gaagccgccc gucggggagg cggaccccua ccgcgugaag augaagcucu 1620

gcauccugcu gcacgccuuc agcacccggg uggucacgau caaccgcgug augggcuacc 1680

ucuccagcgc cugaggacua gugcaucaca uuuaaaagca ucucagccua ccaugagaau 1740

aagagaaaga aaaugaagau caauagcuua uucaucucuu uuucuuuuuc guugguguaa 1800

agccaacacc cugucuaaaa aacauaaauu ucuuuaauca uuuugccucu uuucucugug 1860

cuucaauuaa uaaaaaaugg aaagaaccua gaucuaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaau gcaucccccc cccccccccc 1980

cccccccccc cccccaaagg cucuuuucag agccaccaga auu 2023

<210> 4

<211> 2034

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R2244 coding for the Photinus pyralis luciferase protein

<400> 4

gggcgcugcc uacggaggug gcagccaucu ccuucucggc aucaagcuug aggauggagg 60

acgccaagaa caucaagaag ggcccggcgc ccuucuaccc gcuggaggac gggaccgccg 120

gcgagcagcu ccacaaggcc augaagcggu acgcccuggu gccgggcacg aucgccuuca 180

ccgacgccca caucgagguc gacaucaccu acgcggagua cuucgagaug agcgugcgcc 240

uggccgaggc caugaagcgg uacggccuga acaccaacca ccggaucgug gugugcucgg 300

agaacagccu gcaguucuuc augccggugc ugggcgcccu cuucaucggc guggccgucg 360

ccccggcgaa cgacaucuac aacgagcggg agcugcugaa cagcaugggg aucagccagc 420

cgaccguggu guucgugagc aagaagggcc ugcagaagau ccugaacgug cagaagaagc 480

ugcccaucau ccagaagauc aucaucaugg acagcaagac cgacuaccag ggcuuccagu 540

cgauguacac guucgugacc agccaccucc cgccgggcuu caacgaguac gacuucgucc 600

cggagagcuu cgaccgggac aagaccaucg cccugaucau gaacagcagc ggcagcaccg 660

gccugccgaa ggggguggcc cugccgcacc ggaccgccug cgugcgcuuc ucgcacgccc 720

gggaccccau cuucggcaac cagaucaucc cggacaccgc cauccugagc guggugccgu 780

uccaccacgg cuucggcaug uucacgaccc ugggcuaccu caucugcggc uuccgggugg 840

uccugaugua ccgguucgag gaggagcugu uccugcggag ccugcaggac uacaagaucc 900

agagcgcgcu gcucgugccg acccuguuca gcuucuucgc caagagcacc cugaucgaca 960

aguacgaccu gucgaaccug cacgagaucg ccagcggggg cgccccgcug agcaaggagg 1020

ugggcgaggc cguggccaag cgguuccacc ucccgggcau ccgccagggc uacggccuga 1080

ccgagaccac gagcgcgauc cugaucaccc ccgaggggga cgacaagccg ggcgccgugg 1140

gcaagguggu cccguucuuc gaggccaagg ugguggaccu ggacaccggc aagacccugg 1200

gcgugaacca gcggggcgag cugugcgugc gggggccgau gaucaugagc ggcuacguga 1260

acaacccgga ggccaccaac gcccucaucg acaaggacgg cuggcugcac agcggcgaca 1320

ucgccuacug ggacgaggac gagcacuucu ucaucgucga ccggcugaag ucgcugauca 1380

aguacaaggg cuaccaggug gcgccggccg agcuggagag cauccugcuc cagcacccca 1440

acaucuucga cgccggcgug gccgggcugc cggacgacga cgccggcgag cugccggccg 1500

cggugguggu gcuggagcac ggcaagacca ugacggagaa ggagaucguc gacuacgugg 1560

ccagccaggu gaccaccgcc aagaagcugc ggggcggcgu gguguucgug gacgaggucc 1620

cgaagggccu gaccgggaag cucgacgccc ggaagauccg cgagauccug aucaaggcca 1680

agaagggcgg caagaucgcc guguaagacu agugcaucac auuuaaaagc aucucagccu 1740

accaugagaa uaagagaaag aaaaugaaga ucaauagcuu auucaucucu uuuucuuuuu 1800

cguuggugua aagccaacac ccugucuaaa aaacauaaau uucuuuaauc auuuugccuc 1860

uuuucucugu gcuucaauua auaaaaaaug gaaagaaccu agaucuaaaa aaaaaaaaaa 1920

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ugcauccccc 1980

cccccccccc cccccccccc ccccccaaag gcucuuuuca gagccaccag aauu 2034

<210> 5

<211> 547

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RNA sequence of the non-coding immunostimulatory RNA

<400> 5

gggagaaagc ucaagcuuau ccaaguaggc uggucaccug uacaacguag ccgguauuuu 60

uuuuuuuuuu uuuuuuuuga ccgucucaag guccaaguua gucugccuau aaaggugcgg 120

auccacagcu gaugaaagac uugugcggua cgguuaaucu ccccuuuuuu uuuuuuuuuu 180

uuuuuaguaa augcgucuac ugaauccagc gaugaugcug gcccagaucu ucgaccacaa 240

gugcauauag uagucaucga gggucgccuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uggcccaguu 300

cugagacuuc gcuagagacu acaguuacag cugcaguagu aaccacugcg gcuauugcag 360

gaaaucccgu ucagguuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuccgc ucacuaugau uaagaaccag 420

guggaguguc acugcucucg aggucucacg agagcgcucg auacaguccu uggaagaauc 480

uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uugugcgacg aucacagaga acuucuauuc augcaggucu 540

gcucuag 547

<210> 6

<211> 1879

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R2650/R2651 coding for the influenza nucleoprotein

<400> 6

ggggcgcugc cuacggaggu ggcagccauc uccuucucgg caucaagcuu accauggcca 60

gccagggcac caagcggucc uacgagcaga uggagaccga cggggagcgc cagaacgcca 120

cggagauccg ggcgagcgug ggcaagauga ucgggggcau cgggcgcuuc uacauccaga 180

ugugcaccga gcugaagcuc uccgacuacg agggccggcu gauccagaac agccugacca 240

ucgagcgcau gguccucucc gccuucgacg agcggcgcaa caaguaccug gaggagcacc 300

ccagcgccgg caaggacccg aagaagaccg ggggccccau cuaccggcgc gugaacggga 360

aguggaugcg ggagcugauc cucuacgaca aggaggagau ccgccggauc uggcgccagg 420

ccaacaacgg cgacgacgcc acggcggggc ugacccacau gaugaucugg cacuccaacc 480

ugaacgacgc caccuaccag cggacccgcg cccucgugcg gacgggcaug gacccccgca 540

ugugcagccu gaugcagggc uccacccugc cccggcgcag cggggccgcg ggcgccgccg 600

ucaagggggu gggcaccaug gugauggagc ucguccggau gaucaagcgc ggcaucaacg 660

accggaacuu cuggcggggc gagaacgggc gcaagacccg gaucgccuac gagcgcaugu 720

gcaacauccu gaaggggaag uuccagacgg ccgcgcagaa ggccaugaug gaccaggugc 780

gggagucccg caacccgggc aacgccgagu ucgaggaccu gaccuuccuc gcccggagcg 840

cccugauccu gcgcgggucc guggcgcaca agagcugccu ccccgccugc gucuacggcc 900

ccgccguggc cuccggcuac gacuucgagc gggaggggua cagccuggug ggcaucgacc 960

ccuuccgccu gcuccagaac ucccaggucu acagccugau ccggccgaac gagaaccccg 1020

cccacaaguc ccagcuggug uggauggcgu gccacagcgc cgccuucgag gaccuccgcg 1080

ugcugagcuu caucaagggg accaaggucc ugccccgggg caagcucucc acccgcgggg 1140

ugcagaucgc cagcaacgag aacauggaga cgauggaguc cagcacccug gagcugcggu 1200

cccgcuacug ggccauccgg acccgcagcg gcggcaacac caaccagcag cgggcguccg 1260

ccgggcagau cagcauccag cccacguucu ccgugcagcg caaccucccg uucgaccgga 1320

ccaccaucau ggccgccuuc aacggcaaca ccgaggggcg gacgagcgac augcgcaccg 1380

agaucauccg gaugauggag uccgcgcgcc ccgaggacgu cagcuuccag ggccggggcg 1440

uguucgagcu guccgacgag aaggccgcca gccccaucgu gcccuccuuc gacaugagca 1500

acgagggguc cuacuucuuc ggcgacaacg ccgaggagua cgacaacuga ccacuagugc 1560

aucacauuua aaagcaucuc agccuaccau gagaauaaga gaaagaaaau gaagaucaau 1620

agcuuauuca ucucuuuuuc uuuuucguug guguaaagcc aacacccugu cuaaaaaaca 1680

uaaauuucuu uaaucauuuu gccucuuuuc ucugugcuuc aauuaauaaa aaauggaaag 1740

aaccuagauc uaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800

aaaaaaaaaa aaaaaugcau cccccccccc cccccccccc cccccccccc caaaggcucu 1860

uuucagagcc accagaauu 1879

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 7

Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys

1 5 10

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Stem-loop nucleotide sequence

<400> 8

caaaggcucu uuucagagcc acca 24

<210> 9

<211> 24

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Stem-loop nucleotide sequence

<400> 9

caaaggcucu uuucagagcc acca 24

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 10

Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys

1 5

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 11

Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys

1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 12

Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys

1 5 10

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 13

Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys

1 5 10

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 14

Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys

1 5 10

<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 15

Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys

1 5 10

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 16

Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys

1 5 10 15

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 17

Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys

1 5 10 15

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 18

Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10 15

Cys

<210> 19

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 19

Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10 15

Arg Cys

<210> 20

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 20

Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Cys

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 21

Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Arg Cys

20

<210> 22

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 22

Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Arg Cys

20

<210> 23

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 23

Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg Arg Arg Cys

20

<210> 24

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 24

Trp Tyr

1

<210> 25

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 25

Tyr Trp

1

<210> 26

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 26

Trp Trp

1

<210> 27

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 27

Tyr Tyr

1

<210> 28

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 28

Trp Tyr Trp

1

<210> 29

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 29

Tyr Trp Tyr

1

<210> 30

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 30

Trp Trp Trp

1

<210> 31

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 31

Tyr Tyr Tyr

1

<210> 32

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 32

Trp Tyr Trp Tyr

1

<210> 33

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 33

Tyr Trp Tyr Trp

1

<210> 34

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 34

Trp Trp Trp Trp

1

<210> 35

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 35

Phe Tyr

1

<210> 36

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 36

Tyr Phe

1

<210> 37

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 37

Phe Phe

1

<210> 38

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 38

Phe Tyr Phe

1

<210> 39

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 39

Tyr Phe Tyr

1

<210> 40

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 40

Phe Phe Phe

1

<210> 41

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 41

Phe Tyr Phe Tyr

1

<210> 42

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 42

Tyr Phe Tyr Phe

1

<210> 43

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 43

Phe Phe Phe Phe

1

<210> 44

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 44

Phe Trp

1

<210> 45

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 45

Trp Phe

1

<210> 46

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 46

Phe Phe

1

<210> 47

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 47

Phe Trp Phe

1

<210> 48

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 48

Trp Phe Trp

1

<210> 49

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 49

Phe Trp Phe Trp

1

<210> 50

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 50

Trp Phe Trp Phe

1

<210> 51

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 51

Tyr Tyr Tyr Tyr

1

<210> 52

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 52

Cys Tyr Cys

1

<210> 53

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 53

Cys Trp Cys

1

<210> 54

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 54

Cys Trp Tyr Cys

1

<210> 55

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 55

Cys Tyr Trp Cys

1

<210> 56

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 56

Cys Trp Trp Cys

1

<210> 57

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 57

Cys Tyr Tyr Cys

1

<210> 58

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 58

Cys Trp Tyr Trp Cys

1 5

<210> 59

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 59

Cys Tyr Trp Tyr Cys

1 5

<210> 60

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 60

Cys Trp Trp Trp Cys

1 5

<210> 61

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 61

Cys Tyr Tyr Tyr Cys

1 5

<210> 62

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 62

Cys Trp Tyr Trp Tyr Cys

1 5

<210> 63

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 63

Cys Tyr Trp Tyr Trp Cys

1 5

<210> 64

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 64

Cys Trp Trp Trp Trp Cys

1 5

<210> 65

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 65

Cys Tyr Tyr Tyr Tyr Cys

1 5

<210> 66

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 66

Cys Phe Cys

1

<210> 67

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 67

Cys Phe Tyr Cys

1

<210> 68

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 68

Cys Tyr Phe Cys

1

<210> 69

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 69

Cys Phe Phe Cys

1

<210> 70

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 70

Cys Tyr Tyr Cys

1

<210> 71

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 71

Cys Phe Tyr Phe Cys

1 5

<210> 72

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 72

Cys Tyr Phe Tyr Cys

1 5

<210> 73

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 73

Cys Phe Phe Phe Cys

1 5

<210> 74

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 74

Cys Tyr Tyr Tyr Cys

1 5

<210> 75

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 75

Cys Phe Tyr Phe Tyr Cys

1 5

<210> 76

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 76

Cys Tyr Phe Tyr Phe Cys

1 5

<210> 77

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 77

Cys Phe Phe Phe Phe Cys

1 5

<210> 78

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 78

Cys Phe Trp Cys

1

<210> 79

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 79

Cys Trp Phe Cys

1

<210> 80

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 80

Cys Phe Phe Cys

1

<210> 81

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 81

Cys Phe Trp Phe Cys

1 5

<210> 82

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 82

Cys Trp Phe Trp Cys

1 5

<210> 83

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 83

Cys Phe Trp Phe Trp Cys

1 5

<210> 84

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 84

Cys Trp Phe Trp Phe Cys

1 5

<210> 85

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 85

Ser Thr

1

<210> 86

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 86

Thr Ser

1

<210> 87

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 87

Ser Ser

1

<210> 88

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 88

Thr Thr

1

<210> 89

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 89

Ser Thr Ser

1

<210> 90

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 90

Thr Ser Thr

1

<210> 91

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 91

Ser Ser Ser

1

<210> 92

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 92

Thr Thr Thr

1

<210> 93

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 93

Ser Thr Ser Thr

1

<210> 94

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 94

Thr Ser Thr Ser

1

<210> 95

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 95

Ser Ser Ser Ser

1

<210> 96

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 96

Thr Thr Thr Thr

1

<210> 97

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 97

Gln Asn

1

<210> 98

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 98

Asn Gln

1

<210> 99

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 99

Gln Gln

1

<210> 100

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 100

Asn Asn

1

<210> 101

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 101

Gln Asn Gln

1

<210> 102

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 102

Asn Gln Asn

1

<210> 103

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 103

Gln Gln Gln

1

<210> 104

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 104

Asn Asn Asn

1

<210> 105

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 105

Gln Asn Gln Asn

1

<210> 106

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 106

Asn Gln Asn Gln

1

<210> 107

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 107

Gln Gln Gln Gln

1

<210> 108

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 108

Asn Asn Asn Asn

1

<210> 109

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 109

Ser Asn

1

<210> 110

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 110

Asn Ser

1

<210> 111

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 111

Ser Ser

1

<210> 112

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 112

Asn Asn

1

<210> 113

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 113

Ser Asn Ser

1

<210> 114

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 114

Asn Ser Asn

1

<210> 115

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 115

Ser Ser Ser

1

<210> 116

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 116

Asn Asn Asn

1

<210> 117

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 117

Ser Asn Ser Asn

1

<210> 118

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 118

Asn Ser Asn Ser

1

<210> 119

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 119

Ser Ser Ser Ser

1

<210> 120

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 120

Asn Asn Asn Asn

1

<210> 121

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 121

Cys Thr Cys

1

<210> 122

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 122

Cys Ser Cys

1

<210> 123

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 123

Cys Ser Thr Cys

1

<210> 124

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 124

Cys Thr Ser Cys

1

<210> 125

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 125

Cys Ser Ser Cys

1

<210> 126

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 126

Cys Thr Thr Cys

1

<210> 127

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 127

Cys Ser Thr Ser Cys

1 5

<210> 128

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 128

Cys Thr Ser Thr Cys

1 5

<210> 129

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 129

Cys Ser Ser Ser Cys

1 5

<210> 130

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 130

Cys Thr Thr Thr Cys

1 5

<210> 131

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 131

Cys Ser Thr Ser Thr Cys

1 5

<210> 132

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 132

Cys Thr Ser Thr Ser Cys

1 5

<210> 133

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 133

Cys Ser Ser Ser Ser Cys

1 5

<210> 134

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 134

Cys Thr Thr Thr Thr Cys

1 5

<210> 135

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 135

Cys Asn Cys

1

<210> 136

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 136

Cys Gln Cys

1

<210> 137

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 137

Cys Gln Asn Cys

1

<210> 138

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 138

Cys Asn Gln Cys

1

<210> 139

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 139

Cys Gln Gln Cys

1

<210> 140

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 140

Cys Asn Asn Cys

1

<210> 141

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 141

Cys Gln Asn Gln Cys

1 5

<210> 142

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 142

Cys Asn Gln Asn Cys

1 5

<210> 143

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 143

Cys Gln Gln Gln Cys

1 5

<210> 144

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 144

Cys Asn Asn Asn Cys

1 5

<210> 145

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 145

Cys Gln Asn Gln Asn Cys

1 5

<210> 146

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 146

Cys Asn Gln Asn Gln Cys

1 5

<210> 147

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 147

Cys Gln Gln Gln Gln Cys

1 5

<210> 148

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 148

Cys Asn Asn Asn Asn Cys

1 5

<210> 149

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 149

Cys Asn Cys

1

<210> 150

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 150

Cys Ser Cys

1

<210> 151

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 151

Cys Ser Asn Cys

1

<210> 152

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 152

Cys Asn Ser Cys

1

<210> 153

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 153

Cys Ser Ser Cys

1

<210> 154

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 154

Cys Asn Asn Cys

1

<210> 155

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 155

Cys Ser Asn Ser Cys

1 5

<210> 156

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 156

Cys Asn Ser Asn Cys

1 5

<210> 157

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 157

Cys Ser Ser Ser Cys

1 5

<210> 158

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 158

Cys Asn Asn Asn Cys

1 5

<210> 159

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 159

Cys Ser Asn Ser Asn Cys

1 5

<210> 160

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 160

Cys Asn Ser Asn Ser Cys

1 5

<210> 161

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 161

Cys Ser Ser Ser Ser Cys

1 5

<210> 162

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 162

Cys Asn Asn Asn Asn Cys

1 5

<210> 163

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 163

Leu Val

1

<210> 164

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 164

Val Leu

1

<210> 165

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 165

Leu Leu

1

<210> 166

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 166

Val Val

1

<210> 167

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 167

Leu Val Leu

1

<210> 168

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 168

Val Leu Val

1

<210> 169

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 169

Leu Leu Leu

1

<210> 170

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 170

Val Val Val

1

<210> 171

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 171

Leu Val Leu Val

1

<210> 172

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 172

Val Leu Val Leu

1

<210> 173

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 173

Leu Leu Leu Leu

1

<210> 174

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 174

Val Val Val Val

1

<210> 175

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 175

Ile Ala

1

<210> 176

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 176

Ala Ile

1

<210> 177

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 177

Ile Ile

1

<210> 178

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 178

Ala Ala

1

<210> 179

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 179

Ile Ala Ile

1

<210> 180

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 180

Ala Ile Ala

1

<210> 181

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 181

Ile Ile Ile

1

<210> 182

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 182

Ala Ala Ala

1

<210> 183

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 183

Ile Ala Ile Ala

1

<210> 184

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 184

Ala Ile Ala Ile

1

<210> 185

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 185

Ile Ile Ile Ile

1

<210> 186

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 186

Ala Ala Ala Ala

1

<210> 187

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 187

Met Ala

1

<210> 188

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 188

Ala Met

1

<210> 189

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 189

Met Met

1

<210> 190

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 190

Ala Ala

1

<210> 191

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 191

Met Ala Met

1

<210> 192

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 192

Ala Met Ala

1

<210> 193

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 193

Met Met Met

1

<210> 194

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 194

Ala Ala Ala

1

<210> 195

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 195

Met Ala Met Ala

1

<210> 196

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 196

Ala Met Ala Met

1

<210> 197

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 197

Met Met Met Met

1

<210> 198

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 198

Cys Val Cys

1

<210> 199

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 199

Cys Leu Cys

1

<210> 200

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 200

Cys Leu Val Cys

1

<210> 201

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 201

Cys Val Leu Cys

1

<210> 202

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 202

Cys Leu Leu Cys

1

<210> 203

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 203

Cys Val Val Cys

1

<210> 204

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 204

Cys Leu Val Leu Cys

1 5

<210> 205

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 205

Cys Val Leu Val Cys

1 5

<210> 206

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 206

Cys Leu Leu Leu Cys

1 5

<210> 207

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 207

Cys Val Val Val Cys

1 5

<210> 208

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 208

Cys Leu Val Leu Val Cys

1 5

<210> 209

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 209

Cys Val Leu Val Leu Cys

1 5

<210> 210

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 210

Cys Leu Leu Leu Leu Cys

1 5

<210> 211

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 211

Cys Val Val Val Val Cys

1 5

<210> 212

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 212

Cys Ala Cys

1

<210> 213

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 213

Cys Ile Cys

1

<210> 214

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 214

Cys Ile Ala Cys

1

<210> 215

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 215

Cys Ala Ile Cys

1

<210> 216

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 216

Cys Ile Ile Cys

1

<210> 217

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 217

Cys Ala Ala Cys

1

<210> 218

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 218

Cys Ile Ala Ile Cys

1 5

<210> 219

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 219

Cys Ala Ile Ala Cys

1 5

<210> 220

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 220

Cys Ile Ile Ile Cys

1 5

<210> 221

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 221

Cys Ala Ala Ala Cys

1 5

<210> 222

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 222

Cys Ile Ala Ile Ala Cys

1 5

<210> 223

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 223

Cys Ala Ile Ala Ile Cys

1 5

<210> 224

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 224

Cys Ile Ile Ile Ile Cys

1 5

<210> 225

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 225

Cys Ala Ala Ala Ala Cys

1 5

<210> 226

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 226

Cys Met Cys

1

<210> 227

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 227

Cys Met Ala Cys

1

<210> 228

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 228

Cys Ala Met Cys

1

<210> 229

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 229

Cys Met Met Cys

1

<210> 230

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 230

Cys Ala Ala Cys

1

<210> 231

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 231

Cys Met Ala Met Cys

1 5

<210> 232

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 232

Cys Ala Met Ala Cys

1 5

<210> 233

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 233

Cys Met Met Met Cys

1 5

<210> 234

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 234

Cys Ala Ala Ala Cys

1 5

<210> 235

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 235

Cys Met Ala Met Ala Cys

1 5

<210> 236

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 236

Cys Ala Met Ala Met Cys

1 5

<210> 237

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 237

Cys Met Met Met Met Cys

1 5

<210> 238

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 238

Cys Ala Ala Ala Ala Cys

1 5

<210> 239

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 239

Asp His

1

<210> 240

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 240

His Asp

1

<210> 241

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 241

Asp Asp

1

<210> 242

<211> 2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 242

His His

1

<210> 243

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 243

Asp His Asp

1

<210> 244

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 244

His Asp His

1

<210> 245

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 245

Asp Asp Asp

1

<210> 246

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 246

His His His

1

<210> 247

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 247

Asp His Asp His

1

<210> 248

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 248

His Asp His Asp

1

<210> 249

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 249

Asp Asp Asp Asp

1

<210> 250

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 250

His His His His

1

<210> 251

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 251

Cys His Cys

1

<210> 252

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 252

Cys Asp Cys

1

<210> 253

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 253

Cys Asp His Cys

1

<210> 254

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 254

Cys His Asp Cys

1

<210> 255

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 255

Cys Asp Asp Cys

1

<210> 256

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 256

Cys His His Cys

1

<210> 257

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 257

Cys Asp His Asp Cys

1 5

<210> 258

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 258

Cys His Asp His Cys

1 5

<210> 259

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 259

Cys Asp Asp Asp Cys

1 5

<210> 260

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 260

Cys His His His Cys

1 5

<210> 261

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 261

Cys Asp His Asp His Cys

1 5

<210> 262

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 262

Cys His Asp His Asp Cys

1 5

<210> 263

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 263

Cys Asp Asp Asp Asp Cys

1 5

<210> 264

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 264

Cys His His His His Cys

1 5

<210> 265

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 265

Lys Asp Glu Leu

1

<210> 266

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 266

Asp Asp Glu Leu

1

<210> 267

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 267

Asp Glu Glu Leu

1

<210> 268

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 268

Gln Glu Asp Leu

1

<210> 269

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 269

Arg Asp Glu Leu

1

<210> 270

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 270

Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn

1 5

<210> 271

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 271

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 272

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 272

Pro Gln Lys Lys Ile Lys Ser

1 5

<210> 273

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 273

Gln Pro Lys Lys Pro

1 5

<210> 274

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 274

Arg Lys Lys Arg

1

<210> 275

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 275

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala His Gln

1 5 10

<210> 276

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 276

Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln Arg

1 5 10 15

<210> 277

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 277

Met Pro Leu Thr Arg Arg Arg Pro Ala Ala Ser Gln Ala Leu Ala Pro

1 5 10 15

Pro Thr Pro

<210> 278

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 278

Gly Ala Ala Leu Thr Ile Leu Val

1 5

<210> 279

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 279

Gly Ala Ala Leu Thr Leu Leu Gly

1 5

<210> 280

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 280

Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro

1 5 10 15

<210> 281

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<222> 7

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 281

Met Leu Phe Asn Leu Arg Xaa Xaa Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg His

1 5 10 15

Gly His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Xaa

20 25 30

<210> 282

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 282

Gly Cys Val Cys Ser Ser Asn Pro

1 5

<210> 283

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 283

Gly Gln Thr Val Thr Thr Pro Leu

1 5

<210> 284

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 284

Gly Gln Glu Leu Ser Gln His Glu

1 5

<210> 285

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 285

Gly Asn Ser Pro Ser Tyr Asn Pro

1 5

<210> 286

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 286

Gly Val Ser Gly Ser Lys Gly Gln

1 5

<210> 287

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 287

Gly Gln Thr Ile Thr Thr Pro Leu

1 5

<210> 288

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 288

Gly Gln Thr Leu Thr Thr Pro Leu

1 5

<210> 289

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 289

Gly Gln Ile Phe Ser Arg Ser Ala

1 5

<210> 290

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 290

Gly Gln Ile His Gly Leu Ser Pro

1 5

<210> 291

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 291

Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser

1 5

<210> 292

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 292

Gly Cys Thr Leu Ser Ala Glu Glu

1 5

<210> 293

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 293

Gly Ala Gln Val Ser Ser Gln Lys

1 5

<210> 294

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 294

Gly Ala Gln Leu Ser Arg Asn Thr

1 5

<210> 295

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 295

Gly Asn Ala Ala Ala Ala Lys Lys

1 5

<210> 296

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 296

Gly Asn Glu Ala Ser Tyr Pro Leu

1 5

<210> 297

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cationic component of the polymeric carrier

<400> 297

Gly Ser Ser Lys Ser Lys Pro Lys

1 5

<210> 298

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 298

gguuuuuuuu uuuuuuuggg 20

<210> 299

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 299

ggggguuuuu uuuuuggggg 20

<210> 300

<211> 40

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 300

ggggguuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuggggg 40

<210> 301

<211> 39

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 301

gugugugugu guuuuuuuuu uuuuuuugug ugugugugu 39

<210> 302

<211> 39

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 302

gguugguugg uuuuuuuuuu uuuuuuuggu ugguugguu 39

<210> 303

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 303

gggggggggu uugggggggg 20

<210> 304

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 304

gggggggguu uugggggggg 20

<210> 305

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 305

ggggggguuu uuuggggggg 20

<210> 306

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 306

ggggggguuu uuuugggggg 20

<210> 307

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 307

gggggguuuu uuuugggggg 20

<210> 308

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 308

gggggguuuu uuuuuggggg 20

<210> 309

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 309

gggggguuuu uuuuuugggg 20

<210> 310

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 310

ggggguuuuu uuuuuugggg 20

<210> 311

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 311

ggggguuuuu uuuuuuuggg 20

<210> 312

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 312

gggguuuuuu uuuuuuuggg 20

<210> 313

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 313

gggguuuuuu uuuuuuuugg 20

<210> 314

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 314

gguuuuuuuu uuuuuuuugg 20

<210> 315

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 315

guuuuuuuuu uuuuuuuuug 20

<210> 316

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 316

gggggggggg uuuggggggg gg 22

<210> 317

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 317

gggggggggu uuuggggggg gg 22

<210> 318

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 318

gggggggguu uuuugggggg gg 22

<210> 319

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 319

gggggggguu uuuuuggggg gg 22

<210> 320

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 320

ggggggguuu uuuuuggggg gg 22

<210> 321

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 321

ggggggguuu uuuuuugggg gg 22

<210> 322

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 322

ggggggguuu uuuuuuuggg gg 22

<210> 323

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 323

gggggguuuu uuuuuuuggg gg 22

<210> 324

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 324

gggggguuuu uuuuuuuugg gg 22

<210> 325

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 325

ggggguuuuu uuuuuuuugg gg 22

<210> 326

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 326

ggggguuuuu uuuuuuuuug gg 22

<210> 327

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 327

ggguuuuuuu uuuuuuuuug gg 22

<210> 328

<211> 22

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 328

gguuuuuuuu uuuuuuuuuu gg 22

<210> 329

<211> 24

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 329

gggggggggg guuugggggg gggg 24

<210> 330

<211> 24

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 330

gggggggggg uuuugggggg gggg 24

<210> 331

<211> 24

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 331

gggggggggu uuuuuggggg gggg 24

<210> 332

<211> 24

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 332

gggggggggu uuuuuugggg gggg 24

<210> 333

<211> 24

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 333

gggggggguu uuuuuugggg gggg 24

<210> 334

<211> 24

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 334

gggggggguu uuuuuuuggg gggg 24

<210> 335

<211> 24

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 335

gggggggguu uuuuuuuugg gggg 24

<210> 336

<211> 24

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 336

ggggggguuu uuuuuuuugg gggg 24

<210> 337

<211> 24

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 337

ggggggguuu uuuuuuuuug gggg 24

<210> 338

<211> 24

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 338

gggggguuuu uuuuuuuuug gggg 24

<210> 339

<211> 24

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 339

gggggguuuu uuuuuuuuuu gggg 24

<210> 340

<211> 24

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 340

gggguuuuuu uuuuuuuuuu gggg 24

<210> 341

<211> 24

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 341

ggguuuuuuu uuuuuuuuuu uggg 24

<210> 342

<211> 32

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 342

guuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu ug 32

<210> 343

<211> 34

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 343

gguuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uugg 34

<210> 344

<211> 36

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 344

ggguuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuggg 36

<210> 345

<211> 37

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 345

gggguuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuggg 37

<210> 346

<211> 39

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 346

ggggguuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuugggg 39

<210> 347

<211> 41

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 347

gggggguuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuugggg g 41

<210> 348

<211> 43

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 348

ggggggguuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuggg ggg 43

<210> 349

<211> 45

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 349

gggggggguu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuugg ggggg 45

<210> 350

<211> 47

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 350

gggggggggu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuug ggggggg 47

<210> 351

<211> 7

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 351

gguuugg 7

<210> 352

<211> 8

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 352

gguuuugg 8

<210> 353

<211> 9

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 353

gguuuuugg 9

<210> 354

<211> 10

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 354

gguuuuuugg 10

<210> 355

<211> 11

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 355

gguuuuuuug g 11

<210> 356

<211> 12

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 356

gguuuuuuuu gg 12

<210> 357

<211> 13

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 357

gguuuuuuuu ugg 13

<210> 358

<211> 14

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 358

gguuuuuuuu uugg 14

<210> 359

<211> 15

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 359

gguuuuuuuu uuugg 15

<210> 360

<211> 16

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 360

gguuuuuuuu uuuugg 16

<210> 361

<211> 17

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 361

gguuuuuuuu uuuuugg 17

<210> 362

<211> 18

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 362

gguuuuuuuu uuuuuugg 18

<210> 363

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 363

gguuuuuuuu uuuuuuugg 19

<210> 364

<211> 9

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 364

ggguuuggg 9

<210> 365

<211> 10

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 365

ggguuuuggg 10

<210> 366

<211> 11

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 366

ggguuuuugg g 11

<210> 367

<211> 12

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 367

ggguuuuuug gg 12

<210> 368

<211> 13

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 368

ggguuuuuuu ggg 13

<210> 369

<211> 14

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 369

ggguuuuuuu uggg 14

<210> 370

<211> 15

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 370

ggguuuuuuu uuggg 15

<210> 371

<211> 16

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 371

ggguuuuuuu uuuggg 16

<210> 372

<211> 17

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 372

ggguuuuuuu uuuuggg 17

<210> 373

<211> 18

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 373

ggguuuuuuu uuuuuggg 18

<210> 374

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 374

ggguuuuuuu uuuuuuggg 19

<210> 375

<211> 57

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 375

ggguuuuuuu uuuuuuuugg guuuuuuuuu uuuuuugggu uuuuuuuuuu uuuuggg 57

<210> 376

<211> 42

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 376

ggguuuuuuu uuuuuuuugg gggguuuuuu uuuuuuuuug gg 42

<210> 377

<211> 51

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 377

ggguuugggu uuggguuugg guuuggguuu ggguuugggu uuggguuugg g 51

<210> 378

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 378

gguuuuuuuu uuuuuuuggg 20

<210> 379

<211> 57

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 379

cccuuuuuuu uuuuuuuucc cuuuuuuuuu uuuuuucccu uuuuuuuuuu uuuuccc 57

<210> 380

<211> 51

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 380

cccuuucccu uucccuuucc cuuucccuuu cccuuucccu uucccuuucc c 51

<210> 381

<211> 42

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 381

cccuuuuuuu uuuuuuuucc ccccuuuuuu uuuuuuuuuc cc 42

<210> 382

<211> 60

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 382

uagcgaagcu cuuggaccua gguuuuuuuu uuuuuuuggg ugcguuccua gaaguacacg 60

<210> 383

<211> 120

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 383

uagcgaagcu cuuggaccua gguuuuuuuu uuuuuuuggg ugcguuccua gaaguacacg 60

aucgcuucga gaaccuggau ccaaaaaaaa aaaaaaaccc acgcaaggau cuucaugugc 120

<210> 384

<211> 229

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 384

gggagaaagc ucaagcuugg agcaaugccc gcacauugag gaaaccgagu ugcauaucuc 60

agaguauugg cccccgugua gguuauucuu gacagacagu ggagcuuauu cacucccagg 120

auccgagucg cauacuacgg uacuggugac agaccuaggu cgucaguuga ccaguccgcc 180

acuagacgug aguccgucaa agcaguuaga uguuacacuc uauuagauc 229

<210> 385

<211> 547

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 385

gggagaaagc ucaagcuugg agcaaugccc gcacauugag gaaaccgagu ugcauaucuc 60

agaguauugg cccccgugua gguuauucuu gacagacagu ggagcuuauu cacucccagg 120

auccgagucg cauacuacgg uacuggugac agaccuaggu cgucaguuga ccaguccgcc 180

acuagacgug aguccgucaa agcaguuaga uguuacacuc uauuagaucu cggauuacag 240

cuggaaggag caggaguagu guucuugcuc uaaguaccga gugugcccaa uacccgauca 300

gcuuauuaac gaacggcucc uccucuuaga cugcagcgua agugcggaau cuggggauca 360

aauuacugac ugccuggauu acccucggac auauaaccuu guagcacgcu guugcuguau 420

aggugaccaa cgcccacucg aguagaccag cucucuuagu ccggacaaug auaggaggcg 480

cggucaaucu acuucuggcu aguuaagaau aggcugcacc gaccucuaua aguagcgugu 540

ccucuag 547

<210> 386

<211> 1083

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 386

gggagaaagc ucaagcuugg agcaaugccc gcacauugag gaaaccgagu ugcauaucuc 60

agaguauugg cccccgugua gguuauucuu gacagacagu ggagcuuauu cacucccagg 120

auccgagucg cauacuacgg uacuggugac agaccuaggu cgucaguuga ccaguccgcc 180

acuagacgug aguccgucaa agcaguuaga uguuacacuc uauuagaucu cggauuacag 240

cuggaaggag caggaguagu guucuugcuc uaaguaccga gugugcccaa uacccgauca 300

gcuuauuaac gaacggcucc uccucuuaga cugcagcgua agugcggaau cuggggauca 360

aauuacugac ugccuggauu acccucggac auauaaccuu guagcacgcu guugcuguau 420

aggugaccaa cgcccacucg aguagaccag cucucuuagu ccggacaaug auaggaggcg 480

cggucaaucu acuucuggcu aguuaagaau aggcugcacc gaccucuaua aguagcgugu 540

ccucuagagc uacgcagguu cgcaauaaaa gcguugauua gugugcauag aacagaccuc 600

uuauucggug aaacgccaga augcuaaauu ccaauaacuc uucccaaaac gcguacggcc 660

gaagacgcgc gcuuaucuug uguacguucu cgcacaugga agaaucagcg ggcauggugg 720

uagggcaaua ggggagcugg guagcagcga aaaagggccc cugcgcacgu agcuucgcug 780

uucgucugaa acaacccggc auccguugua gcgaucccgu uaucaguguu auucuugugc 840

gcacuaagau ucauggugua gucgacaaua acagcgucuu ggcagauucu ggucacgugc 900

ccuaugcccg ggcuugugcc ucucaggugc acagcgauac uuaaagccuu caagguacuc 960

gacgugggua ccgauucgug acacuuccua agauuauucc acuguguuag ccccgcaccg 1020

ccgaccuaaa cugguccaau guauacgcau ucgcugagcg gaucgauaau aaaagcuuga 1080

auu 1083

<210> 387

<211> 229

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 387

gggagaaagc ucaagcuuau ccaaguaggc uggucaccug uacaacguag ccgguauuuu 60

uuuuuuuuuu uuuuuuuuga ccgucucaag guccaaguua gucugccuau aaaggugcgg 120

auccacagcu gaugaaagac uugugcggua cgguuaaucu ccccuuuuuu uuuuuuuuuu 180

uuuuuaguaa augcgucuac ugaauccagc gaugaugcug gcccagauc 229

<210> 388

<211> 546

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 388

gggagaaagc ucaagcuuau ccaaguaggc uggucaccug uacaacguag ccgguauuuu 60

uuuuuuuuuu uuuuuuuuga ccgucucaag guccaaguua gucugccuau aaaggugcgg 120

auccacagcu gaugaaagac uugugcggua cgguuaaucu ccccuuuuuu uuuuuuuuuu 180

uuuuuaguaa augcgucuac ugaauccagc gaugaugcug gcccagaucu ucgaccacaa 240

gugcauauag uagucaucga gggucgccuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uggcccaguu 300

cugagacuuc gcuagagacu acaguuacag cugcaguagu aaccacugcg gcuauugcag 360

gaaaucccgu ucagguuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuccgc ucacuaugau uaagaaccag 420

guggaguguc acugcucucg aggucucacg agagcgcucg auacaguccu uggaagaauc 480

uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uugugcgacg aucacagaga acuucuauuc augcaggucu 540

gcucua 546

<210> 389

<211> 856

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R3971 coding for the mouse Pdcd1(1-157,C83S) protein

<400> 389

ggggcgcugc cuacggaggu ggcagccauc uccuucucgg caucaagcuu accauguggg 60

ugcgccaggu ccccuggagc uucaccuggg ccgugcugca gcucuccugg cagagcggcu 120

ggcugcugga ggugccgaac gggcccuggc ggucccucac cuucuacccc gccuggcuga 180

cggucagcga gggcgcgaac gccaccuuca ccugcucccu gagcaacugg uccgaggacc 240

ucaugcugaa cuggaaccgc cugagccccu ccaaccagac cgagaagcag gccgccuuca 300

gcaacgggcu cucccagccg gugcaggacg cccgguucca gaucauccag cugcccaacc 360

gccacgacuu ccacaugaac auccuggaca cgcggcgcaa cgacagcggc aucuaccucu 420

gcggggcgau cucccugcac cccaaggcca agaucgagga gagccccggc gccgagcugg 480

uggucaccga gcggauccuc gagaccucca cccgcuaccc gagcugagga cuagugcauc 540

acauuuaaaa gcaucucagc cuaccaugag aauaagagaa agaaaaugaa gaucaauagc 600

uuauucaucu cuuuuucuuu uucguuggug uaaagccaac acccugucua aaaaacauaa 660

auuucuuuaa ucauuuugcc ucuuuucucu gugcuucaau uaauaaaaaa uggaaagaac 720

cuagaucuaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780

aaaaaaaaaa aaugcauccc cccccccccc cccccccccc ccccccccaa aggcucuuuu 840

cagagccacc agaauu 856

<210> 390

<211> 862

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AXIN1__Homo sapiens__O15169

<400> 390

Met Asn Ile Gln Glu Gln Gly Phe Pro Leu Asp Leu Gly Ala Ser Phe

1 5 10 15

Thr Glu Asp Ala Pro Arg Pro Pro Val Pro Gly Glu Glu Gly Glu Leu

20 25 30

Val Ser Thr Asp Pro Arg Pro Ala Ser Tyr Ser Phe Cys Ser Gly Lys

35 40 45

Gly Val Gly Ile Lys Gly Glu Thr Ser Thr Ala Thr Pro Arg Arg Ser

50 55 60

Asp Leu Asp Leu Gly Tyr Glu Pro Glu Gly Ser Ala Ser Pro Thr Pro

65 70 75 80

Pro Tyr Leu Lys Trp Ala Glu Ser Leu His Ser Leu Leu Asp Asp Gln

85 90 95

Asp Gly Ile Ser Leu Phe Arg Thr Phe Leu Lys Gln Glu Gly Cys Ala

100 105 110

Asp Leu Leu Asp Phe Trp Phe Ala Cys Thr Gly Phe Arg Lys Leu Glu

115 120 125

Pro Cys Asp Ser Asn Glu Glu Lys Arg Leu Lys Leu Ala Arg Ala Ile

130 135 140

Tyr Arg Lys Tyr Ile Leu Asp Asn Asn Gly Ile Val Ser Arg Gln Thr

145 150 155 160

Lys Pro Ala Thr Lys Ser Phe Ile Lys Gly Cys Ile Met Lys Gln Leu

165 170 175

Ile Asp Pro Ala Met Phe Asp Gln Ala Gln Thr Glu Ile Gln Ala Thr

180 185 190

Met Glu Glu Asn Thr Tyr Pro Ser Phe Leu Lys Ser Asp Ile Tyr Leu

195 200 205

Glu Tyr Thr Arg Thr Gly Ser Glu Ser Pro Lys Val Cys Ser Asp Gln

210 215 220

Ser Ser Gly Ser Gly Thr Gly Lys Gly Ile Ser Gly Tyr Leu Pro Thr

225 230 235 240

Leu Asn Glu Asp Glu Glu Trp Lys Cys Asp Gln Asp Met Asp Glu Asp

245 250 255

Asp Gly Arg Asp Ala Ala Pro Pro Gly Arg Leu Pro Gln Lys Leu Leu

260 265 270

Leu Glu Thr Ala Ala Pro Arg Val Ser Ser Ser Arg Arg Tyr Ser Glu

275 280 285

Gly Arg Glu Phe Arg Tyr Gly Ser Trp Arg Glu Pro Val Asn Pro Tyr

290 295 300

Tyr Val Asn Ala Gly Tyr Ala Leu Ala Pro Ala Thr Ser Ala Asn Asp

305 310 315 320

Ser Glu Gln Gln Ser Leu Ser Ser Asp Ala Asp Thr Leu Ser Leu Thr

325 330 335

Asp Ser Ser Val Asp Gly Ile Pro Pro Tyr Arg Ile Arg Lys Gln His

340 345 350

Arg Arg Glu Met Gln Glu Ser Val Gln Val Asn Gly Arg Val Pro Leu

355 360 365

Pro His Ile Pro Arg Thr Tyr Arg Val Pro Lys Glu Val Arg Val Glu

370 375 380

Pro Gln Lys Phe Ala Glu Glu Leu Ile His Arg Leu Glu Ala Val Gln

385 390 395 400

Arg Thr Arg Glu Ala Glu Glu Lys Leu Glu Glu Arg Leu Lys Arg Val

405 410 415

Arg Met Glu Glu Glu Gly Glu Asp Gly Asp Pro Ser Ser Gly Pro Pro

420 425 430

Gly Pro Cys His Lys Leu Pro Pro Ala Pro Ala Trp His His Phe Pro

435 440 445

Pro Arg Cys Val Asp Met Gly Cys Ala Gly Leu Arg Asp Ala His Glu

450 455 460

Glu Asn Pro Glu Ser Ile Leu Asp Glu His Val Gln Arg Val Leu Arg

465 470 475 480

Thr Pro Gly Arg Gln Ser Pro Gly Pro Gly His Arg Ser Pro Asp Ser

485 490 495

Gly His Val Ala Lys Met Pro Val Ala Leu Gly Gly Ala Ala Ser Gly

500 505 510

His Gly Lys His Val Pro Lys Ser Gly Ala Lys Leu Asp Ala Ala Gly

515 520 525

Leu His His His Arg His Val His His His Val His His Ser Thr Ala

530 535 540

Arg Pro Lys Glu Gln Val Glu Ala Glu Ala Thr Arg Arg Ala Gln Ser

545 550 555 560

Ser Phe Ala Trp Gly Leu Glu Pro His Ser His Gly Ala Arg Ser Arg

565 570 575

Gly Tyr Ser Glu Ser Val Gly Ala Ala Pro Asn Ala Ser Asp Gly Leu

580 585 590

Ala His Ser Gly Lys Val Gly Val Ala Cys Lys Arg Asn Ala Lys Lys

595 600 605

Ala Glu Ser Gly Lys Ser Ala Ser Thr Glu Val Pro Gly Ala Ser Glu

610 615 620

Asp Ala Glu Lys Asn Gln Lys Ile Met Gln Trp Ile Ile Glu Gly Glu

625 630 635 640

Lys Glu Ile Ser Arg His Arg Arg Thr Gly His Gly Ser Ser Gly Thr

645 650 655

Arg Lys Pro Gln Pro His Glu Asn Ser Arg Pro Leu Ser Leu Glu His

660 665 670

Pro Trp Ala Gly Pro Gln Leu Arg Thr Ser Val Gln Pro Ser His Leu

675 680 685

Phe Ile Gln Asp Pro Thr Met Pro Pro His Pro Ala Pro Asn Pro Leu

690 695 700

Thr Gln Leu Glu Glu Ala Arg Arg Arg Leu Glu Glu Glu Glu Lys Arg

705 710 715 720

Ala Ser Arg Ala Pro Ser Lys Gln Arg Tyr Val Gln Glu Val Met Arg

725 730 735

Arg Gly Arg Ala Cys Val Arg Pro Ala Cys Ala Pro Val Leu His Val

740 745 750

Val Pro Ala Val Ser Asp Met Glu Leu Ser Glu Thr Glu Thr Arg Ser

755 760 765

Gln Arg Lys Val Gly Gly Gly Ser Ala Gln Pro Cys Asp Ser Ile Val

770 775 780

Val Ala Tyr Tyr Phe Cys Gly Glu Pro Ile Pro Tyr Arg Thr Leu Val

785 790 795 800

Arg Gly Arg Ala Val Thr Leu Gly Gln Phe Lys Glu Leu Leu Thr Lys

805 810 815

Lys Gly Ser Tyr Arg Tyr Tyr Phe Lys Lys Val Ser Asp Glu Phe Asp

820 825 830

Cys Gly Val Val Phe Glu Glu Val Arg Glu Asp Glu Ala Val Leu Pro

835 840 845

Val Phe Glu Glu Lys Ile Ile Gly Lys Val Glu Lys Val Asp

850 855 860

<210> 391

<211> 695

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DVL1__Homo sapiens__O14640

<400> 391

Met Ala Glu Thr Lys Ile Ile Tyr His Met Asp Glu Glu Glu Thr Pro

1 5 10 15

Tyr Leu Val Lys Leu Pro Val Ala Pro Glu Arg Val Thr Leu Ala Asp

20 25 30

Phe Lys Asn Val Leu Ser Asn Arg Pro Val His Ala Tyr Lys Phe Phe

35 40 45

Phe Lys Ser Met Asp Gln Asp Phe Gly Val Val Lys Glu Glu Ile Phe

50 55 60

Asp Asp Asn Ala Lys Leu Pro Cys Phe Asn Gly Arg Val Val Ser Trp

65 70 75 80

Leu Val Leu Ala Glu Gly Ala His Ser Asp Ala Gly Ser Gln Gly Thr

85 90 95

Asp Ser His Thr Asp Leu Pro Pro Pro Leu Glu Arg Thr Gly Gly Ile

100 105 110

Gly Asp Ser Arg Pro Pro Ser Phe His Pro Asn Val Ala Ser Ser Arg

115 120 125

Asp Gly Met Asp Asn Glu Thr Gly Thr Glu Ser Met Val Ser His Arg

130 135 140

Arg Glu Arg Ala Arg Arg Arg Asn Arg Glu Glu Ala Ala Arg Thr Asn

145 150 155 160

Gly His Pro Arg Gly Asp Arg Arg Arg Asp Val Gly Leu Pro Pro Asp

165 170 175

Ser Ala Ser Thr Ala Leu Ser Ser Glu Leu Glu Ser Ser Ser Phe Val

180 185 190

Asp Ser Asp Glu Asp Gly Ser Thr Ser Arg Leu Ser Ser Ser Thr Glu

195 200 205

Gln Ser Thr Ser Ser Arg Leu Ile Arg Lys His Lys Arg Arg Arg Arg

210 215 220

Lys Gln Arg Leu Arg Gln Ala Asp Arg Ala Ser Ser Phe Ser Ser Ile

225 230 235 240

Thr Asp Ser Thr Met Ser Leu Asn Ile Val Thr Val Thr Leu Asn Met

245 250 255

Glu Arg His His Phe Leu Gly Ile Ser Ile Val Gly Gln Ser Asn Asp

260 265 270

Arg Gly Asp Gly Gly Ile Tyr Ile Gly Ser Ile Met Lys Gly Gly Ala

275 280 285

Val Ala Ala Asp Gly Arg Ile Glu Pro Gly Asp Met Leu Leu Gln Val

290 295 300

Asn Asp Val Asn Phe Glu Asn Met Ser Asn Asp Asp Ala Val Arg Val

305 310 315 320

Leu Arg Glu Ile Val Ser Gln Thr Gly Pro Ile Ser Leu Thr Val Ala

325 330 335

Lys Cys Trp Asp Pro Thr Pro Arg Ser Tyr Phe Thr Val Pro Arg Ala

340 345 350

Asp Pro Val Arg Pro Ile Asp Pro Ala Ala Trp Leu Ser His Thr Ala

355 360 365

Ala Leu Thr Gly Ala Leu Pro Arg Tyr Gly Thr Ser Pro Cys Ser Ser

370 375 380

Ala Val Thr Arg Thr Ser Ser Ser Ser Leu Thr Ser Ser Val Pro Gly

385 390 395 400

Ala Pro Gln Leu Glu Glu Ala Pro Leu Thr Val Lys Ser Asp Met Ser

405 410 415

Ala Val Val Arg Val Met Gln Leu Pro Asp Ser Gly Leu Glu Ile Arg

420 425 430

Asp Arg Met Trp Leu Lys Ile Thr Ile Ala Asn Ala Val Ile Gly Ala

435 440 445

Asp Val Val Asp Trp Leu Tyr Thr His Val Glu Gly Phe Lys Glu Arg

450 455 460

Arg Glu Ala Arg Lys Tyr Ala Ser Ser Leu Leu Lys His Gly Phe Leu

465 470 475 480

Arg His Thr Val Asn Lys Ile Thr Phe Ser Glu Gln Cys Tyr Tyr Val

485 490 495

Phe Gly Asp Leu Cys Ser Asn Leu Ala Thr Leu Asn Leu Asn Ser Gly

500 505 510

Ser Ser Gly Thr Ser Asp Gln Asp Thr Leu Ala Pro Leu Pro His Pro

515 520 525

Ala Ala Pro Trp Pro Leu Gly Gln Gly Tyr Pro Tyr Gln Tyr Pro Gly

530 535 540

Pro Pro Pro Cys Phe Pro Pro Ala Tyr Gln Asp Pro Gly Phe Ser Tyr

545 550 555 560

Gly Ser Gly Ser Thr Gly Ser Gln Gln Ser Glu Gly Ser Lys Ser Ser

565 570 575

Gly Ser Thr Arg Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gly Arg Glu Lys Glu Arg

580 585 590

Arg Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ser Asp His Thr Ala

595 600 605

Pro Ser Gly Val Gly Ser Ser Trp Arg Glu Arg Pro Ala Gly Gln Leu

610 615 620

Ser Arg Gly Ser Ser Pro Arg Ser Gln Ala Ser Ala Thr Ala Pro Gly

625 630 635 640

Leu Pro Pro Pro His Pro Thr Thr Lys Ala Tyr Thr Val Val Gly Gly

645 650 655

Pro Pro Gly Gly Pro Pro Val Arg Glu Leu Ala Ala Val Pro Pro Glu

660 665 670

Leu Thr Gly Ser Arg Gln Ser Phe Gln Lys Ala Met Gly Asn Pro Cys

675 680 685

Glu Phe Phe Val Asp Ile Met

690 695

<210> 392

<211> 619

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TF7L2__Homo sapiens__Q9NQB0

<400> 392

Met Pro Gln Leu Asn Gly Gly Gly Gly Asp Asp Leu Gly Ala Asn Asp

1 5 10 15

Glu Leu Ile Ser Phe Lys Asp Glu Gly Glu Gln Glu Glu Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Ser Ser Ala Glu Arg Asp Leu Ala Asp Val Lys Ser Ser Leu

35 40 45

Val Asn Glu Ser Glu Thr Asn Gln Asn Ser Ser Ser Asp Ser Glu Ala

50 55 60

Glu Arg Arg Pro Pro Pro Arg Ser Glu Ser Phe Arg Asp Lys Ser Arg

65 70 75 80

Glu Ser Leu Glu Glu Ala Ala Lys Arg Gln Asp Gly Gly Leu Phe Lys

85 90 95

Gly Pro Pro Tyr Pro Gly Tyr Pro Phe Ile Met Ile Pro Asp Leu Thr

100 105 110

Ser Pro Tyr Leu Pro Asn Gly Ser Leu Ser Pro Thr Ala Arg Thr Leu

115 120 125

His Phe Gln Ser Gly Ser Thr His Tyr Ser Ala Tyr Lys Thr Ile Glu

130 135 140

His Gln Ile Ala Val Gln Tyr Leu Gln Met Lys Trp Pro Leu Leu Asp

145 150 155 160

Val Gln Ala Gly Ser Leu Gln Ser Arg Gln Ala Leu Lys Asp Ala Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Pro Ala His Ile Val Ser Asn Lys Val Pro Val Val Gln

180 185 190

His Pro His His Val His Pro Leu Thr Pro Leu Ile Thr Tyr Ser Asn

195 200 205

Glu His Phe Thr Pro Gly Asn Pro Pro Pro His Leu Pro Ala Asp Val

210 215 220

Asp Pro Lys Thr Gly Ile Pro Arg Pro Pro His Pro Pro Asp Ile Ser

225 230 235 240

Pro Tyr Tyr Pro Leu Ser Pro Gly Thr Val Gly Gln Ile Pro His Pro

245 250 255

Leu Gly Trp Leu Val Pro Gln Gln Gly Gln Pro Val Tyr Pro Ile Thr

260 265 270

Thr Gly Gly Phe Arg His Pro Tyr Pro Thr Ala Leu Thr Val Asn Ala

275 280 285

Ser Met Ser Arg Phe Pro Pro His Met Val Pro Pro His His Thr Leu

290 295 300

His Thr Thr Gly Ile Pro His Pro Ala Ile Val Thr Pro Thr Val Lys

305 310 315 320

Gln Glu Ser Ser Gln Ser Asp Val Gly Ser Leu His Ser Ser Lys His

325 330 335

Gln Asp Ser Lys Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Pro His Ile Lys Lys

340 345 350

Pro Leu Asn Ala Phe Met Leu Tyr Met Lys Glu Met Arg Ala Lys Val

355 360 365

Val Ala Glu Cys Thr Leu Lys Glu Ser Ala Ala Ile Asn Gln Ile Leu

370 375 380

Gly Arg Arg Trp His Ala Leu Ser Arg Glu Glu Gln Ala Lys Tyr Tyr

385 390 395 400

Glu Leu Ala Arg Lys Glu Arg Gln Leu His Met Gln Leu Tyr Pro Gly

405 410 415

Trp Ser Ala Arg Asp Asn Tyr Gly Lys Lys Lys Lys Arg Lys Arg Asp

420 425 430

Lys Gln Pro Gly Glu Thr Asn Glu His Ser Glu Cys Phe Leu Asn Pro

435 440 445

Cys Leu Ser Leu Pro Pro Ile Thr Asp Leu Ser Ala Pro Lys Lys Cys

450 455 460

Arg Ala Arg Phe Gly Leu Asp Gln Gln Asn Asn Trp Cys Gly Pro Cys

465 470 475 480

Arg Arg Lys Lys Lys Cys Val Arg Tyr Ile Gln Gly Glu Gly Ser Cys

485 490 495

Leu Ser Pro Pro Ser Ser Asp Gly Ser Leu Leu Asp Ser Pro Pro Pro

500 505 510

Ser Pro Asn Leu Leu Gly Ser Pro Pro Arg Asp Ala Lys Ser Gln Thr

515 520 525

Glu Gln Thr Gln Pro Leu Ser Leu Ser Leu Lys Pro Asp Pro Leu Ala

530 535 540

His Leu Ser Met Met Pro Pro Pro Pro Ala Leu Leu Leu Ala Glu Ala

545 550 555 560

Thr His Lys Ala Ser Ala Leu Cys Pro Asn Gly Ala Leu Asp Leu Pro

565 570 575

Pro Ala Ala Leu Gln Pro Ala Ala Pro Ser Ser Ser Ile Ala Gln Pro

580 585 590

Ser Thr Ser Ser Leu His Ser His Ser Ser Leu Ala Gly Thr Gln Pro

595 600 605

Gln Pro Leu Ser Leu Val Thr Lys Ser Leu Glu

610 615

<210> 393

<211> 420

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GSK3B__Homo sapiens__P49841

<400> 393

Met Ser Gly Arg Pro Arg Thr Thr Ser Phe Ala Glu Ser Cys Lys Pro

1 5 10 15

Val Gln Gln Pro Ser Ala Phe Gly Ser Met Lys Val Ser Arg Asp Lys

20 25 30

Asp Gly Ser Lys Val Thr Thr Val Val Ala Thr Pro Gly Gln Gly Pro

35 40 45

Asp Arg Pro Gln Glu Val Ser Tyr Thr Asp Thr Lys Val Ile Gly Asn

50 55 60

Gly Ser Phe Gly Val Val Tyr Gln Ala Lys Leu Cys Asp Ser Gly Glu

65 70 75 80

Leu Val Ala Ile Lys Lys Val Leu Gln Asp Lys Arg Phe Lys Asn Arg

85 90 95

Glu Leu Gln Ile Met Arg Lys Leu Asp His Cys Asn Ile Val Arg Leu

100 105 110

Arg Tyr Phe Phe Tyr Ser Ser Gly Glu Lys Lys Asp Glu Val Tyr Leu

115 120 125

Asn Leu Val Leu Asp Tyr Val Pro Glu Thr Val Tyr Arg Val Ala Arg

130 135 140

His Tyr Ser Arg Ala Lys Gln Thr Leu Pro Val Ile Tyr Val Lys Leu

145 150 155 160

Tyr Met Tyr Gln Leu Phe Arg Ser Leu Ala Tyr Ile His Ser Phe Gly

165 170 175

Ile Cys His Arg Asp Ile Lys Pro Gln Asn Leu Leu Leu Asp Pro Asp

180 185 190

Thr Ala Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly Ser Ala Lys Gln Leu Val

195 200 205

Arg Gly Glu Pro Asn Val Ser Tyr Ile Cys Ser Arg Tyr Tyr Arg Ala

210 215 220

Pro Glu Leu Ile Phe Gly Ala Thr Asp Tyr Thr Ser Ser Ile Asp Val

225 230 235 240

Trp Ser Ala Gly Cys Val Leu Ala Glu Leu Leu Leu Gly Gln Pro Ile

245 250 255

Phe Pro Gly Asp Ser Gly Val Asp Gln Leu Val Glu Ile Ile Lys Val

260 265 270

Leu Gly Thr Pro Thr Arg Glu Gln Ile Arg Glu Met Asn Pro Asn Tyr

275 280 285

Thr Glu Phe Lys Phe Pro Gln Ile Lys Ala His Pro Trp Thr Lys Val

290 295 300

Phe Arg Pro Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile Ala Leu Cys Ser Arg Leu

305 310 315 320

Leu Glu Tyr Thr Pro Thr Ala Arg Leu Thr Pro Leu Glu Ala Cys Ala

325 330 335

His Ser Phe Phe Asp Glu Leu Arg Asp Pro Asn Val Lys Leu Pro Asn

340 345 350

Gly Arg Asp Thr Pro Ala Leu Phe Asn Phe Thr Thr Gln Glu Leu Ser

355 360 365

Ser Asn Pro Pro Leu Ala Thr Ile Leu Ile Pro Pro His Ala Arg Ile

370 375 380

Gln Ala Ala Ala Ser Thr Pro Thr Asn Ala Thr Ala Ala Ser Asp Ala

385 390 395 400

Asn Thr Gly Asp Arg Gly Gln Thr Asn Asn Ala Ala Ser Ala Ser Ala

405 410 415

Ser Asn Ser Thr

420

<210> 394

<211> 547

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA R2025

<400> 394

gggagaaagc ucaagcuuau ccaaguaggc uggucaccug uacaacguag ccgguauuuu 60

uuuuuuuuuu uuuuuuuuga ccgucucaag guccaaguua gucugccuau aaaggugcgg 120

auccacagcu gaugaaagac uugugcggua cgguuaaucu ccccuuuuuu uuuuuuuuuu 180

uuuuuaguaa augcgucuac ugaauccagc gaugaugcug gcccagaucu ucgaccacaa 240

gugcauauag uagucaucga gggucgccuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uggcccaguu 300

cugagacuuc gcuagagacu acaguuacag cugcaguagu aaccacugcg gcuauugcag 360

gaaaucccgu ucagguuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuccgc ucacuaugau uaagaaccag 420

guggaguguc acugcucucg aggucucacg agagcgcucg auacaguccu uggaagaauc 480

uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uugugcgacg aucacagaga acuucuauuc augcaggucu 540

gcucuag 547

<210> 395

<211> 1083

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 395

gggagaaagc ucaagcuuau ccaaguaggc uggucaccug uacaacguag ccgguauuuu 60

uuuuuuuuuu uuuuuuuuga ccgucucaag guccaaguua gucugccuau aaaggugcgg 120

auccacagcu gaugaaagac uugugcggua cgguuaaucu ccccuuuuuu uuuuuuuuuu 180

uuuuuaguaa augcgucuac ugaauccagc gaugaugcug gcccagaucu ucgaccacaa 240

gugcauauag uagucaucga gggucgccuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uggcccaguu 300

cugagacuuc gcuagagacu acaguuacag cugcaguagu aaccacugcg gcuauugcag 360

gaaaucccgu ucagguuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuccgc ucacuaugau uaagaaccag 420

guggaguguc acugcucucg aggucucacg agagcgcucg auacaguccu uggaagaauc 480

uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uugugcgacg aucacagaga acuucuauuc augcaggucu 540

gcucuagaac gaacugaccu gacgccugaa cuuaugagcg ugcguauuuu uuuuuuuuuu 600

uuuuuuuuuc cucccaacaa augucgauca auagcugggc uguuggagac gcgucagcaa 660

augccguggc uccauaggac guguagacuu cuauuuuuuu uuuuuuuuuu uuuucccggg 720

accacaaaua auauucuugc uugguugggc gcaagggccc cguaucaggu cauaaacggg 780

uacauguugc acaggcuccu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uucgcugagu uauuccgguc 840

ucaaaagacg gcagacguca gucgacaaca cggucuaaag cagugcuaca aucugccgug 900

uucguguuuu uuuuuuuuuu uuuuuuguga accuacacgg cgugcacugu aguucgcaau 960

ucauagggua ccggcucaga guuaugccuu gguugaaaac ugcccagcau acuuuuuuuu 1020

uuuuuuuuuu uucauauucc caugcuaagc aagggaugcc gcgagucaug uuaagcuuga 1080

auu 1083

<210> 396

<211> 59

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 396

uagcgaagcu cuuggaccua ccuuuuuuuu uuuuuucccu gcguuccuag aaguacacg 59

<210> 397

<211> 120

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> immune stimmulatory RNA

<400> 397

uagcgaagcu cuuggaccua ccuuuuuuuu uuuuuuuccc ugcguuccua gaaguacacg 60

aucgcuucga gaaccuggau ggaaaaaaaa aaaaaaaggg acgcaaggau cuucaugugc 120

<210> 398

<211> 365

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1A01_HLA-A/m__Homo_sapiens__P30443

<400> 398

Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Gly Ala

1 5 10 15

Leu Ala Leu Thr Gln Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe

20 25 30

Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala

35 40 45

Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala

50 55 60

Ala Ser Gln Lys Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly

65 70 75 80

Pro Glu Tyr Trp Asp Gln Glu Thr Arg Asn Met Lys Ala His Ser Gln

85 90 95

Thr Asp Arg Ala Asn Leu Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser

100 105 110

Glu Asp Gly Ser His Thr Ile Gln Ile Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly

115 120 125

Pro Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly Tyr Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly

130 135 140

Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala

145 150 155 160

Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr Lys Arg Lys Trp Glu Ala Val His Ala

165 170 175

Ala Glu Gln Arg Arg Val Tyr Leu Glu Gly Arg Cys Val Asp Gly Leu

180 185 190

Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro

195 200 205

Pro Lys Thr His Met Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr

210 215 220

Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr

225 230 235 240

Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu

245 250 255

Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val

260 265 270

Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu

275 280 285

Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Leu Ser Ser Gln Pro

290 295 300

Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala

305 310 315 320

Val Ile Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser

325 330 335

Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Thr Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser

340 345 350

Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala Cys Lys Val

355 360 365

<210> 399

<211> 1098

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1A01_HLA-A/m__Homo_sapiens__AAA59652

<400> 399

auggccguca uggcgccccg aacccuccuc cugcuacucu cgggggcccu ggcccugacc 60

cagaccuggg cgggcuccca cuccaugagg uauuucuuca cauccguguc ccggcccggc 120

cgcggggagc cccgcuucau cgccgugggc uacguggacg acacgcaguu cgugcgguuc 180

gacagcgacg ccgcgagcca gaagauggag ccgcgggcgc cguggauaga gcaggagggg 240

ccggaguauu gggaccagga gacacggaau augaaggccc acucacagac ugaccgagcg 300

aaccugggga cccugcgcgg cuacuacaac cagagcgagg acgguucuca caccauccag 360

auaauguaug gcugcgacgu ggggccggac gggcgcuucc uccgcgggua ccggcaggac 420

gccuacgacg gcaaggauua caucgcccug aacgaggacc ugcgcucuug gaccgcggcg 480

gacauggcag cucagaucac caagcgcaag ugggaggcgg uccaugcggc ggagcagcgg 540

agagucuacc uggagggccg gugcguggac gggcuccgca gauaccugga gaacgggaag 600

gagacgcugc agcgcacgga cccccccaag acacauauga cccaccaccc caucucugac 660

caugaggcca cccugaggug cugggcccug ggcuucuacc cugcggagau cacacugacc 720

uggcagcggg auggggagga ccagacccag gacacggagc ucguggagac caggccugca 780

ggggauggaa ccuuccagaa gugggcggcu gugguggugc cuucuggaga ggagcagaga 840

uacaccugcc augugcagca ugagggucug cccaagcccc ucacccugag augggagcug 900

ucuucccagc ccaccauccc caucgugggc aucauugcug gccugguucu ccuuggagcu 960

gugaucacug gagcuguggu cgcugccgug auguggagga ggaagagcuc agauagaaaa 1020

ggagggaguu acacucaggc ugcaagcagu gacagugccc agggcucuga ugugucucuc 1080

acagcuugua aaguguga 1098

<210> 400

<211> 1098

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt1 from

1A01_HLA-A/m__Homo_sapiens__AAA59652

<400> 400

auggccguga uggcgccccg cacccugcuc cugcugcuca gcggcgcccu ggcccugacc 60

cagacguggg ccggguccca cagcaugcgg uacuucuuca ccuccgucag ccgcccgggc 120

cgcggggagc cccgguucau cgccgugggc uacguggacg acacccaguu cguccgguuc 180

gacuccgacg ccgcgagcca gaagauggag ccccgcgccc ccuggaucga gcaggagggg 240

ccggaguacu gggaccagga gacccggaac augaaggccc acucccagac ggaccgcgcc 300

aaccucggca cccugcgggg cuacuacaac cagagcgagg acggguccca caccauccag 360

aucauguacg gcugcgacgu ggggcccgac ggccgcuucc ugcgggggua ccgccaggac 420

gcguacgacg gcaaggacua caucgcccuc aacgaggacc ugcggagcug gaccgccgcc 480

gacauggccg cgcagaucac gaagcgcaag ugggaggccg ugcacgccgc cgagcagcgg 540

cgcgucuacc uggagggccg gugcguggac gggcuccgcc gguaccugga gaacggcaag 600

gagacccugc agcgcaccga cccgcccaag acccacauga cgcaccaccc caucuccgac 660

cacgaggcca cccuccggug cugggcgcug ggguucuacc ccgccgagau cacccugacc 720

uggcagcgcg acggcgagga ccagacgcag gacaccgagc ucguggagac ccgccccgcc 780

ggcgacggga ccuuccagaa gugggccgcc gucguggugc ccagcggcga ggagcagcgg 840

uacacgugcc acguccagca cgaggggcug ccgaagcccc ugacccuccg cugggagcug 900

uccagccagc ccaccauccc caucgugggc aucaucgcgg ggcuggugcu ccugggcgcc 960

gucaucaccg gcgccguggu ggccgccguc auguggcggc gcaaguccag cgaccggaag 1020

ggcggguccu acacgcaggc ggccagcucc gacagcgccc aggggagcga cgugucccug 1080

accgccugca agguguga 1098

<210> 401

<211> 1098

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt2 from

1A01_HLA-A/m__Homo_sapiens__AAA59652

<400> 401

auggccguca uggccccccg cacccuccuc cuccuccucu ccggcgcccu cgcccucacc 60

cagaccuggg ccggcuccca cuccaugcgc uacuucuuca ccuccgucuc ccgccccggc 120

cgcggcgagc cccgcuucau cgccgucggc uacgucgacg acacccaguu cguccgcuuc 180

gacuccgacg ccgccuccca gaagauggag ccccgcgccc ccuggaucga gcaggagggc 240

cccgaguacu gggaccagga gacccgcaac augaaggccc acucccagac cgaccgcgcc 300

aaccucggca cccuccgcgg cuacuacaac caguccgagg acggcuccca caccauccag 360

aucauguacg gcugcgacgu cggccccgac ggccgcuucc uccgcggcua ccgccaggac 420

gccuacgacg gcaaggacua caucgcccuc aacgaggacc uccgcuccug gaccgccgcc 480

gacauggccg cccagaucac caagcgcaag ugggaggccg uccacgccgc cgagcagcgc 540

cgcgucuacc ucgagggccg cugcgucgac ggccuccgcc gcuaccucga gaacggcaag 600

gagacccucc agcgcaccga cccccccaag acccacauga cccaccaccc caucuccgac 660

cacgaggcca cccuccgcug cugggcccuc ggcuucuacc ccgccgagau cacccucacc 720

uggcagcgcg acggcgagga ccagacccag gacaccgagc ucgucgagac ccgccccgcc 780

ggcgacggca ccuuccagaa gugggccgcc gucgucgucc ccuccggcga ggagcagcgc 840

uacaccugcc acguccagca cgagggccuc cccaagcccc ucacccuccg cugggagcuc 900

uccucccagc ccaccauccc caucgucggc aucaucgccg gccucguccu ccucggcgcc 960

gucaucaccg gcgccgucgu cgccgccguc auguggcgcc gcaaguccuc cgaccgcaag 1020

ggcggcuccu acacccaggc cgccuccucc gacuccgccc agggcuccga cgucucccuc 1080

accgccugca aggucuga 1098

<210> 402

<211> 1098

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt3 from

1A01_HLA-A/m__Homo_sapiens__AAA59652

<400> 402

auggccguga uggcucccag aacccugcuc cuucuguuga gcggcgcauu agcccugaca 60

cagacuuggg cgggguccca cucuaugagg uacuucuuua cgucagucag ucggccugga 120

cgcggugagc cacgauucau cgcuguuggc uauguggacg auacccaauu uguacguuuc 180

gacagcgaug ccgcauccca gaagauggaa ccgagagccc ccuggauuga gcaggaaggg 240

ccugaguacu gggaccagga aacaaggaac augaaagcuc auucucaaac ugaucgggca 300

aaucuaggaa cccuccgcgg cuauuacaac cagucggagg acgguucaca cacaauacag 360

aucauguaug ggugcgaugu gggaccagac ggcagauuuc ugaggggcua ccggcaggau 420

gccuaugacg ggaaggauua cauugcucuu aaugaggacc ugcgcagcug gaccgccgcg 480

gauauggcag cccaaaucac uaaacgaaag ugggaagcug uccaugccgc agagcagaga 540

aggguguacu uggaaggacg guguguugac ggucuccguc gcuaucugga gaacggcaaa 600

gagacacugc agagaaccga ucccccuaag acgcacauga cucaucaccc aauuagugac 660

cacgaagcua cccucaggug cugggccuua ggguucuacc ccgcggagau cacacugacu 720

uggcagcggg acggagaaga ucaaacccag gacacagagc uuguggaaac ccgaccugcc 780

ggcgauggua cguuucagaa gugggcagcu gucgugguac cauccgggga ggagcaacgc 840

uauacuuguc auguucagca cgaaggauug ccgaaacccc ugacacuaag augggagcuc 900

ucuagccagc cuaccauacc aaucgugggc auuaucgccg gccugguccu ucugggggcu 960

gugauuacug gagccguggu cgcagccguu auguggaggc ggaaguccuc agaccgcaaa 1020

gguggcaguu acacacaggc ugcgagcucu gauuccgcac aagggucaga cgugagcuug 1080

accgccugca agguauga 1098

<210> 403

<211> 1098

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt4 from

1A01_HLA-A/m__Homo_sapiens__AAA59652

<400> 403

auggccguga uggcccccag aacccugcug cugcugcuga gcggcgcccu ggcccugacc 60

cagaccuggg ccggcagcca cagcaugaga uacuucuuca ccagcgugag cagacccggc 120

agaggcgagc ccagauucau cgccgugggc uacguggacg acacccaguu cgugagauuc 180

gacagcgacg ccgccagcca gaagauggag cccagagccc ccuggaucga gcaggagggc 240

cccgaguacu gggaccagga gaccagaaac augaaggccc acagccagac cgacagagcc 300

aaccugggca cccugagagg cuacuacaac cagagcgagg acggcagcca caccauccag 360

aucauguacg gcugcgacgu gggccccgac ggcagauucc ugagaggcua cagacaggac 420

gccuacgacg gcaaggacua caucgcccug aacgaggacc ugagaagcug gaccgccgcc 480

gacauggccg cccagaucac caagagaaag ugggaggccg ugcacgccgc cgagcagaga 540

agaguguacc uggagggcag augcguggac ggccugagaa gauaccugga gaacggcaag 600

gagacccugc agagaaccga cccccccaag acccacauga cccaccaccc caucagcgac 660

cacgaggcca cccugagaug cugggcccug ggcuucuacc ccgccgagau cacccugacc 720

uggcagagag acggcgagga ccagacccag gacaccgagc ugguggagac cagacccgcc 780

ggcgacggca ccuuccagaa gugggccgcc gugguggugc ccagcggcga ggagcagaga 840

uacaccugcc acgugcagca cgagggccug cccaagcccc ugacccugag augggagcug 900

agcagccagc ccaccauccc caucgugggc aucaucgccg gccuggugcu gcugggcgcc 960

gugaucaccg gcgccguggu ggccgccgug auguggagaa gaaagagcag cgacagaaag 1020

ggcggcagcu acacccaggc cgccagcagc gacagcgccc agggcagcga cgugagccug 1080

accgccugca agguguga 1098

<210> 404

<211> 1098

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt5 from

1A01_HLA-A/m__Homo_sapiens__AAA59652

<400> 404

auggccguga uggcucccag aacccugcuc cugcuucuga gcggcgcccu cgcgcugaca 60

cagacguggg cuggguccca cucuaugcgg uacuucuuua ccagcgucuc ccgcccugga 120

agaggcgagc cgcgguucau cgccguuggg uauguggacg auacacaauu ugugcgcuuc 180

gacucugaug ccgcuagcca gaagauggaa cccagagccc cuuggauuga gcaggaagga 240

cccgaguacu gggaccagga aacccggaac augaaagcuc auucccaaac agaucgcgcc 300

aaucuuggca cccugagagg guauuacaac cagucugagg acggaagcca cacaauccag 360

auuauguaug gcugcgaugu cggcccugac gggcgguuuc uccgcggaua cagacaggau 420

gcguaugacg gcaaggauua caucgcccug aaugaggacc ugcgguccug gaccgcugcc 480

gauauggcug cccaaauuac gaaacgcaag ugggaagcgg ugcaugccgc ugagcagaga 540

cggguuuacc ucgaagggcg cuguguggac ggacugagac gguaucuuga gaacggcaaa 600

gagacccugc agagaacaga ucccccuaag acccacauga cacaucaccc gaucagcgac 660

cacgaagcca cccuccgcug cugggcucug ggguucuacc ccgccgagau cacgcuuaca 720

uggcagcggg acggagaaga ucaaacccag gacacagagc uggucgaaac cagaccugcc 780

ggcgauggca ccuuucagaa gugggcugcg gugguugugc ccucugggga ggagcaacgc 840

uauacauguc auguccagca cgaaggacuc ccuaaacccc ugacgcugcg gugggagcuc 900

uccagccagc cgaccauucc uaucgugggc auuaucgccg ggcuggugcu ucugggagcu 960

gucauuacag gcgccguugu ggccgcugug auguggagac gcaagucuuc cgaccggaaa 1020

gggggaagcu acacccaggc cgcgucuucc gauagcgcuc aaggcuccga cgucucucuc 1080

acagccugca agguguga 1098

<210> 405

<211> 365

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1A02__Homo_sapiens__P01892

<400> 405

Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala

1 5 10 15

Leu Ala Leu Thr Gln Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe

20 25 30

Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala

35 40 45

Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala

50 55 60

Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly

65 70 75 80

Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln

85 90 95

Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser

100 105 110

Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly

115 120 125

Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly

130 135 140

Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala

145 150 155 160

Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val

165 170 175

Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu

180 185 190

Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala

195 200 205

Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr

210 215 220

Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr

225 230 235 240

Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu

245 250 255

Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val

260 265 270

Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu

275 280 285

Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro

290 295 300

Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala

305 310 315 320

Val Ile Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser

325 330 335

Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser

340 345 350

Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala Cys Lys Val

355 360 365

<210> 406

<211> 1098

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1A02__Homo_sapiens__AAA59606

<400> 406

auggccguca uggcgccccg aacccucguc cugcuacucu cgggggcucu ggcccugacc 60

cagaccuggg cgggcucuca cuccaugagg uauuucuuca cauccguguc ccggcccggc 120

cgcggggagc cccgcuucau cgcagugggc uacguggacg acacgcaguu cgugcgguuc 180

gacagcgacg ccgcgagcca gaggauggag ccgcgggcgc cguggauaga gcaggagggu 240

ccggaguauu gggacgggga gacacggaaa gugaaggccc acucacagac ucaccgagug 300

gaccugggga cccugcgcgg cuacuacaac cagagcgagg ccgguucuca caccguccag 360

aggauguaug gcugcgacgu ggggucggac uggcgcuucc uccgcgggua ccaccaguac 420

gccuacgacg gcaaggauua caucgcccug aaagaggacc ugcgcucuug gaccgcggcg 480

gacauggcag cucagaccac caagcacaag ugggaggcgg cccauguggc ggagcaguug 540

agagccuacc uggagggcac gugcguggag uggcuccgca gauaccugga gaacgggaag 600

gagacgcugc agcgcacgga cgcccccaaa acgcauauga cucaccacgc ugucucugac 660

caugaagcca cccugaggug cugggcccug agcuucuacc cugcggagau cacacugacc 720

uggcagcggg auggggagga ccagacccag gacacggagc ucguggagac caggccugca 780

ggggauggaa ccuuccagaa gugggcggcu gugguggugc cuucuggaca ggagcagaga 840

uacaccugcc augugcagca ugaggguuug cccaagcccc ucacccugag augggagccg 900

ucuucccagc ccaccauccc caucgugggc aucauugcug gccugguucu cuuuggagcu 960

gugaucacug gagcuguggu cgcugcugug auguggagga ggaagagcuc agauagaaaa 1020

ggagggagcu acucucaggc ugcaagcagu gacagugccc agggcucuga ugugucucuc 1080

acagcuugua aaguguga 1098

<210> 407

<211> 1098

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt1 from

1A02__Homo_sapiens__AAA59606

<400> 407

auggccguga uggcgccccg cacccugguc cuccugcuga gcggcgcccu cgcccugacc 60

cagacguggg ccggguccca cagcaugcgg uacuucuuca ccuccgugag ccgcccgggc 120

cggggcgagc cccgcuucau cgccgugggc uacgucgacg acacccaguu cgugcgguuc 180

gacuccgacg ccgcgagcca gcgcauggag ccccgggccc ccuggaucga gcaggagggg 240

ccggaguacu gggacggcga gacccgcaag gugaaggccc acucccagac gcaccggguc 300

gaccugggca cccuccgcgg guacuacaac cagagcgagg ccggcuccca caccgugcag 360

cggauguacg ggugcgacgu gggcagcgac uggcgcuucc ugcgggggua ccaccaguac 420

gcguacgacg gcaaggacua caucgcccug aaggaggacc uccgcuccug gaccgccgcc 480

gacauggccg cgcagacgac caagcacaag ugggaggccg cccacgucgc cgagcagcug 540

cgggccuacc uggaggggac cugcguggag uggcuccgcc gguaccugga gaacgggaag 600

gagacccugc agcgcacgga cgcgcccaag acccacauga cccaccacgc cgugagcgac 660

cacgaggcca cccuccggug cugggcccug uccuucuacc ccgccgagau cacgcugacc 720

uggcagcgcg acggcgagga ccagacccag gacaccgagc ucgucgagac gcggcccgcg 780

ggggacggca ccuuccagaa gugggccgcc gugguggucc cgagcggcca ggagcagcgc 840

uacacgugcc acgugcagca cgaggggcug cccaagcccc ugacccuccg cugggagccc 900

uccagccagc cgaccauccc caucgugggc aucaucgccg ggcugguccu guucggcgcc 960

gugaucaccg gggcgguggu cgccgccgug auguggcggc gcaaguccag cgaccggaag 1020

ggcggcuccu acagccaggc cgcgagcucc gacagcgccc agggguccga cgugagccuc 1080

accgccugca aggucuga 1098

<210> 408

<211> 1098

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt2 from

1A02__Homo_sapiens__AAA59606

<400> 408

auggccguca uggccccccg cacccucguc cuccuccucu ccggcgcccu cgcccucacc 60

cagaccuggg ccggcuccca cuccaugcgc uacuucuuca ccuccgucuc ccgccccggc 120

cgcggcgagc cccgcuucau cgccgucggc uacgucgacg acacccaguu cguccgcuuc 180

gacuccgacg ccgccuccca gcgcauggag ccccgcgccc ccuggaucga gcaggagggc 240

cccgaguacu gggacggcga gacccgcaag gucaaggccc acucccagac ccaccgcguc 300

gaccucggca cccuccgcgg cuacuacaac caguccgagg ccggcuccca caccguccag 360

cgcauguacg gcugcgacgu cggcuccgac uggcgcuucc uccgcggcua ccaccaguac 420

gccuacgacg gcaaggacua caucgcccuc aaggaggacc uccgcuccug gaccgccgcc 480

gacauggccg cccagaccac caagcacaag ugggaggccg cccacgucgc cgagcagcuc 540

cgcgccuacc ucgagggcac cugcgucgag uggcuccgcc gcuaccucga gaacggcaag 600

gagacccucc agcgcaccga cgcccccaag acccacauga cccaccacgc cgucuccgac 660

cacgaggcca cccuccgcug cugggcccuc uccuucuacc ccgccgagau cacccucacc 720

uggcagcgcg acggcgagga ccagacccag gacaccgagc ucgucgagac ccgccccgcc 780

ggcgacggca ccuuccagaa gugggccgcc gucgucgucc ccuccggcca ggagcagcgc 840

uacaccugcc acguccagca cgagggccuc cccaagcccc ucacccuccg cugggagccc 900

uccucccagc ccaccauccc caucgucggc aucaucgccg gccucguccu cuucggcgcc 960

gucaucaccg gcgccgucgu cgccgccguc auguggcgcc gcaaguccuc cgaccgcaag 1020

ggcggcuccu acucccaggc cgccuccucc gacuccgccc agggcuccga cgucucccuc 1080

accgccugca aggucuga 1098

<210> 409

<211> 1098

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt3 from

1A02__Homo_sapiens__AAA59606

<400> 409

auggccguga uggcucccag aacccugguc cuccuucuga gcggcgcauu ggccuuaaca 60

cagacuuggg cgggguccca cucuaugagg uacuucuuua cgucaguuag ucggccugga 120

cgcggugagc cacgauucau cgcugugggc uauguagacg auacccaauu ugugcguuuc 180

gacagcgaug ccgcauccca gagaauggaa ccgagggccc ccuggauuga gcaggaaggg 240

ccugaguacu gggacggaga aacacggaag gucaaagcuc auucucagac ucaccgcgug 300

gaucugggca cccuaagagg uuauuacaac caaucggagg cagggucaca uacaguucag 360

aggauguaug gaugcgacgu gggcagcgau uggcgguuuc uccgcggcua ccaccaguau 420

gccuacgacg ggaaggauua cauagcucug aaagaggacc uucgaaguug gaccgccgcg 480

gauauggcag cccagacuac aaagcauaaa ugggaagcug cccacgucgc agagcaacug 540

agagcuuauu uggaaggaac cuguguggag uggcucaggc gguaccugga gaaugguaag 600

gaaacgcugc agcguacuga cgccccaaag acccacauga cacaucacgc gguauccgau 660

caugaggcca cucuccgcug cugggcauua ucuuucuauc ccgcugaaau cacccugaca 720

uggcagagag acggcgagga ccagacccaa gauacggaac uuguugagac uaggccugcc 780

ggggacggaa cauuucagaa augggcugcc guggucgugc caagcggcca ggagcaacgg 840

uacaccuguc acgugcagca cgaagguuug cccaagccuc ugacucuacg augggagcca 900

uccucacagc cgacaauucc caucgucggg auuaucgcag gacucguucu guucggcgcc 960

gugauaaccg gcgcuguagu ggcggcaguc auguggcgca gaaaaaguag cgauaggaaa 1020

gggggaucuu auucccaggc cgcuucaagc gacagugccc aagguucuga ugugucccuu 1080

acggcaugca agguuuga 1098

<210> 410

<211> 1098

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt4 from

1A02__Homo_sapiens__AAA59606

<400> 410

auggccguga uggcccccag aacccuggug cugcugcuga gcggcgcccu ggcccugacc 60

cagaccuggg ccggcagcca cagcaugaga uacuucuuca ccagcgugag cagacccggc 120

agaggcgagc ccagauucau cgccgugggc uacguggacg acacccaguu cgugagauuc 180

gacagcgacg ccgccagcca gagaauggag cccagagccc ccuggaucga gcaggagggc 240

cccgaguacu gggacggcga gaccagaaag gugaaggccc acagccagac ccacagagug 300

gaccugggca cccugagagg cuacuacaac cagagcgagg ccggcagcca caccgugcag 360

agaauguacg gcugcgacgu gggcagcgac uggagauucc ugagaggcua ccaccaguac 420

gccuacgacg gcaaggacua caucgcccug aaggaggacc ugagaagcug gaccgccgcc 480

gacauggccg cccagaccac caagcacaag ugggaggccg cccacguggc cgagcagcug 540

agagccuacc uggagggcac cugcguggag uggcugagaa gauaccugga gaacggcaag 600

gagacccugc agagaaccga cgcccccaag acccacauga cccaccacgc cgugagcgac 660

cacgaggcca cccugagaug cugggcccug agcuucuacc ccgccgagau cacccugacc 720

uggcagagag acggcgagga ccagacccag gacaccgagc ugguggagac cagacccgcc 780

ggcgacggca ccuuccagaa gugggccgcc gugguggugc ccagcggcca ggagcagaga 840

uacaccugcc acgugcagca cgagggccug cccaagcccc ugacccugag augggagccc 900

agcagccagc ccaccauccc caucgugggc aucaucgccg gccuggugcu guucggcgcc 960

gugaucaccg gcgccguggu ggccgccgug auguggagaa gaaagagcag cgacagaaag 1020

ggcggcagcu acagccaggc cgccagcagc gacagcgccc agggcagcga cgugagccug 1080

accgccugca agguguga 1098

<210> 411

<211> 1098

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt5 from

1A02__Homo_sapiens__AAA59606

<400> 411

auggccguga uggcucccag aacccugguc cuccugcuua gcggcgcccu ggcgcucaca 60

cagacguggg cuggguccca cucuaugcgg uacuucuuua ccagcguuuc ccgcccugga 120

agaggcgagc cgcgguucau cgccgugggg uauguggacg auacacaauu uguccgcuuc 180

gacucugaug ccgcuagcca gagaauggaa ccccgggccc cuuggauuga gcaggaagga 240

cccgaguacu gggacggcga aacccgcaag gugaaagcuc auucccagac acacagaguu 300

gaucugggga cccuucgggg auauuacaac caaucugagg ccggcagcca uacagugcag 360

cgcauguaug gcugcgacgu cggguccgau uggagauuuc ugcggggaua ccaccaguau 420

gcguacgacg gcaaggauua caucgcccuc aaagaggacc ugcgcagcug gaccgcugcc 480

gauauggcug cccagacgac caagcauaaa ugggaagcgg cccacguggc ugagcaacug 540

agagccuauc ucgaagggac auguguugag uggcugcggc gcuaccuuga gaauggaaag 600

gaaacccugc agagaacaga cgcuccuaag acccacauga cgcaucacgc cgugucugau 660

caugaggcca cacuccggug cugggcucug uccuucuauc ccgcggaaau uacccuuaca 720

uggcagagag acggcgagga ccagacccaa gauaccgaac uggucgagac acgcccugcc 780

ggggacggaa cguuucagaa augggcugcc gugguggucc cgagcggcca ggagcaacgg 840

uacaccuguc acguucagca cgaaggccuc cccaagccuc ugacacugag augggagccc 900

ucuucccagc cuaccauccc cauugugggg aucaucgccg gacucgugcu guucggcgcu 960

gucauuacag gggccguggu ugcggcugug auguggcgcc ggaaaagcuc ugauagaaag 1020

ggaggcuccu auagccaggc cgccuccucu gacagcgcuc aaggguccga ugucagccuu 1080

accgccugca aaguguga 1098

<210> 412

<211> 420

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5T4__Homo_sapiens__Q13641

<400> 412

Met Pro Gly Gly Cys Ser Arg Gly Pro Ala Ala Gly Asp Gly Arg Leu

1 5 10 15

Arg Leu Ala Arg Leu Ala Leu Val Leu Leu Gly Trp Val Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Pro Thr Ser Ser Ala Ser Ser Phe Ser Ser Ser Ala Pro Phe Leu

35 40 45

Ala Ser Ala Val Ser Ala Gln Pro Pro Leu Pro Asp Gln Cys Pro Ala

50 55 60

Leu Cys Glu Cys Ser Glu Ala Ala Arg Thr Val Lys Cys Val Asn Arg

65 70 75 80

Asn Leu Thr Glu Val Pro Thr Asp Leu Pro Ala Tyr Val Arg Asn Leu

85 90 95

Phe Leu Thr Gly Asn Gln Leu Ala Val Leu Pro Ala Gly Ala Phe Ala

100 105 110

Arg Arg Pro Pro Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ser

115 120 125

Arg Leu Asp Glu Val Arg Ala Gly Ala Phe Glu His Leu Pro Ser Leu

130 135 140

Arg Gln Leu Asp Leu Ser His Asn Pro Leu Ala Asp Leu Ser Pro Phe

145 150 155 160

Ala Phe Ser Gly Ser Asn Ala Ser Val Ser Ala Pro Ser Pro Leu Val

165 170 175

Glu Leu Ile Leu Asn His Ile Val Pro Pro Glu Asp Glu Arg Gln Asn

180 185 190

Arg Ser Phe Glu Gly Met Val Val Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg Ala

195 200 205

Leu Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Leu Ala Ser Asn His Phe Leu Tyr

210 215 220

Leu Pro Arg Asp Val Leu Ala Gln Leu Pro Ser Leu Arg His Leu Asp

225 230 235 240

Leu Ser Asn Asn Ser Leu Val Ser Leu Thr Tyr Val Ser Phe Arg Asn

245 250 255

Leu Thr His Leu Glu Ser Leu His Leu Glu Asp Asn Ala Leu Lys Val

260 265 270

Leu His Asn Gly Thr Leu Ala Glu Leu Gln Gly Leu Pro His Ile Arg

275 280 285

Val Phe Leu Asp Asn Asn Pro Trp Val Cys Asp Cys His Met Ala Asp

290 295 300

Met Val Thr Trp Leu Lys Glu Thr Glu Val Val Gln Gly Lys Asp Arg

305 310 315 320

Leu Thr Cys Ala Tyr Pro Glu Lys Met Arg Asn Arg Val Leu Leu Glu

325 330 335

Leu Asn Ser Ala Asp Leu Asp Cys Asp Pro Ile Leu Pro Pro Ser Leu

340 345 350

Gln Thr Ser Tyr Val Phe Leu Gly Ile Val Leu Ala Leu Ile Gly Ala

355 360 365

Ile Phe Leu Leu Val Leu Tyr Leu Asn Arg Lys Gly Ile Lys Lys Trp

370 375 380

Met His Asn Ile Arg Asp Ala Cys Arg Asp His Met Glu Gly Tyr His

385 390 395 400

Tyr Arg Tyr Glu Ile Asn Ala Asp Pro Arg Leu Thr Asn Leu Ser Ser

405 410 415

Asn Ser Asp Val

420

<210> 413

<211> 1263

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5T4__Homo_sapiens__AAH37161

<400> 413

augccugggg ggugcucccg gggccccgcc gccggggacg ggcgucugcg gcuggcgcga 60

cuagcgcugg uacuccuggg cugggucucc ucgucuucuc ccaccuccuc ggcauccucc 120

uucuccuccu cggcgccguu ccuggcuucc gccguguccg cccagccccc gcugccggac 180

cagugccccg cgcugugcga gugcuccgag gcagcgcgca cagucaagug cguuaaccgc 240

aaucugaccg aggugcccac ggaccugccc gccuacgugc gcaaccucuu ccuuaccggc 300

aaccagcugg ccgugcuccc ugccggcgcc uucgcccgcc ggccgccgcu ggcggagcug 360

gccgcgcuca accucagcgg cagccgccug gacgaggugc gcgcgggcgc cuucgagcau 420

cugcccagcc ugcgccagcu cgaccucagc cacaacccac uggccgaccu cagucccuuc 480

gcuuucucgg gcagcaaugc cagcgucucg gcccccaguc cccuugugga acugauccug 540

aaccacaucg ugcccccuga agaugagcgg cagaaccgga gcuucgaggg caugguggug 600

gcggcccugc uggcgggccg ugcacugcag gggcuccgcc gcuuggagcu ggccagcaac 660

cacuuccuuu accugccgcg ggaugugcug gcccaacugc ccagccucag gcaccuggac 720

uuaaguaaua auucgcuggu gagccugacc uacguguccu uccgcaaccu gacacaucua 780

gaaagccucc accuggagga caaugcccuc aagguccuuc acaauggcac ccuggcugag 840

uugcaagguc uaccccacau uaggguuuuc cuggacaaca aucccugggu cugcgacugc 900

cacauggcag acauggugac cuggcucaag gaaacagagg uagugcaggg caaagaccgg 960

cucaccugug cauauccgga aaaaaugagg aaucgggucc ucuuggaacu caacagugcu 1020

gaccuggacu gugacccgau ucuuccccca ucccugcaaa ccucuuaugu cuuccugggu 1080

auuguuuuag cccugauagg cgcuauuuuc cuccugguuu uguauuugaa ccgcaagggg 1140

auaaaaaagu ggaugcauaa caucagagau gccugcaggg aucacaugga aggguaucau 1200

uacagauaug aaaucaaugc ggaccccaga uuaacgaacc ucaguucuaa cucggauguc 1260

uga 1263

<210> 414

<211> 1263

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt1 from

5T4__Homo_sapiens__AAH37161

<400> 414

augcccggcg ggugcagccg cggccccgcc gccggggacg gccggcugcg ccucgcgcgg 60

cuggcccugg ugcuccuggg gugggucucc agcuccagcc ccaccuccag cgccuccagc 120

uucuccagcu ccgcccccuu ccuggccagc gcgguguccg cccagccccc gcuccccgac 180

cagugccccg cccugugcga gugcagcgag gccgcgcgca ccgugaagug cgucaaccgg 240

aaccugacgg aggugcccac cgaccucccg gccuacgugc gcaaccuguu ccugaccggc 300

aaccagcucg ccguccugcc cgccggcgcc uucgcgcggc gcccgccccu ggccgagcuc 360

gccgcccuga accuguccgg gagccggcuc gacgaggugc gcgccggcgc guucgagcac 420

cuccccuccc ugcggcagcu ggaccugagc cacaaccccc uggccgaccu cucccccuuc 480

gccuucagcg ggagcaacgc cuccgugagc gcccccuccc cgcuggucga gcugauccuc 540

aaccacaucg ugccgcccga ggacgagcgc cagaaccgga gcuucgaggg cauggugguc 600

gcggcccugc uggccgggcg cgcccuccag ggccugcggc gccuggagcu cgccuccaac 660

cacuuccugu accugccccg ggacgugcuc gcgcagcugc ccagccugcg ccaccucgac 720

cuguccaaca acagccuggu gucccucacc uacgucagcu uccggaaccu gacgcaccug 780

gagucccucc accuggagga caacgcccug aaggugcucc acaacggcac ccuggccgag 840

cugcaggggc ugccccacau ccgcguguuc cucgacaaca accccugggu cugcgacugc 900

cacauggccg acauggugac cuggcugaag gagaccgagg ugguccaggg caaggaccgg 960

cugacgugcg cguaccccga gaagaugcgc aaccgcgugc uccuggagcu gaacagcgcc 1020

gaccucgacu gcgacccgau ccugccgccc ucccugcaga ccagcuacgu guuccucggg 1080

aucguccugg cccugaucgg cgccaucuuc cuccuggugc uguaccucaa ccggaagggc 1140

aucaagaagu ggaugcacaa cauccgcgac gccugccggg accacaugga gggguaccac 1200

uaccgcuacg agaucaacgc ggacccccgg cugaccaacc uguccagcaa cuccgacguc 1260

uga 1263

<210> 415

<211> 1263

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt2 from

5T4__Homo_sapiens__AAH37161

<400> 415

augcccggcg gcugcucccg cggccccgcc gccggcgacg gccgccuccg ccucgcccgc 60

cucgcccucg uccuccucgg cugggucucc uccuccuccc ccaccuccuc cgccuccucc 120

uucuccuccu ccgcccccuu ccucgccucc gccgucuccg cccagccccc ccuccccgac 180

cagugccccg cccucugcga gugcuccgag gccgcccgca ccgucaagug cgucaaccgc 240

aaccucaccg agguccccac cgaccucccc gccuacgucc gcaaccucuu ccucaccggc 300

aaccagcucg ccguccuccc cgccggcgcc uucgcccgcc gccccccccu cgccgagcuc 360

gccgcccuca accucuccgg cucccgccuc gacgaggucc gcgccggcgc cuucgagcac 420

cuccccuccc uccgccagcu cgaccucucc cacaaccccc ucgccgaccu cucccccuuc 480

gccuucuccg gcuccaacgc cuccgucucc gcccccuccc cccucgucga gcucauccuc 540

aaccacaucg ucccccccga ggacgagcgc cagaaccgcu ccuucgaggg cauggucguc 600

gccgcccucc ucgccggccg cgcccuccag ggccuccgcc gccucgagcu cgccuccaac 660

cacuuccucu accucccccg cgacguccuc gcccagcucc ccucccuccg ccaccucgac 720

cucuccaaca acucccucgu cucccucacc uacgucuccu uccgcaaccu cacccaccuc 780

gagucccucc accucgagga caacgcccuc aagguccucc acaacggcac ccucgccgag 840

cuccagggcc ucccccacau ccgcgucuuc cucgacaaca accccugggu cugcgacugc 900

cacauggccg acauggucac cuggcucaag gagaccgagg ucguccaggg caaggaccgc 960

cucaccugcg ccuaccccga gaagaugcgc aaccgcgucc uccucgagcu caacuccgcc 1020

gaccucgacu gcgaccccau ccuccccccc ucccuccaga ccuccuacgu cuuccucggc 1080

aucguccucg cccucaucgg cgccaucuuc cuccucgucc ucuaccucaa ccgcaagggc 1140

aucaagaagu ggaugcacaa cauccgcgac gccugccgcg accacaugga gggcuaccac 1200

uaccgcuacg agaucaacgc cgacccccgc cucaccaacc ucuccuccaa cuccgacguc 1260

uga 1263

<210> 416

<211> 1263

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt3 from

5T4__Homo_sapiens__AAH37161

<400> 416

augcccggcg ggugcagcag aggaccugcc gcuggugacg gcaggcugcg gcucgcacgc 60

cuugcccugg uguuguuagg gugggucucc ucuucaaguc caaccagcuc cgcgucuucg 120

uucucaagca gugcuccguu ucuggccucc gcaguuucug cccagccccc ucuaccagau 180

caaugucccg cucucugcga guguagcgaa gcagcccgaa cagugaagug cguaaaccgu 240

aaucugacug aggugccuac ggaccuucca gcuuacguca gaaaccuguu cuugaccgga 300

aaucagcucg ccgugcugcc cgcgggcgca uuugccaggc ggccuccacu ggcugaacuc 360

gccgcauuaa accuguccgg uucacgccuu gaugagguua gagcuggggc cuucgaacac 420

uugccgaguc ugaggcagcu agaccucagc cauaaucccc uggcggaucu uucuccuuuu 480

gccuucuccg gaucaaacgc aagcgugagu gcuccaucuc cccuggucga guugauccuc 540

aaucacauug ugccuccaga ggacgaacgg cagaaccgcu ccuuugaggg caugguaguu 600

gccgcucugu uagccggccg agcacugcaa gggcucagaa ggcuugaacu ggccagcaau 660

cauuucuugu aucuaccccg ggaugugcug gcucagcucc cgucgcugcg ucaccuugac 720

cugucuaaca auuccuuggu cucacucaca uacgugaguu uucgcaaccu gacucauuua 780

gagagccugc accuagagga uaaugcgcuc aaagugcugc acaacggaac ccuugcagaa 840

uugcaggguc ugccucauau aagagucuuc cucgacaaua accccugggu uugugauugc 900

cacauggccg acauggugac auggcugaag gagaccgaag uagugcaggg caaagauagg 960

cuuacuugug cuuauccaga gaagaugcgg aaccgagucc uguuggaacu caauuccgcc 1020

gaccuggacu gcgauccuau cuuaccccca ucucugcaaa caagcuacgu guuucuaggg 1080

auuguucucg cacugaucgg agccauuuuc cuuuuggugc uguaucucaa ccgcaaaggc 1140

aucaagaagu ggaugcauaa uauaagagac gcuuguaggg aucacaugga ggguuaccac 1200

uaucgguacg agaucaacgc cgacccccgc cugaccaauu uaucaaguaa cuccgauguc 1260

uga 1263

<210> 417

<211> 1263

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt4 from

5T4__Homo_sapiens__AAH37161

<400> 417

augcccggcg gcugcagcag aggccccgcc gccggcgacg gcagacugag acuggccaga 60

cuggcccugg ugcugcuggg cugggugagc agcagcagcc ccaccagcag cgccagcagc 120

uucagcagca gcgcccccuu ccuggccagc gccgugagcg cccagccccc ccugcccgac 180

cagugccccg cccugugcga gugcagcgag gccgccagaa ccgugaagug cgugaacaga 240

aaccugaccg aggugcccac cgaccugccc gccuacguga gaaaccuguu ccugaccggc 300

aaccagcugg ccgugcugcc cgccggcgcc uucgccagaa gacccccccu ggccgagcug 360

gccgcccuga accugagcgg cagcagacug gacgagguga gagccggcgc cuucgagcac 420

cugcccagcc ugagacagcu ggaccugagc cacaaccccc uggccgaccu gagccccuuc 480

gccuucagcg gcagcaacgc cagcgugagc gcccccagcc cccuggugga gcugauccug 540

aaccacaucg ugccccccga ggacgagaga cagaacagaa gcuucgaggg caugguggug 600

gccgcccugc uggccggcag agcccugcag ggccugagaa gacuggagcu ggccagcaac 660

cacuuccugu accugcccag agacgugcug gcccagcugc ccagccugag acaccuggac 720

cugagcaaca acagccuggu gagccugacc uacgugagcu ucagaaaccu gacccaccug 780

gagagccugc accuggagga caacgcccug aaggugcugc acaacggcac ccuggccgag 840

cugcagggcc ugccccacau cagaguguuc cuggacaaca accccugggu gugcgacugc 900

cacauggccg acauggugac cuggcugaag gagaccgagg uggugcaggg caaggacaga 960

cugaccugcg ccuaccccga gaagaugaga aacagagugc ugcuggagcu gaacagcgcc 1020

gaccuggacu gcgaccccau ccugcccccc agccugcaga ccagcuacgu guuccugggc 1080

aucgugcugg cccugaucgg cgccaucuuc cugcuggugc uguaccugaa cagaaagggc 1140

aucaagaagu ggaugcacaa caucagagac gccugcagag accacaugga gggcuaccac 1200

uacagauacg agaucaacgc cgaccccaga cugaccaacc ugagcagcaa cagcgacgug 1260

uga 1263

<210> 418

<211> 1263

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt5 from

5T4__Homo_sapiens__AAH37161

<400> 418

augcccggcg ggugcagcag aggaccugcc gcuggcgacg ggcggcugcg ccucgccaga 60

cuggcgcuug ugcugcucgg augggucucc ucuagcuccc cgaccucuag cgcuuccucu 120

uucagcucca gcgcccccuu ucuggccucu gcuguuuccg cccagccucc ccuuccugau 180

caaugucccg cucugugcga guguagcgaa gccgcgcgga cagugaagug cgugaaccgc 240

aaucucacgg aggucccuac cgaccugccg gccuacguga gaaaccuguu ccucacaggc 300

aaucagcugg cuguucuucc cgccggggcu uuugcccggc gcccuccccu ggcggaacuc 360

gccgcucuga accuuucugg auccagacug gaugaggugc gggccggcgc uuucgaacac 420

cucccuagcc ugcgccagcu ggaccucucu cauaaucccc uggccgaucu uuccccguuu 480

gccuucagcg gcuccaacgc uucugucagc gcgccuagcc cccuggugga gcucauccug 540

aaucacauug uuccucccga ggacgaaaga cagaaccggu ccuuugaggg gauggugguc 600

gccgcccuuc uggcuggacg cgcccuccaa ggccugagac ggcuggaacu cgcuucuaau 660

cauuuccugu aucuuccccg cgaugugcug gcccagcucc cuucccugag acaccuugac 720

cugagcaaca auucucucgu gagccugacc uacgucuccu uucggaaccu gacacaucuc 780

gagucucugc accuugagga uaaugcgcug aaaguucucc acaacgggac ccuggcugaa 840

cugcagggac uuccgcauau cagaguguuc cucgacaaua accccugggu gugugauugc 900

cacauggccg acauggucac auggcugaag gagaccgaag ugguucaggg caaagaucgc 960

cugacgugug ccuauccuga gaagaugcgg aacagagugc uccuggaacu uaauagcgcu 1020

gaccuggacu gcgaucccau ucucccuccc ucccugcaaa ccagcuacgu cuuucugggg 1080

aucgugcuug cccucauugg agcuaucuuc cugcugguuc ucuaucugaa ccgcaaaggc 1140

aucaagaagu ggaugcauaa uauucgggac gccuguagag aucacaugga gggcuaccac 1200

uaucgcuacg agaucaacgc ggacccgcgg cuuacaaauc ugucuuccaa cagcgaugug 1260

uga 1263

<210> 419

<211> 543

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACRBP__Homo_sapiens__Q8NEB7

<400> 419

Met Arg Lys Pro Ala Ala Gly Phe Leu Pro Ser Leu Leu Lys Val Leu

1 5 10 15

Leu Leu Pro Leu Ala Pro Ala Ala Ala Gln Asp Ser Thr Gln Ala Ser

20 25 30

Thr Pro Gly Ser Pro Leu Ser Pro Thr Glu Tyr Glu Arg Phe Phe Ala

35 40 45

Leu Leu Thr Pro Thr Trp Lys Ala Glu Thr Thr Cys Arg Leu Arg Ala

50 55 60

Thr His Gly Cys Arg Asn Pro Thr Leu Val Gln Leu Asp Gln Tyr Glu

65 70 75 80

Asn His Gly Leu Val Pro Asp Gly Ala Val Cys Ser Asn Leu Pro Tyr

85 90 95

Ala Ser Trp Phe Glu Ser Phe Cys Gln Phe Thr His Tyr Arg Cys Ser

100 105 110

Asn His Val Tyr Tyr Ala Lys Arg Val Leu Cys Ser Gln Pro Val Ser

115 120 125

Ile Leu Ser Pro Asn Thr Leu Lys Glu Ile Glu Ala Ser Ala Glu Val

130 135 140

Ser Pro Thr Thr Met Thr Ser Pro Ile Ser Pro His Phe Thr Val Thr

145 150 155 160

Glu Arg Gln Thr Phe Gln Pro Trp Pro Glu Arg Leu Ser Asn Asn Val

165 170 175

Glu Glu Leu Leu Gln Ser Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gln Glu Gln Ala

180 185 190

Pro Glu His Lys Gln Glu Gln Gly Val Glu His Arg Gln Glu Pro Thr

195 200 205

Gln Glu His Lys Gln Glu Glu Gly Gln Lys Gln Glu Glu Gln Glu Glu

210 215 220

Glu Gln Glu Glu Glu Gly Lys Gln Glu Glu Gly Gln Gly Thr Lys Glu

225 230 235 240

Gly Arg Glu Ala Val Ser Gln Leu Gln Thr Asp Ser Glu Pro Lys Phe

245 250 255

His Ser Glu Ser Leu Ser Ser Asn Pro Ser Ser Phe Ala Pro Arg Val

260 265 270

Arg Glu Val Glu Ser Thr Pro Met Ile Met Glu Asn Ile Gln Glu Leu

275 280 285

Ile Arg Ser Ala Gln Glu Ile Asp Glu Met Asn Glu Ile Tyr Asp Glu

290 295 300

Asn Ser Tyr Trp Arg Asn Gln Asn Pro Gly Ser Leu Leu Gln Leu Pro

305 310 315 320

His Thr Glu Ala Leu Leu Val Leu Cys Tyr Ser Ile Val Glu Asn Thr

325 330 335

Cys Ile Ile Thr Pro Thr Ala Lys Ala Trp Lys Tyr Met Glu Glu Glu

340 345 350

Ile Leu Gly Phe Gly Lys Ser Val Cys Asp Ser Leu Gly Arg Arg His

355 360 365

Met Ser Thr Cys Ala Leu Cys Asp Phe Cys Ser Leu Lys Leu Glu Gln

370 375 380

Cys His Ser Glu Ala Ser Leu Gln Arg Gln Gln Cys Asp Thr Ser His

385 390 395 400

Lys Thr Pro Phe Val Ser Pro Leu Leu Ala Ser Gln Ser Leu Ser Ile

405 410 415

Gly Asn Gln Val Gly Ser Pro Glu Ser Gly Arg Phe Tyr Gly Leu Asp

420 425 430

Leu Tyr Gly Gly Leu His Met Asp Phe Trp Cys Ala Arg Leu Ala Thr

435 440 445

Lys Gly Cys Glu Asp Val Arg Val Ser Gly Trp Leu Gln Thr Glu Phe

450 455 460

Leu Ser Phe Gln Asp Gly Asp Phe Pro Thr Lys Ile Cys Asp Thr Asp

465 470 475 480

Tyr Ile Gln Tyr Pro Asn Tyr Cys Ser Phe Lys Ser Gln Gln Cys Leu

485 490 495

Met Arg Asn Arg Asn Arg Lys Val Ser Arg Met Arg Cys Leu Gln Asn

500 505 510

Glu Thr Tyr Ser Ala Leu Ser Pro Gly Lys Ser Glu Asp Val Val Leu

515 520 525

Arg Trp Ser Gln Glu Phe Ser Thr Leu Thr Leu Gly Gln Phe Gly

530 535 540

<210> 420

<211> 1632

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ACRBP__Homo_sapiens__AAH33010

<400> 420

augaggaagc cagccgcugg cuuccuuccc ucacuccuga aggugcugcu ccugccucug 60

gcaccugccg cagcccagga uucgacucag gccuccacuc caggcagccc ucucucuccu 120

accgaauacg aacgcuucuu cgcacugcug acuccaaccu ggaaggcaga gacuaccugc 180

cgucuccgug caacccacgg cugccggaau cccacacucg uccagcugga ccaauaugaa 240

aaccacggcu uagugcccga uggugcuguc ugcuccaacc ucccuuaugc cuccugguuu 300

gagucuuucu gccaguucac ucacuaccgu ugcuccaacc acgucuacua ugccaagaga 360

guccuguguu cccagccagu cucuauucuc ucaccuaaca cucucaagga gauagaagcu 420

ucagcugaag ucucacccac cacgaugacc ucccccaucu caccccacuu cacagugaca 480

gaacgccaga ccuuccagcc cuggccugag aggcucagca acaacgugga agagcuccua 540

caauccuccu ugucccuggg aggccaggag caagcgccag agcacaagca ggagcaagga 600

guggagcaca ggcaggagcc gacacaagaa cacaagcagg aagaggggca gaaacaggaa 660

gagcaagaag aggaacagga agaggaggga aagcaggaag aaggacaggg gacuaaggag 720

ggacgggagg cugugucuca gcugcagaca gacucagagc ccaaguuuca cucugaaucu 780

cuaucuucua acccuuccuc uuuugcuccc cggguacgag aaguagaguc uacuccuaug 840

auaauggaga acauccagga gcucauucga ucagcccagg aaauagauga aaugaaugaa 900

auauaugaug agaacuccua cuggagaaac caaaacccug gcagccuccu gcagcugccc 960

cacacagagg ccuugcuggu gcugugcuau ucgaucgugg agaauaccug caucauaacc 1020

cccacagcca aggccuggaa guacauggag gaggagaucc uugguuucgg gaagucgguc 1080

ugugacagcc uugggcggcg acacaugucu accugugccc ucugugacuu cugcuccuug 1140

aagcuggagc agugccacuc agaggccagc cugcagcggc aacaaugcga caccucccac 1200

aagacucccu uugucagccc cuugcuugcc ucccagagcc uguccaucgg caaccaggua 1260

ggguccccag aaucaggccg cuuuuacggg cuggauuugu acggugggcu ccacauggac 1320

uucuggugug cccggcuugc cacgaaaggc ugugaagaug uccgagucuc uggguggcuc 1380

cagacugagu uccuuagcuu ccaggauggg gauuucccua ccaagauuug ugacacagac 1440

uauauccagu acccaaacua cuguuccuuc aaaagccagc agugucugau gagaaaccgc 1500

aaucggaagg ugucccgcau gagaugucug cagaaugaga cuuacagugc gcugagcccu 1560

ggcaaaagug aggacguugu gcuucgaugg agccaggagu ucagcaccuu gacucuaggc 1620

caguucggau ga 1632

<210> 421

<211> 1632

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt1 from

ACRBP__Homo_sapiens__AAH33010

<400> 421

augcgcaagc ccgccgccgg cuuccugccg agccuccuga aggugcugcu ccugccccug 60

gcgcccgccg ccgcccagga cuccacccag gccagcaccc ccgggucccc gcucagcccc 120

acggaguacg agcgguucuu cgcgcugcug acccccaccu ggaaggccga gaccacgugc 180

cgccuccggg ccacccacgg cugccgcaac cccacccugg uccagcugga ccaguacgag 240

aaccacgggc ucgugccgga cggcgccgug ugcuccaacc ugcccuacgc gagcugguuc 300

gaguccuucu gccaguucac ccacuaccgg ugcagcaacc acgucuacua cgccaagcgc 360

gugcugugcu cccagcccgu gagcauccuc ucccccaaca cgcugaagga gaucgaggcc 420

agcgccgagg ucuccccgac caccaugacc agccccauca gcccccacuu cacggugacc 480

gagcggcaga ccuuccagcc cuggccggag cgccugagca acaacgugga ggagcuccug 540

caguccagcc ugucccucgg gggccaggag caggcccccg agcacaagca ggagcagggc 600

gucgagcacc ggcaggagcc cacccaggag cacaagcagg aggaggggca gaagcaggag 660

gagcaggagg aggagcagga ggaggagggc aagcaggagg aggggcaggg cacgaaggag 720

gggcgcgagg cggugagcca gcugcagacc gacagcgagc ccaaguucca cuccgagagc 780

cuguccagca acccguccag cuucgcgccc cgggugcgcg aggucgaguc cacccccaug 840

aucauggaga acauccagga gcucauccgg agcgcccagg agaucgacga gaugaacgag 900

aucuacgacg agaacuccua cuggcgcaac cagaaccccg gcagccugcu gcagcucccg 960

cacaccgagg cccugcuggu gcucugcuac uccaucgugg agaacacgug caucaucacc 1020

cccaccgcca aggccuggaa guacauggag gaggagaucc ugggcuucgg gaaguccguc 1080

ugcgacuccc ugggccggcg ccacaugagc acgugcgccc ucugcgacuu cugcucccug 1140

aagcuggagc agugccacag cgaggccucc cuccagcggc agcagugcga caccagccac 1200

aagacccccu ucgugagccc ccugcuggcc ucccagagcc ucuccaucgg gaaccaggug 1260

ggcagcccgg aguccggccg cuucuacggg cuggaccugu acggcgggcu ccacauggac 1320

uucuggugcg cccggcuggc gaccaagggc ugcgaggacg uccgcgugag cggguggcug 1380

cagaccgagu uccucuccuu ccaggacggc gacuucccca cgaagaucug cgacaccgac 1440

uacauccagu accccaacua cugcagcuuc aagucccagc agugccugau gcggaaccgc 1500

aaccgcaagg ugagccggau gcgcugccug cagaacgaga ccuacuccgc ccucagcccg 1560

ggcaaguccg aggacgucgu gcugcggugg agccaggagu ucuccacccu gacgcugggg 1620

caguucggcu ga 1632

<210> 422

<211> 1632

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt2 from

ACRBP__Homo_sapiens__AAH33010

<400> 422

augcgcaagc ccgccgccgg cuuccucccc ucccuccuca agguccuccu ccucccccuc 60

gcccccgccg ccgcccagga cuccacccag gccuccaccc ccggcucccc ccucuccccc 120

accgaguacg agcgcuucuu cgcccuccuc acccccaccu ggaaggccga gaccaccugc 180

cgccuccgcg ccacccacgg cugccgcaac cccacccucg uccagcucga ccaguacgag 240

aaccacggcc ucguccccga cggcgccguc ugcuccaacc uccccuacgc cuccugguuc 300

gaguccuucu gccaguucac ccacuaccgc ugcuccaacc acgucuacua cgccaagcgc 360

guccucugcu cccagcccgu cuccauccuc ucccccaaca cccucaagga gaucgaggcc 420

uccgccgagg ucucccccac caccaugacc ucccccaucu ccccccacuu caccgucacc 480

gagcgccaga ccuuccagcc cuggcccgag cgccucucca acaacgucga ggagcuccuc 540

caguccuccc ucucccucgg cggccaggag caggcccccg agcacaagca ggagcagggc 600

gucgagcacc gccaggagcc cacccaggag cacaagcagg aggagggcca gaagcaggag 660

gagcaggagg aggagcagga ggaggagggc aagcaggagg agggccaggg caccaaggag 720

ggccgcgagg ccgucuccca gcuccagacc gacuccgagc ccaaguucca cuccgagucc 780

cucuccucca accccuccuc cuucgccccc cgcguccgcg aggucgaguc cacccccaug 840

aucauggaga acauccagga gcucauccgc uccgcccagg agaucgacga gaugaacgag 900

aucuacgacg agaacuccua cuggcgcaac cagaaccccg gcucccuccu ccagcucccc 960

cacaccgagg cccuccucgu ccucugcuac uccaucgucg agaacaccug caucaucacc 1020

cccaccgcca aggccuggaa guacauggag gaggagaucc ucggcuucgg caaguccguc 1080

ugcgacuccc ucggccgccg ccacaugucc accugcgccc ucugcgacuu cugcucccuc 1140

aagcucgagc agugccacuc cgaggccucc cuccagcgcc agcagugcga caccucccac 1200

aagacccccu ucgucucccc ccuccucgcc ucccaguccc ucuccaucgg caaccagguc 1260

ggcucccccg aguccggccg cuucuacggc cucgaccucu acggcggccu ccacauggac 1320

uucuggugcg cccgccucgc caccaagggc ugcgaggacg uccgcgucuc cggcuggcuc 1380

cagaccgagu uccucuccuu ccaggacggc gacuucccca ccaagaucug cgacaccgac 1440

uacauccagu accccaacua cugcuccuuc aagucccagc agugccucau gcgcaaccgc 1500

aaccgcaagg ucucccgcau gcgcugccuc cagaacgaga ccuacuccgc ccucuccccc 1560

ggcaaguccg aggacgucgu ccuccgcugg ucccaggagu ucuccacccu cacccucggc 1620

caguucggcu ga 1632

<210> 423

<211> 1632

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt3 from

ACRBP__Homo_sapiens__AAH33010

<400> 423

augagaaagc ccgccgcugg cuuccugccu agccuccuua aagugcuguu guuaccacug 60

gcaccggccg cggcucagga cuccacccaa gccucuacac ccgggucacc ucuaagucca 120

acugaguacg aaagguuuuu cgcacuccug acgcccaccu ggaaggccga gacaacuugc 180

cggcuucgcg cuacccacgg augucgaaac ccuacacugg uccaguugga ucaguaugaa 240

aaucaugguc ucguuccaga cggcgcagug ugcagcaacc ugcccuacgc cuccugguuu 300

gagucuuucu gucaguuuac ccacuaucgu ugcucgaauc auguauacua ugcuaaaaga 360

gugcuguguu cacaaccugu cagcauccuc aguccaaaca cuuuaaagga aauugaggcc 420

uccgcggagg ugucuccgac aaccaugacg agccccauau ccccucacuu cacuguuacc 480

gaaaggcaga cauuucagcc auggcccgag cggcugucaa auaacgugga agaacuuuug 540

cagaguagcc ugucucuagg gggacaagag caggcaccug aacauaaaca ggagcagggc 600

gucgaacacc gccaagagcc aacucaggaa cacaagcagg aggaggguca aaagcaggag 660

gagcaggaag aggaacagga ggaggaaggg aaacaagagg aaggacaggg caccaaggag 720

ggcagagaag ccguguccca gcuccagaca gauucagagc ccaaauucca uagcgagagu 780

cugucuucca auccgagcuc guuugcuccu aggguacggg aaguugaguc uacccccaug 840

aucauggaaa acauucaaga gcuuauccgc uccgcccagg agauugacga aaugaaugag 900

aucuacgaug aaaacucaua uuggcgaaau cagaacccag ggagucuguu gcagcucccu 960

cacacggagg cacuguuagu gcugugcuac agcauagucg aaaauacuug uaucauuaca 1020

cccaccgcua aggccuggaa auacauggag gaggaaaucc ucggauucgg uaaguccgug 1080

ugcgacucuc uuggcagaag gcauaugagc acuugugcgc ugugcgauuu uuguucauug 1140

aagcuagagc aaugccacag ugaagccucc cugcagcggc agcagugcga cacaagccac 1200

aaaaccccau ucgugucucc ccuccuggca ucacaaaguc uuagcauugg gaaccagguc 1260

ggauccccug agucuggccg uuuuuauggu cuggauuugu acgggggacu ccauauggac 1320

uucuggugug cucgccuggc cacgaagggc ugcgaagaug uuagaguguc gggcugguua 1380

cagaccgagu uccugagcuu ucaagacggg gauuucccaa caaaaaucug ugacacugac 1440

uauauacagu acccgaauua uugcuccuuu aagucacagc agugucuaau gaggaaccgg 1500

aaccgaaaag uaagucgcau gagaugccuc caaaaugaga ccuacucugc ucugagcccc 1560

ggaaaguccg aagauguggu ccuuaggugg ucacaggagu ucagcacauu gacucugggu 1620

caguuuggcu ga 1632

<210> 424

<211> 1632

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt4 from

ACRBP__Homo_sapiens__AAH33010

<400> 424

augagaaagc ccgccgccgg cuuccugccc agccugcuga aggugcugcu gcugccccug 60

gcccccgccg ccgcccagga cagcacccag gccagcaccc ccggcagccc ccugagcccc 120

accgaguacg agagauucuu cgcccugcug acccccaccu ggaaggccga gaccaccugc 180

agacugagag ccacccacgg cugcagaaac cccacccugg ugcagcugga ccaguacgag 240

aaccacggcc uggugcccga cggcgccgug ugcagcaacc ugcccuacgc cagcugguuc 300

gagagcuucu gccaguucac ccacuacaga ugcagcaacc acguguacua cgccaagaga 360

gugcugugca gccagcccgu gagcauccug agccccaaca cccugaagga gaucgaggcc 420

agcgccgagg ugagccccac caccaugacc agccccauca gcccccacuu caccgugacc 480

gagagacaga ccuuccagcc cuggcccgag agacugagca acaacgugga ggagcugcug 540

cagagcagcc ugagccuggg cggccaggag caggcccccg agcacaagca ggagcagggc 600

guggagcaca gacaggagcc cacccaggag cacaagcagg aggagggcca gaagcaggag 660

gagcaggagg aggagcagga ggaggagggc aagcaggagg agggccaggg caccaaggag 720

ggcagagagg ccgugagcca gcugcagacc gacagcgagc ccaaguucca cagcgagagc 780

cugagcagca accccagcag cuucgccccc agagugagag agguggagag cacccccaug 840

aucauggaga acauccagga gcugaucaga agcgcccagg agaucgacga gaugaacgag 900

aucuacgacg agaacagcua cuggagaaac cagaaccccg gcagccugcu gcagcugccc 960

cacaccgagg cccugcuggu gcugugcuac agcaucgugg agaacaccug caucaucacc 1020

cccaccgcca aggccuggaa guacauggag gaggagaucc ugggcuucgg caagagcgug 1080

ugcgacagcc ugggcagaag acacaugagc accugcgccc ugugcgacuu cugcagccug 1140

aagcuggagc agugccacag cgaggccagc cugcagagac agcagugcga caccagccac 1200

aagacccccu ucgugagccc ccugcuggcc agccagagcc ugagcaucgg caaccaggug 1260

ggcagccccg agagcggcag auucuacggc cuggaccugu acggcggccu gcacauggac 1320

uucuggugcg ccagacuggc caccaagggc ugcgaggacg ugagagugag cggcuggcug 1380

cagaccgagu uccugagcuu ccaggacggc gacuucccca ccaagaucug cgacaccgac 1440

uacauccagu accccaacua cugcagcuuc aagagccagc agugccugau gagaaacaga 1500

aacagaaagg ugagcagaau gagaugccug cagaacgaga ccuacagcgc ccugagcccc 1560

ggcaagagcg aggacguggu gcugagaugg agccaggagu ucagcacccu gacccugggc 1620

caguucggcu ga 1632

<210> 425

<211> 1632

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt5 from

ACRBP__Homo_sapiens__AAH33010

<400> 425

augagaaagc ccgccgcugg cuuccugccu agccuccuga aagugcuucu gcucccgcug 60

gcccccgcgg cugcccagga cuccacccaa gccucuacac cugggagccc ccuuuccccu 120

acggaguacg aacgguuuuu cgcucugcuc acccccacau ggaaggccga gaccacaugc 180

cgccugagag cuacccacgg augucggaac ccuacacugg uccagcucga ucaguaugaa 240

aaucauggcc ugguuccgga cggggccgug ugcucuaacc uucccuacgc gagcugguuu 300

gaguccuucu gucaguuuac ccacuaucgc ugcucuaauc auguguacua ugccaaaaga 360

guccugugua gccaaccugu guccauccuc agccccaaca cgcugaagga aauugaggcu 420

ucugccgagg uuuccccuac cacaaugacc agccccaucu cuccgcacuu cacagugacc 480

gaacggcaga cguuucagcc uuggcccgag cgccuuucca auaacgucga agaacugcuc 540

cagagcucuc ugucccuggg aggccaagag caggcuccug aacauaaaca ggagcagggg 600

guggaacaca gacaagagcc cacacaggaa cacaagcagg aggagggaca aaagcaggag 660

gagcaggaag aggaacagga ggaggaaggc aaacaagagg aaggccaggg gaccaaggag 720

ggacgggaag ccguuagcca gcuccagaca gauuccgagc ccaaauucca uucugagagc 780

cuguccagca auccuucuuc cuuugcgccg cgcgugagag aagucgagag cacccccaug 840

auuauggaaa acauccaaga gcuuauucgg ucugcccagg agaucgacga aaugaaugag 900

aucuacgaug aaaacagcua uuggcgcaau cagaacccug gcucccugcu ccagcugccc 960

cacaccgagg cccuucuggu gcucugcuac ucuauugugg aaaauacaug uaucauuacg 1020

ccuaccgcua aggcuuggaa auacauggag gaggaaaucc ugggguucgg aaagagcguc 1080

ugcgacuccc ugggcagacg gcauaugagc acaugugccc ucugcgauuu uuguucucug 1140

aaacuugagc aaugccacuc cgaagccagc cugcagcgcc agcagugcga caccucucac 1200

aagacacccu ucguuucccc gcuccuggcu agccaauccc uuucuauugg gaaccaggug 1260

ggaagcccug aguccggcag auuuuauggc cuggaucucu acgggggacu gcauauggac 1320

uucuggugug cgcggcuggc caccaagggc ugcgaagaug ugagagucuc uggguggcuc 1380

cagacggagu uccugagcuu ucaagacgga gauuucccca caaaaaucug ugacaccgac 1440

uauauucagu acccuaauua uugcuccuuu aagagccagc agugucuuau gcgcaaccgg 1500

aacagaaaag ugucucgcau gcggugccug caaaaugaga ccuacuccgc ucucagcccc 1560

ggcaagucug aagauguugu gcugagaugg ucccaggagu ucagcacacu gacccuuggg 1620

caguuuggau ga 1632

<210> 426

<211> 609

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AFP__Homo_sapiens__P02771

<400> 426

Met Lys Trp Val Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr

1 5 10 15

Glu Ser Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu

20 25 30

Asp Ser Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr

35 40 45

Ile Phe Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser

50 55 60

Lys Met Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp

65 70 75 80

Glu Gln Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu

85 90 95

Glu Leu Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp

100 105 110

Cys Cys Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His

115 120 125

Lys Lys Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro

130 135 140

Val Thr Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn

145 150 155 160

Lys Phe Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro

165 170 175

Thr Ile Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys

180 185 190

Cys Lys Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr

195 200 205

Val Thr Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys

210 215 220

Ala Val Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val

225 230 235 240

Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln

245 250 255

Lys Leu Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly

260 265 270

Asp Val Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile

275 280 285

Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys

290 295 300

Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp

305 310 315 320

Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp

325 330 335

Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala

340 345 350

Ser Phe Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser

355 360 365

Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys

370 375 380

Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu

385 390 395 400

Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys

405 410 415

Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu

420 425 430

Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met

435 440 445

Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu

450 455 460

Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile

465 470 475 480

Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly

485 490 495

Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe

500 505 510

Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp

515 520 525

Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala

530 535 540

Leu Gln Thr Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys

545 550 555 560

Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser

565 570 575

Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe

580 585 590

Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly

595 600 605

Val

<210> 427

<211> 1830

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AFP__Homo_sapiens__AAB58754

<400> 427

augaaguggg uggaaucaau uuuuuuaauu uuccuacuaa auuuuacuga auccagaaca 60

cugcauagaa augaauaugg aauagcuucc auauuggauu cuuaccaaug uacugcagag 120

auaaguuuag cugaccuggc uaccauauuu uuugcccagu uuguucaaga agccacuuac 180

aaggaaguaa gcaaaauggu gaaagaugca uugacugcaa uugagaaacc cacuggagau 240

gaacagucuu caggguguuu agaaaaccag cuaccugccu uucuggaaga acuuugccau 300

gagaaagaaa uuuuggagaa guacggacau ucagacugcu gcagccaaag ugaagaggga 360

agacauaacu guuuucuugc acacaaaaag cccacuccag caucgauccc acuuuuccaa 420

guuccagaac cugucacaag cugugaagca uaugaagaag acagggagac auucaugaac 480

aaauucauuu augagauagc aagaaggcau cccuuccugu augcaccuac aauucuucuu 540

ugggcugcuc gcuaugacaa aauaauucca ucuugcugca aagcugaaaa ugcaguugaa 600

ugcuuccaaa caaaggcagc aacaguuaca aaagaauuaa gagaaagcag cuuguuaaau 660

caacaugcau gugcaguaau gaaaaauuuu gggacccgaa cuuuccaagc cauaacuguu 720

acuaaacuga gucagaaguu uaccaaaguu aauuuuacug aaauccagaa acuaguccug 780

gauguggccc auguacauga gcacuguugc agaggagaug ugcuggauug ucugcaggau 840

ggggaaaaaa ucauguccua cauauguucu caacaagaca cucugucaaa caaaauaaca 900

gaaugcugca aacugaccac gcuggaacgu ggucaaugua uaauucaugc agaaaaugau 960

gaaaaaccug aaggucuauc uccaaaucua aacagguuuu uaggagauag agauuuuaac 1020

caauuuucuu caggggaaaa aaauaucuuc uuggcaaguu uuguucauga auauucaaga 1080

agacauccuc agcuugcugu cucaguaauu cuaagaguug cuaaaggaua ccaggaguua 1140

uuggagaagu guuuccagac ugaaaacccu cuugaaugcc aagauaaagg agaagaagaa 1200

uuacagaaau acauccagga gagccaagca uuggcaaagc gaagcugcgg ccucuuccag 1260

aaacuaggag aauauuacuu acaaaaugcg uuucucguug cuuacacaaa gaaagccccc 1320

cagcugaccu cgucggagcu gauggccauc accagaaaaa uggcagccac agcagccacu 1380

uguugccaac ucagugagga caaacuauug gccuguggcg agggagcggc ugacauuauu 1440

aucggacacu uauguaucag acaugaaaug acuccaguaa acccuggugu uggccagugc 1500

ugcacuucuu cauaugccaa caggaggcca ugcuucagca gcuugguggu ggaugaaaca 1560

uaugucccuc cugcauucuc ugaugacaag uucauuuucc auaaggaucu gugccaagcu 1620

caggguguag cgcugcaaac gaugaagcaa gaguuucuca uuaaccuugu gaagcaaaag 1680

ccacaaauaa cagaggaaca acuugaggcu gucauugcag auuucucagg ccuguuggag 1740

aaaugcugcc aaggccagga acaggaaguc ugcuuugcug aagagggaca aaaacugauu 1800

ucaaaaacuc gugcugcuuu gggaguuuaa 1830

<210> 428

<211> 1830

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt1 from

AFP__Homo_sapiens__AAB58754

<400> 428

augaaguggg uggagagcau cuuccugauc uuccuccuga acuucaccga gucccgcacc 60

cugcaccgga acgaguacgg caucgccagc auccucgacu ccuaccagug cacggccgag 120

aucagccugg cggaccuggc caccaucuuc uucgcccagu ucguccagga ggccaccuac 180

aaggaggugu ccaagauggu gaaggacgcc cucaccgcga ucgagaagcc cacgggggac 240

gagcagagcu ccggcugccu ggagaaccag cugcccgccu uccucgagga gcugugccac 300

gagaaggaga uccuggagaa guacgggcac agcgacugcu gcucccagag cgaggagggc 360

cgccacaacu gcuuccucgc ccacaagaag cccacccccg ccuccauccc ccuguuccag 420

gucccggagc ccgugaccag cugcgaggcg uacgaggagg accgggagac cuucaugaac 480

aaguucaucu acgagaucgc ccgccggcac cccuuccugu acgcccccac gauccuccug 540

ugggccgccc gcuacgacaa gaucaucccg uccugcugca aggcggagaa cgccguggag 600

ugcuuccaga ccaaggccgc caccgucacc aaggagcugc gggagagcuc ccuccugaac 660

cagcacgccu gcgcggugau gaagaacuuc gggacgcgca ccuuccaggc caucaccgug 720

accaagcuga gccagaaguu cacgaagguc aacuucaccg agauccagaa gcucgugcug 780

gacguggccc acguccacga gcacugcugc cggggcgacg ugcuggacug ccuccaggac 840

ggcgagaaga ucauguccua caucugcagc cagcaggaca cccuguccaa caagaucacc 900

gagugcugca agcugacgac ccucgagcgc gggcagugca ucauccacgc cgagaacgac 960

gagaagcccg agggccugag ccccaaccug aaccgguucc ucggggaccg cgacuucaac 1020

caguucagcu ccggcgagaa gaacaucuuc cuggccagcu ucgugcacga guacucccgg 1080

cgccaccccc agcuggcggu cagcgugauc cuccgggugg ccaaggggua ccaggagcug 1140

cuggagaagu gcuuccagac cgagaacccg cucgagugcc aggacaaggg cgaggaggag 1200

cugcagaagu acauccagga gucccaggcc cuggccaagc gcagcugcgg ccucuuccag 1260

aagcuggggg aguacuaccu gcagaacgcc uuccucgucg cguacaccaa gaaggcgccc 1320

cagcugacgu ccagcgagcu gauggccauc acccggaaga uggccgccac cgccgcgacc 1380

ugcugccagc ucuccgagga caagcugcug gccugcggcg agggggccgc cgacaucauc 1440

aucggccacc ucugcauccg ccacgagaug acgcccguga accccggcgu ggggcagugc 1500

ugcaccagcu ccuacgccaa ccggcgcccg ugcuucagcu cccuggucgu ggacgagacc 1560

uacgugccgc ccgccuucag cgacgacaag uucaucuucc acaaggaccu gugccaggcc 1620

cagggcgucg cccugcagac caugaagcag gaguuccuca ucaaccuggu gaagcagaag 1680

ccccagauca cggaggagca gcuggaggcg gucaucgccg acuucuccgg gcuccuggag 1740

aagugcugcc agggccagga gcaggaggug ugcuucgccg aggaggggca gaagcugauc 1800

agcaagaccc gggccgcccu cggcguguga 1830

<210> 429

<211> 1830

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt2 from

AFP__Homo_sapiens__AAB58754

<400> 429

augaaguggg ucgaguccau cuuccucauc uuccuccuca acuucaccga gucccgcacc 60

cuccaccgca acgaguacgg caucgccucc auccucgacu ccuaccagug caccgccgag 120

aucucccucg ccgaccucgc caccaucuuc uucgcccagu ucguccagga ggccaccuac 180

aaggaggucu ccaagauggu caaggacgcc cucaccgcca ucgagaagcc caccggcgac 240

gagcaguccu ccggcugccu cgagaaccag cuccccgccu uccucgagga gcucugccac 300

gagaaggaga uccucgagaa guacggccac uccgacugcu gcucccaguc cgaggagggc 360

cgccacaacu gcuuccucgc ccacaagaag cccacccccg ccuccauccc ccucuuccag 420

guccccgagc ccgucaccuc cugcgaggcc uacgaggagg accgcgagac cuucaugaac 480

aaguucaucu acgagaucgc ccgccgccac cccuuccucu acgcccccac cauccuccuc 540

ugggccgccc gcuacgacaa gaucaucccc uccugcugca aggccgagaa cgccgucgag 600

ugcuuccaga ccaaggccgc caccgucacc aaggagcucc gcgaguccuc ccuccucaac 660

cagcacgccu gcgccgucau gaagaacuuc ggcacccgca ccuuccaggc caucaccguc 720

accaagcucu cccagaaguu caccaagguc aacuucaccg agauccagaa gcucguccuc 780

gacgucgccc acguccacga gcacugcugc cgcggcgacg uccucgacug ccuccaggac 840

ggcgagaaga ucauguccua caucugcucc cagcaggaca cccucuccaa caagaucacc 900

gagugcugca agcucaccac ccucgagcgc ggccagugca ucauccacgc cgagaacgac 960

gagaagcccg agggccucuc ccccaaccuc aaccgcuucc ucggcgaccg cgacuucaac 1020

caguucuccu ccggcgagaa gaacaucuuc cucgccuccu ucguccacga guacucccgc 1080

cgccaccccc agcucgccgu cuccgucauc cuccgcgucg ccaagggcua ccaggagcuc 1140

cucgagaagu gcuuccagac cgagaacccc cucgagugcc aggacaaggg cgaggaggag 1200

cuccagaagu acauccagga gucccaggcc cucgccaagc gcuccugcgg ccucuuccag 1260

aagcucggcg aguacuaccu ccagaacgcc uuccucgucg ccuacaccaa gaaggccccc 1320

cagcucaccu ccuccgagcu cauggccauc acccgcaaga uggccgccac cgccgccacc 1380

ugcugccagc ucuccgagga caagcuccuc gccugcggcg agggcgccgc cgacaucauc 1440

aucggccacc ucugcauccg ccacgagaug acccccguca accccggcgu cggccagugc 1500

ugcaccuccu ccuacgccaa ccgccgcccc ugcuucuccu cccucgucgu cgacgagacc 1560

uacguccccc ccgccuucuc cgacgacaag uucaucuucc acaaggaccu cugccaggcc 1620

cagggcgucg cccuccagac caugaagcag gaguuccuca ucaaccucgu caagcagaag 1680

ccccagauca ccgaggagca gcucgaggcc gucaucgccg acuucuccgg ccuccucgag 1740

aagugcugcc agggccagga gcaggagguc ugcuucgccg aggagggcca gaagcucauc 1800

uccaagaccc gcgccgcccu cggcgucuga 1830

<210> 430

<211> 1830

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt3 from

AFP__Homo_sapiens__AAB58754

<400> 430

augaaguggg uggagagcau cuuccugauu uuucuccuua acuucaccga auccagaaca 60

cugcacagga augaguacgg cauagccucu aucuuggacu cauaucagug cacugcugaa 120

auuaguuuag cagaucuggc cacgaucuuu uucgcgcaau uuguccagga ggcuaccuac 180

aaagaaguua gcaagauggu gaaagacgcc cuaacagcaa uugagaagcc cacuggggau 240

gagcaguccu cuggaugucu cgaaaaccag cugccugccu uccuugagga acugugccau 300

gagaaagaga ucuuggaaaa guauggucac ucggacuguu gcucacaaag cgaggaaggc 360

cggcauaauu guuuucucgc ucacaagaaa ccaaccccgg caaguauacc ccuguuccag 420

guaccugagc cagugacauc cugcgaagcc uacgaggagg aucgcgaaac cuuuaugaac 480

aaguucaucu augagauugc ucgacgucau cccuuucugu acgccccuac uauccucuua 540

ugggcggcaa gauaugacaa aauuauccca ucuuguugca aggccgaaaa ugcugucgag 600

uguuuccaga caaaagccgc aaccgugacg aaggaacuga gggagagcuc ccuuuugaac 660

cagcacgcuu gcgccguuau gaagaauuuu gggacucgga ccuuccaagc gauaacagug 720

acuaaacugu cacagaaguu caccaaaguc aacuuuacag agauucagaa gcuagugcuc 780

gauguagccc acguucauga acacuguugc cgcggagacg ugcuggauug ccuucaggac 840

ggcgagaaaa ucaugaguua cauuuguagc caacaggaua cccugucuaa uaagaucacg 900

gaaugcugua aauugacuac acucgagaga ggucagugca ucauucaugc agaaaacgac 960

gagaagcccg aggggcuguc cccuaauuua aacagguucc ugggagaucg ggacuuuaau 1020

caauucucaa gcggcgaaaa gaacauauuu cucgcuaguu ucguccacga guacucucgc 1080

cgacacccac agcuugccgu guccgugauc cugagagucg cuaaaggcua ucaggaauug 1140

cuagagaagu guuuucagac cgagaauccg cuggaaugcc aagacaaagg ggaggaagaa 1200

cuccagaagu acauucagga aagccaggcc cuggcaaaaa ggucgugugg acuuuuccaa 1260

aagcugggug aguauuacuu gcagaacgcc uuucucguug cuuauacuaa gaaagcgccc 1320

cagcugacau cuuccgaguu aauggcaauc acccggaaga uggccgcuac ggccgcaacc 1380

ugcugucagc ugucagaaga uaaacuacuc gccugcggcg agggggcugc cgacauaauu 1440

aucggacauc uguguauccg ucacgaaaug acaccuguga acccaggcgu aggucaaugc 1500

ugcaccagua gcuacgcaaa ucgcagaccc uguuucuccu cucuuguggu cgaugagacu 1560

uaugugccuc cagcguuuag cgacgauaag uucauuuuuc auaaagacuu gugccaggcu 1620

caggggguug cccugcagac aaugaagcaa gaguuccuca ucaaccuggu gaagcagaaa 1680

ccccagauua cugaggagca acuugaagca gucauagccg auuucucagg acuguuggag 1740

aaguguugcc agggccagga acaggaggug uguuuugcug aagagggcca aaaacucauc 1800

aguaagacca gggccgcacu ggggguauga 1830

<210> 431

<211> 1830

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt4 from

AFP__Homo_sapiens__AAB58754

<400> 431

augaaguggg uggagagcau cuuccugauc uuccugcuga acuucaccga gagcagaacc 60

cugcacagaa acgaguacgg caucgccagc auccuggaca gcuaccagug caccgccgag 120

aucagccugg ccgaccuggc caccaucuuc uucgcccagu ucgugcagga ggccaccuac 180

aaggagguga gcaagauggu gaaggacgcc cugaccgcca ucgagaagcc caccggcgac 240

gagcagagca gcggcugccu ggagaaccag cugcccgccu uccuggagga gcugugccac 300

gagaaggaga uccuggagaa guacggccac agcgacugcu gcagccagag cgaggagggc 360

agacacaacu gcuuccuggc ccacaagaag cccacccccg ccagcauccc ccuguuccag 420

gugcccgagc ccgugaccag cugcgaggcc uacgaggagg acagagagac cuucaugaac 480

aaguucaucu acgagaucgc cagaagacac cccuuccugu acgcccccac cauccugcug 540

ugggccgcca gauacgacaa gaucaucccc agcugcugca aggccgagaa cgccguggag 600

ugcuuccaga ccaaggccgc caccgugacc aaggagcuga gagagagcag ccugcugaac 660

cagcacgccu gcgccgugau gaagaacuuc ggcaccagaa ccuuccaggc caucaccgug 720

accaagcuga gccagaaguu caccaaggug aacuucaccg agauccagaa gcuggugcug 780

gacguggccc acgugcacga gcacugcugc agaggcgacg ugcuggacug ccugcaggac 840

ggcgagaaga ucaugagcua caucugcagc cagcaggaca cccugagcaa caagaucacc 900

gagugcugca agcugaccac ccuggagaga ggccagugca ucauccacgc cgagaacgac 960

gagaagcccg agggccugag ccccaaccug aacagauucc ugggcgacag agacuucaac 1020

caguucagca gcggcgagaa gaacaucuuc cuggccagcu ucgugcacga guacagcaga 1080

agacaccccc agcuggccgu gagcgugauc cugagagugg ccaagggcua ccaggagcug 1140

cuggagaagu gcuuccagac cgagaacccc cuggagugcc aggacaaggg cgaggaggag 1200

cugcagaagu acauccagga gagccaggcc cuggccaaga gaagcugcgg ccuguuccag 1260

aagcugggcg aguacuaccu gcagaacgcc uuccuggugg ccuacaccaa gaaggccccc 1320

cagcugacca gcagcgagcu gauggccauc accagaaaga uggccgccac cgccgccacc 1380

ugcugccagc ugagcgagga caagcugcug gccugcggcg agggcgccgc cgacaucauc 1440

aucggccacc ugugcaucag acacgagaug acccccguga accccggcgu gggccagugc 1500

ugcaccagca gcuacgccaa cagaagaccc ugcuucagca gccugguggu ggacgagacc 1560

uacgugcccc ccgccuucag cgacgacaag uucaucuucc acaaggaccu gugccaggcc 1620

cagggcgugg cccugcagac caugaagcag gaguuccuga ucaaccuggu gaagcagaag 1680

ccccagauca ccgaggagca gcuggaggcc gugaucgccg acuucagcgg ccugcuggag 1740

aagugcugcc agggccagga gcaggaggug ugcuucgccg aggagggcca gaagcugauc 1800

agcaagacca gagccgcccu gggcguguga 1830

<210> 432

<211> 1830

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt5 from

AFP__Homo_sapiens__AAB58754

<400> 432

augaaguggg uggagagcau cuuccugauu uuucuccuga acuucaccga auccagaaca 60

cuucaccgga augaguacgg caucgccucu auucuggaca gcuaucagug cacggcugaa 120

aucucccucg ccgaucuggc gaccauuuuc uucgcucaau uuguccagga ggccacauac 180

aaagaaguuu cuaagauggu gaaagacgcc cuuaccgcua ucgagaagcc cacaggggau 240

gagcagagcu ccggaugucu ggaaaaccag cucccugccu uccuggagga acugugccau 300

gagaaagaga uccucgaaaa guauggccac ucugacuguu gcagccaauc cgaggaaggg 360

cgccauaauu guuuucuggc ucacaagaaa ccgacccccg ccagcauucc ucuuuuccag 420

gugcccgagc cugucacauc uugcgaagcg uacgaggagg auagagaaac cuuuaugaac 480

aaguucaucu augagauugc ccggcgccau cccuuucugu acgcuccuac gauccuccug 540

ugggccgcua gauaugacaa aauuaucccg uccuguugca aggccgaaaa ugcgguggag 600

uguuuccaga ccaaagccgc uacaguuacc aaggaacuuc gggagagcuc ucugcucaac 660

cagcacgccu gcgcugugau gaagaauuuu ggaacacgca ccuuccaagc cauuacgguc 720

acaaaacugu cccagaaguu caccaaagug aacuuuacag agauccagaa gcugguucuc 780

gauguggccc acguccauga acacuguugc agaggcgacg ugcuggauug ccuucaggac 840

ggggagaaaa ucaugagcua cauuuguucu caacaggaua cccuguccaa uaagaucacc 900

gaaugcugua aacucacaac gcuggagcgg ggacagugca uuauccaugc ugaaaacgac 960

gagaagcccg agggccuuag cccuaaucug aaccgcuucc ucggcgauag agacuuuaau 1020

caauucuccu cuggggaaaa gaacauuuuu cuggcgagcu ucgugcacga guacucccgg 1080

cgccaccccc agcuggccgu cagcguuauc cucagagugg cuaaaggaua ucaggaacug 1140

cuugagaagu guuuucagac cgagaauccu cuggaaugcc aagacaaagg cgaggaggaa 1200

cuccagaagu acauccagga aucucaggcc cuggccaaac gguccugugg gcuuuuccaa 1260

aagcugggag aguauuaccu ccagaacgcu uuucuggugg ccuauacaaa gaaagcgccc 1320

cagcugacca gcucugagcu cauggcuauu acacgcaaga uggccgccac cgcugccacg 1380

ugcugucagc ugagcgaaga uaaacuucug gcuugcggcg agggggccgc ggacaucauu 1440

aucggacauc ucuguauuag acacgaaaug acaccgguca acccuggcgu gggccaaugc 1500

ugcaccuccu cuuacgccaa ucggagaccc uguuucagcu cccugguugu ggaugagacc 1560

uaugucccuc ccgcuuuuag cgacgauaag uucaucuuuc auaaagaccu gugccaggcc 1620

cagggggugg cccuucagac aaugaagcaa gaauuucuca ucaaccuggu uaagcagaaa 1680

ccccagauua ccgaggagca acuggaagcu gugaucgcgg auuucucugg acuccuggag 1740

aaguguugcc agggccagga acaggagguc uguuuugccg aagaggggca aaaacuuauu 1800

uccaagacac gcgcugcccu gggaguguga 1830

<210> 433

<211> 854

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AKAP4__Homo_sapiens__Q5JQC9

<400> 433

Met Met Ala Tyr Ser Asp Thr Thr Met Met Ser Asp Asp Ile Asp Trp

1 5 10 15

Leu Arg Ser His Arg Gly Val Cys Lys Val Asp Leu Tyr Asn Pro Glu

20 25 30

Gly Gln Gln Asp Gln Asp Arg Lys Val Ile Cys Phe Val Asp Val Ser

35 40 45

Thr Leu Asn Val Glu Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Ala Ala Ser Ser Ser

50 55 60

Ser Glu Gly Asn Leu Asn Leu Gly Ser Leu Glu Glu Lys Glu Ile Ile

65 70 75 80

Val Ile Lys Asp Thr Glu Lys Lys Asp Gln Ser Lys Thr Glu Gly Ser

85 90 95

Val Cys Leu Phe Lys Gln Ala Pro Ser Asp Pro Val Ser Val Leu Asn

100 105 110

Trp Leu Leu Ser Asp Leu Gln Lys Tyr Ala Leu Gly Phe Gln His Ala

115 120 125

Leu Ser Pro Ser Thr Ser Thr Cys Lys His Lys Val Gly Asp Thr Glu

130 135 140

Gly Glu Tyr His Arg Ala Ser Ser Glu Asn Cys Tyr Ser Val Tyr Ala

145 150 155 160

Asp Gln Val Asn Ile Asp Tyr Leu Met Asn Arg Pro Gln Asn Leu Arg

165 170 175

Leu Glu Met Thr Ala Ala Lys Asn Thr Asn Asn Asn Gln Ser Pro Ser

180 185 190

Ala Pro Pro Ala Lys Pro Pro Ser Thr Gln Arg Ala Val Ile Ser Pro

195 200 205

Asp Gly Glu Cys Ser Ile Asp Asp Leu Ser Phe Tyr Val Asn Arg Leu

210 215 220

Ser Ser Leu Val Ile Gln Met Ala His Lys Glu Ile Lys Glu Lys Leu

225 230 235 240

Glu Gly Lys Ser Lys Cys Leu His His Ser Ile Cys Pro Ser Pro Gly

245 250 255

Asn Lys Glu Arg Ile Ser Pro Arg Thr Pro Ala Ser Lys Ile Ala Ser

260 265 270

Glu Met Ala Tyr Glu Ala Val Glu Leu Thr Ala Ala Glu Met Arg Gly

275 280 285

Thr Gly Glu Glu Ser Arg Glu Gly Gly Gln Lys Ser Phe Leu Tyr Ser

290 295 300

Glu Leu Ser Asn Lys Ser Lys Ser Gly Asp Lys Gln Met Ser Gln Arg

305 310 315 320

Glu Ser Lys Glu Phe Ala Asp Ser Ile Ser Lys Gly Leu Met Val Tyr

325 330 335

Ala Asn Gln Val Ala Ser Asp Met Met Val Ser Leu Met Lys Thr Leu

340 345 350

Lys Val His Ser Ser Gly Lys Pro Ile Pro Ala Ser Val Val Leu Lys

355 360 365

Arg Val Leu Leu Arg His Thr Lys Glu Ile Val Ser Asp Leu Ile Asp

370 375 380

Ser Cys Met Lys Asn Leu His Asn Ile Thr Gly Val Leu Met Thr Asp

385 390 395 400

Ser Asp Phe Val Ser Ala Val Lys Arg Asn Leu Phe Asn Gln Trp Lys

405 410 415

Gln Asn Ala Thr Asp Ile Met Glu Ala Met Leu Lys Arg Leu Val Ser

420 425 430

Ala Leu Ile Gly Glu Glu Lys Glu Thr Lys Ser Gln Ser Leu Ser Tyr

435 440 445

Ala Ser Leu Lys Ala Gly Ser His Asp Pro Lys Cys Arg Asn Gln Ser

450 455 460

Leu Glu Phe Ser Thr Met Lys Ala Glu Met Lys Glu Arg Asp Lys Gly

465 470 475 480

Lys Met Lys Ser Asp Pro Cys Lys Ser Leu Thr Ser Ala Glu Lys Val

485 490 495

Gly Glu His Ile Leu Lys Glu Gly Leu Thr Ile Trp Asn Gln Lys Gln

500 505 510

Gly Asn Ser Cys Lys Val Ala Thr Lys Ala Cys Ser Asn Lys Asp Glu

515 520 525

Lys Gly Glu Lys Ile Asn Ala Ser Thr Asp Ser Leu Ala Lys Asp Leu

530 535 540

Ile Val Ser Ala Leu Lys Leu Ile Gln Tyr His Leu Thr Gln Gln Thr

545 550 555 560

Lys Gly Lys Asp Thr Cys Glu Glu Asp Cys Pro Gly Ser Thr Met Gly

565 570 575

Tyr Met Ala Gln Ser Thr Gln Tyr Glu Lys Cys Gly Gly Gly Gln Ser

580 585 590

Ala Lys Ala Leu Ser Val Lys Gln Leu Glu Ser His Arg Ala Pro Gly

595 600 605

Pro Ser Thr Cys Gln Lys Glu Asn Gln His Leu Asp Ser Gln Lys Met

610 615 620

Asp Met Ser Asn Ile Val Leu Met Leu Ile Gln Lys Leu Leu Asn Glu

625 630 635 640

Asn Pro Phe Lys Cys Glu Asp Pro Cys Glu Gly Glu Asn Lys Cys Ser

645 650 655

Glu Pro Arg Ala Ser Lys Ala Ala Ser Met Ser Asn Arg Ser Asp Lys

660 665 670

Ala Glu Glu Gln Cys Gln Glu His Gln Glu Leu Asp Cys Thr Ser Gly

675 680 685

Met Lys Gln Ala Asn Gly Gln Phe Ile Asp Lys Leu Val Glu Ser Val

690 695 700

Met Lys Leu Cys Leu Ile Met Ala Lys Tyr Ser Asn Asp Gly Ala Ala

705 710 715 720

Leu Ala Glu Leu Glu Glu Gln Ala Ala Ser Ala Asn Lys Pro Asn Phe

725 730 735

Arg Gly Thr Arg Cys Ile His Ser Gly Ala Met Pro Gln Asn Tyr Gln

740 745 750

Asp Ser Leu Gly His Glu Val Ile Val Asn Asn Gln Cys Ser Thr Asn

755 760 765

Ser Leu Gln Lys Gln Leu Gln Ala Val Leu Gln Trp Ile Ala Ala Ser

770 775 780

Gln Phe Asn Val Pro Met Leu Tyr Phe Met Gly Asp Lys Asp Gly Gln

785 790 795 800

Leu Glu Lys Leu Pro Gln Val Ser Ala Lys Ala Ala Glu Lys Gly Tyr

805 810 815

Ser Val Gly Gly Leu Leu Gln Glu Val Met Lys Phe Ala Lys Glu Arg

820 825 830

Gln Pro Asp Glu Ala Val Gly Lys Val Ala Arg Lys Gln Leu Leu Asp

835 840 845

Trp Leu Leu Ala Asn Leu

850

<210> 434

<211> 2565

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AKAP4__Homo_sapiens__AAI26251

<400> 434

augauggcgu acucugauac uacaaugaug ucugaugaua uugacugguu acgcagccac 60

aggggugugu gcaagguaga ucucuacaac ccagaaggac agcaagauca ggaccggaaa 120

gugauaugcu uugucgaugu guccacccug aauguagaag auaaagauua caaggaugcu 180

gcuaguucca gcucagaagg caacuuaaac cugggaaguc uggaagaaaa agagauuauc 240

gugaucaagg acacugagaa gaaagaccag ucuaagacag agggaucugu augccuuuuc 300

aaacaagcuc ccucugaucc uguaaguguc cucaacuggc uucucaguga ucuccagaag 360

uaugccuugg guuuccaaca ugcacugagc cccucaaccu cuaccuguaa acauaaagua 420

ggagacacag agggcgaaua ucacagagca uccucugaga acugcuacag ugucuaugcc 480

gaucaaguga acauagauua uuugaugaac agaccucaaa accuacgucu agaaaugaca 540

gcagcuaaaa acaccaacaa uaaucaaagu ccuucagcuc cuccagccaa accuccuagc 600

acucagagag cagucauuuc cccugaugga gaauguucua uagaugaccu uuccuucuac 660

gucaaccgac uaucuucucu gguaauccag auggcccaua aggaaaucaa ggagaaguug 720

gaagguaaaa gcaaaugccu ucaucauuca aucuguccau ccccugggaa caaagagaga 780

aucagucccc gaacuccugc gagcaagauu gcuucugaaa uggccuauga agcuguggaa 840

cugacagcug cagaaaugcg uggcacugga gaggagucca gggaaggugg ccagaaaagc 900

uuucuauaua gcgaauuauc caacaagagc aaaaguggag acaaacagau gucccagaga 960

gagagcaaag aauuugcaga uuccaucagc aaggggcuca ugguuuaugc aaaucaggug 1020

gcaucugaca ugauggucuc ucucaugaag accuugaaag ugcacagcuc ugggaagcca 1080

auuccagcau cugugguccu gaagagggug uugcuaaggc acaccaagga gauugugucc 1140

gauuugauug auucuugcau gaagaaccug cauaauauua cugggguccu gaugacugac 1200

ucagacuuug ucucagcugu caagagaaau cuguucaacc aguggaaaca aaaugcuaca 1260

gacaucaugg aggccaugcu gaagcgcuug gucagugccc uuauagguga ggagaaggag 1320

acuaagucuc agagucuguc auaugcaucu uuaaaagcug ggucccauga ucccaaaugc 1380

aggaaucaga gucuugaauu cuccaccaug aaagcugaaa ugaaagagag ggacaaaggc 1440

aaaaugaaau cagacccaug caagucacug acuagugcug agaaagucgg ugaacacauu 1500

cucaaagagg gccuaaccau cuggaaccaa aagcaaggaa acucaugcaa gguggcuacc 1560

aaagcaugca gcaauaaaga ugagaaagga gaaaagauca augcuuccac agauucacug 1620

gccaaggacc ugauugucuc ugcccuuaag cugauccagu accaucugac ccagcagacu 1680

aagggcaaag auacauguga agaagacugu ccugguucca ccaugggcua uauggcucag 1740

aguacucaau augaaaagug uggagguggc caaagugcca aagcacuuuc agugaaacaa 1800

cuagaaucuc acagagcccc uggaccaucc accugucaaa aggagaacca acaccuggac 1860

ucccagaaaa uggauauguc aaacaucguu cuaaugcuga uucagaaacu gcuuaaugag 1920

aaccccuuca aaugugagga uccaugcgaa ggugagaaca aguguucuga gcccagggca 1980

agcaaagcag cuuccauguc caacagaucu gacaaagcgg aagaacaaug ccaggagcau 2040

caagaacuug acuguaccag ugggaugaag caagcgaacg ggcaauuuau agauaaacua 2100

guagaaucug ugaugaagcu cugccuuauc auggcuaagu auagcaacga uggggcagcc 2160

cuugcugagu uggaagaaca agcagccucg gcaaauaagc ccaauuucag gggcaccaga 2220

ugcauucaca guggugcaau gccacagaac uaucaagacu cucuuggaca ugaaguaauu 2280

gucaauaauc agugcucuac aaauagcuug cagaagcagc uccaggcugu ccugcagugg 2340

auugcagccu cccaguuuaa cgugcccaug cucuacuuca ugggagauaa ggauggacaa 2400

cuggaaaagc uuccucaggu uucagcuaaa gcagcagaga agggguacag uguaggaggu 2460

cuucuucaag aggucaugaa guuugccaag gaacggcaac cagaugaagc ugugggaaag 2520

guggccagga aacaguugcu ggacuggcug cucgcuaacc uguga 2565

<210> 435

<211> 2565

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt1 from

AKAP4__Homo_sapiens__AAI26251

<400> 435

augauggccu acagcgacac caccaugaug uccgacgaca ucgacuggcu gcgcagccac 60

cggggcgugu gcaaggucga ccucuacaac cccgaggggc agcaggacca ggaccgcaag 120

gugaucugcu ucguggacgu cuccacccug aacguggagg acaaggacua caaggacgcc 180

gcgagcucca gcuccgaggg caaccugaac cucgggagcc uggaggagaa ggagaucauc 240

gugaucaagg acaccgagaa gaaggaccag uccaagaccg agggcagcgu cugccuguuc 300

aagcaggccc cguccgaccc cgugagcgug cucaacuggc ugcuguccga ccuccagaag 360

uacgcccugg gguuccagca cgcccugagc cccuccacca gcacgugcaa gcacaagguc 420

ggcgacaccg agggcgagua ccaccgggcc uccagcgaga acugcuacuc cguguacgcg 480

gaccagguga acaucgacua ccucaugaac cgcccccaga accugcggcu ggagaugacc 540

gccgccaaga acaccaacaa caaccagagc ccgagcgccc cgcccgcgaa gccgcccucc 600

acgcagcgcg ccgucaucag ccccgacggg gagugcucca ucgacgaccu cagcuucuac 660

gugaaccggc uguccagccu ggugauccag auggcccaca aggagaucaa ggagaagcuc 720

gagggcaagu ccaagugccu gcaccacagc aucugccccu cccccgggaa caaggagcgc 780

aucagccccc ggacccccgc cuccaagauc gccagcgaga uggcguacga ggccgucgag 840

cugaccgccg ccgagaugcg cggcaccggg gaggaguccc gggagggcgg ccagaagucc 900

uuccucuaca gcgagcugag caacaagucc aagagcgggg acaagcagau gucccagcgc 960

gagagcaagg aguucgccga cagcaucucc aagggccuga ugguguacgc gaaccaggug 1020

gccagcgaca ugauggucuc ccucaugaag acgcugaagg ugcacagcuc cgggaagccc 1080

auccccgcca gcgugguccu gaagcgggug cuccugcgcc acaccaagga gaucgugucc 1140

gaccugaucg acagcugcau gaagaaccuc cacaacauca ccggcguccu gaugaccgac 1200

uccgacuucg ugagcgccgu caagcggaac cuguucaacc aguggaagca gaacgccacg 1260

gacaucaugg aggcgaugcu caagcgccug guguccgccc ugaucggcga ggagaaggag 1320

accaagagcc agucccucag cuacgccucc cugaaggccg ggagccacga cccgaagugc 1380

cggaaccagu cccuggaguu cagcaccaug aaggccgaga ugaaggagcg cgacaagggc 1440

aagaugaagu ccgaccccug caagagccuc accagcgcgg agaagguggg ggagcacauc 1500

cugaaggagg gccugacgau cuggaaccag aagcagggga acuccugcaa ggucgccacc 1560

aaggccugca gcaacaagga cgagaagggc gagaagauca acgccuccac cgacagccuc 1620

gcgaaggacc ugaucguguc cgcccugaag cucauccagu accaccugac ccagcagacg 1680

aagggcaagg acacgugcga ggaggacugc cccgggagca ccaugggcua cauggcccag 1740

uccacccagu acgagaagug cgggggcggg cagagcgcca aggcccuguc cgugaagcag 1800

cucgagagcc accgggcgcc cggcccgucc acgugccaga aggagaacca gcaccuggac 1860

agccagaaga uggacauguc caacaucguc cugaugcuga uccagaagcu ccugaacgag 1920

aaccccuuca agugcgagga ccccugcgag ggcgagaaca agugcagcga gccccgcgcc 1980

uccaaggccg ccagcauguc caaccggagc gacaaggccg aggagcagug ccaggagcac 2040

caggagcugg acugcaccag cgggaugaag caggcgaacg gccaguucau cgacaagcuc 2100

guggaguccg ugaugaagcu gugccugauc auggccaagu acagcaacga cggggccgcc 2160

cucgccgagc uggaggagca ggcggccucc gccaacaagc cgaacuuccg cggcacccgc 2220

ugcauccaca gcggggccau gccccagaac uaccaggacu cccugggcca cgaggucauc 2280

gugaacaacc agugcagcac caacucccuc cagaagcagc ugcaggcggu gcugcagugg 2340

aucgccgcca gccaguucaa cguccccaug cucuacuuca ugggcgacaa ggacgggcag 2400

cuggagaagc ugccccaggu guccgccaag gccgcggaga agggcuacag cgucgggggc 2460

cuccugcagg aggugaugaa guucgccaag gagcggcagc cggacgaggc cgugggcaag 2520

guggcccgca agcagcugcu cgacuggcug cuggccaacc ucuga 2565

<210> 436

<211> 2565

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt2 from

AKAP4__Homo_sapiens__AAI26251

<400> 436

augauggccu acuccgacac caccaugaug uccgacgaca ucgacuggcu ccgcucccac 60

cgcggcgucu gcaaggucga ccucuacaac cccgagggcc agcaggacca ggaccgcaag 120

gucaucugcu ucgucgacgu cuccacccuc aacgucgagg acaaggacua caaggacgcc 180

gccuccuccu ccuccgaggg caaccucaac cucggcuccc ucgaggagaa ggagaucauc 240

gucaucaagg acaccgagaa gaaggaccag uccaagaccg agggcuccgu cugccucuuc 300

aagcaggccc ccuccgaccc cgucuccguc cucaacuggc uccucuccga ccuccagaag 360

uacgcccucg gcuuccagca cgcccucucc cccuccaccu ccaccugcaa gcacaagguc 420

ggcgacaccg agggcgagua ccaccgcgcc uccuccgaga acugcuacuc cgucuacgcc 480

gaccagguca acaucgacua ccucaugaac cgcccccaga accuccgccu cgagaugacc 540

gccgccaaga acaccaacaa caaccagucc cccuccgccc cccccgccaa gccccccucc 600

acccagcgcg ccgucaucuc ccccgacggc gagugcucca ucgacgaccu cuccuucuac 660

gucaaccgcc ucuccucccu cgucauccag auggcccaca aggagaucaa ggagaagcuc 720

gagggcaagu ccaagugccu ccaccacucc aucugccccu cccccggcaa caaggagcgc 780

aucucccccc gcacccccgc cuccaagauc gccuccgaga uggccuacga ggccgucgag 840

cucaccgccg ccgagaugcg cggcaccggc gaggaguccc gcgagggcgg ccagaagucc 900

uuccucuacu ccgagcucuc caacaagucc aaguccggcg acaagcagau gucccagcgc 960

gaguccaagg aguucgccga cuccaucucc aagggccuca uggucuacgc caaccagguc 1020

gccuccgaca ugauggucuc ccucaugaag acccucaagg uccacuccuc cggcaagccc 1080

auccccgccu ccgucguccu caagcgcguc cuccuccgcc acaccaagga gaucgucucc 1140

gaccucaucg acuccugcau gaagaaccuc cacaacauca ccggcguccu caugaccgac 1200

uccgacuucg ucuccgccgu caagcgcaac cucuucaacc aguggaagca gaacgccacc 1260

gacaucaugg aggccaugcu caagcgccuc gucuccgccc ucaucggcga ggagaaggag 1320

accaaguccc agucccucuc cuacgccucc cucaaggccg gcucccacga ccccaagugc 1380

cgcaaccagu cccucgaguu cuccaccaug aaggccgaga ugaaggagcg cgacaagggc 1440

aagaugaagu ccgaccccug caagucccuc accuccgccg agaaggucgg cgagcacauc 1500

cucaaggagg gccucaccau cuggaaccag aagcagggca acuccugcaa ggucgccacc 1560

aaggccugcu ccaacaagga cgagaagggc gagaagauca acgccuccac cgacucccuc 1620

gccaaggacc ucaucgucuc cgcccucaag cucauccagu accaccucac ccagcagacc 1680

aagggcaagg acaccugcga ggaggacugc cccggcucca ccaugggcua cauggcccag 1740

uccacccagu acgagaagug cggcggcggc caguccgcca aggcccucuc cgucaagcag 1800

cucgaguccc accgcgcccc cggccccucc accugccaga aggagaacca gcaccucgac 1860

ucccagaaga uggacauguc caacaucguc cucaugcuca uccagaagcu ccucaacgag 1920

aaccccuuca agugcgagga ccccugcgag ggcgagaaca agugcuccga gccccgcgcc 1980

uccaaggccg ccuccauguc caaccgcucc gacaaggccg aggagcagug ccaggagcac 2040

caggagcucg acugcaccuc cggcaugaag caggccaacg gccaguucau cgacaagcuc 2100

gucgaguccg ucaugaagcu cugccucauc auggccaagu acuccaacga cggcgccgcc 2160

cucgccgagc ucgaggagca ggccgccucc gccaacaagc ccaacuuccg cggcacccgc 2220

ugcauccacu ccggcgccau gccccagaac uaccaggacu cccucggcca cgaggucauc 2280

gucaacaacc agugcuccac caacucccuc cagaagcagc uccaggccgu ccuccagugg 2340

aucgccgccu cccaguucaa cguccccaug cucuacuuca ugggcgacaa ggacggccag 2400

cucgagaagc ucccccaggu cuccgccaag gccgccgaga agggcuacuc cgucggcggc 2460

cuccuccagg aggucaugaa guucgccaag gagcgccagc ccgacgaggc cgucggcaag 2520

gucgcccgca agcagcuccu cgacuggcuc cucgccaacc ucuga 2565

<210> 437

<211> 2565

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt3 from

AKAP4__Homo_sapiens__AAI26251

<400> 437

augauggccu acagcgacac cacaaugaug uccgaugaca ucgauuggcu gagaucucac 60

aggggcgugu gcaaggucga ccucuauaac cccgaggggc agcaagauca ggaccggaaa 120

guuauuuguu ucguggaugu aucaacucuu aauguggaag acaaggauua caaagacgcu 180

gcaaguagcu ccucugaggg aaaccugaau uuggguucgu uagaagagaa ggaaauaauc 240

gucauuaaag auacggagaa gaaggaccag ucaaaaaccg agggcagcgu gugccuguuu 300

aagcaggccc cuagugaucc aguuuccgug cuaaacuggc uccugucuga ccuucaaaaa 360

uaugcgcugg gguuccagca ugcuuugagc ccguccacau caacuuguaa gcacaaaguc 420

ggagacaccg aaggcgagua ccaucgcgcc aguagcgaaa auugcuauuc uguguacgca 480

gaucagguaa acaucgacua ucucaugaau cgaccccaga accugcgucu ggagaugaca 540

gccgcuaaga auaccaacaa uaaccaaucc ccuucagcac cacccgccaa gccuccaagc 600

acucagagag cuguuauuag ucccgauggu gaguguucua ucgacgaucu cuccuuuuac 660

gugaauaggu uaagcucgcu ggucauacag auggcccaca aagaaaucaa ggagaaacuu 720

gaagggaagu cuaaaugcuu gcaucacucc auuuguccuu caccaggaaa caaggagcgg 780

aucaguccgc gcacacccgc gagcaaaauu gcauccgaaa uggccuacga ggcuguggag 840

cugaccgccg cagaaaugag aggcacgggc gaggaaucua gggaaggggg acaaaagagc 900

uuccuauauu cagaacucag uaauaagucc aaaagcggug acaagcagau gucucagcgg 960

gagucaaaag aguuugcuga uaguaucagc aagggccuga ugguguacgc caaccagguc 1020

gcguccgaca ugaugguuuc ucuuaugaaa acucugaagg ugcacucgag cgggaagccu 1080

auaccagccu ccguaguguu gaaacgcguc cuccugcgac auaccaagga aauuguguca 1140

gauuuaaucg acaguugcau gaaaaaccug cacaauauua caggaguucu caugacugau 1200

ucugacuucg ugagcgcagu caagagaaac cuuuuuaauc aauggaaaca gaacgcuacc 1260

gacaucaugg aggccaugcu gaagagguug guguccgcuc uaaucggcga agagaaggaa 1320

acaaaaucac agagccuguc uuaugccucc cucaaggcag guagucauga ucccaaaugu 1380

cggaaucaga gccuggaguu cucuaccaug aaggccgaga ugaaagaacg ugacaagggg 1440

aagaugaaau ccgauccuug caagucacuu acgagugcug agaaaguagg agaacacauu 1500

cugaaggagg gcuugacuau auggaaccaa aaacagggca auagcuguaa gguugcgaca 1560

aaagcaugcu cgaacaagga cgagaagggg gagaaaauca augccuccac cgauucucuc 1620

gcuaaggacc ugauugugag cgccuuaaaa cugauccagu accaccuaac ucagcaaaca 1680

aagggaaaag auaccugcga ggaagacugu ccagguucaa cgaugggcua uauggcacag 1740

aguacccagu acgagaagug cgggggaggc caguccgcca aggcucucuc ugucaaacaa 1800

cuggaaagcc aucgcgcccc cgguccgucc acaugucaga aggagaacca gcaccuugau 1860

ucacagaaaa uggacaugag caauauagug uugaugcuga uucaaaagcu ccugaacgag 1920

aauccuuuua aaugcgaaga ucccugugag ggggaaaaca agugcaguga gccaagagca 1980

ucuaaggcgg cuuccaugag caauaggucg gacaaagccg aggaacagug ucaggagcau 2040

caagaacuug auugcacuuc aggcaugaag caggcaaacg gacaguucau cgacaaacug 2100

gucgagucug ugaugaaguu gugucucauc auggccaaau auaguaacga cggcgcugcc 2160

cuggcagaau uagaggaaca ggcugccucc gcgaauaagc cuaacuuucg ggggacccga 2220

ugcauucaca gcggagccau gccccaaaau uaccaggauu cucuggguca ugagguuauc 2280

gugaacaauc aguguagcac aaacucccua cagaagcaac uccaggcugu acugcagugg 2340

auugcagccu cacaguucaa ugucccaaug cuuuacuuua ugggcgacaa agaugggcaa 2400

uuggagaagc ugccccaggu gagugcuaaa gccgcagaaa agggauauag cguuggcggu 2460

cuccugcagg aggugaugaa auucgcgaag gaacgccaac cugacgaggc cgucgggaaa 2520

guggcuagaa agcaguuacu ggauuggcuu uuggccaacc ucuga 2565

<210> 438

<211> 2565

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt4 from

AKAP4__Homo_sapiens__AAI26251

<400> 438

augauggccu acagcgacac caccaugaug agcgacgaca ucgacuggcu gagaagccac 60

agaggcgugu gcaaggugga ccuguacaac cccgagggcc agcaggacca ggacagaaag 120

gugaucugcu ucguggacgu gagcacccug aacguggagg acaaggacua caaggacgcc 180

gccagcagca gcagcgaggg caaccugaac cugggcagcc uggaggagaa ggagaucauc 240

gugaucaagg acaccgagaa gaaggaccag agcaagaccg agggcagcgu gugccuguuc 300

aagcaggccc ccagcgaccc cgugagcgug cugaacuggc ugcugagcga ccugcagaag 360

uacgcccugg gcuuccagca cgcccugagc cccagcacca gcaccugcaa gcacaaggug 420

ggcgacaccg agggcgagua ccacagagcc agcagcgaga acugcuacag cguguacgcc 480

gaccagguga acaucgacua ccugaugaac agaccccaga accugagacu ggagaugacc 540

gccgccaaga acaccaacaa caaccagagc cccagcgccc cccccgccaa gccccccagc 600

acccagagag ccgugaucag ccccgacggc gagugcagca ucgacgaccu gagcuucuac 660

gugaacagac ugagcagccu ggugauccag auggcccaca aggagaucaa ggagaagcug 720

gagggcaaga gcaagugccu gcaccacagc aucugcccca gccccggcaa caaggagaga 780

aucagcccca gaacccccgc cagcaagauc gccagcgaga uggccuacga ggccguggag 840

cugaccgccg ccgagaugag aggcaccggc gaggagagca gagagggcgg ccagaagagc 900

uuccuguaca gcgagcugag caacaagagc aagagcggcg acaagcagau gagccagaga 960

gagagcaagg aguucgccga cagcaucagc aagggccuga ugguguacgc caaccaggug 1020

gccagcgaca ugauggugag ccugaugaag acccugaagg ugcacagcag cggcaagccc 1080

auccccgcca gcguggugcu gaagagagug cugcugagac acaccaagga gaucgugagc 1140

gaccugaucg acagcugcau gaagaaccug cacaacauca ccggcgugcu gaugaccgac 1200

agcgacuucg ugagcgccgu gaagagaaac cuguucaacc aguggaagca gaacgccacc 1260

gacaucaugg aggccaugcu gaagagacug gugagcgccc ugaucggcga ggagaaggag 1320

accaagagcc agagccugag cuacgccagc cugaaggccg gcagccacga ccccaagugc 1380

agaaaccaga gccuggaguu cagcaccaug aaggccgaga ugaaggagag agacaagggc 1440

aagaugaaga gcgaccccug caagagccug accagcgccg agaagguggg cgagcacauc 1500

cugaaggagg gccugaccau cuggaaccag aagcagggca acagcugcaa gguggccacc 1560

aaggccugca gcaacaagga cgagaagggc gagaagauca acgccagcac cgacagccug 1620

gccaaggacc ugaucgugag cgcccugaag cugauccagu accaccugac ccagcagacc 1680

aagggcaagg acaccugcga ggaggacugc cccggcagca ccaugggcua cauggcccag 1740

agcacccagu acgagaagug cggcggcggc cagagcgcca aggcccugag cgugaagcag 1800

cuggagagcc acagagcccc cggccccagc accugccaga aggagaacca gcaccuggac 1860

agccagaaga uggacaugag caacaucgug cugaugcuga uccagaagcu gcugaacgag 1920

aaccccuuca agugcgagga ccccugcgag ggcgagaaca agugcagcga gcccagagcc 1980

agcaaggccg ccagcaugag caacagaagc gacaaggccg aggagcagug ccaggagcac 2040

caggagcugg acugcaccag cggcaugaag caggccaacg gccaguucau cgacaagcug 2100

guggagagcg ugaugaagcu gugccugauc auggccaagu acagcaacga cggcgccgcc 2160

cuggccgagc uggaggagca ggccgccagc gccaacaagc ccaacuucag aggcaccaga 2220

ugcauccaca gcggcgccau gccccagaac uaccaggaca gccugggcca cgaggugauc 2280

gugaacaacc agugcagcac caacagccug cagaagcagc ugcaggccgu gcugcagugg 2340

aucgccgcca gccaguucaa cgugcccaug cuguacuuca ugggcgacaa ggacggccag 2400

cuggagaagc ugccccaggu gagcgccaag gccgccgaga agggcuacag cgugggcggc 2460

cugcugcagg aggugaugaa guucgccaag gagagacagc ccgacgaggc cgugggcaag 2520

guggccagaa agcagcugcu ggacuggcug cuggccaacc uguga 2565

<210> 439

<211> 2565

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt5 from

AKAP4__Homo_sapiens__AAI26251

<400> 439

augauggccu acagcgacac cacaaugaug uccgaugaca ucgauuggcu gagaucucac 60

cggggcgugu gcaaggucga ccucuauaac cccgaggggc agcaagauca ggaccgcaaa 120

guuauuuguu ucguggaugu gagcacgcug aaugucgaag acaaggauua caaagacgcu 180

gccuccucua gcuccgaggg aaaccuuaau cugggcucuc ucgaagagaa ggaaaucauu 240

gugaucaaag auaccgagaa gaaggaccag agcaaaacag agggguccgu uugccuguuu 300

aagcaggcgc cuagcgaucc ggugucuguc cuuaacuggc ugcucuccga ccugcaaaaa 360

uaugcucugg gauuccagca ugcccucagc cccucuaccu ccacauguaa gcacaaagug 420

ggcgacaccg aaggggagua ccauagagcc agcucugaaa auugcuauuc cguuuacgcu 480

gaucagguga acauugacua ucugaugaau cggccucaga accuucgccu ggagaugaca 540

gccgcuaaga auaccaacaa uaaccaaagc cccuccgccc cucccgcgaa gccuccgucu 600

acgcagagag ccgucaucag ccccgaugga gaguguucca ucgacgaucu cagcuuuuac 660

gugaaucggc ugucuucccu ugugauucag auggcucaca aagaaaucaa ggagaaacug 720

gaaggcaaga gcaaaugccu ccaucacucu auuuguccua gccccggcaa caaggagcgc 780

aucuccccua gaacccccgc cucuaaaauu gcuagcgaaa uggccuacga ggcggucgag 840

cugacagccg cugaaaugcg ggggaccgga gaggaauccc gcgagggcgg gcagaagucu 900

uuccuguauu cugaacucuc caauaagagc aaaucuggag acaagcaaau gucccagaga 960

gagagcaaag aguuugccga uuccaucucu aagggccuga ugguuuacgc uaaccaggug 1020

gccagcgaca ugaugguguc ccuuaugaaa acacugaagg uccacucuag cgggaagccg 1080

auuccugccu ccgugguucu caaacgggug cugcuucgcc auaccaagga aaucgucagc 1140

gaucugaucg acucuugcau gaaaaaccuc cacaauauua cgggagugcu gaugacagau 1200

uccgacuucg uuagcgcugu gaagagaaac cuguuuaauc aauggaaaca gaacgcgacc 1260

gacaucaugg aggccaugcu caagcggcug gucucugcuc uuauuggcga agagaaggaa 1320

acaaaauccc agagccuguc uuaugccagc cucaaggccg gcucccauga ucccaaaugu 1380

cgcaaucaga gccuggaguu cucuaccaug aaggcugaga ugaaagaaag agacaagggg 1440

aagaugaaau ccgauccuug caagagccuu accuccgccg agaaaguggg agaacacauc 1500

cugaaggagg gccucacaau uuggaaccaa aaacagggga auagcuguaa ggucgcgacg 1560

aaggcuugca gcaacaaaga cgagaaggga gagaaaauca augccuccac cgauucucug 1620

gccaaggacc ugaucgugag cgcucucaaa cugauucagu accaccuuac acagcaaacc 1680

aagggcaaag auacaugcga ggaagacugu cccgggucca ccaugggaua uauggcccag 1740

ucuacgcagu acgagaagug cggcggcggg cagagcgcua aggcccuguc cguuaaacaa 1800

cucgaaagcc aucgggcgcc cggaccuucu acaugucaga aggagaacca gcaccuggau 1860

ucccagaaaa uggacaugag caauaucgug cugaugcuua uucaaaagcu ccugaacgag 1920

aauccguuua aaugcgaaga ucccugugag ggcgaaaaca agugcucuga gccuagagcc 1980

uccaaggcug ccagcauguc uaaucgcucc gacaaagcug aagaacagug ucaggagcau 2040

caagaacugg auugcaccag cgggaugaag caggccaacg gacaguucau cgacaaacuc 2100

gucgaguccg ugaugaagcu gugucuuauu auggcgaaau auagcaacga cggcgccgcu 2160

cuggccgaac ucgaggaaca ggcugccucu gccaauaagc ccaacuuucg ggggaccaga 2220

ugcauccaca gcggcgcuau gccucaaaau uaccaggauu cccugggaca ugagguuauc 2280

gugaacaauc aguguucuac aaacagccug cagaagcaac uucaggcggu ccuccagugg 2340

auugccgcuu cccaguucaa ugugcccaug cuguacuuua ugggcgacaa agaugggcaa 2400

cuggagaagc ucccucaggu gucugccaaa gccgcugaaa agggauauag cguuggcggg 2460

cugcuucagg aggucaugaa auucgccaag gaacgccaac cggacgaggc ggugggaaaa 2520

guggcucgga agcagcugcu cgauuggcug cuggccaacc uuuga 2565

<210> 440

<211> 416

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> alpha-actinin-_4/m__Homo_sapiens__B4DSX0

<400> 440

Met Val Asp Tyr His Ala Ala Asn Gln Ser Tyr Gln Tyr Gly Pro Ser

1 5 10 15

Ser Ala Gly Asn Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Met Gly Asp Tyr Met

20 25 30

Ala Gln Glu Asp Asp Trp Asp Arg Asp Leu Leu Leu Asp Pro Ala Trp

35 40 45

Glu Lys Gln Gln Arg Lys Thr Phe Thr Ala Trp Cys Asn Ser His Leu

50 55 60

Arg Lys Ala Gly Thr Gln Ile Glu Asn Ile Asp Glu Asp Phe Arg Asp

65 70 75 80

Gly Leu Lys Leu Met Leu Leu Leu Glu Val Ile Ser Gly Glu Arg Leu

85 90 95

Pro Lys Pro Glu Arg Gly Lys Met Arg Val His Lys Ile Asn Asn Val

100 105 110

Asn Lys Ala Leu Asp Phe Ile Ala Ser Lys Gly Val Lys Leu Val Ser

115 120 125

Ile Gly Ala Glu Glu Ile Val Asp Gly Asn Ala Lys Met Thr Leu Gly

130 135 140

Met Ile Trp Thr Ile Ile Leu Arg Phe Ala Ile Gln Asp Ile Ser Val

145 150 155 160

Glu Glu Thr Ser Ala Lys Glu Gly Leu Leu Leu Trp Cys Gln Arg Lys

165 170 175

Thr Ala Pro Tyr Lys Asn Val Asn Val Gln Asn Phe His Ile Ser Trp

180 185 190

Lys Asp Gly Leu Ala Phe Asn Ala Leu Ile His Arg His Arg Pro Glu

195 200 205

Leu Ile Glu Tyr Asp Lys Leu Arg Lys Asp Asp Pro Val Thr Asn Leu

210 215 220

Asn Asn Ala Phe Glu Val Ala Glu Lys Tyr Leu Asp Ile Pro Lys Met

225 230 235 240

Leu Asp Ala Glu Asp Ile Val Asn Thr Ala Arg Pro Asp Glu Lys Ala

245 250 255

Ile Met Thr Tyr Val Ser Ser Phe Tyr His Ala Phe Ser Gly Ala Gln

260 265 270

Lys Ala Glu Thr Ala Ala Asn Arg Ile Cys Lys Val Leu Ala Val Asn

275 280 285

Gln Glu Asn Glu His Leu Met Glu Asp Tyr Glu Lys Leu Ala Ser Asp

290 295 300

Leu Leu Glu Trp Ile Arg Arg Thr Ile Pro Trp Leu Glu Asp Arg Val

305 310 315 320

Pro Gln Lys Thr Ile Gln Glu Met Gln Gln Lys Leu Glu Asp Phe Arg

325 330 335

Asp Tyr Arg Arg Val His Lys Pro Pro Lys Val Gln Glu Lys Cys Gln

340 345 350

Leu Glu Ile Asn Phe Asn Thr Leu Gln Thr Lys Leu Arg Leu Ser Asn

355 360 365

Arg Pro Ala Phe Met Pro Ser Trp Arg Ser Arg Ala Ser Ser Ser Pro

370 375 380

Thr Ser Thr Cys Ala Ala Ser Ser Pro Ala Arg Pro Met Leu Trp Gly

385 390 395 400

Pro Gly Ser Arg Pro Arg Trp Arg Arg Ser Gly Ala Ser Pro Leu Arg

405 410 415

<210> 441

<211> 1251

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> alpha-actinin-_4/m__Homo_sapiens__BAG61782

<400> 441

augguggacu accacgcggc gaaccagucg uaccaguacg gccccagcag cgcgggcaau 60

ggcgcuggcg gcgggggcag caugggcgac uacauggccc aggaggacga cugggaccgg 120

gaccugcugc uggacccggc cugggagaag cagcagcgca agaccuucac ggcauggugc 180

aacucccacc ugcggaaggc aggcacacag aucgagaaca uugaugagga cuuccgagac 240

gggcucaagc ucaugcugcu ccuggagguc auaucagggg agcgguuacc uaagccggag 300

cgggggaaga ugagagugca caaaaucaac aaugugaaca aagcgcugga cuuuauugcc 360

agcaaaggcg ucaagcuggu cuccaucggg gcagaagaga uuguggacgg caacgcaaag 420

augacccugg gaaugaucug gaccaucauc cuuagguucg ccauccagga caucuccgug 480

gaagagaccu cggccaagga agggcuccuu cucuggugcc agagaaagac agccccguau 540

aagaacguca augugcagaa cuuccacauc agcuggaagg auggucuugc cuucaaugcc 600

cugauccacc ggcacagacc agagcugauu gaguaugaca agcugaggaa ggacgacccu 660

gucaccaacc ugaacaaugc cuucgaagug gcugagaaau accucgacau ccccaagaug 720

cuggaugcag aggacaucgu gaacacggcc cggcccgacg agaaggccau aaugaccuau 780

guguccagcu ucuaccaugc cuuuucagga gcgcagaagg cugaaacugc cgccaaccgg 840

aucuguaagg ugcuggcugu caaccaagag aacgagcacc ugauggagga cuacgagaag 900

cuggccagcg accuccugga guggauccgg cgcaccaucc ccuggcugga ggaccgugug 960

ccccaaaaga cuauccagga gaugcagcag aagcuggagg acuuccgcga cuaccggcgu 1020

gugcacaagc cgcccaaggu gcaggagaag ugccagcugg agaucaacuu caacacgcug 1080

cagaccaagc ugcgccucag caaccggccc gccuucaugc ccuccuggag gagcagagca 1140

agcagcaguc caacgagcac cugcgccgcc aguucgccag ccaggccaau guuguggggc 1200

ccuggaucca gaccaagaug gaggagaucg ggcgcaucuc cauugagaug a 1251

<210> 442

<211> 1251

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt1 from

alpha-actinin-_4/m__Homo_sapiens__BAG61782

<400> 442

augguggacu accacgccgc caaccagucc uaccaguacg gccccuccag cgcggggaac 60

ggcgccgggg gcgggggcuc caugggcgac uacauggccc aggaggacga cugggaccgc 120

gaccugcucc uggacccggc cugggagaag cagcagcgga agaccuucac cgccuggugc 180

aacagccacc uccgcaaggc ggggacccag aucgagaaca ucgacgagga cuuccgggac 240

ggccugaagc ugaugcugcu ccuggagguc aucuccgggg agcgccugcc caagcccgag 300

cggggcaaga ugcgcgugca caagaucaac aacgugaaca aggcccucga cuucaucgcc 360

agcaaggggg ucaagcuggu guccaucggc gccgaggaga ucguggacgg caacgcgaag 420

augacccugg ggaugaucug gaccaucauc cuccgguucg ccauccagga caucagcguc 480

gaggagaccu ccgccaagga gggccugcug cucuggugcc agcgcaagac ggcccccuac 540

aagaacguga acgugcagaa cuuccacauc agcuggaagg acgggcuggc cuucaacgcg 600

cugauccacc ggcaccgccc ggagcucauc gaguacgaca agcugcggaa ggacgacccc 660

gucaccaacc ugaacaacgc cuucgaggug gccgagaagu accucgacau ccccaagaug 720

cuggacgccg aggacaucgu gaacaccgcc cgccccgacg agaaggcgau caugaccuac 780

gucuccagcu ucuaccacgc cuucuccggc gcccagaagg ccgagacggc cgcgaaccgg 840

aucugcaagg ugcuggccgu gaaccaggag aacgagcacc ucauggagga cuacgagaag 900

cuggccagcg accugcucga guggauccgc cggaccaucc cguggcugga ggaccgcguc 960

ccccagaaga ccauccagga gaugcagcag aagcuggagg acuuccggga cuaccgccgg 1020

gugcacaagc cgcccaaggu gcaggagaag ugccagcucg agaucaacuu caacacccug 1080

cagacgaagc ugcgccucuc caaccggccc gccuucaugc ccagcuggcg cucccgcgcc 1140

agcuccagcc ccaccagcac gugcgcggcc uccagccccg cccggccgau gcuguggggc 1200

cccggguccc gcccccggug gcgccggagc ggcgccagcc cccugcgcug a 1251

<210> 443

<211> 1251

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt2 from

alpha-actinin-_4/m__Homo_sapiens__BAG61782

<400> 443

auggucgacu accacgccgc caaccagucc uaccaguacg gccccuccuc cgccggcaac 60

ggcgccggcg gcggcggcuc caugggcgac uacauggccc aggaggacga cugggaccgc 120

gaccuccucc ucgaccccgc cugggagaag cagcagcgca agaccuucac cgccuggugc 180

aacucccacc uccgcaaggc cggcacccag aucgagaaca ucgacgagga cuuccgcgac 240

ggccucaagc ucaugcuccu ccucgagguc aucuccggcg agcgccuccc caagcccgag 300

cgcggcaaga ugcgcgucca caagaucaac aacgucaaca aggcccucga cuucaucgcc 360

uccaagggcg ucaagcucgu cuccaucggc gccgaggaga ucgucgacgg caacgccaag 420

augacccucg gcaugaucug gaccaucauc cuccgcuucg ccauccagga caucuccguc 480

gaggagaccu ccgccaagga gggccuccuc cucuggugcc agcgcaagac cgcccccuac 540

aagaacguca acguccagaa cuuccacauc uccuggaagg acggccucgc cuucaacgcc 600

cucauccacc gccaccgccc cgagcucauc gaguacgaca agcuccgcaa ggacgacccc 660

gucaccaacc ucaacaacgc cuucgagguc gccgagaagu accucgacau ccccaagaug 720

cucgacgccg aggacaucgu caacaccgcc cgccccgacg agaaggccau caugaccuac 780

gucuccuccu ucuaccacgc cuucuccggc gcccagaagg ccgagaccgc cgccaaccgc 840

aucugcaagg uccucgccgu caaccaggag aacgagcacc ucauggagga cuacgagaag 900

cucgccuccg accuccucga guggauccgc cgcaccaucc ccuggcucga ggaccgcguc 960

ccccagaaga ccauccagga gaugcagcag aagcucgagg acuuccgcga cuaccgccgc 1020

guccacaagc cccccaaggu ccaggagaag ugccagcucg agaucaacuu caacacccuc 1080

cagaccaagc uccgccucuc caaccgcccc gccuucaugc ccuccuggcg cucccgcgcc 1140

uccuccuccc ccaccuccac cugcgccgcc uccucccccg cccgccccau gcucuggggc 1200

cccggcuccc gcccccgcug gcgccgcucc ggcgccuccc cccuccgcug a 1251

<210> 444

<211> 1251

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt3 from

alpha-actinin-_4/m__Homo_sapiens__BAG61782

<400> 444

augguggacu accacgccgc uaaccagagc uaucaauacg gccccuccuc ugcagggaau 60

ggagccggug gcgggggauc aaugggcgau uauauggcgc aggaggacga uugggacaga 120

gaucugcucc uugacccugc uugggaaaag cagcagagga aaaccuucac agccuggugc 180

aacagucauc ugcggaaggc agguacucaa aucgagaaua uugaugaaga cuuucgcgau 240

ggguugaaau uaaugcugcu acucgagguc auaagcggag aacgacugcc aaagccggag 300

cguggcaaaa ugagaguuca caagaucaac aaugugaaca aggcccuuga cuucauugcu 360

uccaaaggcg uaaagcuggu gucuaucggg gcagaggaaa uugucgaugg aaaugccaaa 420

augacguugg guaugaucug gaccauaauc cucagguuug cuauucagga caucucggug 480

gaggaaacau cagccaagga gggccugcug cucugguguc agcggaaaac ugcgcccuac 540

aagaacguua augugcagaa cuuccauauu agcuggaagg auggguuagc auuuaaugcc 600

cugauccacc gccauagacc ugagcuuaua gaauaugaca aauugaggaa ggacgaucca 660

gucaccaacc ugaauaacgc uuucgaggug gccgaaaaau accuagacau ucccaagaug 720

cucgaugcag aggacaucgu aaauacagcu cggccugaug aaaaagccau uaugaccuau 780

guuaguuccu uuuaccacgc guucucugga gcccaaaagg cagagacugc ugccaaccgc 840

aucugcaaag ugcuggcugu caaccaggag aaugaacacc uuauggagga cuacgaaaag 900

cuggccagcg auuugcucga guggauccga agaacaauuc cauggcugga agacagggug 960

ccccagaaga ccauacagga gaugcaacag aaauuagagg auuuucggga cuaucgucgc 1020

gugcauaagc cuccaaaagu ccaggaaaag ugucaacugg agaucaacuu caauacgcuc 1080

cagacuaaac uuagacuguc caacaggccg gcauuuaugc ccucauggcg gagucgagcc 1140

ucuagcuccc cuaccucaac augcgcugcg agcaguccag cacgccccau guuguggggc 1200

ccugguucua gaccaaggug gcggcgcucc ggggccagcc cccuaagaug a 1251

<210> 445

<211> 1251

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt4 from

alpha-actinin-_4/m__Homo_sapiens__BAG61782

<400> 445

augguggacu accacgccgc caaccagagc uaccaguacg gccccagcag cgccggcaac 60

ggcgccggcg gcggcggcag caugggcgac uacauggccc aggaggacga cugggacaga 120

gaccugcugc uggaccccgc cugggagaag cagcagagaa agaccuucac cgccuggugc 180

aacagccacc ugagaaaggc cggcacccag aucgagaaca ucgacgagga cuucagagac 240

ggccugaagc ugaugcugcu gcuggaggug aucagcggcg agagacugcc caagcccgag 300

agaggcaaga ugagagugca caagaucaac aacgugaaca aggcccugga cuucaucgcc 360

agcaagggcg ugaagcuggu gagcaucggc gccgaggaga ucguggacgg caacgccaag 420

augacccugg gcaugaucug gaccaucauc cugagauucg ccauccagga caucagcgug 480

gaggagacca gcgccaagga gggccugcug cuguggugcc agagaaagac cgcccccuac 540

aagaacguga acgugcagaa cuuccacauc agcuggaagg acggccuggc cuucaacgcc 600

cugauccaca gacacagacc cgagcugauc gaguacgaca agcugagaaa ggacgacccc 660

gugaccaacc ugaacaacgc cuucgaggug gccgagaagu accuggacau ccccaagaug 720

cuggacgccg aggacaucgu gaacaccgcc agacccgacg agaaggccau caugaccuac 780

gugagcagcu ucuaccacgc cuucagcggc gcccagaagg ccgagaccgc cgccaacaga 840

aucugcaagg ugcuggccgu gaaccaggag aacgagcacc ugauggagga cuacgagaag 900

cuggccagcg accugcugga guggaucaga agaaccaucc ccuggcugga ggacagagug 960

ccccagaaga ccauccagga gaugcagcag aagcuggagg acuucagaga cuacagaaga 1020

gugcacaagc cccccaaggu gcaggagaag ugccagcugg agaucaacuu caacacccug 1080

cagaccaagc ugagacugag caacagaccc gccuucaugc ccagcuggag aagcagagcc 1140

agcagcagcc ccaccagcac cugcgccgcc agcagccccg ccagacccau gcuguggggc 1200

cccggcagca gacccagaug gagaagaagc ggcgccagcc cccugagaug a 1251

<210> 446

<211> 1251

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt5 from

alpha-actinin-_4/m__Homo_sapiens__BAG61782

<400> 446

augguggacu accacgccgc uaaccagagc uaucaauacg gccccuccuc ugccgggaau 60

ggagcgggcg ggggaggcag caugggggau uauauggcuc aggaggacga uugggacaga 120

gaucugcucc uggacccugc cugggaaaag cagcagcgga aaaccuucac agccuggugc 180

aacucccauc uucgcaaggc uggaacgcaa aucgagaaua uugaugaaga cuuuagagau 240

ggccugaaac ucaugcugcu ucuggagguc aucucuggcg aacggcuccc gaagcccgag 300

cgcgggaaaa ugagaguuca caagauuaac aaugugaaca aggcccugga cuucaucgcu 360

agcaaaggag ugaagcuggu cuccauuggc gccgaggaaa ucguggaugg gaaugcgaaa 420

augacccucg gaaugaucug gacaauuauc cugcgguuug ccauucagga caucucuguu 480

gaggaaacca gcgcuaagga gggccuucug cucugguguc agcgcaaaac agccccuuac 540

aagaacguga auguccagaa cuuccauauu uccuggaagg augggcuggc uuuuaaugcc 600

cuuauccaca gacaucggcc cgagcugauu gaauaugaca aacuccgcaa ggacgauccu 660

gugaccaacc ugaauaacgc guucgagguu gccgaaaaau accuggacau ccccaagaug 720

cucgaugcug aggacaucgu gaauacagcc agaccugaug aaaaagcuau uaugaccuau 780

gucagcucuu uuuaccacgc cuucuccgga gcccaaaagg cugagacggc ggccaaccgg 840

aucugcaaag ugcuggcugu gaaccaggag aaugaacacc uuauggagga cuacgaaaag 900

cuggccagcg aucuccugga guggauucgc agaaccaucc cguggcuuga agaccggguc 960

ccccagaaga caauucagga gaugcaacag aaacuggagg auuuucgcga cuauagacgg 1020

guucauaagc cucccaaagu gcaggaaaag ugucaacucg agaucaacuu caauacccug 1080

cagacaaaac ugagacucuc uaaccgcccu gccuuuaugc ccuccuggcg gagcagagcu 1140

ucuuccagcc cgaccuccac gugcgccgcg ucuagcccug cucgccccau gcuguggggc 1200

ccuggcuccc ggcccagaug gcgccggagc ggggccucuc cccuuagaug a 1251

<210> 447

<211> 562

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> alpha-actinin-_4/m__Homo_sapiens__B4E337

<400> 447

Met Val Asp Tyr His Ala Ala Asn Gln Ser Tyr Gln Tyr Gly Pro Ser

1 5 10 15

Ser Ala Gly Asn Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Met Gly Asp Tyr Met

20 25 30

Ala Gln Glu Asp Asp Trp Asp Arg Asp Leu Leu Leu Asp Pro Ala Trp

35 40 45

Glu Lys Gln Gln Arg Lys Thr Phe Thr Ala Trp Cys Asn Ser His Leu

50 55 60

Arg Lys Ala Gly Thr Gln Ile Glu Asn Ile Asp Glu Asp Phe Arg Asp

65 70 75 80

Gly Leu Lys Leu Met Leu Leu Leu Glu Val Ile Ser Gly Glu Arg Leu

85 90 95

Pro Lys Pro Glu Arg Gly Lys Met Arg Val His Lys Ile Asn Asn Val

100 105 110

Asn Lys Ala Leu Asp Phe Ile Ala Ser Lys Gly Val Lys Leu Val Ser

115 120 125

Ile Gly Ala Glu Glu Ile Val Asp Gly Asn Ala Lys Met Thr Leu Gly

130 135 140

Met Ile Trp Thr Ile Ile Leu Arg Phe Ala Ile Gln Asp Ile Ser Val

145 150 155 160

Glu Glu Thr Ser Ala Lys Glu Gly Leu Leu Leu Trp Cys Gln Arg Lys

165 170 175

Thr Ala Pro Tyr Lys Asn Val Asn Val Gln Asn Phe His Ile Ser Trp

180 185 190

Lys Asp Gly Leu Ala Phe Asn Ala Leu Ile His Arg His Arg Pro Glu

195 200 205

Leu Ile Glu Tyr Asp Lys Leu Arg Lys Asp Asp Pro Val Thr Asn Leu

210 215 220

Asn Asn Ala Phe Glu Val Ala Glu Lys Tyr Leu Asp Ile Pro Lys Met

225 230 235 240

Leu Asp Ala Glu Asp Ile Val Asn Thr Ala Arg Pro Asp Glu Lys Ala

245 250 255

Ile Met Thr Tyr Val Ser Ser Phe Tyr His Ala Phe Ser Gly Ala Gln

260 265 270

Lys Ala Glu Thr Ala Ala Asn Arg Ile Cys Lys Val Leu Ala Val Asn

275 280 285

Gln Glu Asn Glu His Leu Met Glu Asp Tyr Glu Lys Leu Ala Ser Asp

290 295 300

Leu Leu Glu Trp Ile Gln Arg Thr Ile Pro Trp Leu Glu Asp Arg Val

305 310 315 320

Pro Gln Lys Ala Ile Gln Glu Met Gln Gln Lys Leu Glu Asp Phe Arg

325 330 335

Asp Tyr Arg Arg Val His Lys Pro Pro Lys Val Gln Glu Lys Cys Gln

340 345 350

Leu Glu Ile Asn Phe Asn Thr Leu Gln Thr Lys Leu Arg Leu Ser Asn

355 360 365

Arg Pro Ala Phe Met Pro Ser Glu Gly Lys Met Val Ser Asp Ile Asn

370 375 380

Asn Gly Trp Gln His Leu Glu Gln Ala Glu Lys Gly Tyr Glu Glu Trp

385 390 395 400

Leu Leu Asn Glu Ile Arg Arg Leu Glu Arg Leu Asp His Leu Ala Glu

405 410 415

Lys Phe Arg Gln Lys Ala Ser Ile His Glu Ala Trp Thr Asp Gly Lys

420 425 430

Glu Ala Met Leu Lys His Arg Asp Tyr Glu Thr Ala Thr Leu Ser Asp

435 440 445

Ile Lys Ala Leu Ile Arg Lys His Glu Ala Phe Glu Ser Asp Leu Ala

450 455 460

Ala His Gln Asp Arg Val Glu Gln Ile Ala Ala Ile Ala Gln Glu Leu

465 470 475 480

Asn Glu Leu Asp Tyr Tyr Asp Ser His Asn Val Asn Thr Pro Asp Gly

485 490 495

Leu Gln Glu Gly Pro Gly Gln Pro His Ser Pro Ile Pro Pro Leu Cys

500 505 510

Ile Tyr Ala Lys His Ser Leu Gln Ser Ser Gly Val Gly Gly Trp Ala

515 520 525

Gly Arg Gly Trp Gly Arg Leu Ser Pro Leu Ser Leu Cys Gly Leu Ala

530 535 540

Arg Arg Phe Pro Arg Pro Gly Trp Gly Asp Leu Gly Pro Ala Leu Leu

545 550 555 560

Val Trp

<210> 448

<211> 1689

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> alpha-actinin-_4/m__Homo_sapiens__BAG65349

<400> 448

augguggacu accacgcggc gaaccagucg uaccaguacg gccccagcag cgcgggcaau 60

ggcgcuggcg gcgggggcag caugggcgac uacauggccc aggaggacga cugggaccgg 120

gaccugcugc uggacccggc cugggagaag cagcagcgca agaccuucac ggcauggugc 180

aacucccacc ugcggaaggc aggcacacag aucgagaaca uugaugagga cuuccgagac 240

gggcucaagc ucaugcugcu ccuggagguc auaucagggg agcgguuacc uaagccggag 300

cgggggaaga ugagagugca caaaaucaac aaugugaaca aagcgcugga cuuuauugcc 360

agcaaaggcg ucaagcuggu cuccaucggg gcagaagaga uuguggacgg caacgcaaag 420

augacccugg gaaugaucug gaccaucauc cuuagguucg ccauccagga caucuccgug 480

gaagagaccu cggccaagga agggcuccuu cucuggugcc agagaaagac agccccauau 540

aagaacguca augugcagaa cuuccacauc agcuggaagg auggucuugc cuucaaugcc 600

cugauccacc ggcacagacc agagcugauu gaguaugaca agcugaggaa ggacgacccu 660

gucaccaacc ugaacaaugc cuucgaagug gcugagaaau accucgacau ccccaagaug 720

cuggaugcag aggacaucgu gaacacggcc cggcccgacg agaaggccau aaugaccuau 780

guguccagcu ucuaccaugc cuuuucagga gcgcagaagg cugaaacugc cgccaaccgg 840

aucuguaagg ugcuggcugu caaccaagag aacgagcacc ugauggagga cuacgagaag 900

cuggccagcg accuccugga guggauccag cgcaccaucc ccuggcugga ggaccgugug 960

ccccaaaagg cuauccagga gaugcagcag aagcuggagg acuuccgcga cuaccggcgu 1020

gugcacaagc cgcccaaggu gcaggagaag ugccagcugg agaucaacuu caacacgcug 1080

cagaccaagc ugcgccucag caaccggccc gccuucaugc ccuccgaggg caagaugguc 1140

ucggacauca acaauggcug gcagcacuug gagcaggcug agaagggcua cgaggagugg 1200

cugcugaaug agauccgcag gcuggagcgg cucgaccacc uggcagagaa guuccggcag 1260

aaggccucca uccacgaggc cuggacugac gggaaggaag ccaugcugaa gcaccgggac 1320

uacgagacgg ccacacuauc ggacaucaaa gcccucauuc gcaagcacga ggccuucgag 1380

agcgaccugg cugcgcacca ggaccgcgug gagcagaucg ccgccauugc ccaggagcuc 1440

aacgagcugg auuacuacga cucccacaau gucaacaccc ccgacggccu ccaggagggg 1500

ccugggcagc cccacagucc cauuccucca cucuguaucu augcaaagca cucucugcag 1560

uccuccgggg ugggugggug ggcagggagg ggcuggggca ggcucucucc ucucucucuu 1620

uguggguugg ccaggagguu cccccgacca gguuggggag acuuggggcc agcgcuucug 1680

gucugguaa 1689

<210> 449

<211> 1689

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt1 from

alpha-actinin-_4/m__Homo_sapiens__BAG65349

<400> 449

augguggacu accacgccgc caaccagagc uaccaguacg gccccuccag cgcggggaac 60

ggcgccgggg gcgggggcuc caugggcgac uacauggccc aggaggacga cugggaccgc 120

gaccugcucc uggacccggc cugggagaag cagcagcgga agaccuucac cgccuggugc 180

aacagccacc uccgcaaggc ggggacgcag aucgagaaca ucgacgagga cuuccgggac 240

ggccugaagc ugaugcugcu ccuggagguc aucuccgggg agcgccugcc caagcccgag 300

cggggcaaga ugcgcgugca caagaucaac aacgugaaca aggcccucga cuucaucgcc 360

agcaaggggg ucaagcuggu guccaucggc gccgaggaga ucguggacgg caacgcgaag 420

augacccugg ggaugaucug gaccaucauc cuccgguucg ccauccagga caucagcguc 480

gaggagaccu ccgccaagga gggccugcug cucuggugcc agcgcaagac ggcccccuac 540

aagaacguga acgugcagaa cuuccacauc agcuggaagg acgggcuggc cuucaacgcg 600

cugauccacc ggcaccgccc ggagcucauc gaguacgaca agcugcggaa ggacgacccc 660

gucaccaacc ugaacaacgc cuucgaggug gccgagaagu accucgacau ccccaagaug 720

cuggacgccg aggacaucgu gaacaccgcc cgccccgacg agaaggcgau caugaccuac 780

gucuccagcu ucuaccacgc cuucuccggc gcccagaagg ccgagacggc cgcgaaccgg 840

aucugcaagg ugcuggccgu gaaccaggag aacgagcacc ucauggagga cuacgagaag 900

cuggccagcg accugcucga guggauccag cgcaccaucc cguggcugga ggaccggguc 960

ccccagaagg ccauccagga gaugcagcag aagcuggagg acuuccgcga cuaccggcgc 1020

gugcacaagc cgcccaaggu gcaggagaag ugccagcucg agaucaacuu caacacccug 1080

cagaccaagc ugcggcucuc caaccgcccc gccuucaugc ccagcgaggg caagaugguc 1140

uccgacauca acaacgggug gcagcaccug gagcaggcgg agaagggcua cgaggagugg 1200

cugcucaacg agauccggcg ccuggagcgc cuggaccacc ucgccgagaa guuccggcag 1260

aaggccagca uccacgaggc cuggacggac gggaaggagg cgaugcugaa gcaccgcgac 1320

uacgagaccg ccacccuguc cgacaucaag gcccucaucc ggaagcacga ggccuucgag 1380

agcgaccugg ccgcgcacca ggaccgcgug gagcagaucg ccgccaucgc ccaggagcug 1440

aacgagcucg acuacuacga cagccacaac gugaacaccc ccgacggccu gcaggagggg 1500

cccggccagc cgcacucccc caucccgccc cugugcaucu acgccaagca cagccuccag 1560

uccagcggcg ucgggggcug ggcggggcgg ggcugggggc gccugagccc ccugucccug 1620

ugcggccucg cccggcgcuu cccccggccc ggcuggggcg accuggggcc cgcccugcuc 1680

gugugguga 1689

<210> 450

<211> 1689

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt2 from

alpha-actinin-_4/m__Homo_sapiens__BAG65349

<400> 450

auggucgacu accacgccgc caaccagucc uaccaguacg gccccuccuc cgccggcaac 60

ggcgccggcg gcggcggcuc caugggcgac uacauggccc aggaggacga cugggaccgc 120

gaccuccucc ucgaccccgc cugggagaag cagcagcgca agaccuucac cgccuggugc 180

aacucccacc uccgcaaggc cggcacccag aucgagaaca ucgacgagga cuuccgcgac 240

ggccucaagc ucaugcuccu ccucgagguc aucuccggcg agcgccuccc caagcccgag 300

cgcggcaaga ugcgcgucca caagaucaac aacgucaaca aggcccucga cuucaucgcc 360

uccaagggcg ucaagcucgu cuccaucggc gccgaggaga ucgucgacgg caacgccaag 420

augacccucg gcaugaucug gaccaucauc cuccgcuucg ccauccagga caucuccguc 480

gaggagaccu ccgccaagga gggccuccuc cucuggugcc agcgcaagac cgcccccuac 540

aagaacguca acguccagaa cuuccacauc uccuggaagg acggccucgc cuucaacgcc 600

cucauccacc gccaccgccc cgagcucauc gaguacgaca agcuccgcaa ggacgacccc 660

gucaccaacc ucaacaacgc cuucgagguc gccgagaagu accucgacau ccccaagaug 720

cucgacgccg aggacaucgu caacaccgcc cgccccgacg agaaggccau caugaccuac 780

gucuccuccu ucuaccacgc cuucuccggc gcccagaagg ccgagaccgc cgccaaccgc 840

aucugcaagg uccucgccgu caaccaggag aacgagcacc ucauggagga cuacgagaag 900

cucgccuccg accuccucga guggauccag cgcaccaucc ccuggcucga ggaccgcguc 960

ccccagaagg ccauccagga gaugcagcag aagcucgagg acuuccgcga cuaccgccgc 1020

guccacaagc cccccaaggu ccaggagaag ugccagcucg agaucaacuu caacacccuc 1080

cagaccaagc uccgccucuc caaccgcccc gccuucaugc ccuccgaggg caagaugguc 1140

uccgacauca acaacggcug gcagcaccuc gagcaggccg agaagggcua cgaggagugg 1200

cuccucaacg agauccgccg ccucgagcgc cucgaccacc ucgccgagaa guuccgccag 1260

aaggccucca uccacgaggc cuggaccgac ggcaaggagg ccaugcucaa gcaccgcgac 1320

uacgagaccg ccacccucuc cgacaucaag gcccucaucc gcaagcacga ggccuucgag 1380

uccgaccucg ccgcccacca ggaccgcguc gagcagaucg ccgccaucgc ccaggagcuc 1440

aacgagcucg acuacuacga cucccacaac gucaacaccc ccgacggccu ccaggagggc 1500

cccggccagc cccacucccc cauccccccc cucugcaucu acgccaagca cucccuccag 1560

uccuccggcg ucggcggcug ggccggccgc ggcuggggcc gccucucccc ccucucccuc 1620

ugcggccucg cccgccgcuu cccccgcccc ggcuggggcg accucggccc cgcccuccuc 1680

gucugguga 1689

<210> 451

<211> 1689

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt3 from

alpha-actinin-_4/m__Homo_sapiens__BAG65349

<400> 451

augguggacu accacgcugc uaaccagagc uaucaauacg gccccuccuc ugcagggaau 60

ggagccggug gcgggggauc aaugggcgau uauauggcgc aggaggacga uugggacaga 120

gaucugcucc uugacccugc uugggaaaag cagcagagga aaaccuucac agccuggugc 180

aacagucauc ugcggaaggc agguacucaa aucgagaaua uugaugaaga cuuucgcgau 240

ggguugaaau uaaugcugcu acucgagguc auaagcggag aacgacugcc aaagccggag 300

cguggcaaaa ugagaguuca caagaucaac aaugugaaca aggcccuuga cuucauugcu 360

uccaaaggcg uaaagcuggu gucuaucggg gcagaggaaa uugucgaugg aaaugccaaa 420

augacguugg guaugaucug gaccauaauc cucagguuug cuauucagga caucucggug 480

gaggaaacau cagccaagga gggccugcug cucugguguc agcggaaaac ugcgcccuac 540

aagaacguua augugcagaa cuuccauauu agcuggaagg auggguuagc auuuaaugcc 600

cugauccacc gccauagacc ugagcuuaua gaauaugaca aauugaggaa ggacgaucca 660

gucaccaacc ugaauaacgc uuucgaggug gccgaaaaau accuagacau ucccaagaug 720

cucgaugcag aggacaucgu aaauacagcu cggccugaug aaaaagccau uaugaccuau 780

guuaguuccu uuuaccacgc guucucugga gcccaaaagg cagagacugc ugccaaccgc 840

aucugcaaag ugcuggcugu caaccaggag aaugaacacc uuauggagga cuacgaaaag 900

cuggccagcg auuugcucga guggauccag cgaacaauuc cauggcugga agacagagug 960

ccccagaagg caauacaaga gaugcagcag aaauuagagg auuuuaggga cuaucggcgu 1020

gugcauaagc cuccaaaagu ccaagaaaag ugucagcugg agaucaacuu caauacccuc 1080

cagacgaaac uucgccuguc caacagaccg gccuuuaugc ccucagaagg caagaugguu 1140

agugauauua auaacgguug gcagcacuug gagcaagcug aaaaggggua cgaggagugg 1200

cuacugaaug aaaucaggcg gcucgagcga cuggaccauc uugcggaaaa auuccgccag 1260

aaggcaagca uacacgaggc cuggacugac ggaaaagagg cuaugcugaa gcacagagau 1320

uaugaaaccg ccacauuguc ugacauuaaa gcacucauca ggaagcauga ggccuuugaa 1380

uccgaucugg cugcccacca ggaccgggug gagcagaucg cagcgauugc ucaagaauua 1440

aacgagcugg auuacuauga cucacauaau guaaacacuc cugauggccu acaggagggc 1500

ccagggcagc cccacagccc uaucccaccc cucugcauuu acgccaagca uagucugcag 1560

ucuuccggag uggguggcug ggcagggcgc ggauggggca gacuuagccc guugucgcug 1620

uguggucucg ccaggcguuu cccucggccc ggguggggcg accugggacc agcccuucug 1680

gucugguga 1689

<210> 452

<211> 1689

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt4 from

alpha-actinin-_4/m__Homo_sapiens__BAG65349

<400> 452

augguggacu accacgccgc caaccagagc uaccaguacg gccccagcag cgccggcaac 60

ggcgccggcg gcggcggcag caugggcgac uacauggccc aggaggacga cugggacaga 120

gaccugcugc uggaccccgc cugggagaag cagcagagaa agaccuucac cgccuggugc 180

aacagccacc ugagaaaggc cggcacccag aucgagaaca ucgacgagga cuucagagac 240

ggccugaagc ugaugcugcu gcuggaggug aucagcggcg agagacugcc caagcccgag 300

agaggcaaga ugagagugca caagaucaac aacgugaaca aggcccugga cuucaucgcc 360

agcaagggcg ugaagcuggu gagcaucggc gccgaggaga ucguggacgg caacgccaag 420

augacccugg gcaugaucug gaccaucauc cugagauucg ccauccagga caucagcgug 480

gaggagacca gcgccaagga gggccugcug cuguggugcc agagaaagac cgcccccuac 540

aagaacguga acgugcagaa cuuccacauc agcuggaagg acggccuggc cuucaacgcc 600

cugauccaca gacacagacc cgagcugauc gaguacgaca agcugagaaa ggacgacccc 660

gugaccaacc ugaacaacgc cuucgaggug gccgagaagu accuggacau ccccaagaug 720

cuggacgccg aggacaucgu gaacaccgcc agacccgacg agaaggccau caugaccuac 780

gugagcagcu ucuaccacgc cuucagcggc gcccagaagg ccgagaccgc cgccaacaga 840

aucugcaagg ugcuggccgu gaaccaggag aacgagcacc ugauggagga cuacgagaag 900

cuggccagcg accugcugga guggauccag agaaccaucc ccuggcugga ggacagagug 960

ccccagaagg ccauccagga gaugcagcag aagcuggagg acuucagaga cuacagaaga 1020

gugcacaagc cccccaaggu gcaggagaag ugccagcugg agaucaacuu caacacccug 1080

cagaccaagc ugagacugag caacagaccc gccuucaugc ccagcgaggg caagauggug 1140

agcgacauca acaacggcug gcagcaccug gagcaggccg agaagggcua cgaggagugg 1200

cugcugaacg agaucagaag acuggagaga cuggaccacc uggccgagaa guucagacag 1260

aaggccagca uccacgaggc cuggaccgac ggcaaggagg ccaugcugaa gcacagagac 1320

uacgagaccg ccacccugag cgacaucaag gcccugauca gaaagcacga ggccuucgag 1380

agcgaccugg ccgcccacca ggacagagug gagcagaucg ccgccaucgc ccaggagcug 1440

aacgagcugg acuacuacga cagccacaac gugaacaccc ccgacggccu gcaggagggc 1500

cccggccagc cccacagccc cauccccccc cugugcaucu acgccaagca cagccugcag 1560

agcagcggcg ugggcggcug ggccggcaga ggcuggggca gacugagccc ccugagccug 1620

ugcggccugg ccagaagauu ccccagaccc ggcuggggcg accugggccc cgcccugcug 1680

gugugguga 1689

<210> 453

<211> 1689

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> derived and/or modified sequence opt5 from

alpha-actinin-_4/m__Homo_sapiens__BAG65349

<400> 453

augguggacu accacgccgc uaaccagagc uaucaauacg gccccuccuc ugccgggaau 60

ggagcgggcg ggggaggcag caugggggau uauauggcuc aggaggacga uugggacaga 120

gaucugcucc uggacccugc cugggaaaag cagcagcgga aaaccuucac agccuggugc 180

aacucccauc uucgcaaggc uggaacgcaa aucgagaaua uugaugaaga cuuuagagau 240

ggccugaaac ucaugcugcu ucuggagguc aucucuggcg aacggcuccc gaagcccgag 300

cgcgggaaaa ugagaguuca caagauuaac aaugugaaca aggcccugga cuucaucgcu 360

agcaaaggag ugaagcuggu cuccauuggc gccgaggaaa ucguggaugg gaaugcgaaa 420

augacccucg gaaugaucug gacaauuauc cugcgguuug ccauucagga caucucuguu 480

gaggaaacca gcgcuaagga gggccuucug cucugguguc agcgcaaaac agccccuuac 540

aagaacguga auguccagaa cuuccauauu uccuggaagg augggcuggc uuuuaaugcc 600

cuuauccaca gacaucggcc cgagcugauu gaauaugaca aacuccgcaa ggacgauccu 660

gugaccaacc ugaauaacgc guucgagguu gccgaaaaau accuggacau ccccaagaug 720

cucgaugcug aggacaucgu gaauacagcc agaccugaug aaaaagcuau uaugaccuau 780

gucagcucuu uuuaccacgc cuucuccgga gcccaaaagg cugagacggc ggccaaccgg 840

aucugcaaag ugcuggcugu gaaccaggag aaugaacacc uuauggagga cuacgaaaag 900

cuggccagcg aucuccugga guggauucag cgcaccaucc cguggcuuga agacagaguc 960

ccccagaagg ccauucaaga gaugcagcag aaacuggagg auuuucggga cuaucgcaga 1020

guucauaagc cucccaaagu gcaagaaaag ugucagcucg agaucaacuu caauacacug 1080

cagaccaaac ugcggcucuc uaacagaccu gcuuuuaugc ccuccgaagg caagauggug 1140

agcgauauca auaacggcug gcagcaccug gagcaagccg aaaaggggua cgaggagugg 1200

cuucugaaug aaauucgccg gcucgagaga cuggaccauc uugcggaaaa auuccgccag 1260

aaggcuucua uccacgaggc cuggacagac ggaaaagagg ccaugcugaa gcaccgggau 1320

uaugaaaccg cuacgcucuc cgacauuaaa gcccugauca gaaagcauga ggcuuuugaa 1380

agcgaucugg ccgcgcacca ggaccgcguc gagcagauug ccgcuaucgc ccaagaacuc 1440

aacgagcugg auuacuauga cucccauaau gugaacacac cggauggccu ucaggagggg 1500

ccuggacagc cccacucucc uaucccuccc cugugcauuu acgcuaagca uagccuccag 1560

uccagcggcg uugggggaug ggccggccgg ggcuggggga gacugucucc ccugucccuu 1620

uguggacucg cgcgccgguu cccgagaccc ggcuggggag accuggggcc ugcccugcuc 1680

gugugguga 1689

<210> 454

<211> 911

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> alpha-actinin-_4/m__Homo_sapiens__O43707

<400> 454

Met Val Asp Tyr His Ala Ala Asn Gln Ser Tyr Gln Tyr Gly Pro Ser

1 5 10 15

Ser Ala Gly Asn Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Met Gly Asp Tyr Met

20 25 30

Ala Gln Glu Asp Asp Trp Asp Arg Asp Leu Leu Leu Asp Pro Ala Trp

35 40 45

Glu Lys Gln Gln Arg Lys Thr Phe Thr Ala Trp Cys Asn Ser His Leu

50 55 60

Arg Lys Ala Gly Thr Gln Ile Glu Asn Ile Asp Glu Asp Phe Arg Asp

65 70 75 80

Gly Leu Lys Leu Met Leu Leu Leu Glu Val Ile Ser Gly Glu Arg Leu

85 90 95

Pro Lys Pro Glu Arg Gly Lys Met Arg Val His Lys Ile Asn Asn Val

100 105 110

Asn Lys Ala Leu Asp Phe Ile Ala Ser Lys Gly Val Lys Leu Val Ser

115 120 125

Ile Gly Ala Glu Glu Ile Val Asp Gly Asn Ala Lys Met Thr Leu Gly

130 135 140

Met Ile Trp Thr Ile Ile Leu Arg Phe Ala Ile Gln Asp Ile Ser Val

145 150 155 160

Glu Glu Thr Ser Ala Lys Glu Gly Leu Leu Leu Trp Cys Gln Arg Lys

165 170 175

Thr Ala Pro Tyr Lys Asn Val Asn Val Gln Asn Phe His Ile Ser Trp

180 185 190

Lys Asp Gly Leu Ala Phe Asn Ala Leu Ile His Arg His Arg Pro Glu

195 200 205

Leu Ile Glu Tyr Asp Lys Leu Arg Lys Asp Asp Pro Val Thr Asn Leu

210 215 220

Asn Asn Ala Phe Glu Val Ala Glu Lys Tyr Leu Asp Ile Pro Lys Met

225 230 235 240

Leu Asp Ala Glu Asp Ile Val Asn Thr Ala Arg Pro Asp Glu Lys Ala

245 250 255

Ile Met Thr Tyr Val Ser Ser Phe Tyr His Ala Phe Ser Gly Ala Gln

260 265 270

Lys Ala Glu Thr Ala Ala Asn Arg Ile Cys Lys Val Leu Ala Val Asn

275 280 285

Gln Glu Asn Glu His Leu Met Glu Asp Tyr Glu Lys Leu Ala Ser Asp