ВАКЦИНА ПРОТИВ РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОГО ВИРУСА (РСВ)

Настоящее изобретение относится к последовательности мРНК, содержащей кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмент, вариант или производное. Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей несколько последовательностей мРНК, содержащих кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмент, вариант или производное.

Кроме того, описано также применение последовательности мРНК или композиции, содержащей несколько последовательностей мРНК, для приготовления фармацевтической композиции, прежде всего вакцины, например, для применения для профилактики или лечения вызываемых РСВ инфекций. В настоящем изобретении описан также способ лечения или профилактики вызываемых РСВ инфекцией с использованием последовательности мРНК.

Общее медицинское значение и экономическая роль РСВ являются очень большими. Этот вирус является наиболее важным причинным фактором острых инфекций нижней части дыхательных путей (ALRI), приводящих к необходимости посещения медицинских учреждений в период младенчества и раннего детского возраста. Например, в Соединенных Штатах более 60% младенцев заражаются РСВ в течение их первого РСВ-сезона, и практически все заражались к возрасту 2-3 года. В США примерно 2,1 миллиона детей возрастом менее 5 лет каждый год проходят лечение от вызываемого РСВ заболевания: 3% в стационаре, 25% в отделении неотложной помощи и 73% у практикующих педиаторов. В целом, среди детей возрастом менее 5 лет случаи ALRI, вызываемые РСВ, составляют 33,8 миллиона каждый год (более 22% всех случаев ALRI), приводя к 66000-199000 смертям, из которых 99% приходится на развивающиеся страны. RSV является также обычной причиной респираторного заболевания у пожилых людей, приводя к такому же количеству госпитализаций, что и грипп в популяции, интенсивно иммунизированной против гриппа. РСВ распространяется воздушно-капельным путем и путем непосредственного контакта с инфицированными людьми или загрязненными предметами. В умеренном климате существуют ежегодные зимние эпидемии. Младенцы имеют наиболее высокий риск серьезного связанного с РСВ заболевания в течение первых 6 месяцев их жизни, и пики госпитализации приходятся на 2-3-месячный возраст. Преждевременные роды и наличие сердечно-легочного заболевания являются факторами риска серьезного связанного с РСВ заболевания. Заражение РСВ младенцев вызывает частичный защитный иммунитет, который, вероятно, снижается быстрее, чем иммунитет против большинства других респираторных вирусов. Большинство младенцев, зараженных РСВ в течение первого года их жизни, повторно инфицируются на следующий год, что, как правило, приводит к менее серьезному заболеванию. Повторяющиеся заражения продолжаются в течение всей жизни, часто с проявлением симптомов в верхней части дыхательных путей, а иногда с вовлечением более низкой части дыхательных путей и синуса. Рекомендованные для лечения РСВ бронхолитические средства обеспечивают в основном поддержание дыхания и гидратацию. Отсутствуют рекомендации по осуществлению какой-либо специфической противовирусной терапии. Для профилактики младенцев с наиболее высоким риском серьезной инфекции применяют нейтрализующее моноклональное антитело паливизумаб, но оно является слишком дорогим и непригодным для универсального практического применения. В настоящее время отсутствует лицензированная вакцина против РСВ, и создание безопасной и эффективной вакцины против РСВ является общей приоритетной задачей здравоохранения.

При испытании вакцины в 1960-ых годах младенцев и детей младшего возраста иммунизировали препаратом инактивированного формалином (FI) полного вириона РСВ (FI-PCB) или эквивалентным препаратом на основе парамиксовируса (FI-PIV). Пять процентов индивидуумов, которых иммунизировали FI-PIV и которые затем в течение следующего сезона РСВ заражались встречающимся в естественных условиях РСВ, были госпитализированы; 80% индивидуумов, которых иммунизировали FI-PCB, и которые затем заражались РСВ, были госпитализированы, а два ребенка умерли. Указанное усиление вызываемой РСВ инфекции в результате вакцинации представляет собой конкретную проблему при разработке вакцин против вызываемых РСВ инфекций (см. обзор Shaw и др., Curr Opin Virol. 3(3), июнь 2013 г., сс. 332-342. doi: 10.1016/j.coviro.2013.05.003. Epub 30 мая 2013 г.).

Таким образом, самой большой нерешенной проблемой, связанной с вызываемыми респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ) инфекциями у детей в развитых странах, остается разработка вакцины для младенцев, важным является также отсутствие вакцины для младенцев во всех мире. Более чем 40-летние усилия пока не дали результатов и не привели к разработке лицензированной вакцины против РСВ для людей.

В целом, следует отметить, что РСВ, который принадлежит к вирусам семейства Paramyxoviridae, является одним из наиболее контагиозных патогенов и вносит значительный вклад в серьезные инфекции дыхательных путей у младенцев, пожилых людей и пациентов с ослабленным иммунитетом.

Как указано выше, в настоящее время на рынке имеется гуманизированное моноклональное антитело к белку F вирусной поверхности, которое представляет собой единственный профилактический продукт, рекомендованный для младенцев, которые относятся к группе высокого риска, включая преждевременно родившихся младенцев и младенцев с хроническим легочным заболеванием (The IMpact-RSV Study Group. Palivizumab, a Humanized Respiratory Syncytial Virus Monoclonal Antibody, Reduces Hospitalization From Respiratory Syncytial Virus Infection in High-risk Infants. Pediatrics, 102(3), 1998, cc. 531-537, Tablan и др., Guidelines for preventing health-care--associated pneumonia, 2003: recommendations of CDC and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee. MMWR. Recommendations and Reports: Morbidity and Mortality Weekly Report. Recommendations and Reports / Centers for Disease Control, 53(RR-3), 2003, cc. 1-36).

Современные исследования, проведенные на животных моделях, продемонстрировали, что при применении в достаточных количествах нейтрализующие антитела, мишенью которых является F-белок РСВ, ограничивают вирусную репликацию, что приводит к менее серьезному течению болезни (Singh S.R. и др., Immunogenicity and efficacy of recombinant RSV-F vaccine in a mouse model. Vaccine, 25(33), 2007, cc. 6211-6223, Zhan X. и др., Respiratory syncytial virus (RSV) F protein expressed by recombinant Sendai virus elicits B-cell and T-cell responses in cotton rats and confers protection against RSV subtypes A and B. Vaccine, 25(52), 2007, cc. 8782-8793., Vaughan K. и др., DNA immunization against respiratory syncytial virus (RSV) in infant rhesus monkeys. Vaccine, 23(22), 2005, cc. 2928-2942).

Кроме того, удалось установить, что для клиренса вируса и снижения серьезности заболевания требуется сбалансированная функция регуляторных и эффекторных Т-клеток (Liu J. и др., Epitope-specific regulatory CD4 Т cells reduce virus-induced illness while preserving CD8 T-cell effector function at the site of infection. Journal of Virology, 84(20), 2010, cc. 10501-10509).

Помимо указанного выше гуманизированного моноклонального антитела разработана вакцина на основе живого ослабленного вируса, которая вызывает сильный иммунный ответ, но которая не рекомендована для применения на определенных целевых группах (младенцы, дети, пожилые люди и пациенты с ослабленным иммунитетом). Кроме того, ДНК-векторы, экспрессирующие F-белок РСВ, которые несут В-клеточные эпитопы, применяли для индукции производства нейтрализующих антител. В этом контексте в WO 2008/077527 и WO 96/040945 описаны векторы, которые содержат последовательности ДНК, кодирующие F-белок РСВ, предназначенные для применения в качестве вакцин. Однако применение ДНК в качестве вакцины может быть опасным из-за нежелательного встраивания в геном, что может приводить к нарушению функциональных генов и раку или образованию антител к ДНК.

Таким образом, в основу настоящего изобретения положена задача создать последовательность мРНК, кодирующую антигенные пептиды или белки респираторно-синцитиального вируса (РСВ), для применения в качестве вакцины для профилактики или лечения вызываемых РСВ инфекцией, прежде всего у младенцев, пожилых людей и пациентов с ослабленным иммунитетом.

Указанные задачи решаются с помощью объектов изобретения, представленных в прилагаемой формуле изобретения. Задачи, положенные в основу настоящего изобретения решаются, прежде всего, согласно первому объекту изобретения с помощью предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, содержащей кодирующую последовательность, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмент, вариант или производное.

Для целей ясности и удобочитаемости представлены указанные ниже определения. Все технические особенности, упомянутые в этих определениях, могут относиться ко всем до единого вариантам осуществления изобретения. В контексте указанных вариантов осуществления изобретения могут быть специально даны дополнительные определения и пояснения.

Иммунная система: Иммунная система может защищать организмы от инфекции. Если патогену удалось преодолеть физический барьер организма и попасть в указанный организм, то врожденная иммунная система обеспечивает немедленный, но неспецифический ответ. Если патоген ускользает от этого врожденного ответа, у позвоночных имеется второй уровень защиты, представляющий собой адаптивную иммунную систему. В этом случае иммунная система адаптирует свой ответ в процессе инфекции для улучшения распознавания патогена. Затем этот улучшенный ответ сохраняется после элиминации патогена в форме иммунологической памяти и позволяет адаптивной иммунной системе организовывать более быстрые и сильные атаки каждый раз при проникновении указанного патогена. Таким образом, иммунная система включает врожденную и адаптивную иммунную систему. Каждая из этих двух частей, как правило, включает так называемые гуморальный и клеточный компоненты.

Иммунный ответ: Иммунный ответ может, как правило, представлять собой либо специфическую реакцию адаптивной иммунной системы на конкретный антиген (так называемый специфический или адаптивный иммунный ответ), либо неспецифическую реакцию врожденной иммунной системы (так называемый неспецифический или врожденный иммунный ответ). Изобретение относится, прежде всего, к специфическим реакциям (адаптивные иммунные ответы) адаптивной иммунной системы. В частности, оно относится к адаптивным иммунным ответам на инфекции, вызываемые вирусами, например, такие, как вызываемые РСВ инфекции. Однако указанная специфическая реакция может поддерживаться дополнительной неспецифической реакцией (врожденный иммунный ответ). Таким образом, изобретение относится также к соединению, предназначенному для одновременной стимуляции врожденной и адаптивной иммунной системы для инициации эффективного адаптивного иммунного ответа.

Адаптивная иммунная система: Адаптивная иммунная система состоит из высокоспециализированных системных клеток и процессов, которые элиминируют или предупреждают рост патогенов. Адаптивная иммунная система придает иммунной системе позвоночных способность распознавать и запоминать специфические патогены (для создания иммунитета) и организовывать более сильную атаку в каждом случае при обнаружении патогена. Система обладает высокой способностью к адаптации вследствие соматической гипермутации (процесс ускоренных соматических мутаций) и V(D)J-рекомбинации (необратимая генетическая рекомбинация сегментов гена рецептора антигена). Этот механизм позволяет небольшому количеству генов создавать огромное количество различных рецепторов антигенов, которые затем уникальным образом экспрессируются на каждом индивидуальном лимфоците. Поскольку перестройка гена приводит к необратимому изменению ДНК каждой клетки, то все потомство такой клетки должно затем наследовать гены, кодирующие ту же самую рецепторную специфичность, включая В-клетки памяти и Т-клетки памяти, которые имеют решающее значение для долговременного специфического иммунитета. Теория иммунной сети представляет собой теорию, описывающую работу адаптивной иммунной системы, которая базируется на взаимодействиях между вариабельными областями рецепторов Т-клеток, В-клеток и молекул, образованных Т-клетками и В-клетками, которые имеют вариабельные области.

Адаптивный иммунный ответ: Как правило, под адаптивным иммунным ответом понимают антигенспецифический ответ иммунной системы. Специфичность в отношении антигена позволяет вырабатывать ответы, приспособленные к специфическим антигенам, патогенам или инфицированным патогеном клеткам. Способность создавать такие приспособленные ответы, как правило, поддерживается в организме «клетками памяти». Если патоген инфицирует организм более одного раза, то указанные специфические клетки памяти используются для его быстрой элиминации. В этом контексте первая стадия адаптивного иммунного ответа представляет собой активацию наивных антигенспецифических Т-клеток или различных иммунных клеток, способных индуцировать антигенспецифический иммунный ответ, антигенпрезентирующими клетками. Это происходит в лимфоидных тканях и органах, через которые постоянно проходят наивные Т-клетки. К типам клеток, которые могут служить в качестве антигенпрезентирующих клеток, относятся, среди прочего, дендритные клетки, макрофаги и В-клетки. Каждая из указанных клеток выполняет отдельную функцию при вызывании иммунных ответов. Дендритные клетки могут поглощать антигены посредством фагоцитоза и макропиноцитоза, и они могут стимулироваться при контакте, например, с чужим антигеном, к миграции в местную лимфоидную ткань, где может происходить их дифференцировка в зрелые дендритные клетки. Макрофаги поглощают находящиеся в форме частиц антигены, такие как бактерии, и могут индуцироваться инфекционными агентами или другими соответствующими стимулами и экспрессировать в результате этого молекулы ГКГС. Уникальная способность В-клеток к связыванию и интернализации растворимых белковых антигенов посредством своих рецепторов также может иметь важное значение для индукции Т-клеток. ГКГС-молекулы, как правило, ответственны за презентацию антигена Т-клеткам. При этом презентация антигена на молекулах ГКГС приводит к активации Т-клеток, что индуцирует их пролиферацию и дифференцировку в «вооруженные» эффекторные Т-клетки. Наиболее важной функцией эффекторных Т-клеток является уничтожение инфицированных клеток цитотоксическими CD8⁺-Т-клетками и активация макрофагов Th1-клетками, что в совокупности создает опосредованный клетками (клеточный) иммунитет, и активация В-клеток и Th2-, и Th1-клетками, приводящая к образованию различных классов антител, в результате чего создается гуморальный иммунный ответ. Т-клетки распознают антиген посредством своих Т-клеточных рецепторов, которые не распознают антиген и не связываются с ним непосредственно, но вместо этого распознают короткие пептидные фрагменты, например, происходящих из патогена белковых антигенов, которые связываются с молекулами ГКГС на поверхностях других клеток.

Клеточный иммунитет/клеточный иммунный ответ: Клеточный иммунитет относится, как правило, к активации макрофагов, естественных клеток-киллеров (NK), антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов и высвобождению различных цитокинов в ответ на антиген. В более общем смысле клеточный иммунитет основан не на антителах, а на активации клеток иммунной системы. Как правило, клеточный иммунный ответ может характеризоваться, например, активацией антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов, которые способны индуцировать апоптоз клеток организма, экспонирующих эпитопы антигенов на своей поверхности, таких как инфицированные вирусом клетки, клетки с внутриклеточными бактериями или раковые клетки, экспонирующие опухолевые антигены; активацией макрофагов и естественных клеток-киллеров, позволяющей им разрушать патогены; и стимуляцией клеток к секреции различных цитокинов, которые влияют на функцию других клеток, участвующих в адаптивных иммунных ответах и врожденных иммунных ответах.

Гуморальный иммунитет/гуморальный иммунный ответ: Гуморальный иммунитет, как правило, относится к производству антител и необязательно к второстепенным процессам, которые могут сопровождать его. Гуморальный иммунный ответ, как правило, может характеризоваться, например, активацией Th2 и производством цитокинов, образованием зародышевого центра и переключением изотипа, созреванием аффинности и образованием клеток памяти. Гуморальный иммунитет, как правило, может относиться также к эффекторным функциям антител, включая нейтрализацию патогенов и токсинов, классическую активацию комплемента и стимулирование опсонинами фагоцитоза и элиминации патогенов.

Врожденная иммунная система: Врожденная иммунная система, которую называют также неспецифической иммунной системой, как правило, включает клетки и механизмы, которые неспецифически защищают хозяина от заражения другими организмами. Это означает, что клетки врожденной системы могут распознавать патогены и реагировать на них обычным путем, но, в отличие от адаптивной иммунной системы, она не обеспечивает долговременный или защитный иммунитет хозяину. Врожденная иммунная система может, например, активироваться лигандами патоген-ассоциированных распознающих молекулярные паттерны (РАМР) рецепторов, например, Толл-подобных рецепторов (TLR), или другими вспомогательными субстанциями, такими как липополисахариды, TNF-альфа, лиганд CD40 или цитокины, монокины, лимфокины, интерлейкины или хемокины, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-альфа, IFN-бета, IFN-гамма, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-бета, TNF-альфа, факторы роста и hGH, лиганд человеческого Толл-подобного рецептора TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, лиганд мышиного Толл-подобного рецептора TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 или TLR13, лиганд NOD-подобного рецептора, лиганд RIG-I-подобного рецептора, иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, иммуностимулирующая РНК (isPHK), CpG-ДНК, антибактериальный агент или противовирусный агент. Как правило, ответ врожденной иммунной системы включает рекрутинг иммунных клеток к областям заражения посредством производства химических факторов, включая специализированные химические медиаторы, которые называют цитокинами; активацию каскада комплемента; идентификацию и удаление чужих субстанций, присутствующих в органах, тканях, крови и лимфе, специализированными лейкоцитами; активацию адаптивной иммунной системы посредством процесса, известного как презентация антигена; и/или функционирование в качестве физического и химического барьера для инфекционных агентов.

Адъювант/адъювантный компонент: Адъювант или адъювантный компонент в наиболее широком смысле, как правило, представляет собой (например, фармакологический или иммунологический) агент или композицию, который/которая может модифицировать, например, усиливать, действие других агентов, таких как лекарственное средство или вакцина. Как правило, понятие в контексте изобретения относится к соединению или композиции, которое/которая служит в качестве носителя или вспомогательной субстанции для иммуногенов и/или других фармацевтических действующих веществ. Это понятие следует рассматривать в широком смысле, и оно относится к широкому спектру субстанций, которые могут повышать иммуногенность антигенов, включенных или вводимых совместно с рассматриваемым адъювантом. В контексте настоящего изобретения адъювант предпочтительно должен повышать специфический иммунногенный ответ действующих веществ, предлагаемых в настоящем изобретении. Как правило, «адъювант» или «адъювантный компонент» имеют одинаковое значение и их можно применять одновременно. Адъюванты можно подразделять, например, на вещества, усиливающие иммунный ответ, системы для введения антигенов или даже их комбинации.

Как правило, считается, что понятие «адъювант» не относится к агентам, которые сами обусловливают иммунитет. Адъюванты помогают иммунной системе неспецифически усиливать антигенспецифический иммунный ответ, например, путем повышения презентации антигена иммунной системе или индукции неспецифического врожденного иммунного ответа. Кроме того, адъювант может предпочтительно, например, модулировать антигенспецифический иммунный ответ путем сдвига, например, доминирующего антигенспецифического ответа на основе Th2 в сторону более антигенспецифического ответа на основе Th1 или наоборот. Таким образом, адъювант может успешно модулировать экспрессию/секрецию цитокинов, презентацию антигена, тип иммунного ответа и т.д.

Иммуностимулирующая РНК: Иммуностимулирующая РНК (isPHK) в контексте изобретения, как правило, может представлять собой РНК, которая обладает способностью индуцировать врожденный иммунный ответ. Обычно она не имеет открытой рамки считывания и, таким образом, не кодирует пептид-антиген или иммуноген, но вызывает врожденный иммунный ответ, например, посредством связывания со специфическим типом Толл-подобного рецептора (TLR) или другими приемлемыми рецепторами. Однако, очевидно, что и мРНК, имеющие открытую рамку считывания и кодирующие пептид/белок (например, антигенную функцию), также могут индуцировать врожденный иммунный ответ.

Антиген: В контексте настоящего изобретения понятие «антиген» относится, как правило, к субстанции, которая может распознаваться иммунной системой и которая обладает способностью запускать антигенспецифический иммунный ответ, например, посредством образования антител и/или антигенспецифических Т-клеток, в качестве компонента адаптивного иммунного ответа. Антиген может представлять собой белок или пептид. В этом контексте первая стадия адаптивного иммунного ответа представляет собой активацию наивных антигенспецифических Т-клеток антигенпрезентирующими клетками. Это происходит в лимфоидных тканях и органах, через которые постоянно проходят наивные Т-клетки. Три типа клеток, которые могут служить в качестве антигенпрезентирующих клеток, представляют собой дендритные клетки, макрофаги и В-клетки. Каждая из указанных клеток выполняет отдельную функцию при вызывании иммунных ответов. Присутствующие в ткани дендритные клетки поглощают антигены посредством фагоцитоза и макропиноцитоза, и они могут стимулироваться инфекцией к миграции в местную лимфоидную ткань, где может происходить их дифференцировка в зрелые дендритные клетки. Макрофаги поглощают находящиеся в форме частиц антигены, такие как бактерии, и индуцируются инфекционными агентами к экспрессии молекул ГКГС класса II. Уникальная способность В-клеток к связыванию и интернализации растворимых белковых антигенов посредством своих рецепторов также может иметь важное значение для индукции Т-клеток. Презентация антигена на молекулах ГКГС приводит к активации Т-клеток, что индуцирует их пролиферацию и дифференцировку в «вооруженные» эффекторные Т-клетки. Наиболее важной функцией эффекторных Т-клеток является уничтожение инфицированных клеток цитотоксическими CD8⁺-T-клетками и активация макрофагов ТН1-клетками, что в совокупности создает опосредованный клетками (клеточный) иммунитет, и активация В-клеток и ТН-2, и ТН1-клетками приводит к образованию различных классов антител, в результате чего создается гуморальный иммунный ответ. Т-клетки распознают антиген посредством своих Т-клеточных рецепторов, которые не распознают антиген и не связываются с ним непосредственно, но вместо этого распознают короткие пептидные фрагменты, например, происходящих из патогена белковых антигенов, которые связываются с молекулами ГКГС на поверхностях других клеток.

Т-клетки подразделяют на два основных класса, которые обладают различными эффекторными функциями. Два класса различаются по экспрессии расположенных на клеточной поверхности белков CD4 и CD8. Эти два типа Т-клеток отличаются по распознаваемому ими классу молекул ГКГС. Известно два класса молекул ГКГС, а именно, молекулы ГКГС класса I и ГКГС класса II, которые отличаются по их структуре и схеме экспрессии в тканях организма. CD4⁺-Т-клетки связываются с молекулой ГКГС класса II, а CD8⁺-Т-клетки с молекулой ГКГС класса I. Молекулы ГКГС класса I и ГКГС класса II имеют разное распределение среди клеток, что отражает различные эффекторные функции Т-клеток, которые их распознают. Молекулы ГКГС класса I презентуют пептиды цитозольного и ядерного происхождения, например, из патогенов, прежде всего вирусов, CD8⁺-Т-клеткам, которые дифференцируются в цитотоксичные Т-клетки, специализирующиеся в уничтожении любой клетки, которую они специфически распознают. Почти все клетки экспрессируют молекулы ГКГС класса I, хотя уровень конститутивной экспрессии варьируется от одного типа клеток к другому. Но молекулами ГКГС класса I презентуются не только патогенные пептиды из вирусов, ими презентуются также аутоантигены типа опухолевых антигенов. Молекулы ГКГС класса I связывают пептиды из белков, расщепляемых в цитозоле, и транспортируют в эндоплазматический ретикулум. CD8⁺-Т-клетки, которые распознают комплексы: ГКГС класса I : пептид на поверхности инфицированных клеток, специализируются в уничтожении любых клеток, презентирующих чужеродные пептиды и тем самым избавляют организм от клеток, зараженных вирусами и другими цитозольными патогенами. Основной функцией CD4⁺-Т-клеток (CD4⁺-Т-клеток-хелперов), которые распознают молекулы ГКГС класса II, является активация других эффекторных клеток иммунной системы. При этом молекулы ГКГС класса II в норме присутствуют на В-лимфоцитах, дендритных клетках и макрофагах, т.е. клетках, которые принимают участие в иммунных ответах, но отсутствуют на других типах клеток тканей. Макрофаги, например, обладают активностью в отношении уничтожения интравезикулярных патогенов, которых они несут, а В-клетки секретируют иммуноглобулины против чужеродных молекул. Молекулы ГКГС класса II не могут связываться с пептидами в эндоплазматическом ретикулуме, и при этом молекулы ГКГС класса II связывают пептиды из белков, расщепляемых в эндосомах. Они могут захватывать пептиды из патогенов, которые проникли в везикулярную систему макрофагов, или из антигенов, интернализованных незрелыми дендритными клетками, или иммуноглобулиновыми рецепторами В-клеток. Патогены, которые накапливаются в больших количествах внутри пузырьков макрофагов и дендритных клеток, имеют тенденцию стимулировать дифференцировку ТН1-клеток, в то время как внеклеточные антигены имеют тенденцию стимулировать производство ТН2-клеток. ТН1-клетки активируют бактерицидные свойства макрофагов и индуцируют производство В-клетками антител типа IgG, которые являются очень эффективными в отношении опсонизации внеклеточных патогенов, что приводит к их поглощению фагоцитами, в то время как ТН2-клетки инициируют гуморальный ответ, активируя секрецию IgM наивными В-клетками, и индуцируют производство обладающих слабой опсонизирующей способностью антител, таких как IgG1 и IgG3 (мышиные) и IgG2 и IgG4 (человеческие), а также IgA и IgE (мышиные и человеческие).

Эпитоп (который называют также «антигенной детерминантой»): В контексте настоящего изобретения Т-клеточные эпитопы или части белков могут содержать фрагменты, предпочтительно имеющие длину от примерно 6 до примерно 20 аминокислот или даже более, например, фрагменты, процессируемые и презентируемые молекулами ГКГС класса I, предпочтительно имеют длину от примерно 8 до примерно 10 аминокислот, например, 8, 9 или 10, (или даже 11 или 12 аминокислот), или фрагменты, процессируемые и презентируемые молекулами ГКГС класса II, предпочтительно имеют длину примерно 13 аминокислот или более, например, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или даже большее количество аминокислот, при этом указанные фрагменты можно выбирать из любой части аминокислотной последовательности. Указанные фрагменты, как правило, распознаются Т-клетками в форме комплекса, состоящего из пептидного фрагмента и молекулы ГКГС.

В-клеточные эпитопы, как правило, представляют собой фрагменты, локализованные на внешней поверхности (нативных) белковых или пептидных антигенов, указанных в настоящем описании, предпочтительно состоящих из 5-15 аминокислот, более предпочтительно состоящих из 5-12 аминокислот, еще более предпочтительно состоящих из 6-9 аминокислот, которые могут распознаваться антителами, т.е. в их нативной форме.

Такие эпитопы белков или пептидов можно, кроме того, выбирать из любых указанных вариантов таких белков или пептидов. В этом контексте антигенные детерминанты могут представлять собой конформационные или прерывистые эпитопы, состоящие из сегментов указанных в настоящем описании белков или пептидов, которые расположены с перерывами в аминокислотной последовательности белков или пептидов, указанных в настоящем описании, но которые находятся вблизи друг от друга в трехмерной структуре, или непрерывные или линейные эпитопы, состоящие из одной полипептидной цепи.

Вакцина: Под вакциной, как правило, понимают предназначенный для профилактики или терапии продукт, содержащий по меньшей мере один антиген или антигенную функцию. Антиген или антигенная функция может стимулировать адаптивную иммунную систему организма вырабатывать адаптивный иммунный ответ.

Образующая антиген мРНК: Образующая антиген мРНК в контексте изобретения может, как правило, представлять собой мРНК, имеющую по меньшей мере одну открытую рамку считывания, которая может транслироваться клеткой или организмом, образованной/образованным указанной мРНК. Продуктом указанной трансляции является пептид или белок, который может действовать в качестве антигена, предпочтительно иммуногена. Продукт может представлять собой также слитый белок, состоящий более чем из одного иммуногена, например, слитый белок, который состоит из двух или большего количества эпитопов, пептидов или белков, происходящих из одинаковых или различных вирусных белков, при этом эпитопы, пептиды или белки могут быть связаны линкерными последовательностями.

Би-/полицистронная мРНК: мРНК, как правило, может иметь две (бицистронная) или большее количество (полицистронная) открытых рамок считывания (ОРС). В этом контексте открытая рамка считывания представляет собой последовательность, состоящую из нескольких нуклеотидных триплетов (кодонов), которые могут транслироваться в пептид или белок. Трансляция указанной мРНК приводит к образованию двух (бицистронная мРНК) или большего количества (полицистронная мРНК) различных продуктов трансляции (при условии, что ОРС не являются идентичными). Для экспрессии в эукариотических организмах указанные мРНК могут, например, содержать последовательность участка внутренней посадки (связывания) рибосомы (IRES).

Структура 5'-кэпа: 5'-кэп, как правило, представляет собой модифицированный нуклеотид, прежде всего гуаниновый нуклеотид, добавленный к 5'-концу молекулы мРНК. Предпочтительно 5'-кэп добавляют, используя 5'-5'-трифосфатную связь (его обозначают также как m7GpppN).

Другими примерами структур 5'-кэпа являются глицерил, инвертированная дезоксигруппа (фрагмент), лишенная азотистого основания, 4',5'-метиленовой нуклеотид, 1-(бета-D-эритрофуранозильный)нуклеотид, 4'-тионуклеотид, карбоциклический нуклеотид, 1,5-ангидрогекситольный нуклеотид, L-нуклеотиды, альфа-нуклеотид, нуклеотид с модифицированным основанием, треопентофуранозильный нуклеотид, ациклический 3',4'-секонуклеотид, ациклический 3,4-дигидроксибутильный нуклеотид, ациклический 3,5-дигидроксипентильный нуклеотид, 3'-3'-инвертированный нуклеотидный фрагмент, 3'-3'-инвертированный лишенный азотистого основания фрагмент, 3'-2'-инвертированный нуклеотидный фрагмент, 3'-2'-инвертированный лишенный азотистого основания фрагмент, 1,4-бутандиолфосфатный, 3'-фосфороамидатный, гексилфосфатный, аминогексилфосфатный, 3'-фосфатный, 3'-фосфоротиоатный, фосфородитиоатный или связанный мостиком или несвязанный мостиком метилфосфонатный фрагмент. Указанные модифицированные структуры 5'-кэпа в контексте настоящего изобретения можно применять для модификации последовательности мРНК, предлагаемой в настоящем изобретении. Другие модифицированные структуры 5' кэпа, которые можно применять в контексте настоящего изобретения, представляют собой САР1 (метилирование рибозы соседнего с m7GpppN нуклеотида), САР2 (метилирование рибозы 2-ого нуклеотида, расположенного по ходу транскрипции относительно m7GpppN), САР3 (метилирование рибозы 3-его нуклеотида, расположенного по ходу транскрипции относительное m7GpppN), САР4 (метилирование рибозы 4-ого нуклеотида, расположенного по ходу транскрипции относительно m7GpppN), ARCA (аналог кэп-структуры с правильной ориентацией, модифицированный ARCA (например, модифицированный фосфотиоатом ARCA), инозин, N1-метилгуанозин, 2'-фторгуанозин, 7-деазагуанозин, 8-оксогуанозин, 2-аминогуанозин, ЗНК-гуанозин и 2-азидогуанозин.

Фрагменты белков: «Фрагменты» белков или пептидов в контексте настоящего изобретения могут, как правило, содержать последовательность белка или пептида, указанного в настоящем описании, которая касательно ее аминокислотной последовательности (или кодирующей ее молекулы нуклеиновой кислоты) укорочена на N-конце и/или С-конце по сравнению с аминокислотной последовательностью исходного (нативного) белка (или кодирующей ее молекулой нуклеиновой кислоты). Таким образом, указанное укорочение может иметь место либо на аминокислотном уровне или соответственно на уровне нуклеиновой кислоты. Таким образом, понятие «идентичность последовательности» касательно такого указанного в настоящем описании фрагмента может предпочтительно относиться к полному белку или пептиду, указанному в настоящем описании, или к полной (кодирующей) молекуле нуклеиновой кислоты указанного белка или пептида.

Кроме того, фрагменты белков или пептидов в контексте настоящего изобретения могут содержать последовательность белка или пептида, указанного в настоящем описании, которая состоит, например, по меньшей мере из 5 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере из 7 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере из 8 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 9 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 10 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 11 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 12 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 13 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 14 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 15 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 16 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 17 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 18 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 19 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 20 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 25 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 30 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 35 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 50 или наиболее предпочтительно по меньшей мере из 100 аминокислот. Например, указанный фрагмент может состоять из от примерно 6 до примерно 20 или даже более аминокислот, например, фрагменты, которые процессируются и презентуются молекулами ГКГС класса I, предпочтительно имеют от примерно 8 до примерно 10 аминокислот, например, 8, 9 или 10, (или даже 6, 7, 11 или 12 аминокислот), или фрагменты, которые процессируются и презентуются молекулами ГКГС класса II, предпочтительно имеют примерно 13 аминокислот или более, например, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или даже большее количество аминокислот, при этом указанные фрагменты можно выбирать из любой части аминокислотной последовательности. Указанные фрагменты, как правило, распознаются Т-клетками в форме комплекса, состоящего из пептидного фрагмента и молекулы ГКГС, т.е. фрагменты, как правило, не распознаются в их нативной форме. Фрагменты белков или пептидов могут содержать по меньшей мере один эпитоп указанных белков или пептидов. Кроме того, под фрагментами белка можно понимать также домены белка, типа внеклеточного домена, внутриклеточного домена или трансмембранного домена, и укороченные или усеченные версии белка.

Варианты белков: Как следует из контекста настоящего изобретения, можно создавать «варианты» белков или пептидов, имеющие аминокислотную последовательность, которая отличается от исходной последовательности наличием одной или большего количества мутации(й), например, замен, инсерций и/или делеций одной или большего количества аминокислот. Предпочтительно указанные фрагменты и/или варианты обладают той же самой биологической функцией или специфической активностью, что и полноразмерный нативный белок, например, присущей ему специфической антигенной характеристикой. Как следует из контекста настоящего изобретения, «варианты» белков или пептидов, могут содержать консервативную(ые) аминокислотную(ые) замену(ы) по сравнению с их нативной, т.е. не подвергнутой мутации физиологической последовательностью. Такие аминокислотные последовательности, а также, в частности, кодирующие их нуклеотидные последовательности, подпадают под указанное в настоящем описании понятие «варианты». Замены, при которых заменяют друг на друга аминокислоты, относящиеся к одному и тому же классу, называют консервативными заменами. В частности, такими классами являются аминокислоты, имеющие алифатические боковые цепи, положительно или отрицательно заряженные боковые цепи, ароматические группы в боковых цепях, или аминокислоты, боковые цепи которых могут входить в водородные мостики, например, боковые цепи которых несут гидроксильную функцию. Это означает, например, что аминокислоту, имеющую полярную боковую цепь, заменяют на другую аминокислоту, также имеющую полярную боковую цепь, или, например, аминокислоту, характеризующуюся гидрофобной боковой цепью, заменяют на другую аминокислоту, также имеющую гидрофобную боковую цепь (например, серин (треонин) на треонин (серин) или лейцин (изолейцин) на изолейцин (лейцин)). Можно осуществлять инсерции и замены, прежде всего, в тех положениях в последовательности, которые не приводят к модификации трехмерной структуры или не влияют на связывающую область. Модификации в трехмерной структуре, обусловленные инсерцией(ями) или делецией(ями) можно легко определять, например, с использованием CD-спектров (спектры кругового дихроизма) (Urry, Absorption, Circular Dichroism и ORD of Polypeptides, в: Modern Physical Methods in Biochemistry, под ред. Neuberger и др., изд-во Elsevier, Amsterdam, 1985).

«Вариант» белка или пептида может иметь по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичных аминокислот на сегменте, состоящем из 10, 20, 30, 50, 75 или 100 аминокислот такого белка или пептида.

Кроме того, варианты белков или пептидов, как указано в настоящем описании, которые могут кодироваться молекулой нуклеиновой кислоты, могут содержать также такие последовательности, в которых нуклеотиды кодирующей нуклеотидной последовательности обменены в соответствии с вырожденностью генетического кода, что не приводит к изменению соответствующей аминокислотной последовательности белка или пептида, т.е. аминокислотная последовательность или по меньшей мере ее часть могут не отличаться от исходной последовательности одной мутацией или большим количеством мутаций в указанном выше смысле.

Идентичность последовательностей: Для определения процента идентичности двух последовательностей, например, нуклеотидных последовательностей или аминокислотных последовательностей, указанных в настоящем описании, предпочтительно аминокислотных последовательностей, кодируемых молекулой нуклеиновой кислоты, которая входит в полимерный носитель как указано в настоящем описании, или самих аминокислотных последовательностей, последовательности можно выравнивать для последующего сравнения друг с другом. Так, например, положение в первой последовательности можно сравнивать с соответствующим положением во второй последовательности. Если положение в первой последовательности занято тем же компонентом (остатком), который находится в этом положении во второй последовательности, то две последовательности являются идентичными в этом положении. Если это не имеет места, то последовательности различаются в этом положении. Если во второй последовательности присутствуют инсерции по сравнению с первой последовательностью, то можно встраивать бреши в первую последовательность, что позволяет продолжать осуществление сравнительного анализа. Если во второй последовательности имеются делеции по сравнению с первой последовательностью, то можно встраивать бреши во вторую последовательность, что позволяет продолжать осуществление сравнительного анализа. Таким образом, процент идентичности двух последовательностей является функцией количества идентичных положений, деленной на общее количество положений, включая те положения, которые заняты только в одной последовательности. Процент идентичности двух последовательностей можно определять с помощью математического алгоритма. Предпочтительным примером математического алгоритма, который можно применять, является (но, не ограничиваясь только им) алгоритм, предложенный Karlin и др., PNAS USA, 90, 1993, cc. 5873-5877 или Altschul и др., Nucleic Acids Res., 25, 1997, cc. 3389-3402. Указанный алгоритм входит в программу BLAST. С помощью этой программы можно идентифицировать последовательности, обладающие конкретной степенью идентичности с последовательностями, предлагаемыми в настоящем изобретении.

Производное белка или пептида: Под производным пептида или белка, как правило, понимают молекулу, которую получают из другой молекулы, такой как указанный пептид или белок. Под понятие «производное» пептида или белка подпадают также слияния, содержащие пептид или белок, применяемые согласно настоящему изобретению. Например, слияние содержит метку, такую, например, как эпитоп, например, эпитоп FLAG или эпитоп V5. Например, эпитоп представляет собой эпитоп FLAG. Такую метку используют, например, для очистки слитого белка.

Моноцистронная мРНК: Моноцистронная мРНК, как правило, может представлять собой мРНК, предпочтительно мРНК, которая содержит только одну открытую рамку считывания. В этом контексте открытая рамка считывания представляет собой последовательность, состоящую из нескольких нуклеотидных триплетов (кодонов), которые могут транслироваться в пептид или белок.

Нуклеиновая кислота: Понятие «нуклеиновая кислота» обозначает либо ДНК-, либо РНК-молекулу и является синонимом понятия «полинуклеотид». В контексте настоящего описания, если понятие относится к нуклеиновой кислоте или нуклеотидной последовательности, кодирующей конкретный белок и/или пептид, то указанная нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность соответственно предпочтительно содержит также регуляторные последовательности, обеспечивающие в соответствующем хозяине, например, человеке, ее экспрессию, т.е. транскрипцию и/или трансляцию нуклеотидной последовательности, кодирующей конкретный белок или пептид.

Пептид: Пептид представляет собой полимер, состоящий из аминокислотных мономеров. Как правило, мономеры сцеплены пептидными связями. Понятие «пептид» не ограничено длиной полимерной цепи аминокислот. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пептид может, например, содержать менее 50 мономерных звеньев. Более длинные пептиды, которые называют также полипептидами, как правило, имеют от 50 до 600 мономерных звеньев, более конкретно от 50 до 300 мономерных звеньев.

Фармацевтически эффективное количество: Под фармацевтически эффективном количеством в контексте изобретения, как правило, понимают количество, достаточное для того, чтобы индуцировать иммунный ответ.

Белок: Белок, как правило, состоит из одного или нескольких пептидов и/или полипептидов, уложенных в 3-мерную структуру, облегчающую биологическую функцию.

Поли(С)-последовательность: Поли (С)-последовательность, как правило, представляет собой длинную последовательность, состоящую из цитозиновых нуклеотидов, как правило, содержащую от примерно 10 до примерно 200 цитозиновых нуклеотидов, предпочтительно от примерно 10 до примерно 100 цитозиновых нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 70 цитозиновых нуклеотидов или еще более предпочтительно от примерно 20 до примерно 50 или даже от примерно 20 до примерно 30 цитозиновых нуклеотидов. Поли(С)-последовательность предпочтительно может располагаться в 3'-направлении относительно кодирующей области, содержащейся в нуклеиновой кислоте.

Поли(А)-хвост: Поли(А)-хвост, который называют также «3'-поли(А)-хвостом», как правило, представляет собой длинную последовательность аденозиновых нуклеотидов, содержащую вплоть до примерно 400 аденозиновых нуклеотидов, например, от примерно 25 до примерно 400, предпочтительно от примерно 50 до примерно 400, более предпочтительно от примерно 50 до примерно 300, еще более предпочтительно от примерно 50 до примерно 250, наиболее предпочтительно от примерно 60 до примерно 250 аденозиновых нуклеотидов, добавленную к 3'-концу РНК.

Стабилизированная нуклеиновая кислота: Стабилизированная нуклеиновая кислота, как правило, содержит модификацию, повышающую устойчивость к расщеплению in vivo (например, расщеплению экзо- или эндонуклеазой) и/или расщеплению ex vivo (например, в процессе производства до введения вакцины, например, в процессе приготовления раствора вакцины, предназначенного для введения). Стабилизацию РНК можно обеспечивать, например, с использованием 5'-кэп-структуры, поли(А)-хвоста или любой другой модификации UTR. Ее можно обеспечивать также путем модификации каркаса или модификации содержания G/C в нуклеиновой кислоте. В контексте настоящего изобретения можно рассматривать и различные другие методы, известные в данной области.

Носитель/полимерный носитель: В контексте изобретения носитель, как правило, может представлять собой соединение, которое облегчает транспорт и/или включение в комплекс другого соединения. Указанный носитель может образовывать комплекс с указанным другим соединением. Полимерный носитель, как правило, представляет собой носитель, образующий полимер.

Катионный компонент: Понятие «катионный компонент», как правило, относится к заряженной молекуле, которая является положительно заряженной (катион) при значении pH, составляющем, как правило, от 1 до 9, предпочтительно при значении pH, равном или ниже 9 (например, от 5 до 9), равном или ниже 8 (например, от 5 до 8), равном или ниже 7 (например, от 5 до 7), наиболее предпочтительно при физиологических значениях pH, например, от 7,3 до 7.4. Таким образом, катионный пептид, белок или полимер, который является положительно заряженным в физиологических солевых условиях в клетке, прежде всего в физиологических условиях in vivo. Катионный пептид или белок предпочтительно содержит большее количество катионных аминокислот, например, большее количество Arg, His, Lys или Orn, чем других аминокислотных остатков (в частности больше катионных аминокислот, чем анионных аминокислотных остатков типа Asp или Glu), или содержит блоки, образованные главным образом катионными аминокислотными остатками. Понятие «катионный» может обозначать также «поликатионные» компоненты.

Наполнитель: Агент, например, носитель, который можно, как правило, применять в фармацевтической композиции или вакцине для облегчения введения индивидууму компонентов фармацевтической композиции или вакцины.

3'-нетранслируемая область (3'UTR): 3'UTR, как правило, является частью мРНК, локализованной между кодирующей белок областью (т.е. открытой рамкой считывания) и поли(А)-последовательностью мРНК. 3'UTR мРНК не транслируется в аминокислотную последовательность. Последовательность 3'UTR, как правило, кодируется геном, который транскрибируется в соответствующую мРНК в процессе экспрессии гена. Геномная последовательность сначала транскрибируется в незрелую мРНК, которая содержит необязательные интроны. Незрелая мРНК затем дополнительно процессируется с образованием зрелой мРНК в процессе созревания. Указанный процесс созревания включает стадии 5'-кэпирования, сплайсинга незрелой мРНК с вырезанием необязательных интронов и модификаций 3'-конца, таких как подиаденилирование 3'-конца незрелой мРНК, и необязательные расщепления эндо-/или экзонуклеазами и т.д. В контексте настоящего изобретения 3'UTR соответствует последовательности зрелой мРНК, которая расположена с 3'-стороны стоп-кодона кодирующей белок области, предпочтительно непосредственно примыкает с 3'-стороны к стоп-кодону кодирующей белок области, и которая простирается до 5'-стороны поли(А)-последовательности, предпочтительно до нуклеотида, непосредственно примыкающего к 5'-концу поли(А)-последовательности. Понятие «соответствует» означает, что последовательность 3'UTR может представлять собой последовательность РНК, такую как последовательность мРНК, указанную при определении последовательности 3'UTR, или последовательность ДНК, которая соответствует указанной последовательности РНК. В контексте настоящего изобретения понятие «3'UTR гена», например, «3'UTR гена альбумина», означает последовательность, которая соответствует 3'UTR зрелой мРНК, полученной из указанного гена, т.е. мРНК, полученной путем транскрипции гена и созревания незрелой мРНК. Понятие «3'UTR гена» включает последовательность ДНК и последовательность РНК 3'UTR.

5'-нетранслируемая область (5'UTR): Под 5'UTR, как правило, понимают конкретный сегмент матричной РНК (мРНК). Она локализована на 5'-конце открытой рамки считывания мРНК. Как правило, 5'UTR начинается с сайта инициации транскрипции и закачивается одним нуклеотидом, расположенным непосредственно перед стартовым ко доном открытой рамки считывания. 5'UTR может содержать элементы, предназначенные для контроля генной экспрессии, так называемые регуляторные элементы. Указанные регуляторные элементы могут представлять собой, например, сайты связывания рибосом или 5'-концевой олигопиримидиновый тракт. 5'UTR может подвергаться посттранскрипционным модификациям, например, путем добавления 5'-кэпа. В контексте настоящего изобретения 5'UTR соответствует последовательности зрелой мРНК, локализованной между 5'-кэпом и стартовым кодоном. Предпочтительно 5'UTR соответствует последовательности, которая простирается от нуклеотида, расположенного с 3'-стороны 5'-кэпа, предпочтительно от нуклеотида, непосредственно примыкающего с 3'-стороны к 5'-кэпу, до нуклеотида, расположенного с 5'-стороны стартового кодона кодирующей белок области, предпочтительно до нуклеотида, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к стартовому кодону кодирующей белок области. Нуклеотид, непосредственно примыкающий с 3'-стороны к 5'-кэпу зрелой мРНК, как правило, соответствует сайту инициации транскрипции. Понятие «соответствует» означает, что последовательность 5'UTR может представлять собой последовательность РНК, такую как последовательность мРНК, указанная при определении последовательности 5'UTR, или последовательность ДНК, которая соответствует указанной последовательности РНК. В контексте настоящего изобретения понятие «5'UTR гена», например, «5'UTR ТОР-гена», обозначает последовательность, которая соответствует 5'UTR зрелой мРНК, полученной из этого гена, т.е. мРНК, полученной путем транскрипции гена и созревания незрелой мРНК. Понятие «5'UTR гена» включает последовательность ДНК и последовательность РНК 5'UTR.

5'-концевой олигопиримидиновый тракт (ТОР): 5'-концевой олигопримидиновый транкт (ТОР), как правило, обозначает сегмент пиримидиновых нуклеотидов, локализованный в 5'-концевой области молекулы нуклеиновой кислоты, например, в 5'-концевой области некоторых молекул мРНК или в 5'-концевой области функционального элемента, например, транскрибируемой области некоторых генов. Последовательность начинается с цитидина, который, как правило, соответствует сайту инициации транскрипции, и за которым следует сегмент, как правило, состоящий примерно из 3-30 пиримидиновых нуклеотидов. Например, ТОР может содержать 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или даже большее количество нуклеотидов. Пиримидиновый сегмент и, следовательно, 5'-ТОР, заканчивается одним нуклеотидом, примыкающим с 5'-стороны к первому пуриновому нуклеотиду, расположенному в прямом направлении относительно ТОР. Матричную РНК, которая содержит 5'-концевой олигопримидиновый тракт, часто обозначают как ТОР-мРНК. Таким образом, гены, из которых получают указанные матричные РНК, обозначают как ТОР-гены. Последовательности ТОР, например, обнаружены в генах и мРНК, кодирующих пептидные факторы элонгации и рибосомные белки.

ТОР-мотив: В контексте настоящего изобретения ТОР-мотив обозначает нуклеотидную последовательность, которая соответствует 5'-ТОР, описанному выше. Таким образом, ТОР-мотив в контексте настоящего изобретения предпочтительно обозначает состоящий из пиримидиновых нуклеотидов сегмент длиной 3-30 нуклеотидов. Предпочтительно ТОР-мотив состоит по меньшей мере из 3 пиримидиновых нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 4 пиримидиновых нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 5 пиримидиновых нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 6 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 7 нуклеотидов, наиболее предпочтительно по меньшей мере 8 пиримидиновых нуклеотидов, при этом сегмент пиримидиновых нуклеотидов предпочтительно начинается на его 5'-конце с цитозинового нуклеотида. В ТОР-генах и ТОР-мРНК ТОР-мотив предпочтительно начинается на его 5'-конце с сайта инициации транскрипции и заканчивается одним нуклеотидом, примыкающим с 5'-стороны к первому пуриновому остатку в указанном гене или мРНК. В контексте настоящего изобретения ТОР-мотив предпочтительно локализован на 5'-конце последовательности, которая представляет собой 5'UTR, или на 5'-конце последовательности, которая кодирует 5'UTR. Таким образом, в контексте настоящего изобретения сегмент из 3 или большего количества пиримидиновых нуклеотидов предпочтительно называют «ТОР-мотивом», если сегмент локализован на 5'-конце соответствующей последовательности, такой как мРНК, предлагаемая в изобретении, 5'UTR-элемент мРНК, предлагаемой в изобретении, или нуклеотидная последовательность, которая происходит из 5'UTR ТОР-гена, указанного в настоящем описании. Другими словами, сегмент, состоящий из 3 или большего количества пиримидиновых нуклеотидов, который не локализован на 5'-конце 5'UTR или 5'UTR-элемента, но локализован где-либо внутри 5'UTR или 5'UTR-элемента, предпочтительно не обозначают как «ТОР-мотив».

ТОР-ген: ТОР-гены, как правило, характеризуются присутствием 5'-концевого олигопримидинового тракта. Кроме того, большинство ТОР-генов характеризуются связанной с ростом регуляцией трансляции. Однако известны также ТОР-гены с тканеспецифической регуляцией трансляции. Как указано выше, 5'UTR ТОР-гена соответствует последовательности 5'UTR зрелой мРНК, происходящей из ТОР-гена, которая предпочтительно простирается от нуклеотида, примыкающего с 3'-стороны к 5'-кэпу, до нуклеотида, примыкающего с 5'-стороны к стартовому ко дону. 5'UTR ТОР-гена, как правило, не содержит никаких стартовых кодонов, предпочтительно не содержит расположенных в обратном направлении AUG (uAUG) или расположенных в обратном направлении открытых рамок считывания (uOPC). В данном контексте под расположенными в обратном направлении AUG и расположенными в обратном направлении открытыми рамками считывания, как правило, понимают AUG и открытые рамки считывания, которые находятся в 5'-направлении относительно стартового кодона (AUG) открытой рамки считывания, которая должна транслироваться. 5'UTR ТОР-генов, как правило, являются относительно короткими. Длины 5'UTR ТОР-генов могут варьироваться от 20 нуклеотидов вплоть до 500 нуклеотидов и, как правило, они содержат менее чем примерно 200 нуклеотидов, предпочтительно менее чем примерно 150 нуклеотидов, более предпочтительно менее чем примерно 100 нуклеотидов. Примерами 5'UTR ТОР-генов в контексте настоящего изобретения являются нуклеотидные последовательности, простирающиеся от нуклеотида в положении 5 до нуклеотида, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к стартовому кодону (например, ATG), указанные последовательности представлены в SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 14221-1363 заявки на патент PCT/EP 2012/002448 WO 2013/143700 или представляют собой их гомологи или варианты, описание указанных документов включено в настоящее описание в качестве ссылки. В этом контексте наиболее предпочтительным фрагментом 5'UTR ТОР-гена является 5'UTR ТОР-гена без 5'ТОР-мотива. Понятие «5'UTR ТОР-гена» предпочтительно относится к 5'UTR встречающегося в естественных условиях ТОР-гена.

Фрагмент нуклеотидной последовательности, прежде всего мРНК: Фрагмент нуклеотидной последовательности состоит из непрерывного сегмента нуклеотидов, который соответствует непрерывному сегменту нуклеотидов в полноразмерной нуклеотидной последовательности, которая является основой для нуклеотидной последовательности фрагмента, который соответствует по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% полноразмерной нуклеотидной последовательности. В контексте настоящего изобретения указанный фрагмент предпочтительно представляет собой функциональный фрагмент полноразмерной нуклеотидной последовательности.

Вариант нуклеотидной последовательности, прежде всего мРНК: Вариант нуклеотидной последовательности относится к варианту нуклеотидной последовательности, которая образует основу нуклеотидной последовательности. Например, вариант нуклеотидной последовательности может характеризоваться одной или несколькими нуклеотидными делециями, инсерциями, добавлениями и/или заменами по сравнению с нуклеотидной последовательностью, из которой вариант происходит. Предпочтительно вариант нуклеотидной последовательности идентичен по меньшей мере на 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%,еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% нуклеотидной последовательности, из которой вариант происходит. Предпочтительно вариант представляет собой функциональный вариант. «Вариант» нуклеотидной последовательности может иметь по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичных нуклеотидов в сегменте, состоящем из 10, 20, 30, 50, 75 или 100 нуклеотидов указанной нуклеотидной последовательности.

Гомолог нуклеотидной последовательности: Понятие «гомолог» нуклеотидной последовательности относится к последовательностям других видов относительно конкретной последовательности. Наиболее предпочтительно нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность человеческого происхождения и поэтому предпочтительно, чтобы гомолог представлял собой гомолог человеческой нуклеотидной последовательности.

Струйная инъекция: Понятие «струйная инъекция» в контексте настоящего описания относится к методу безыгольной инъекции, при котором жидкость, содержащая по меньшей мере одну предлагаемую в изобретения последовательность мРНК и необязательно дополнительные приемлемые эксципиенты, принудительно пропускают через отверстие, создавая тем самым ультратонкую жидкую струю под высоким давлением, которая обладает способностью проникать через кожу млекопитающего и, в зависимости от условий инъекции, в подкожную ткань или мышечную ткань. В принципе жидкая струя образует отверстие в коже, через которую жидкая струя проходит в ткань-мишень. Предпочтительно струйную инъекцию применяют для внутрикожной, подкожной или внутримышечной инъекции мРНК, предлагаемой в изобретении. В предпочтительном варианте осуществления изобретения струйную инъекцию применяют для внутримышечной инъекции последовательности мРНК, предлагаемой в изобретении. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения струйную инъекцию применяют для внутрикожной инъекции последовательности мРНК, предлагаемой в изобретении.

В основу настоящего изобретения положены неожиданно установленные данные о том, что последовательность мРНК, содержащая кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ), индуцирует антигенспецифические иммунные ответы и тем самым предупреждает или по меньшей мере минимизирует инфекции, вызываемые респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ). При создании изобретения совершенно неожиданно было установлено, что последовательность мРНК индуцирует по меньшей мере такие же иммунные ответы, что и вакцины на основе инактивированного РСВ, которые состоят из цельного вируса. Еще более неожиданно при создании изобретения было установлено, что предлагаемая в изобретении последовательность мРНК, кодирующая антигенный белок РСВ, индуцирует антигенспецифические CD8⁺-Т-клетки в отличие от вакцины на основе инактивированного РСВ. Кроме того, на модели контрольного заражения РСВ хлопковых крыс установлено, что вирусные титры в носу и легких вакцинированных мРНК животных оказались существенно более низкими по сравнению с животными, которых вакцинировали вакцинами на основе инактивированного РСВ-вируса. Касательно безопасности при создании изобретения было продемонстрировано, что при применении вакцины на основе мРНК РСВ не обнаружено никакого опосредуемого вакциной усиления заболевания в плане легочной патологии по сравнению с вакциной на основе инактивированного формалином вируса. Кроме того, при создании изобретения неожиданно было установлено, что уже только одной единичной вакцинации предлагаемой в изобретении последовательности мРНК оказалось достаточно для вызывания иммунного ответа против вводимого(ых) антигена(ов). В частности, было установлено, что одно единственное введение, предпочтительно путем внутрикожной или внутримышечной инъекции предлагаемой в изобретении мРНК, обладало высокой эффективностью в отношении снижения вирусных титров в легких после контрольного заражения РСВ-вирусом.

В целом, предлагаемая в изобретении последовательность мРНК, содержащая кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ), может представлять собой эффективную и безопасную вакцину, прежде всего для младенцев, пожилых людей и пациентов с ослабленным иммунитетом.

В этом контексте наиболее предпочтительно, чтобы предлагаемая в изобретении последовательность мРНК содержала кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из слитого белка F, гликопротеина G, короткого гидрофобного белка SH, матричного белка М, нуклеопротеина N, большой субъединицы полимеразы L, белка М2-1, белка М2-2, фосфопротеина Р, неструктурного белка NS1 или неструктурного белка NS2 респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмент, вариант или производное.

Согласно первому объекту настоящего изобретения кодирующая область предлагаемой в изобретении мРНК может присутствовать в виде моно-, би- или даже полицистронной мРНК, т.е. мРНК, которая несет кодирующую(ие) последовательность(и) одного, двух или большего количества белков или пептидов. Указанные кодирующие последовательности би- или даже полицистронных мРНК могут разделяться по меньшей мере одной последовательностью участка внутренней посадки (связывания) рибосомы (IRES), например, указанной в настоящем описании, или сигнальными пептидами, которые индуцируют расщепление образовавшегося полипептида, который содержит несколько белков или пептидов.

Согласно первому объекту настоящего изобретения кодирующая область предлагаемой в изобретении мРНК содержит кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из слитого белка F, гликопротеина G, короткого гидрофобного белка SH, матриксного белка М, нуклеопротеина N, большой субъединицы полимеразы L, белка М2-1, белка М2-2, фосфопротеина Р, неструктурного белка NS1 или неструктурного белка NS2 респираторно-синцитиального вируса (РСВ), или его фрагмент, вариант или производное. В наиболее предпочтительном варианте осуществления первого объекта изобретения предлагаемая в изобретении последовательность мРНК содержит кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из слитого белка F, нуклеопротеина N или белка М2-1 респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмента, варианта или производного.

В этом контексте аминокислотную последовательность по меньшей мере одного антигенного пептида или белка можно выбирать из любого пептида или белка, происходящего из слитого белка F, гликопротеина G, короткого гидрофобного белка SH, матриксного белка М, нуклеопротеина N, большой субъединицы полимеразы L, белка М2-1, белка М2-2, фосфопротеина Р, неструктурного белка NS1 или неструктурного белка NS2 любого изолята РСВ или из любого созданного с помощью синтеза пептида или белка РСВ, или из любого его фрагмента, варианта или производного.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения полноразмерный белок слитого белка F, гликопротеина G, короткого гидрофобного белка SH, матриксного белка М, нуклеопротеина N, большой субъединицы полимеразы L, белка М2-1, белка М2-2, фосфопротеина Р, неструктурного белка NS1 или неструктурного белка NS2 респираторно-синцитиального вируса (РСВ) кодируется кодирующей областью, содержащейся в предлагаемой в изобретении мРНК.

В этом контексте наиболее предпочтительными являются полноразмерный белок из слитого белка F и нуклеопротеина N. Кроме того, наиболее предпочтительным является мутант белка F с делецией цитоплазматического хвоста. Примером такого делеционного мутанта является белок «длинного» штамма RSV-Fdel 554-574, описанный у Oomens и др., J. Virol. 80(21), 2006, cc. 10465-10477).

В другом наиболее предпочтительном варианте осуществления фрагмент, содержащий по меньшей мере один эпитоп слитого белка F, гликопротеина G, короткого гидрофобного белка SH, матриксного белка М, нуклеопротеина N, большой субъединицы полимеразы L, белка М2-1, белка М2-2, фосфопротеина Р, неструктурного белка NS1 или неструктурного белка NS2 респираторно-синцитиального вируса (РСВ) кодируется кодирующей областью, содержащейся в предлагаемой в изобретении мРНК.

Наиболее предпочтительными являются аминокислотные последовательности «длинного» штамма РСВ (АТСС VR-26), имеющие регистрационный номер NCBI № AY911262:

Слитый белок F «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1:

Гликопротеин G «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 2:

Короткий гидрофобный белок SH «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 3:

Матриксный белок М «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 4:

Нуклепротеин N «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 5:

Большая субъединица полимеразы L «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 6:

Белок М2-1 «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 7:

Белок М2-2 «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 8:

Фосфопротеин Р «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 9:

Неструктурный белок NS1 «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 10:

Неструктурный белок NS2 «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 11:

В контексте изобретения помимо представленных в настоящем описании последовательностей SEQ ID NO: 1-11 согласно изобретению можно применять аминокислотные последовательности различных изолятов респираторно-синцитиального вируса (РСВ), и они подпадают под объем изобретения. Эти изоляты респираторно-синцитиального вируса (РСВ) характеризуются предпочтительно по меньшей мере 70%-ной, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ной и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90%-ной идентичностью с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 1-11.

Кроме того, в этом контексте кодирующую последовательность, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из слитого белка F, гликопротеина G, короткого гидрофобного белка SH, матриксного белка М, нуклеопротеина N, большой субъединицы полимеразы L, белка М2-1, белка М2-2, фосфопротеина Р, неструктурного белка NS1 или неструктурного белка NS2 респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или любого его фрагмента, варианта или производного, можно выбирать из любой нуклеотидной последовательности, которая содержит кодирующую область, происходящую из любого изолята респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмента или варианта.

Наиболее предпочтительными являются последовательности мРНК кодирующих областей «длинного» штамма РСВ дикого типа (АТСС VR-26), имеющие регистрационный номер NCBI № AY911262:

мРНК, кодирующая слитый белок F «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Последовательность мРНК SEQ ID NO: 12:

мРНК, кодирующая гликопротеин G «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Последовательность мРНК SEQ ID NO: 13

мРНК, колирующая короткий гидрофобный белок SH «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Последовательность мРНК SEQ ID NO: 14:

мРНК, кодирующая матриксный белок М «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Последовательность мРНК SEQ ID NO: 15:

мРНК, кодирующая нуклеопротеин N «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Последовательность мРНК SEQ ID NO: 16:

мРНК, кодирующая большую субъединицу полимеразы L «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Последовательность мРНК SEQ ID NO: 17:

мРНК, кодирующая белок М2-1 «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Последовательность мРНК SEQ ID NO: 18:

мРНК, кодирующая белок М2-2 «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Последовательность мРНК SEQ ID NO: 19:

мРНК, кодирующая фосфопротеин Р «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Последовательность мРНК SEQ ID NO: 20:

мРНК, кодирующая неструктурный белок NS1 «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Последовательность мРНК SEQ ID NO: 21:

мРНК, кодирующая неструктурный белок NS2 «длинного» штамма РСВ АТСС VR-26:

Последовательность мРНК SEP ID NO: 22:

В контексте изобретения помимо представленных в настоящем описании нуклеотидных последовательностей, изобретение относится также к нуклеотидным последовательностям различных изолятов респираторно-синцитиального вируса (РСВ). Эти различные изоляты респираторно-синцитиального вируса (РСВ) предпочтительно идентичны по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% нуклеотидным последовательностям SEQ ID NO: 12-22 или их фрагментам.

В предпочтительном варианте осуществления последовательность мРНК, предлагаемая в изобретении, не содержит репортерный ген или маркерный ген. Предпочтительно мРНК, предлагаемая в изобретении, не кодирует, например, люциферазу; зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его варианты (такие как eGFP, RFP или BFP); α-глобин; гипоксантин : гуанинфосфорибозилтрансферазу (HGPRT); β-галактозидазу; галактокиназу; щелочную фосфатазу; секретируемую эмбриональную щелочную фосфатазу (SEAP)) или ген, обусловливающий устойчивость (такой как ген, обусловливающий устойчивость к неомицину, пуромицину, гигромицину и зеоцину). В предпочтительном варианте осуществления изобретения мРНК, предлагаемая в изобретении, не кодирует люциферазу. В другом варианте осуществления изобретения мРНК, предлагаемая в изобретении, не кодирует GFP или его вариант.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность мРНК, предлагаемая в изобретении, не кодирует белок (или фрагмент белка), происходящий из вируса, который принадлежит к семейству Orthomyxoviridae. Предпочтительно последовательность мРНК не кодирует белок, происходящий из вируса гриппа, более предпочтительно вируса гриппа А. Предпочтительно последовательность мРНК, предлагаемая в изобретении, не кодирует белок вируса гриппа А, выбранный из группы, состоящей из гемагглютинина (НА), нейраминидазы (NA), нуклеопротеина (NP), M1, М2, NS1, NS2 (NEP: белок ядерного экспорта), PA, РВ1 (основная полимераза 1), PB1-F2 и РВ2. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения мРНК, предлагаемая в изобретении, не кодирует овальбумин (OVA) или его фрагмент. Предпочтительно последовательность мРНК, предлагаемая в изобретении, не кодирует белок вируса гриппа А или овальбумин.

В другом варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении мРНК предпочтительно содержит по меньшей мере один из следующих структурных элементов: элемент 5'- и/или 3'-нетранслируемой области (UTR-элемент), прежде всего 5'UTR-элемент, который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, происходящей из 5'UTR ТОР-гена или из его фрагмента, гомолога или варианта, или элемент, представляющий собой 5'-/или 3'UTR, который может иметь происхождение из гена, из которого получают стабильную мРНК, или из его гомолога, фрагмента или варианта; гистоновую структуру типа «стебель-петля», предпочтительно гистоновую структуру типа «стебель-петля» в ее 3'-нетранслируемой области; 5'-кэп-структуру; поли-А-хвост или поли(С)-последовательность.

В предпочтительном варианте осуществления первого объекта настоящего изобретения мРНК, предлагаемая в изобретении, содержит по меньшей мере один 5'- или 3'UTR-элемент. В этом контексте UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 5'- или 3'UTR любого встречающегося в естественных условиях гена, или которую получают из фрагмента, гомолога или варианта 5'- или 3'UTR гена. Предпочтительно 5'- или 3'UTR-элемент, применяемый согласно настоящему изобретению, является гетерологичным относительно кодирующей области мРНК, предлагаемой в изобретении. Хотя предпочтительными являются 5'- или 3'UTR-элементы, полученные из встречающихся в естественных условиях генов, в контексте настоящего изобретения можно применять также созданные путем синтеза UTR-элементы.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления первого объекта настоящего изобретения последовательность мРНК, предлагаемая в изобретении, содержит по меньшей мере один элемент, представляющий собой 5'-нетранслируемую область (5'UTR-элемент), который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 5'UTR ТОР-гена, или которую получают из фрагмента, гомолога или варианта 5'UTR ТОР-гена.

Наиболее предпочтительно, чтобы 5'UTR-элемент не содержал ТОР-мотив или 5'ТОР, указанный выше.

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность 5'UTR-элемента, которую получают из 5'UTR ТОР-гена, оканчивается на ее 3'-конце нуклеотидом, локализованным в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 в обратном направлении относительно стартового кодона (например, A(U/T)G) гена или полученной из него мРНК. Таким образом, 5'UTR-элемент не содержит никакой части кодирующей белок области. Таким образом, предпочтительно только кодирующий белок участок мРНК, предлагаемой в изобретении, представляет собой кодирующую область. Нуклеотидную последовательность, имеющую происхождение из 5'UTR ТОР-гена, получают из эукариотического ТОР-гена, предпочтительно ТОР-гена растений или животных, более предпочтительно ТОР-гена хордовых животных, еще более предпочтительно ТОР-гена позвоночных животных, наиболее предпочтительно ТОР-гена млекопитающих, например, ТОР-гена человека.

Например, 5'UTR-элемент предпочтительно выбирают из 5'UTR-элементов, содержащих или состоящих из нуклеотидной последовательности, которая происходит из нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки, из гомологов SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, из ее вариантов, или предпочтительно из соответствующей РНК-последовательности. Понятие «гомологи SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700» относится к последовательностям из видов, отличных от человека (Homo sapiens), которые являются гомологами последовательностей SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая происходит из нуклеотидной последовательности, простирающейся от нуклеотидного положения 5 (т.е. нуклеотида, локализованного в положении 5 в последовательности) до нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к стартовому кодону (локализованному на 3'-конце последовательностей), например, до нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к ATG-последовательности, нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, из гомологов SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, из ее вариантов или соответствующей РНК-последовательности. Наиболее предпочтительным является, если 5' UTR-элемент получают из нуклеотидной последовательности, простирающейся от нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего с 3'-стороны к 5'ТОР, до нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к стартовому кодону (локализованному на 3'-конце последовательностей), например, до нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к ATG-последовательности нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, из гомологов SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, из ее вариантов или соответствующей РНК-последовательности.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR ТОР-гена, кодирующего рибосомный белок, или из варианта 5'UTR ТОР-гена, кодирующего рибосомный белок. Например, 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 67, 170, 193, 244, 259, 554, 650, 675, 700, 721, 913, 1016, 1063, 1120, 1138 и 1284-1360, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, соответствующей РНК-последовательности, ее гомолога или варианта, указанного в настоящем описании, предпочтительно лишенного 5'ТОР-мотива. Как описано выше, последовательность, простирающаяся от положения 5 до нуклеотида, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к ATG (локализованному на 3'-конце последовательностей), соответствует 5'UTR указанных последовательностей.

Предпочтительно 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, имеющей происхождение из 5'UTR ТОР-гена, кодирующего белок большой субъединицы рибосомы (RPL), или из гомолога или варианта 5'UTR ТОР-гена, кодирующего белок большой субъединицы рибосомы (RPL). Например, 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 67, 259, 1284-1318, 1344, 1346, 1348-1354, 1357, 1358, 1421 и 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, соответствующей РНК-последовательности, ее гомолога или варианта, указанного в настоящем описании, предпочтительно лишенного 5'ТОР-мотива.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR, имеющей происхождение из 5'UTR гена белка большой субъединицы рибосомы 32, предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) позвоночных животных, более предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) млекопитающих, наиболее предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) человека, или из варианта 5'UTR гена белка большой субъединицы рибосомы 32, предпочтительно гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) позвоночных животных, более предпочтительно гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) млекопитающих, наиболее предпочтительно гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) человека, при этом предпочтительно 5'UTR-элемент не содержит 5'ТОР указанного гена.

Таким образом, согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23 (5'UTR человеческого белка большой субъединицы рибосомы 32, лишенного 5'-концевого олигопримидинового тракта: GGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC; которая соответствует SEQ ID NO: 1368 в заявке на патент WO 2013/143700) или предпочтительно соответствующей РНК-последовательности, или в которой по меньшей мере один 5'UTR-элемент содержит или состоит из фрагмента нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23, или более предпочтительно соответствующей РНК-последовательности, при этом предпочтительно описанный выше фрагмент представляет собой непрерывный сегмент нуклеотидов, на долю которого приходится по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% полноразмерной 5'UTR. Предпочтительно фрагмент состоит по меньшей мере примерно из 20 нуклеотидов или более, предпочтительно по меньшей мере примерно из 30 нуклеотидов или более, более предпочтительно по меньшей мере примерно из 40 нуклеотидов или более. Предпочтительно фрагмент представляет собой функциональный фрагмент, указанный в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мРНК, предлагаемая в изобретении, содержит 5'UTR-элемент, который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR ТОР-гена позвоночных животных, таких как млекопитающие, например, человеческого ТОР-гена, выбранного из RPSA, RPS2, RPS3, RPS3A, RPS4, RPS5, RPS6, RPS7, RPS8, RPS9, RPS10, RPS11, RPS12, RPS13, RPS14, RPS15, RPS15A, RPS16, RPS17, RPS18, RPS19, RPS20, RPS21, RPS23, RPS24, RPS25, RPS26, RPS27, RPS27A, RPS28, RPS29, RPS30, RPL3, RPL4, RPL5, RPL6, RPL7, RPL7A, RPL8, RPL9, RPL10, RPL10A, RPL11, RPL12, RPL13, RPL13A, RPL14, RPL15, RPL17, RPL18, RPL18A, RPL19, RPL21, RPL22, RPL23, RPL23A, RPL24, RPL26, RPL27, RPL27A, RPL28, RPL29, RPL30, RPL31, RPL32, RPL34, RPL35, RPL35A, RPL36, RPL36A, RPL37, RPL37A, RPL38, RPL39, RPL40, RPL41, RPLP0, RPLP1, RPLP2, RPLP3, RPLP0, RPLP1, RPLP2, EEF1A1, EEF1B2, EEF1D, EEF1G, EEF2, EIF3E, EIF3F, EIF3H, EIF2S3, EIF3C, EIF3K, EIF3EIP, EIF4A2, РАВРС1, HNRNPA1, ТРТ1, TUBB1, UBA52, NPM1, ATP5G2, GNB2L1, NME2, UQCRB, или из их гомолога или варианта, в которых предпочтительно 5'UTR-элемент не содержит ТОР-мотива, или 5'ТОР указанных генов и в которых необязательно 5'-конец 5'UTR-элемента начинается с нуклеотида, локализованного в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 в прямом направлении относительно 5'-концевого олигопримидинового тракта (ТОР), и в которых также необязательно 5'UTR-элемент, происходящий из 5'UTR ТОР-гена, оканчивается на его 3'-конце нуклеотидом, локализованным в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 в обратном направлении относительно стартового кодона (A(U/T)G) гена, из которого он получен.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (RPL32), гена белка большой субъединицы рибосомы 35 (RPL35), белка большой субъединицы рибосомы 21 (RPL21), гена АТФ-синтазы, Н⁺-транспортирующей, митохондриального комплекса F1, альфа-субъединицы 1, сердечной мышцы (АТР5А1), гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4), индуцируемого андрогеном гена 1 (AIG1), гена субъединицы VIc оксидазы цитохрома с (СОХ6С) или гена N-ацилсфингозин-амидогидролазы (кислая церамидаза) 1 (ASAH1), или из их варианта, предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (RPL32) позвоночных животных, гена белка большой субъединицы рибосомы 35 (RPL35) позвоночных животных, гена белка большой субъединицы рибосомы 21 (RPL21) позвоночных животных, гена АТФ-синтазы, Н⁺-транспортирующей, митохондриального комплекса F1, альфа-субъединицы 1, сердечной мышцы (АТР5А1) позвоночных животных, гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4) позвоночных животных, индуцируемого андрогеном гена 1 (AIG1) позвоночных животных, гена субъединицы VIc оксидазы цитохрома с (СОХ6С) позвоночных животных или гена N-ацилсфингозин-амидогидролазы (кислая церамидаза) 1 (ASAH1) позвоночных животных, или из их варианта, более предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (RPL32) млекопитающих, гена белка большой субъединицы рибосомы 35 (RPL35) млекопитающих, гена белка большой субъединицы рибосомы 21 (RPL21) млекопитающих, гена АТФ-синтазы, Н⁺-транспортирующей, митохондриального комплекса F1, альфа-субъединицы 1, сердечной мышцы (АТР5А1) млекопитающих, гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4) млекопитающих, индуцируемого андрогеном гена 1 (AIG1) млекопитающих, гена субъединицы VIc оксидазы цитохрома с (СОХ6С) млекопитающих или гена N-ацилсфингозин-амидогидролазы (кислая церамидаза) 1 (ASAH1) млекопитающих, наиболее предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (RPL32) человека, гена белка большой субъединицы рибосомы 35 (RPL35) млекопитающих, гена белка большой субъединицы рибосомы 21 (RPL21) человека, гена АТФ-синтазы, Н⁺-транспортирующей, митохондриального комплекса F1, альфа-субъединицы 1, сердечной мышцы (АТР5А1) человека, гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4) человека, индуцируемого андрогеном гена 1 (AIG1) человека, гена субъединицы VIc оксидазы цитохрома с (СОХ6С) человека или гена N-ацилсфингозин-амидогидролазы (кислая церамидаза) 1 (ASAH1) человека, или из их варианта, в которых предпочтительно 5'UTR-элемент не содержит 5'ТОР указанного гена.

Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1368 или SEQ ID NO: 1412-1420, которые указаны в заявке на патент WO 2013/143700, или соответствующей РНК-последовательности, или в которых по меньшей мере один 5'UTR-элемент содержит или состоит из фрагмента нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1368 или SEQ ID NO: 1412-1420, которые указаны в заявке на патент WO 2013/143700, при этом предпочтительно фрагмент представляет собой описанный выше фрагмент, т.е. является непрерывным состоящим из нуклеотидов сегментом, на долю которого приходится по меньшей мере 20% и т.д. от полноразмерной 5'UTR. Предпочтительно фрагмент состоит по меньшей мере примерно из 20 нуклеотидов или более, предпочтительно по меньшей мере примерно из 30 нуклеотидов или более, более предпочтительно по меньшей мере примерно из 40 нуклеотидов или более. Предпочтительно фрагмент представляет собой функциональный фрагмент, указанный в настоящем описании.

Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 36 (5'UTR АТР5А1, лишенная 5'-концевого олигопиримидинового тракта: GCGGCTCGGCCATTTTGTCCCAGTCAGTCCGGAGGCTGCGGCTGCAGAAGTACCGCCTGCG-GAGTAACTGCAAAG; соответствует SEQ ID NO: 1414 в заявке на патент WO 2013/143700), или предпочтительно соответствующей РНК-последовательности, или в которой по меньшей мере один 5'UTR-элемент содержит или состоит из фрагмента нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 26, или более предпочтительно соответствующей РНК-последовательности, в которой предпочтительно фрагмент представляет собой описанный выше фрагмент, т.е. является непрерывным состоящим из нуклеотидов сегментом, на долю которого приходится по меньшей мере 20% и т.д. от полноразмерной 5'UTR. Предпочтительно фрагмент состоит по меньшей мере примерно из 20 нуклеотидов или более, предпочтительно по меньшей мере примерно из 30 нуклеотидов или более, более предпочтительно по меньшей мере примерно из 40 нуклеотидов или более. Предпочтительно фрагмент представляет собой функциональный фрагмент, указанный в настоящем описании.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения мРНК, предлагаемая в изобретении, содержит также по меньшей мере один 3'UTR-элемент, который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, происходящей из 3'UTR гена хордовых животных, предпочтительно гена позвоночных животных, более предпочтительно гена млекопитающих, наиболее предпочтительно человеческого гена, или из варианта 3'UTR гена хордовых животных, предпочтительно гена позвоночных животных, более предпочтительно гена млекопитающих, наиболее предпочтительно человеческого гена.

Понятие «3'UTR-элемент» относится к нуклеотидной последовательности, которая содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, происходящей из 3'UTR или из варианта 3'UTR. 3'UTR-элемент в контексте настоящего изобретения может представлять собой 3'UTR мРНК. Таким образом, в контексте настоящего изобретения предпочтительно 3'UTR-элемент может представлять собой 3'UTR мРНК, предпочтительно искусственной мРНК, или может представлять собой матрицу для транскрипции 3'UTR мРНК. Таким образом, 3'UTR-элемент предпочтительно представляет собой нуклеотидную последовательность, которая соответствует 3'UTR мРНК, предпочтительно 3'UTR искусственной мРНК, такой как мРНК, полученная путем транскрипции созданной с помощью генной инженерии векторной конструкции. Предпочтительно 3'UTR-элемент выполняет функцию 3'UTR или кодирует последовательность, которая выполняет функцию 3'UTR.

Предпочтительно предлагаемая в изобретении мРНК содержит 3'UTR-элемент, который может происходить из гена, который соответствует мРНК с удлиненным временем полужизни (представляющей собой стабильную мРНК), например, 3'UTR-элемент указанный и описанный ниже.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 3'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 3'UTR гена, выбранного из группы, состоящей из гена альбумина, гена α-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), или из варианта 3'UTR гена, выбранного из группы, состоящей из гена альбумина, гена α-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена альфа, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 1369-1390 в заявке на патент WO 2013/143700, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 3'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 3'UTR гена альбумина, предпочтительно гена альбумина позвоночных животных, более предпочтительно гена альбумина млекопитающих, наиболее предпочтительно человеческого гена альбумина, которая имеет SEQ ID NO: 24.

3'UTR человеческого альбумина, имеющая SEQ ID NO: 24:

(соответствует SEQ ID NO: 1369 в заявке на патент WO 2013/143700).

В этом контексте наиболее предпочтительно, когда предлагаемая в изобретении мРНК содержит 3'UTR-элемент, который содержит соответствующую РНК-последовательность, происходящую из SEQ ID NO: 1369-1390, которые указаны в заявке па патент WO 2013/143700, или ее фрагмент, гомолог или вариант.

Наиболее предпочтительно 3'UTR-элемент содержит нуклеотидную последовательность, происходящую из фрагмента гена человеческого альбумина, которая представлена в SEQ ID NO: 25:

3'UTR альбумина7

(SEQ ID NO: 25 соответствует SEQ ID NO: 1376 в заявке на патент WO 2013/143700).

В этом контексте наиболее предпочтительно, когда 3'UTR-элемент предлагаемой в изобретении мРНК содержит или состоит из РНК-последовательности, соответствующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 25.

В другом наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 3'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, происходящей из 3'UTR гена α-глобина, предпочтительно гена α- или β-глобина, более предпочтительно гена α- или β-глобина млекопитающих, наиболее предпочтительно человеческого гена α- или β-глобина, которая имеет SEQ ID NO: 26-28:

3'UTR альфа-цепи гемоглобина 1 Homo sapiens (НВА1)

(SEQ ID NO: 26 соответствует SEQ ID NO: 1370 заявки на патент WO 2013/143700),

3'UTR альфа-цепи гемоглобина 2 Homo sapiens (HBA2)

(SEQ ID NO: 27 соответствует SEQ ID NO: 1371 заявки на патент WO 2013/143700),

3'UTR бета-цепи гемоглобина Homo sapien (HBB)

(SEQ ID NO: 28 соответствует SEQ ID NO: 1372 заявки на патент WO 2013/143700).

Например, 3'UTR-элемент может содержать или состоять из центральной, связывающей α-комплекс области 3'UTR гена α-глобина, такого как ген человеческого α-глобина, которая предпочтительно имеет SEQ ID NO: 29:

центральная связывающая α-комплекс область 3'UTR гена α-глобина (которую в контексте настоящего описания обозначают также как «muag») GCCCGATGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCG (SEQ ID NO: 29 соответствует SEQ ID NO: 1393 заявки на патент WO 2013/143700).

В этом контексте наиболее предпочтительно, когда 3'UTR-элемент мРНК, предлагаемой в изобретении, содержит или состоит из РНК-последовательности, соответствующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 29, или ее гомолога, фрагмента или варианта.

Понятие «нуклеотидная последовательность, происходящая из 3'UTR […]-гена» предпочтительно относится к нуклеотидной последовательности, основой которой является 3'UTR-последовательность […]-гена или ее часть, например, 3'UTR гена альбумина, гена α-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), предпочтительно гена альбумина или его части. Указанное понятие включает последовательности, соответствующие полной 3'UTR-последовательности, т.е. полноразмерной 3'UTR-последовательности гена, и последовательности, соответствующие фрагменту 3'UTR-последовательности гена, например, гена альбумина, гена α-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), предпочтительно гена альбумина.

Понятие ««нуклеотидная последовательность, происходящая из варианта 3'UTR […]-гена» предпочтительно относится к нуклеотидной последовательности, основой которой является вариант 3'UTR-последовательности гена, например, вариант 3'UTR гена альбумина, гена α-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), или его части, как указано выше. Указанное понятия включают последовательности, соответствующие полной последовательности варианта 3'UTR гена, т.е. полноразмерной 3'UTR-последовательности варианта гена, и последовательности, соответствующие фрагменту варианта 3'UTR-последовательности гена. Фрагмент в этом контексте предпочтительно состоит из непрерывного нуклеотидного сегмента, соответствующего непрерывному нуклеотидному сегменту полноразмерного варианта 3'UTR, на долю которого приходится по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% полноразмерного варианта 3'UTR. Указанный фрагмент варианта в контексте настоящего изобретения предпочтительно представляет собой функциональный фрагмент варианта, указанного в настоящем описании.

Предпочтительно по меньшей мере один 5'UTR-элемент и по меньшей мере один 3'UTR-элемент действуют синергетически в отношении повышения производства белка указанной выше мРНК, предлагаемой в изобретении.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении мРНК, содержащая кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмент, вариант или производное, содержит гистоновую последовательность/структуру типа «стебель-петля». Указанные последовательности гистоновой структуры типа «стебель-петля» предпочтительно выбирают из последовательностей гистоновой структуры типа «стебель-петля», которые представлены в WO 2012/019780, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», которую можно применять в настоящем изобретении, предпочтительно выбирают по меньшей мере из одной из следующих формул (I) или (II):

формула (I) (последовательность структуры типа «стебель-петля» без пограничных элементов стебля):

формула (II) (последовательность структуры типа «стебель-петля» с пограничными элементами стебля):

,

в которых:

где

у элементов stem1 и stem2 может происходить спаривание оснований друг с другом с образованием обратно комплементарной последовательности, где спаривание оснований может иметь место между stem1 и stem2, например, посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику нуклеотидов А и U/T или G и С, или посредством спаривания оснований не по Уотсону-Крику, например, посредством спаривания «качающихся» оснований («качающегося» спаривания оснований), обратного спариванию оснований по Уотсону-Крику, посредством хугстиновского спаривания оснований, посредством обратного хугстиновскому спаривания оснований, или у них может происходить спаривание оснований друг с другом с образованием частично обратно комплементарной последовательности, при этом неполное спаривание оснований может иметь место между stem1 и stem2, вследствие того, что для одного или нескольких оснований в одном стебле не имеется комплементарного основания в обратно комплементарной последовательности другого стебля.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения мРНК, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать или кодировать по меньшей мере одну последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», соответствующую по меньшей мере одной из следующих конкретных формул (Ia) или (IIa):

формула (Ia) (последовательность структуры типа «стебель-петля» без пограничных элементов стебля):

формула (IIa) (последовательность структуры типа «стебель-петля» с пограничными элементами стебля):

,

в которой:

N, С, G, T и U имеют указанные выше значения.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения мРНК, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать или кодировать по меньшей мере одну последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», соответствующую по меньшей мере одной из следующих конкретных формул (Ib) или (IIb):

формула (Ib) (последовательность структуры типа «стебель-петля» без пограничных элементов стебля):

формула (IIb) (последовательность структуры типа «стебель-петля» с пограничными элементами стебля):

в которой:

N, С, G, T и U имеют указанные выше значения.

Наиболее предпочтительной последовательностью гистоновой структуры типа «стебель-петля» является последовательность, представленная в SEQ ID NO: 30 CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA, или более предпочтительно последовательность РНК, соответствующая нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 30 (CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA SEQ ID NO: 37).

В конкретном предпочтительном варианте осуществления первого объекта настоящего изобретения мРНК, предлагаемая в изобретении, содержит помимо кодирующей области, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмент, вариант или производное, поли(А)-последовательность, которую называют также поли-А-хвостом, предпочтительно на 3'-конце предлагаемой в изобретении мРНК. Когда она присутствует, то указанная поли(А)-последовательность содержит последовательность, содержащую от примерно 25 до примерно 400 аденозиновых нуклеотидов, предпочтительно последовательность, содержащую от примерно 50 до примерно 400 аденозиновых нуклеотидов, более предпочтительно последовательность, содержащую от примерно 50 до примерно 300 аденозиновых нуклеотидов, еще более предпочтительно последовательность, содержащую от примерно 50 до примерно 250 аденозиновых нуклеотидов, наиболее предпочтительно последовательность, содержащую от примерно 60 до примерно 250 аденозиновых нуклеотидов. В этом контексте понятие «примерно» относится к отклонению, составляющему ±10% от величины(н), к которой(ым) оно относится. Указанная поли(А)-последовательность предпочтительно локализована на 3'-конце кодирующей области, которая входит в предлагаемую в изобретении мРНК, указанную в первом объекте настоящего изобретения. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения предлагаемую в изобретении мРНК можно модифицировать с помощью последовательности, состоящей по меньшей мере из 10 цитозинов, предпочтительно по меньшей мере из 20 цитозинов, более предпочтительно по меньшей мере из 30 цитозинов (так называемая «поли(С)-последовательность»). В частности, мРНК может содержать поли(С)-последовательность, которая, как правило, содержит примерно от 10 до 200 цитозиновых нуклеотидов, предпочтительно примерно от 10 до 100 цитозиновых нуклеотидов, более предпочтительно примерно от 10 до 70 цитозиновых нуклеотидов или еще более предпочтительно примерно от 20 до 50 или даже от 20 до 30 цитозиновых нуклеотидов. Указанная поли(С)-последовательность предпочтительно локализована на 3'-конце кодирующей области, более предпочтительно на 3'-конце необязательной поли(А)-последовательности, которая входит в предлагаемую в изобретении мРНК, указанную в первом объекте настоящего изобретения.

В этом контексте в конкретном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении последовательность мРНК может содержать:

а.) структуру 5'-кэпа, предпочтительно m7GpppN;

б.) кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ), предпочтительно происходящий из слитого белка F респираторно-синцитиального вируса (РСВ);

в.) поли(А)-последовательность, предпочтительно содержащую 64 аденозина; и

г.) необязательно поли(С)-последовательность, предпочтительно содержащую 30 цитозинов.

В наиболее предпочтительном варианте первого объекта настоящего изобретения предлагаемая в настоящем изобретении мРНК, содержащая кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмент, вариант или производное, содержит предпочтительно в 5'→3'-направлении:

а.) структуру 5'-кэпа, предпочтительно m7GpppN;

б.) кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ), предпочтительно происходящий из слитого белка F респираторно-синцитиального вируса (РСВ);

в.) поли(А)-последовательность, предпочтительно содержащую 64 аденозина;

г.) необязательно поли(С)-последовательность, предпочтительно содержащую 30 цитозинов; и

д.) гистоновую структуру типа «стебель-петля», предпочтительно содержащую последовательность РНК, соответствующую нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 30.

В другом наиболее предпочтительном варианте первого объекта настоящего изобретения предлагаемая в настоящем изобретении мРНК, содержащая кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмент, вариант или производное, содержит предпочтительно в 5'→3'-направлении:

а.) структуру 5'-кэпа, предпочтительно m7GpppN;

б.) кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ), предпочтительно происходящий из слитого белка F респираторно-синцитиального вируса (РСВ);

в.) необязательно 3'UTR-элемент, происходящий из гена альфа-глобина, предпочтительно содержащий последовательность РНК, соответствующую нуклеотидной последовательности SEQ ID NO. 29, ее гомолог, фрагмент или вариант;

г.) поли(А)-последовательность, предпочтительно содержащую 64 аденозина;

д.) необязательно поли(С)-последовательность, предпочтительно содержащую 30 цитозинов; и

е.) гистоновую структуру типа «стебель-петля», предпочтительно содержащую последовательность РНК, соответствующую нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 30.

В другом наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в настоящем изобретении мРНК, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмент, вариант или производное, содержит предпочтительно в 5'→3'-направлении:

а.) структуру 5'-кэпа, предпочтительно m7GpppN;

б.) необязательно 5'UTR-элемент, происходящий из гена ТОР, предпочтительно происходящий из последовательности РНК, соответствующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23, ее гомолога, фрагмента или варианта;

в.) кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ), предпочтительно происходящий из слитого белка F респираторно-синцитиального вируса (РСВ);

г.) необязательно 3'UTR-элемент, происходящий из гена, из которого получают стабильную мРНК, предпочтительно происходящий из последовательности РНК, соответствующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 25, ее гомолога, фрагмента или варианта;

д.) поли(А)-последовательность, предпочтительно содержащую 64 аденозина;

е.) необязательно поли(С)-последовательность, предпочтительно содержащую 30 цитозинов; и

ж.) гистоновую структуру типа «стебель-петля», предпочтительно содержащую соответствующую последовательность РНК нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 30.

Кодирующая область может кодировать по меньшей мере частично одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-11 или ее фрагменты, варианты или производные. Кроме того, кодирующая область предлагаемой в изобретении мРНК может кодировать комбинацию по меньшей мере двух указанных аминокислотных последовательностей или комбинацию их фрагментов, вариантов или производных. В этом контексте наиболее предпочтительной является комбинация слитого белка F с нуклеопротеином N и комбинация слитого белка F с белком М2-1.

Кроме того, кодирующая область может представлять собой или может содержать по меньшей мере частично одну из последовательностей SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 22 или ее фрагменты, гомологи или варианты. Кроме того, мРНК может содержать комбинацию по меньшей мере двух указанных аминокислотных последовательностей или комбинацию их фрагментов, гомологов или вариантов.

Для дополнительного повышения устойчивости, например, к расщеплению in vivo (например, экзо- или эндонуклеазой), предлагаемую в изобретении мРНК можно получать в виде стабилизированной нуклеиновой кислоты, например, в форме модифицированной нуклеиновой кислоты. Таким образом, согласно дополнительному варианту осуществления изобретения предпочтительно стабилизируют предлагаемую в изобретении мРНК, предпочтительно с помощью модификаций каркаса, модификаций сахара и/или модификаций оснований, более предпочтительно путем модификации содержания G/C. Все указанные модификации можно интродуцировать в предлагаемую в изобретению мРНК без нарушения функции мРНК, которая должна транслироваться в антигенную функцию происходящего из респираторно-синцитиального вируса (РСВ) пептида или белка.

В контексте настоящего изобретения модификация каркаса предпочтительно представляет собой модификацию, при которой фосфаты каркаса нуклеотидов, входящих в предлагаемую в изобретении мРНК, химически модифицируют, например, с помощью анионной межнуклеозидной связи, N3'→P5'-модификаций, замены несвязанных мостиками атомов кислорода на бораны, нейтральной межнуклеозидной связи, амидной связи нуклеозидов, метиленовых (метиленимино) связей, формацетальных или тиоформацетальных связей, интродукции сульфонильных групп или т.п.

В контексте настоящего изобретения модификация сахара предпочтительно представляет собой химическую модификацию сахара нуклеотидов предлагаемой в изобретении мРНК, например, метилирование рибозного остатка или т.п.

Согласно другому варианту осуществления изобретения предлагаемую в изобретении мРНК можно модифицировать и тем самым стабилизировать путем модификации содержания G (гуанозин)/С (цитозина) в мРНК, предпочтительно в ее кодирующей области.

При этом содержание G/C в предлагаемой в изобретении мРНК, предпочтительно в кодирующей области, значительно повышают по сравнению с содержанием G/C в кодирующей области ее конкретной кодирующей последовательности дикого типа, т.е. в немодифицированной мРНК. Однако кодируемую аминокислотную последовательность предлагаемой в изобретении мРНК предпочтительно не модифицируют по сравнению кодируемой аминокислотной последовательностью конкретной мРНК дикого типа/немодифицированной мРНК.

Модификация содержания G/C в предлагаемой в изобретении мРНК основана на том факте, что последовательности РНК, имеющие повышенное содержание G (гуанозин)/С (цитозин), являются более стабильными, чем последовательности мРНК, имеющие повышенное содержание А (аденозин)/U (урацил). Таким образом, кодоны кодирующей области полной РНК можно изменять по сравнению с кодирующей областью дикого типа или мРНК так, чтобы они содержали большее количество G/C-нуклеотидов, с сохранением транслируемой аминокислотной последовательности. Учитывая тот факт, что несколько кодонов кодируют одну и ту же аминокислоту (так называемая вырожденность генетического кода), можно определять наиболее предпочтительные с точки зрения стабильности кодоны (так называемые альтернативные наиболее часто встречающиеся кодоны). Предпочтительно содержание G/C в кодирующей области предлагаемой в изобретении мРНК повышают по меньшей мере на 7%, более предпочтительно по меньшей мере на 15%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 20%, по сравнению с содержанием G/C в кодирующей области мРНК дикого типа. В конкретном варианте осуществления изобретения заменяют по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90%, 95% или даже 100% пригодных для замены кодонов в области, кодирующей белок или пептид, указанный в настоящем описании, или его фрагмент, вариант и/или производное, или всю последовательность мРНК дикого типа или кодирующую последовательность, повышая тем самым содержание G/C в указанной последовательности. В этом контексте наиболее предпочтительно повышать содержание G/C в предлагаемой в изобретении мРНК до максимума (т.е. до 100% пригодных для замещения кодонов), прежде всего в кодирующей области, по сравнению с последовательностью дикого типа.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения предлагаемую в изобретении мРНК оптимизируют для трансляции, предпочтительно оптимизируют для трансляции путем замены менее часто встречающихся тРНК данной аминокислоты на кодоны более часто встречающихся тРНК соответствующей аминокислоты. Это основано на открытии того факта, что эффективность трансляции определяется также различной частотой встречаемости тРНК в клетках. Так, если так называемые «менее часто встречающиеся кодоны» присутствуют в предлагаемой в изобретении мРНК в более высоком уровне, то соответствующая модифицированная РНК транслируется в существенно худшей степени, чем в случае, если присутствуют кодоны более часто встречающихся тРНК. Предпочтительно кодирующую область предлагаемой в изобретении мРНК модифицируют по сравнению с соответствующей областью РНК дикого типа или кодирующей последовательностью так, чтобы по меньшей мере один кодон последовательности дикого типа, который кодирует тРНК, которая является редкой или менее часто встречается в клетке, заменять на кодон, который кодирует тРНК, которая более или наиболее часто встречается в клетке и «несет» ту же самую аминокислоту, что и относительно редкая или менее часто встречающаяся тРНК. Путем такой модификации последовательности предлагаемой в изобретении мРНК можно модифицировать таким образом, чтобы встраивать кодоны, для которых доступны более часто встречающиеся тРНК. Другими словами, согласно изобретению с помощью такой модификации все кодоны последовательности дикого типа, которые кодируют тРНК, являющуюся относительно редкой в клетке, можно в каждом случае заменять на кодоны, которые кодируют тРНК, относительно часто встречающуюся в клетке, и которая в каждом случае «несет» такую же аминокислоту, что и относительно редкая тРНК. Кроме того, наиболее предпочтительно объединять повышение G/C-содержания в последовательности, прежде всего до максимума, в предлагаемой в изобретении мРНК с «часто встречающимися» кодонами без модификации аминокислотной последовательности белка, кодируемого кодирующей областью предлагаемой в изобретении мРНК или кодирующей области. Указанный предпочтительный вариант осуществления изобретения позволяет получать наиболее эффективно транслируемую и стабилизированную (модифицированную) предлагаемую в изобретении мРНК.

Замены, добавления или элиминации оснований предпочтительно осуществляют с использованием ДНК-матрицы для получения молекулы нуклеиновой кислоты с помощью хорошо известных методик сайтнаправленного мутагенеза или олигонуклеотидного лигирования. В указанном процессе для получения по меньшей мере одной РНК в предлагаемой в изобретении комбинированной вакцине, указанной в настоящем описании, соответственную молекулу ДНК можно транскрибировать in vitro. Указанная ДНК-матрица предпочтительно содержит пригодный промотор, например, промотор Т7 или SP6, для транскрипции in vitro, за которым располагается требуемая нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере одну мРНК, которую нужно получить, и сигнал терминации для транскрипции in vitro. Молекулу ДНК, которая служит матрицей по меньшей мере для одной представляющей интерес РНК, можно получать путем ферментативной пролиферации и последующего выделения в виде части плазмиды, которая может реплицироваться в бактериях. Плазмиды, которые можно рассматривать в качестве приемлемых для осуществления настоящего изобретения, представляют собой, например, плазмиды рТ7Т (GenBank, регистрационный номер U26404; Lai и др., Development, 121, 1995, сс. 2349-2360), серии pGEM^®, например, pGEM^®-1 (GenBank, регистрационный номер Х65300; фирма Promega) и pSP64 (GenBank, регистрационный номер Х65327); ср. также Mezei и Storts, Purification of PCR Products в: PCR Technology: Current Innovation, под ред. Griffin и Griffin, изд-во CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении последовательность мРНК согласно первому объекту настоящего изобретения содержит, предпочтительно в 5'→3' направлении:

а) структуру 5'-кэпа, указанную в настоящем описании, предпочтительно m7GpppN;

б) кодирующую область, предпочтительно с повышенным или даже максимальным содержанием G/C по сравнению с содержанием G/C в кодирующей области мРНК дикого типа, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из слитого белка F, гликопротеина G, короткого гидрофобного белка SH, матриксного белка М, нуклеопротеина N, большой субъединицы полимеразы L, белка М2-1, белка М2-2, фосфопротеина Р, неструктурного белка NS1 или неструктурного белка NS2 респираторно-синцитиального вируса (РСВ), или его фрагмент, вариант или производное;

в) 3'UTR-элемент, указанный в настоящем описании, предпочтительно происходящий из гена, образующего стабильную мРНК, наиболее предпочтительно РНК-последовательности, соответствующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 29, или ее гомолога, фрагмента или варианта;

г) поли(А)-последовательность, предпочтительно состоящую из 64 аденозинов;

д) необязательно поли(С)-последовательность, состоящую из 30 цитозинов;

е) по меньшей мере одну последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», предпочтительно РНК-последовательность, соответствующую нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 30.

Наиболее предпочтительно предлагаемая в изобретении последовательность мРНК, указанная в этом конкретном варианте осуществления изобретения, содержит модификации последовательности, представленные на фиг. 1 (SEQ ID NO: 31), приведенной в качестве примера предлагаемой в изобретении мРНК, кодирующей слитый белок F «длинного» штамма РСВ.

В другом наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении последовательность мРНК согласно первому объекту настоящего изобретения содержит, предпочтительно в 5'→3' направлении:

а) структуру 5'-кэпа, указанную в настоящем описании, предпочтительно m7GpppN;

б) 5'UTR-элемент, указанный в настоящем описании, предпочтительно 5'UTR-элемент, который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, происходящей из 5'UTR ТОР-гена, предпочтительно 5'UTR человеческого белка большой субъединицы рибосомы 32, без 5'-концевого олигопиримидинового тракта, имеющего SEQ ID NO: 23, или соответствующей РНК-последовательности; или ее фрагмента, гомолога или варианта;

в) кодирующую область, предпочтительно с повышенным или даже максимальным содержанием G/C по сравнению с содержанием G/C в кодирующей области мРНК дикого типа, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из слитого белка F, гликопротеина G, короткого гидрофобного белка SH, матриксного белка М, нуклеопротеина N, большой субъединицы полимеразы L, белка М2-1, белка М2-2, фосфопротеина Р, неструктурного белка NS1 или неструктурного белка NS2 респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмент, вариант или производное;

г) 3'UTR-элемент, предпочтительно 3'UTR-элемент человеческого альбумина, имеющий SEQ ID NO: 24 или соответствующую РНК, или ее гомолог, фрагмент или вариант;

д) поли(А)-последовательность, предпочтительно состоящую из 64 аденозинов;

е) необязательно поли(С)-последовательность, состоящую из 30 цитозинов;

ж) по меньшей мере одну последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», предпочтительно РНК-последовательность, соответствующую нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 30.

Наиболее предпочтительно предлагаемая в изобретении последовательность мРНК, указанная в этом конкретном варианте осуществления изобретения, содержит модификации последовательности, представленные на фиг. 2 (SEQ ID NO: 32), приведенной в качестве примера предлагаемой в изобретении мРНК, кодирующей слитый белок F «длинного» штамма РСВ.

В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении последовательность мРНК содержит или состоит из последовательностей, представленных на фиг. 1-5. которые соответствуют SEQ ID NO: 31 и 35.

В других конкретных вариантах осуществления изобретения мРНК, предлагаемая в изобретении, может содержать также последовательность участка внутренней посадки (связывания) рибосомы (IRES) или IRES-мотива, которая может разделять несколько открытых рамок считывания, например, если предлагаемая в изобретении мРНК кодирует два или большее количество антигенных пептидов или белков. IRES-последовательность может оказаться особенно ценной, если мРНК представляет собой би- или полицистронную мРНК.

Кроме того, предлагаемую в изобретении мРНК можно получать с помощью любого метода, известного в данной области, включая методы синтеза, такие как твердофазный синтез, а также методы in vitro, такие как реакции транскрипции in vitro.

Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения мРНК, содержащую кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмент, вариант или производное, можно вводить в «оголенном» виде без ассоциации с каким-либо дополнительным наполнителем, трансфектирующим или комплексообразующим агентом, предназначенным для повышения эффективности трансфекции и/или иммуностимулирующих свойств предлагаемой в изобретении мРНК, или дополнительно включенной нуклеиновой кислотой.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемую в изобретении мРНК можно объединять вместе с катионным или поликатионным соединением и/или с полимерным носителем. Следовательно, в конкретном варианте осуществления изобретения предпочтительно, чтобы предлагаемая в изобретении мРНК или любая другая нуклеиновая кислота, входящая в предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину, была ассоциирована или включена в комплекс с катионным или поликатионным соединением или полимерным носителем, необязательно в массовом соотношении мРНК или нуклеиновой кислоты к катионному или поликатионному соединению и/или к полимерному носителю, выбранном из диапазона от примерно 6:1 до примерно 0,25:1 (мас./мас.), более предпочтительно от примерно 5:1 до примерно 0,5:1 (мас./мас.), еще более предпочтительно от примерно 4:1 до примерно 1:1 (мас./мас.) или от примерно 3:1 до примерно 1:1 (мас./мас.), и наиболее предпочтительно в соотношении, составляющем от примерно 3:1 до примерно 2:1 (мас./мас.); или необязательно в соотношении азот/фосфат мРНК или нуклеиновой кислоты к катионному или поликатионному соединению и/или к полимерному носителю, в диапазоне, примерно 0,1-10, предпочтительно в диапазоне примерно 0,3-4 или 0,3-1, и наиболее предпочтительно в диапазоне примерно 0,5-1 или 0,7-1, и еще более предпочтительно в диапазоне примерно 0,3-0,9 или 0,5-0,9. Таким образом, предлагаемая в изобретении мРНК или любая другая нуклеиновая кислота, входящая в предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину, может быть ассоциирована с наполнителем, трансфектирующим или комплексообразующим агентом, предназначенным для повышения эффективности трансфекции и/или иммуностимулирующих свойств предлагаемой в изобретении мРНК, или с необязательно дополнительно включенными нуклеиновыми кислотами.

В этом контексте наиболее предпочтительными агентами для трансфекции или комплексообразования являются катионные или поликатионные соединения, включая протамин, нуклеолин, спермин или спермидин, или другие катионные пептиды или белки, такие как поли-L-лизин (ПЛЛ), полиаргинин, основные полипептиды, проникающие в клетки пептиды (СРР), включая ВИЧ-связывающие пептиды, Tat, ВИЧ-1 Tat (ВИЧ), полученные из Tat пептиды, пенетратин, полученные из VP22 пептиды или аналогичные пептиды, VP22 HSV (вирус герпеса простого), MAP, KALA или домены белковой трансдукции (PTD), РрТ620, богатые пролином пептиды, богатые аргинином пептиды, богатые лизином пептиды, MPG-пептид(ы), Рер-1, L-олигомеры, пептид(ы) кальцитонина, пептиды, полученные из Antennapedia (прежде всего, из Drosophila antennapedia), pAntp, pIsl, FGF, лактоферрин, транспортан, буфорин-2, Вас715-24, SynB, SynB(1), pVEC, полученные из hCT пептиды, SAP или гистоны.

В этом контексте наиболее предпочтительным является протамин.

Кроме того, предпочтительные катионные или поликатионные белки или пептиды, можно выбирать из следующих белков или пептидов, которые имеют следующую общую формулу (III):

,

в которой l+m+n+o+x обозначают 8-15 и l, m, n или o каждый независимо друг от друга могут представлять собой любые числа, выбранные из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, при условии, что общее содержание Arg, Lys, His и Orn составляет по меньшей мере 50% от общего содержания аминокислот в олигопептиде; а Хаа может обозначать любую аминокислоту, выбранную из нативных (т.е. встречающихся в естественных условиях) или не встречающихся в естественных условиях аминокислот за исключением Arg, Lys, His или Orn; и x может обозначать любое число, выбранное из 0, 1, 2, 3 или 4, при условии, что общее содержание Хаа не превышает 50% от общего содержания аминокислот в олигопептиде. В этом контексте наиболее предпочтительными катионными пептидами являются, например, Arg₇, Arg₈, Arg₉, H₃R₉, R₉H₃, H₃R₉H₃, YSSR₉SSY, (RKH)₄, Y(RKH)₂R и т.д., которые описаны в WO 2009/030481, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Кроме того, предпочтительные катионные или поликатионные соединения, которые можно применять в качестве агентов для трансфекции или комплексообразования, могут включать катионные полисахариды, например, хитозан, полибрен, катионные полимеры, например, полиэтиленимин (ПЭИ), катионные липиды, например, DOTMA: хлорид [1-(2,3-сиолеилокси)пропил)]-N,N,N-триметиламмония, DMRIE, ди-С14-амидин, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, СТАР, DOPC, DODAP, DOPE: диолеилфосфатидилэтаноламин, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: диоктадециламидоглицилспермин, DIMRI: бромид димиристооксипропилдиметилгидроксиэтиламмония, DOTAP: диолеоилокси-3-(триметиламмоний)пропан, DC-6-14: хлорид O,O-дитетрадеканоил-N-(α-триметиламмонийацетил)диэтаноламина, CLIP1: хлорид рац[(2,3-диоктадецилоксипропил)(2-гидроксиэтил)]диметиламмония, CLIP6: рац[2(2,3-дигексадецилоксипропилоксиметилокси)этил]триметиламмоний, CLIP9: рац[2(2,3-дигексадецилоксипропилоксисукцинилокси)этил]триметиламмоний, олигофектамин, или катионные или поликатионные полимеры, например, модифицированные полиаминокислоты, такие как полимеры |3-аминокислот или обращенные полиамиды и т.п., модифицированные полиэтилены, такие как ПВП (поли-N-этил-4-винилпириднийбромид)) и т.п., модифицированные акрилаты, такие как пДМАЭМА (поли(диметиламиноэтилметилакрилат)) и т.п., модифицированные амидоамины, такие как пАМАМ (поли(амидоамин)) и т.п., модифицированные сложные поли-β-аминоэфиры (ПБАЭ), такие как модифицированные в диаминоконцевом фрагменте сополимеры 1,4-бутандиолдиакрилата и 5-амино-1-пентанола и т.п., дендримеры, такие как дендримеры полипропиламина или дендримеры на основе пАМАМ и т.п., полиимин(ы), такие как полиэтиленимин (ПЭИ), полипропиленимин и т.п., полиаллиламин, полимеры на основе сахарного каркаса, такие как полимеры на основе циклодекстрина, полимеры на основе декстрана, хитозан и т.п., силановые полимеры, такие как сополимеры PMOXA-PDMS и т.п., блокполимеры, включающие комбинацию одного или более катионных блоков (например, выбранных из катионных полимеров, указанных выше) и одного или нескольких гидрофильных или гидрофобных блоков (таких, например, как полиэтиленгликоль) и т.п.

Полимерный носитель, применяемый согласно изобретению, может представлять собой полимерный носитель, состоящий из сшитых дисульфидами катионных компонентов. Сшитые дисульфидами катионные компоненты могут быть одинаковыми или отличными друг от друга. Полимерный носитель может содержать также другие компоненты. Наиболее предпочтительно также, чтобы полимерный носитель, применяемый согласно настоящему изобретению, содержал смеси катионных пептидов, белков или полимеров и необязательно другие компоненты, указанные в настоящем описании, которые сшиты с помощью дисульфидных связей, как указано в настоящем описании. В этом контексте содержание WO 2012/013326 включено в настоящее описание в качестве ссылки.

В этом контексте катионные компоненты, которые в результате сшивания дисульфидами формируют основу полимерного носителя, как правило, выбирают из любых пригодных катионных или поликатионных пептидов, белков или полимеров, которые можно применять для этой цели, прежде всего из любых катионных или поликатионных пептидов, белков или полимеров, которые обладают способностью образовывать комплекс с мРНК или нуклеиновой кислотой, указанной в настоящем изобретении, и тем самым предпочтительно конденсировать мРНК или нуклеиновую кислоту. Катионный или поликатионный пептид, белок или полимер предпочтительно представляет собой линейную молекулу, однако можно применять также разветвленные катионные или поликатионные пептиды, белки или полимеры.

Каждый сшитый дисульфидами катионный или поликатионный белок, пептид или полимер полимерного носителя, который можно применять для образования комплекса с предлагаемой в изобретении мРНК или любой другой нуклеиновой кислотой, входящей в предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину, содержит по меньшей мере одну -SH-группу, наиболее предпочтительно по меньшей мере один цистеиновый остаток или любую другую химическую группу, несущую -SH-группу, которая способна образовывать дисульфидную связь при конденсации по меньшей мере с одним другим катионным или поликатионным белком, пептидом или полимером в качестве катионного компонента полимерного носителя, указанного в настоящем описании.

Как указано выше, полимерный носитель, который можно применять для образования комплекса с предлагаемой в изобретении мРНК или любой другой нуклеиновой кислотой, входящей в предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину, может быть образован из сшитых дисульфидами катионных (или поликатионных) компонентов.

Предпочтительно указанные катионные или поликатионные пептиды или белки или полимеры полимерного носителя, которые содержат или дополнительно модифицированы так, что они содержат по меньшей мере одну -SH-группу, выбирают из белков, пептидов и полимеров, указанных выше в качестве комплексообразующего агента.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения полимерный носитель, который можно применять для образования комплекса с предлагаемой в изобретении мРНК или любой другой нуклеиновой кислотой, входящей в предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину, можно выбирать из молекулы полимерного носителя, имеющей общую форму (IV):

,

в которой

Р¹ и Р³ являются различными или идентичными друг другу и представляют собой линейную или разветвленную гидрофильную полимерную цепь, каждый Р¹ и Р³ несет по меньшей мере одну -SH-группу, способную образовывать дисульфидную связь при конденсации с компонентом Р², или альтернативно этому с (АА), (АА)_x или [(AA)_x]_z, если указанные компоненты используют в качестве линкера между Р¹ и Р² или Р³ и Р²) и/или с другими компонентами (например, (АА), (АА)_x, [(AA)_x]_z или L), линейную или разветвленную гидрофильную полимерную цепь, выбранную независимо друг от друга из полиэтиленгликоля (ПЭГ), поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламида, поли-2-(метакрилоилокси)этилфосфорилхолинов, поли(гидроксиалкил-L-аспарагина), поли(2-(метакрилоилокси)этилфосфорилхолина), гидроксиэтилкрахмала или поли(гидроксиалкид-L-глутамина), где гидрофильная полимерная цепь имеет молекулярную массу от примерно 1 до примерно 100 кДа, предпочтительно от примерно 2 до примерно 25 кДа или более предпочтительно от примерно 2 до примерно 10 кДа, например, от примерно 5 до примерно 25 кДа или от 5 до примерно 10 кДа;

Р² обозначает катионный или поликатионный пептид или белок, например, указанный выше для полимерного носителя, сформированного сшитыми дисульфидами катионными компонентами, и предпочтительно имеющий длину от примерно 3 до примерно 100 аминокислот, более предпочтительно имеющий длину от примерно 3 до примерно 50 аминокислот, еще более предпочтительно имеющий длину от примерно 3 до примерно 25 аминокислот, например, имеющий длину примерно от 3 до 10, от 5 до 15, от 10 до 20 или от 15 до 25 аминокислот, более предпочтительно имеющий длину от примерно 5 до примерно 20 и еще более предпочтительно имеющий длину от примерно 10 до примерно 20 аминокислот; или

обозначает катионный или поликатионный полимер, например, указанный выше для полимерного носителя, сформированного сшитыми дисульфидами катионными компонентами, как правило, имеющий молекулярную массу от примерно 0,5 до примерно 30 кДа, включая молекулярную массу от примерно 1 до примерно 20 кДа, еще более предпочтительно от примерно 1,5 до примерно 10 кДа, или имеющий молекулярную массу от примерно 0,5 до примерно 100 кДа, включая молекулярную массу от примерно 10 до примерно 50 кДа, еще более предпочтительно от примерно 10 до примерно 30 кДа;

каждый Р² несет по меньшей мере две -SH-группы, способные образовывать дисульфидную связь при конденсации с другими компонентами Р² или с компонентом(ами) Р¹ и/или Р³, или альтернативно этому с другими компонентами (например, (АА), (АА)_x или [(AA)_x]_z);

-S-S- обозначает (обратимую) дисульфидную связь (для удобочитаемости скобки опущены), в которой S предпочтительно представляет собой серу или несущую -SH группу, которая образует (обратимую) дисульфидную связь. (Обратимую) дисульфидную связь предпочтительно получают путем конденсации -SH-групп либо компонентов Р¹ и Р², либо Р² и Р², либо Р² и Р³, либо необязательно других компонентов, указанных в настоящем описании (например, L, (АА), (АА)_x, [(AA)_x]_z и т.д.); -SH-группа может представлять собой часть структуры указанных компонентов или может быть добавлена путем указанной модификации;

L обозначает необязательный лиганд, который может присутствовать или отсутствовать, и его можно выбирать независимо друг от друга из RGD, трансферрина, фолата, сигнального пептида или сигнальной последовательности, сигнала или последовательности локализации, сигнала или последовательности ядерной локализации (NLS), антитела, проникающего в клетку пептида (например, ТАТ или KALA), лиганда рецептора (например, цитокинов, гормонов, факторов роста и т.д.), малых молекул (например, углеводов типа маннозы или галактозы, или синтетических лигандов), агонистов малых молекул, ингибиторов или антагонистов рецепторов (например, аналогов RGD-пептидомиметиков) или любого другого белка, указанного в настоящем описании, и т.д.;

n обозначает целое число, как правило выбранное из диапазона примерно от 1 до 50, предпочтительно из диапазона примерно от 1, 2 или 3 до 30, более предпочтительно из диапазона примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 25, или диапазона примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 20, или диапазона примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 15, или диапазона примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 10, включая, например, диапазон примерно от 4 до 9, от 4 до 10, от 3 до 20, от 4 до 20, от 5 до 20 или от 10 до 20, или диапазон примерно от 3 до 15, от 4 до 15, от 5 до 15 или от 10 до 15, или диапазон примерно от 6 до 11 или от 7 до 10. Наиболее предпочтительно n находится в диапазоне примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 10, более предпочтительно в диапазоне примерно от 1, 2, 3 или 4 до 9, в диапазоне примерно от 1, 2, 3 или 4 до 8, или в диапазоне примерно от 1, 2 или 3 до 7.

В этом контексте содержание WO 2011/026641 включено в настоящее описание в качестве ссылки. Каждый из гидрофильных полимеров Р¹ и Р³, как правило, несет по меньшей мере одну -SH-группу, где по меньшей мере одна -SH-группа может образовывать дисульфидную связь при взаимодействии с компонентом Р² или с компонентом (АА) или (АА)_x, если его используют в качестве линкера между Р¹ и Р² или Р³ и Р², как указано ниже, и необязательно с другим компонентом, например, L и/или (АА) или (АА)_x, например, если он несет две или большее количество -SH-групп. Следующие подформулы «P¹-S-S-Р²» и «Р²-S-S-P³» в представленной выше общей формуле (V) (для большей удобочитаемости скобки опущены), в которой все S, Р¹ и Р³ имеют указанные выше значения, как правило, описывают ситуацию, когда одна -SH-группа гидрофильных полимеров Р¹ и Р³ сконденсирована с одной -SH-группой компонента Р² в представленной выше общей формуле (V), где оба атома серы в указанных -SH-группах образуют дисульфидную связь -S-S-, как указано в формуле (V). Указанные -SH-группы, как правило, присутствуют в каждом из гидрофильных полимеров Р¹ и Р³, например, присутствуют в локализованном внутри него цистеине или любой другой (модифицированной) аминокислоте или соединении, которая/которое несет -SH-группу. Следовательно, подформулы «Р¹-S-S-P²» и «Р²-S-S-P³» можно записать также в виде «Р¹-Cys-Cys-P²» и «Р²-Cys-Cys-P³», если -SH-группа присутствует в цистеине, где понятие Cys-Cys обозначает два цистеина, сцепленных дисульфидной связью, но не пептидной связью. В этом случае понятие «-S-S-» в указанных формулах можно записать также в виде «-S-Cys», в виде «-Cys-S» или в виде «-Cys-Cys-». В этом контексте понятие «-Cys-Cys-» описывает не пептидную связь, а сцепление двух цистеинов через их -SH-группы с образованием дисульфидной связи. Таким образом, понятие «-Cys-Cys-» можно записать также в общем виде как «-(Cys-S)-(S-Cys)-», где в рассматриваемом конкретном случае S обозначает атом серы -SH-группы цистеина. Аналогично этому понятия «-S-Cys» и «-Cys-S» обозначают дисульфидную связь между содержащим -SH-группу фрагментом и цистеином, которые можно записать также как «-S-(S-Cys)» и «-(Cys-S)-S». Альтернативно этому, гидрофильные полимеры Р¹ и Р³ можно модифицировать -SH-группой, предпочтительно посредством химического взаимодействия с соединением, несущим -SH-группу, так, чтобы каждый из гидрофильных полимеров Р¹ и Р³ нес по меньшей мере одну -SH-группу. Такое соединение, несущее -SH-группу, может представлять собой, например, (дополнительный) цистеин или любую другую (модифицированную) аминокислоту, которая несет -SH-группу. Такое соединение может представлять собой также отличное от аминокислоты соединение или группу, которое/которая содержит или дает возможность интродуцировать -SH-группу в гидрофильные полимеры Р¹ и Р³, представленные в настоящем описании. Такие отличные от аминокислот соединения можно присоединять к гидрофильным полимерам Р¹ и Р³ полимерного носителя формулы (VI), предлагаемого в настоящем изобретении, посредством химических взаимодействий или путем связывания с соединениями, например, путем связывания с 3-тиопропионовой кислотой или тиоимоланом, путем образования амида (например, карбоновые кислоты, сульфоновые кислоты, амины и т.д.), путем реакции присоединения по Михаэлю (например, малеимидные группы, α,β-ненасыщенные карбонилы и т.д.), с помощью клик-химии (например, азиды или алкины), с помощью метатезиса алкенов/алкинов (например, алкены или алкины), формирования иминов или гидрозонов (альдегиды или кетоны, гидразины, гидроксиламины, амины), реакций комплексообразования (авидин, биотин, белок G) или с компонентами, которые допускают реакции замещения S_n-типа (например, галогеналканы, тиолы, спирты, амины, гидразины, гидразиды, эфиры сульфоновых кислот, соли оксифосфония) или другими химическими группами, которые можно использовать для присоединения других компонентов. В этом контексте наиболее предпочтительным производным ПЭГ является альфа-метокси-омега-меркапто-поли(этиленгликоль). В каждом случае SH-группа, например, цистеина или любой другой (модифицированной) аминокислоты или соединения, может присутствовать на концах или в любом положении внутри гидрофильных полимеров Р¹ и Р³. Как указано в настоящем описании, каждый из гидрофильных полимеров Р¹ и Р³, как правило, несет по меньшей мере одну -SH-группу, предпочтительно на одном конце, но может содержать также две или даже большее количество -SH-групп, которые можно использовать для дополнительного присоединения других компонентов, указанных в настоящем описании, предпочтительно других функциональных пептидов или белков, например, лиганда, аминокислотного компонента (АА) или (АА)_x, антител, проникающих в клетку пептидов или энхансерных пептидов (например, ТАТ, KALA) и т.д.

В этом контексте наиболее предпочтительно, если предлагаемая в изобретении мРНК образует комплекс по меньшей мере частично с катионным или поликатионным соединением и/или полимерным носителем, предпочтительно катионными белками или пептидами. В этом контексте содержание WO 2010/037539 и содержание WO 2012/113513 включены в настоящее описание в качестве ссылки. «Частично» означает, что только часть предлагаемой в изобретении мРНК входит в состав комплекса с катионным соединением и что остальная предлагаемая в изобретении мРНК (входящая в предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину) не входит в состав комплекса (т.е. находится в «свободной» форме). Предпочтительно соотношение входящая в комплекс мРНК : свободная мРНК (в предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцине) выбирают из диапазона от примерно 5:1 до примерно 1:10 (мас./мас.), более предпочтительно из диапазона от примерно 4:1 до примерно 1:8 (мас./мас.), еще более предпочтительно из диапазона от примерно 3:1 до примерно 1:5 (мас./мас.) или 1:3 (мас./мас.), и наиболее предпочтительно соотношение входящая в комплекс мРНК : свободная мРНК в предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцине, выбирают из соотношения, составляющего примерно 1:1 (мас./мас.).

Входящую в комплекс мРНК, предлагаемую в изобретении, содержащуюся в предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцине, предпочтительно получают, формируя на первой стадии комплекс предлагаемой в изобретении мРНК с катионным или поликатионным соединением и/или с полимерным носителем, предпочтительно указанным в настоящем описании, в определенном соотношении для создания стабильного комплекса. В этом контексте наиболее предпочтительно, чтобы после включения в комплекс мРНК не оставалось свободного катионного или поликатионного соединения, или полимерного носителя или чтобы оно/он присутствовал лишь в незначительном количестве в компоненте, содержащем включенную в комплекс мРНК. Следовательно, соотношение между мРНК и катионным или поликатионным соединением и/или полимерным носителем в компоненте, представляющем собой включенную в комплекс мРНК, как правило, выбирают таким образом, чтобы мРНК была полностью включена в комплекс и чтобы в композиции не оставалось свободного катионного или поликатионного соединения, или полимерного носителя, или чтобы оно/он присутствовал лишь в незначительном количестве.

Предпочтительно соотношение между мРНК и катионным или поликатионным соединением и/или полимерным носителем, предпочтительно указанным в настоящем описании, выбирают из диапазона от примерно 6:1 до примерно 0,25:1 (мас./мас.), более предпочтительно от примерно 5:1 до примерно 0,5:1 (мас./мас.), еще более предпочтительно от примерно 4:1 до примерно 1:1 (мас./мас.) или от примерно 3:1 до примерно 1:1 (мас./мас.), и наиболее предпочтительно соотношение составляет от примерно 3:1 до примерно 2:1 (мас./мас.). Альтернативно этому соотношение между мРНК и катионным или поликатионным соединением и/или полимерным носителем, предпочтительно, указанным в настоящем описании, в компоненте, содержащем включенную в комплекс мРНК, можно рассчитывать также на основе соотношения азот/фосфат (N/P-соотношение) для всего комплекса. В контексте настоящего изобретения N/P-соотношение предпочтительно находится в диапазоне примерно 0,1-10, предпочтительно в диапазоне примерно 0,3-4 и наиболее предпочтительно диапазоне примерно 0,5-2 или 0,7-2 касательно соотношения катионное или поликатионное соединение и/или полимерный носитель: мРНК в комплексе, предпочтительно, указанном в настоящем описании, и наиболее предпочтительно в диапазоне примерно 0,7-1,5, 0,5-1 или 0,7-1, и еще наиболее предпочтительно в диапазоне примерно 0,3-0,9 или 0,5-0,9, предпочтительно при условии, что катионное или поликатионное соединение в комплексе представляет собой катионный или поликатионный белок, или пептид и/или полимерный носитель, указанный выше. В этом конкретном варианте осуществления изобретения включенная в комплекс мРНК подпадает также под понятие «адъювантный компонент».

Другим объектом изобретения является композиция, содержащая несколько или больше одной, предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 5, наиболее предпочтительно от 2 до 4 предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании. Такие указанные в изобретении композиции содержат более одной предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, которые предпочтительно кодируют различные пептиды или белки, содержащие предпочтительно различные патогенные антигены или их фрагменты, варианты или производные. Наиболее предпочтительным в этом контексте является то, что по меньшей мере одна последовательность мРНК кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из слитого белка F респираторно-синцитиального вируса (РСВ) и что по меньшей одна последовательность мРНК кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из другого антигена респираторно-синцитиального вируса (РСВ), прежде всего нуклеопротеина N или белка М2-1.

В этом контексте наиболее предпочтительными комбинациями антигенов являются:

- F+G (серотип А) + G (серотип В)

- F+G (серотип А) + G (серотип В) + М2-1

- F+G (серотип А) + G (серотип В) + N

- F+G (серотип А) + G (серотип В) + N + М2-1

- F + М2-1 + N

- F + М2-1

- F+N

- F+G (серотип А) + G (серотип В) + N + М2-1 + Р + М2-2 + М+L

- F+G (серотип А) + G (серотип В) + N + М2-1 + Р + М2-2 + М

- F+G (серотип А) + G (серотип В) + N + М2-1 + Р + М2-2 + L

- F+G (серотип А) + G (серотип В) + N + М2-1 + Р + М+L

- F+G (серотип А) + G (серотип В) + N + М2-1 + М2-2 + М+L

- F+G (серотип А) + G (серотип В) + N + Р + М2-2 + М+L

- F+G (серотип А) + G (серотип В) + М2-1 + Р + М2-2 + М+L.

Таким образом, следующим наиболее предпочтительным объектом настоящего изобретения является также фармацевтическая композиция, которая содержит по меньшей мере одну предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, указанную в настоящем описании, или предлагаемую в изобретении композицию, содержащую несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.

В качестве первого ингредиента предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одну предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, указанную в настоящем описании.

В качестве второго ингредиента предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может необязательно содержать по меньшей мере один дополнительный фармацевтически активный компонент. В этом контексте фармацевтически активный компонент представляет собой соединение, которое обладает терапевтическим действием с позиций лечения, облегчения или предупреждения конкретного показания или заболевания, указанного в настоящем описании, предпочтительно вызываемых РСВ инфекций. Указанные соединения включают (но, не ограничиваясь только ими) пептиды или белки, предпочтительно указанные в настоящем описании, нуклеиновые кислоты, предпочтительно указанные в настоящем описании, (терапевтически активные) низкомолекулярные органические или неорганические соединения (с молекулярной массой менее 5000, предпочтительно менее 1000), сахара, антигены или антитела, предпочтительно указанные в настоящем описании, терапевтические средства, уже известные из существующего уровня техники, антигенные клетки, антигенные клеточные фрагменты, клеточные фракции; компоненты клеточной оболочки (например, полисахариды), модифицированные, ослабленные или деактивированные (например, химически или путем облучения) патогены (вирус, бактерии и т.д.), адъюванты, предпочтительно указанные в настоящем описании, и т.д. Наиболее предпочтительными в этом контексте являются вакцины на основе РСВ или иммуноглобулинов против РСВ, например, паливизумаб (Synagis^®).

Предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить орально, парентерально, с помощью спрея для ингаляции, местно, ректально, назально, трансбуккально, вагинально или с помощью имплантируемого резервуара. Понятие «парентеральный» в контексте настоящего описания включает подкожную, внутривенную, внутримышечную, внутрисуставную, интрасиновиальную, надчревную, внутриоболочечную, внутрипеченочную, в пораженный участок, внутричерепную, трансдермальную, внутрикожную, внутрилегочную, внутрибрюшинную, внутрисердечную, внутриартериальную и подъязычную инъекцию или инфузию.

Наиболее предпочтительной является внутрикожная и внутримышечная инъекция. Стерильные инъецируемые формы предлагаемых в изобретении фармацевтических композиций могут представлять собой водную или масляную суспензию. Такие суспензии можно приготавливать с помощью методов, известных в данной области, с использованием пригодных диспергирующих или смачивающих агентов или суспендирующих агентов.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию вводят с помощью внутрикожной или внутримышечной инъекции, предпочтительно с использованием общепринятой техники на основе игольной инъекции или с использованием безыгольной системы, например, струйной инъекции. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить с помощью струйной инъекции, представленной в настоящем описании. Предпочтительно предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить внутримышечно с помощью струйной инъекции. Согласно другому варианту осуществления изобретения фармацевтическую композицию вводят внутрикожно с помощью струйной инъекции.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическую композицию можно вводить один, два или три раза, предпочтительно с помощью внутрикожной или внутримышечной инъекции, предпочтительно струйной инъекции. Согласно конкретному варианту осуществления изобретения одного введения предлагаемой в изобретении фармацевтический композиции, предпочтительно с использованием внутрикожной или внутримышечной инъекции, предпочтительно с помощью струйной инъекции, достаточно для вызывания иммунного ответа против по меньшей мере одного антигена, кодируемого последовательностью мРНК, предлагаемой в изобретении. В предпочтительном варианте осуществления изобретения одно введение фармацевтической композиции вызывает иммунный ответ, который приводит к нейтрализации вируса. В этом контексте наиболее предпочтительной является одна единичная внутрикожная или внутримышечная инъекция фармацевтической композиции. Предпочтительно необязательно можно осуществлять дополнительные введения фармацевтической композиции для повышения и/или пролонгирования иммунного ответа.

Согласно конкретному варианту осуществления изобретения предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может содержать адъювант. В этом контексте под адъювантом можно понимать любое соединение, которое может инициировать или повышать иммунный ответ врожденной иммунной системы, т.е. неспецифический иммунный ответ. Другими словами, предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция, когда ее вводят, предпочтительно вызывает врожденный иммунный ответ благодаря адъюванту, который необязательно содержится в ней. Предпочтительно указанный адъювант можно выбирать из адъювантов, известных специалисту в данной области и пригодных для рассматриваемого случая, т.е. для поддержания индукции врожденного иммунного ответа у млекопитающего, например, выбирать из адъювантного белка, описанного выше, или адъюванта, указанного ниже.

Наиболее предпочтительными в качестве адъювантов, пригодных для запасания и доставки являются катионные или поликатионные соединения, описанные выше в качестве наполнителя, агента для трансфекции или комплексообразования для предлагаемой в изобретении последовательности мРНК.

Кроме того, предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может содержать один или несколько дополнительных адъювантов, пригодных для инициации или усиления иммунного ответа врожденной иммунной системы, т.е. неспецифического иммунного ответа, прежде всего посредством связывания с патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (РАМР). Другими словами, при введении фармацевтическая композиция или вакцина предпочтительно вызывает врожденный иммунный ответ благодаря адъюванту, который необязательно содержится в ней. Предпочтительно указанный адъювант можно выбирать из адъювантов, известных специалисту в данной области и пригодных для рассматриваемого случая, т.е. для поддержания индукции врожденного иммунного ответа у млекопитающего, например, из адъювантного белка, описанного выше, или адъюванта, указанного ниже. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения указанный адъювант можно выбирать из указанного ниже адъюванта.

Кроме того, указанный адъювант можно выбирать из адъюванта, известного специалисту в данной области и пригодного для рассматриваемого случая, т.е. для поддержания индукции врожденного иммунного ответа у млекопитающего и/или пригодного для запасания и доставки компонентов предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины. Предпочтительными в качестве пригодных для запасания и доставки адъювантов, являются катионные или поликатионные соединения, указанные выше. Аналогично этому, адъювант можно выбирать из группы, состоящей, например, из катионных или поликатионных соединений, указанных выше, таких как хитозан, TDM, MDP, мурамилдипептид, плюроники, раствор квасцов, гидроксид алюминия, ADJUMER™ (полифосфазен); гель фосфата алюминия; глюканы, выделенные из водорослей; алгаммулин; гель гидроксида алюминия (квасцы); высокоадсорбирующий белки гель гидроксида алюминия; обладающий низкой вязкостью гель гидроксида алюминия; AF или SPT (эмульсия, содержащая сквалан (5%), Твин 80 (0.2%), плюроник L121 (1,25%), забуференный фосфатом физиологический раствор, pH 7,4); AVRIDINE™ (пропандиамин); BAY R1005™ ((N-(2-дезокси-2-L-леуциламиноб-D-глюкопиранозил)-N-октадециламида гидроацетат); CALCITRIOL™ (1-альфа,25-дигидрокси-витамин D3); гель фосфата кальция; САР™ (наночастицы фосфата кальция); холерный голотоксин, слитый белок холерный токсин-А1-белок-A-D-фрагмент, субъединица В холерного токсина; CRL 1005 (блок-сополимер Р1205); содержащие цитокин липосомы; DDA (диметилдиоктадециламмония бромид); DHEA (дегидроэпиандростерон); DMPC (димиристоилфосфатидилхолин); DMPG (димиристоилфосфатидилглицерин); комплекс DOC/квасцы (натриевая соль дезоксихолиновой кислоты); полный адъювант Фрейнда; неполный адъювант Фрейнда; инулин-гамма; адъювант Гербу (смесь, содержащая: I) N-ацетилглюкозаминил-(Р1-4)-N-ацетилмурамоил-L-аланил-D35 глутамин (GMDP), II) диметилдиоктадециламмония хлорид (DDA), III) комплекс цинк-соль L-пролина (ZnPro-8); GM-CSF); GMDP (N-ацетилглюкозаминил-(b1-4)-N-ацетилмурамил-L47 аланил-D-изоглутамин); имиквимод (1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин); ImmTher™ (N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-Ala-D-изоGlu-L-Ala-глицерина дипальмитат); DRV (иммунолипосомы, приготовленные из везикул, полученных методом гидратации-регидратации); интерферон-гамма; интерлейкин-1бета; интерлейкин-2; интерлейкин-7; интерлейкин-12; ISCOMSTM; ISCOPREP 7.0.3. ТМ; липосомы; LOXORIBINE™ (7-аллил-8-оксогуанозин); оральный адъювант LT 5 (лабильный энтеротоксин-протоксин из E. coli); микросферы и микрочастицы любого состава; MF59TM; (водная эмульсия сквалена); MONTANIDE ISA 51™ (очищенный неполный адъювант Фрейнда); MONTANIDE ISA 720™ (метаболизируемый масляный адъювант); MPL™ (3-Q-дезацил-4'-монофосфорил-липид А); липосомы МТР-РЕ и МТР-РЕ ((N-ацетил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-(гидроксифосфорилокси))этиламид, однонатриевая соль); MURAMETIDE™ (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3); MURAPALMITINE™ и DMURAPALMITINE™ (Nac-Mur-L-Thr-D-изoGIn-sn-глицериндипальмитоил); NAGO (нейраминидаза-галактозооксидаза); наносферы или наночастицы любого состава; NISV (везикулы из неионогенного поверхностно-активного вещества); PLEURAN™ (β-глюкан); PLGA, PGA и PLA (гомо- и сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты; микросферы/наносферы); ПЛЮРОНИК L121™; РММА (полиметилметакрилат); PODDS™ (протеноидные микросферы); полиэтиленкарбаматные производные; поли-rA : поли-rU (комплекс полиадениловая кислота-полиуридиновая кислота); полисорбат 80 (Твин 80); белковые кохлеаты (фирма Avanti Polar Lipids, Inc., Алабастер, шт. Алабама); STIMULON™ (QS-21); Quil-A (сапонин Quil-A); S-28463 (4-аминоотекдиметил-2-этоксиметил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-1-этанол); SAF-1™ («композиция адъювантов фирмы Syntex»); протеолипосомы вируса Сендаи и липидные матрицы, содержащие вирус Сендаи; Спан-85 (сорбитантриолеат); Specol (эмульсия Marcol 52, Спан 85 и Твин 85); сквален или Robane® (2,6,10,15,19,23-гексаметилтетракозан и 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексан); стеарилтирозин (октадецилтирозина гидрохлорид); Theramid® (N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-дипальмитоксипропиламид); Theronyl-MDP (Termurtide™ или [thr 1]-MDP; N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин); Ту-частицы (Ту-ВПЧ или вирусоподобные частицы); липосомы Уолтера-Рида (липосомы, содержащие липид А, адсорбированный на гидроксиде алюминия) и липопептиды, включая Pam3Cys, прежде всего соли алюминия, такие как адъю-фос (Adju-phos), алгидрогель, регидрагель и т.д., эмульсии, такие как CFA, SAF, IFA, MF59, провакс, TiterMax, монтанид, ваксфектин и т.д., сополимеры, такие как оптивакс (Optivax, CRL1005), L121, полоксамер 4010) и т.д., липосомы, такие как «липосомы-невидимки (Stealth)» и т.д., кохлеаты, такие как BIORAL, и т.д., адъюванты растительного происхождения, такие как QS21, Quil A, Iscomatrix, ISCOM; адъюванты, пригодные для костимуляции, включая томатин, биополимеры, такие как PLG, РММ, инулин и т.д., адъюванты микробного происхождения, такие как ромуртид, DETOX, MPL, CWS, манноза, нуклеотидные последовательности CpG, CpG7909, лиганды человеческого TLR 1-13, ISS-1018, 35 IC31, имидазохинолины, амплиген, Ribi529, IMOxine, IRIV, ВПЧ, холерный токсин, термолабильный токсин, Pam3Cys, флагеллин, GPI (гликозилфосфатидилинозитол)-якорь, LNFPIII/Lewis X, противомикробные пептиды, UC-1V150, слитый белок RSV, cdiGMP; и адъюванты, пригодные в качестве антагонистов, включая нейропептид CGRP.

Адъювант наиболее предпочтительно выбирают из адъювантов, которые поддерживают индукцию Th1-иммунного ответа или созревание наивных Т-клеток, таких как GM-CSF, IL-12, IFNg, любой иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, указанной выше, предпочтительно иммуностимулирующей РНК, ДНК CpG и т.д.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может содержать помимо образующей антиген мРНК также другие компоненты, которые выбирают из группы, включающей: другие антигены или другие образующие антиген нуклеиновые кислоты; другой иммунотерапевтический агент; одну или несколько вспомогательных субстанций; или любое другое соединение, в отношении которого известно, что оно обладает иммуностимулирующим действием благодаря его аффинности связывания (как лиганда) с человеческими Толл-подобными рецепторами; и/или адъювантную нуклеиновую кислоту, предпочтительно иммуностимулирующую РНК (isРНК).

Предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может дополнительно содержать одну или несколько вспомогательных субстанций, предназначенных для повышения при необходимости иммуногенности или иммуностимулирующей способности. Тем самым предпочтительно достигается синергетическое действие предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, представленной в настоящем описании, и вспомогательной субстанции, которая необязательно может содержаться в предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции. В зависимости от различных типов вспомогательных субстанций в этом контексте можно рассматривать различные механизмы. Например, соединения, ускоряющие созревание дендритных клеток (ДК), например липополисахариды, TNF-альфа или лиганд CD40, образуют первый класс пригодных вспомогательных веществ. В целом, в качестве вспомогательного вещества можно использовать любой агент, который оказывает влияние на иммунную систему, по механизму «сигнала опасности» (LPS, GP96, и т.п.), или можно использовать цитокины, такие как GM-CSF, которые позволяют целенаправленно усиливать иммунный ответ или целенаправленно влиять на него. Наиболее предпочтительными вспомогательными веществами являются цитокины, такие как монокины, лимфокины, интерлейкины или хемокины, которые дополнительно стимулируют врожденный иммунный ответ, такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, INF-альфа, IFN-бета, INF-гамма, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-бета или TNF-альфа, факторы роста, такие как hGH.

Другими добавками, которые можно включать в состав фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении, являются эмульгаторы, такие, например, как Tween^®; смачивающие вещества, такие, например, как лаурилсульфат натрия; красители; улучшающие вкус вещества; фармацевтические носители; наполнители для приготовления таблеток; стабилизаторы; антиоксиданты; консерванты.

Предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может содержать также любое дополнительное соединение, у которого известна способность оказывать иммуностимулирующее действие в результате его аффинности связывания (в качестве лиганда) с человеческими Толл-подобными рецепторами TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10 или в результате его аффинности связывания (в качестве лиганда) с мышиными Толл-подобными рецепторами TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 или TLR13.

В этом контексте наиболее предпочтительно, чтобы необязательно входящий в ее состав адъювантный компонент содержал такую же предлагаемую в изобретении мРНК, которая входит в предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию в качестве образующей антиген мРНК, например, мРНК, которая кодирует антигенный пептид или белок, который присутствует при заражении респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ), или его фрагменты, варианты или производные.

Кроме того, предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может дополнительно содержать компоненты, которые ускоряют введение и поглощение компонентов фармацевтической композиции. Указанные дополнительные компоненты могут представлять собой соответствующий носитель или наполнитель, дополнительные адъюванты, поддерживающие любой иммунный ответ, антибактериальные и/или противовирусные агенты.

Таким образом, в другом варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция содержит также фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.

Указанный фармацевтически приемлемый носитель, как правило, включает жидкую или нежидкую основу композиции, содержащую компоненты предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции. Если композиция находится в жидкой форме, то носитель, как правило, может представлять собой свободную от пирогенов воду; изотонический соляной раствор или забуференные (водные) растворы, например, растворы, забуференные фосфатом, цитратом и т.д. Предназначенный для инъекции буфер может быть гипертоническим, изотоническим или гипотоническим относительно конкретной референс-среды, т.е. содержание в буфере солей может быть выше, идентичным или ниже их содержания в конкретной референс-среде, при этом предпочтительно можно применять такие концентрации вышеуказанных солей, которые не приводят к повреждению клеток в результате осмоса или других связанных с концентрацией воздействий. Референс-среды могут представлять собой, например, жидкости, применяемые в методах «in vivo», такие как кровь, лимфа, цитозольные жидкости или другие жидкости организма, или, например, жидкости, которые можно использовать в качестве референс-сред в методах «in vitro», такие как обычные буферы или жидкости. Указанные обычные буферы или жидкости известны специалисту в данной области. Наиболее предпочтительной жидкой основой является лактированный раствор Рингера.

Однако в предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции можно использовать также один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей или разбавителей или капсулирующих соединений, которые можно применять для введения пациенту, подлежащему лечению. Понятие «совместимые» в контексте настоящего описания означает, что указанные компоненты предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции можно смешивать с компонентами предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции таким образом, чтобы не происходило взаимодействие, которое могло бы существенно снижать фармацевтическую эффективность фармацевтической композиции в обычных условиях применения.

Дополнительным компонентом предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции может быть иммунотерапевтический агент, который можно выбирать из иммуноглобулинов, предпочтительно IgG-типа, моноклональных или поликлональных антител, поликлональной сыворотки или сывороток и т.д., наиболее предпочтительно из иммуноглобулинов против респираторно-синцитиального вируса (РСВ), например, пализимумаба. Предпочтительно указанный дополнительный иммунотерапевтический агент может находиться в виде пептида/белка или может кодироваться нуклеиновой кислотой, предпочтительно ДНК или РНК, наиболее предпочтительно мРНК. Указанный иммунотерапевтический агент позволяет осуществлять пассивную вакцинацию в дополнение к активной вакцинации, которая запускается предлагаемой в изобретении образующей антиген мРНК.

Кроме того, согласно конкретному варианту осуществления изобретения помимо образующей антиген мРНК в предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно включать дополнительные антигены, и они, как правило, представляют собой такие субстанции как клетки, клеточные лизаты, вирусы, ослабленные вирусы, инактивированные вирусы, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты или другие био- или макромолекулы или их фрагменты. Предпочтительно антигены могут представлять собой белки и пептиды или их фрагменты, такие как эпитопы указанных белков или пептидов, предпочтительно содержащие от 5 до 15, более предпочтительно от 6 до 9 аминокислот. В частности, указанные белки, пептиды или эпитопы могут происходить из слитого белка F, гликопротеина G, гидрофобного белка SH, матриксного белка М, нуклеопротеина N, большой полимеразы L, белка М2-1, белка М2-2, фосфопротеина Р, неструктурного белка NS1 или неструктурного белка NS2 респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или из их фрагментов, вариантов или производных. Кроме того, антигены могут содержать также любую другую биомолекулу, например, липиды, углеводы и т.д. Предпочтительно антиген представляет собой белок или (поли-)пептидный антиген, нуклеиновую кислоту, нуклеиновую кислоту, которая кодирует белковый или (поли-)пептидный антиген, полисахаридный антиген, конъюгат полисахаридного антигена, липидный антиген, гликолипидный антиген, углеводный антиген, бактерию, клетку (вакцина) или убитый или ослабленный вирус.

Предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция или вакцина, указанная в настоящем описании, может содержать также другие добавки или дополнительные соединения. Другие добавки, которые можно включать в фармацевтическую композицию, представляют собой эмульгаторы, такие, например, как Iween^®; смачивающие вещества, такие, например, как лаурилсульфат натрия; красители; улучшающие вкус вещества; фармацевтические носители; наполнители для приготовления таблеток; стабилизаторы; антиоксиданты; консерванты; ингибиторы РНКазы и/или противобактериальный или антивирусный агент. Кроме того, предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может содержать малую интерферирующую РНК (siРНК), мишенью которой являются гены респираторно-синцитиального вируса (РСВ), например, siРНК, мишенью которой являются гены, которые кодируют слитый белок F, гликопротеин G, гидрофобный белок SH, матриксный белок М, нуклеопротеин N, большую полимеразу L, белок М2-1, белок М2-2, фосфопротеин Р, неструктурный белок NS1 или неструктурный белок NS2 респираторно-синцитиального вируса (РСВ). Предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция, как правило, содержит в «безопасном и эффективном количестве» компоненты предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции, прежде всего предлагаемую(ые) в изобретении последовательность(и) мРНК, указанной(ых) в настоящем описании. В контексте настоящего описания под «безопасным и эффективным количеством» подразумевается количество предлагаемой(ых) в изобретении последовательности(ей) мРНК, указанной(ых) в настоящем описании, которое является достаточным для значимой индукции положительной модификации или предупреждения заболевания или нарушения, указанного в настоящем описании. Однако в то же время «безопасное и эффективное количество» является достаточно небольшим, чтобы избегать серьезных побочных действий и обеспечивать разумное соотношение между преимуществом и риском. Определение этих пределов, как правило, находится в компетенции осуществляющего лечение врача.

Предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно применять для лечения человека, а также для целей медицинской ветеринарии, предпочтительно в медицине для лечения человека в общем случае в виде фармацевтической композиции или в виде вакцины.

Согласно другому наиболее предпочтительному объекту изобретения предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию (или предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, указанную в настоящем описании, или предлагаемую в изобретении композицию, содержащую несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании) можно получать или применять в качестве вакцины. Как правило, указанная вакцина представляет собой вакцину, указанную выше при описании фармацевтической композиции. Кроме того, указанная вакцина, как правило, содержит предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, указанную в настоящем описании, или предлагаемую в изобретении композицию, которая содержит несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, предлагаемых в настоящем описании.

Предлагаемая в изобретении вакцина может содержать также фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и/или наполнитель, указанные в настоящем описании для предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции. В конкретном варианте предлагаемой в изобретении вакцины выбор фармацевтически приемлемого носителя определяют в основном в зависимости от пути введения предлагаемой в изобретении вакцины. Предлагаемую в изобретении вакцину можно применять, например, системно или локально. Пути системного введения в целом включают, например, трансдермальный, оральный, парентеральный пути, включая подкожные, внутривенные, внутримышечные, внутриартериальные, внутрикожные и внутрибрюшинные инъекции и/или интраназальный путь введения. Пути локального применения в целом включают, например, местные пути нанесения, но также и внутрикожные, чрескожные, подкожные или внутримышечные инъекции или инъекции в область повреждения, внутричерепную, внутрилегочную, внутрисердечную и подъязычную инъекции. Более предпочтительно вакцины можно применять внутрикожным, подкожным или внутримышечным путем. Таким образом, предлагаемые в изобретении вакцины предпочтительно приготавливать в форме жидкости (или иногда в твердой форме).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемую в изобретении вакцину вводят посредством внутрикожной или внутримышечной инъекции, предпочтительно с использованием общепринятой техники на основе игольной инъекции или с использованием безыгольной системы, например, струйной инъекции. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить с помощью струйной инъекции, представленной в настоящем описании. Предпочтительно предлагаемую в изобретении вакцину вводят внутримышечно с помощью струйной инъекции. Согласно другому варианту осуществления изобретения вакцину вводят внутрикожно с помощью струйной инъекции.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения вакцину можно вводить один, два или три раза, предпочтительно с помощью внутрикожной или внутримышечной инъекции, предпочтительно струйной инъекции. Согласно конкретному варианту осуществления изобретения одного введения предлагаемой в изобретении вакцины, предпочтительно с использованием внутрикожной или внутримышечной инъекции, предпочтительно с использованием струйной инъекции, достаточно для вызывания иммунного ответа против по меньшей мере одного антигена, кодируемого последовательностью мРНК, предлагаемой в изобретении. В предпочтительном варианте осуществления изобретения одно введение вакцины вызывает иммунный ответ, который приводит к нейтрализации вируса. В этом контексте наиболее предпочтительной является одна единичная внутрикожная или внутримышечная инъекция вакцины. Предпочтительно необязательно можно осуществлять дополнительные введения вакцины для повышения и/или пролонгирования иммунного ответа.

Предлагаемая в изобретении вакцина может дополнительно содержать одну или несколько вспомогательных субстанций, предназначенных для повышения при необходимости иммуногенности или иммуностимулирующей способности. Наиболее предпочтительными в качестве вспомогательных субстанций или добавок являются адъюванты, описанные для фармацевтической композиции.

Следующим объектом изобретения является набор или набор компонентов, содержащий компоненты в виде предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины, и необязательно технические инструкции с информацией о введении и дозировании компонентов.

Помимо компонентов, представляющих собой предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, предлагаемую в изобретении композицию, содержащую несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину, набор может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель, адъювант и по меньшей мере один дополнительный компонент, указанный в настоящем описании, а также средства для введения и технические инструкции. Компоненты в виде предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины и, например, адъювант, могут находиться в лиофилизированной форме. В предпочтительном варианте осуществления изобретения перед применением набора для вакцинации к лиофилизированным компонентам добавляют указанный наполнитель в предварительно определенном количестве, которое прописано, например, в прилагаемых технических инструкциях. Путем осуществления указанной процедуры получают предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, предлагаемую в изобретении композицию, содержащую несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину, которые описаны в представленных выше объектах изобретения, которые после этого можно применять также в описанном выше способе.

В настоящем изобретении предложено также несколько вариантов применения предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, указанной в настоящем описании, предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины, которые все содержат предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, указанную в настоящем описании, или содержащих их наборов.

Следующим объектом изобретения является последовательность мРНК, кодирующая по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмент, вариант или производное, и композиция, фармацевтическая композиция, вакцина и набор, которые все содержат последовательность мРНК, предназначенные для применения в способе профилактического и/или терапевтического лечения инфекций, вызываемых РСВ. Следовательно, следующим объектом настоящего изобретения является первое медицинское применение предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины и предлагаемого в изобретении набора, которые указаны в настоящем описании, в качестве лекарственного средства. В частности, в изобретении предложено применение последовательности мРНК, кодирующей по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмент, вариант или производное, которые указаны выше, для приготовления лекарственного средства.

Другим объектом настоящего изобретения является второе медицинское применение последовательности мРНК, кодирующей по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмент, вариант или производное, которые указаны выше, необязательно в форме композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, фармацевтической композиции или вакцины, набора или набора компонентов, для лечения вызываемых РСВ инфекций, указанных в настоящем описании. В частности, последовательность мРНК, кодирующая по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмент, вариант или производное, подлежащая применению в способе, указанном выше, представляет собой последовательность мРНК, приготовленную в сочетании с фармацевтически приемлемым наполнителем и необязательно дополнительным адъювантом и необязательным дополнительным другим компонентом, которые указаны выше, например, дополнительным антигеном или иммуноглобулином против РСВ. В этом контексте наиболее предпочтительным является (профилактическое) лечение младенцев, пожилых людей и пациентов с ослабленным иммунитетом. И еще более предпочтительным является (профилактическое) лечение преждевременно родившихся младенцев и младенцев с хроническим легочным заболеванием.

Предлагаемую в изобретении последовательность мРНК в альтернативном варианте можно получать в такой форме, которая позволяет вводить ее для предупреждения или лечения вызываемых РСВ инфекций с использованием нескольких доз, где каждая доза содержит предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, кодирующую по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его фрагмент, вариант или производное, например, первая доза содержит по меньшей мере одну мРНК, кодирующую по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из слитого белка F (или его фрагменты, варианты или производные), а вторая доза содержит по меньшей мере одну последовательность мРНК, кодирующую по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из другого антигена респираторно-синцитиального вируса (РСВ), предпочтительно из нуклеопротеина N (или его фрагменты, варианты или производные), из белка М2-1 или гликопротеина G (или его фрагментов, вариантов или производных). Согласно этому варианту осуществления изобретения обе дозы вводят поочередно, т.е. последовательно, через короткий промежуток времени один за другим, например, в пределах менее 10 мин, предпочтительно менее 2 мин, и в одну и ту же область организма для достижения такого же иммунологического действия, которое достигается при однократном введении одной композиции, которая содержит обе мРНК, например, мРНК, которая кодирует слитый белок F, и мРНК, которая кодирует нуклеопротеин N.

Согласно конкретному варианту осуществления изобретения предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину можно вводить пациенту в виде единичной дозы. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину можно вводить пациенту в виде единичной дозы с последующим введением второй дозы и необязательно даже третьей, четвертой (или еще большего количества) последующих доз и т.д. Согласно этому варианту осуществления изобретения бустерные инокуляции предлагаемой в изобретении последовательности мРНК или предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины можно вводить пациенту через конкретные интервалы времени, предпочтительно указанные ниже, после второй (или третьей, четвертой и т.д.) инокуляции. В этом контексте особенно предпочтительным является, если несколько доз содержат такую же последовательность мРНК, которая кодирует такой же антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ), например, слитый белок F. В указанном варианте осуществления изобретения дозы вводят в течение определенного периода времени, например, составляющего 20-30 дней. Например, для постконтактной профилактики можно вводить в течение 20-30 дней по меньшей мере 5 доз предлагаемой в изобретении последовательности мРНК или предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят посредством внутрикожной или внутримышечной инъекции, предпочтительно с использованием общепринятой техники на основе игольной инъекции или с использованием безыгольной системы, например, струйной инъекции. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину можно вводить с помощью струйной инъекции, указанной в настоящем описании. Предпочтительно предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят внутримышечно с помощью струйной инъекции. Согласно другому варианту осуществления изобретения предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят внутрикожно с помощью струйной инъекции.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину можно вводить один, два или три раза, предпочтительно с помощью внутрикожной или внутримышечной инъекции, предпочтительно струйной инъекции. Согласно конкретному варианту осуществления изобретения одного введения предлагаемой в изобретении последовательности мРНК или предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины, предпочтительно с использованием внутрикожной или внутримышечной инъекции, предпочтительно с использованием струйной инъекции, достаточно для вызывания иммунного ответа против по меньшей мере одного антигена, кодируемого последовательностью мРНК, предлагаемой в изобретении. В предпочтительном варианте осуществления изобретения одно введение предлагаемой в изобретении последовательности мРНК или предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины вызывает иммунный ответ, который приводит к нейтрализации вируса. В этом контексте наиболее предпочтительной является одна единичная внутрикожная или внутримышечная инъекция предлагаемой в изобретении последовательности мРНК или предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины. Предпочтительно необязательно можно осуществлять дополнительные введения предлагаемой в изобретении последовательности мРНК или предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины для повышения и/или пролонгирования иммунного ответа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в указанных бустерных инокуляциях предлагаемой в изобретении последовательности мРНК или предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины можно применять дополнительное соединение или компонент, описанный для предлагаемой в изобретении последовательности мРНК или предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины, которые указаны в настоящем описании.

Следующим объектом настоящего изобретения является также способ экспрессии кодируемого антигенного пептида или белка, происходящего из слитого белка F, гликопротеина G, гидрофобного белка SH, матриксного белка М, нуклеопротеина N, большой субъединицы полимеразы L, белка М2-1, белка М2-2, фосфопротеина Р, неструктурного белка NS1 или неструктурного белка NS2 респираторно-синцитиального вируса (РСВ), заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых а) получают предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, указанную в настоящем описании, или предлагаемую в изобретении композицию, содержащую несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, б) интродуцируют или вносят предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, указанную в настоящем описании, или предлагаемую в изобретении композицию, содержащую несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, в экспрессионную систему, например, бесклеточную экспрессионную систему, клетку (например, обеспечивающую экспрессию клетку-хозяина или соматическую клетку), ткань или организм. Способ можно применять для лабораторных опытов, в исследовательских целях, для диагностики, для коммерческого получения пептидов или белков и/или для терапевтических целей. В этом контексте, как правило, после получения предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, указанной в настоящем описании, или предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, их, как правило, интродуцируют или вносят в бесклеточную экспрессионную систему, клетку (например, обеспечивающую экспрессию клетку-хозяина или соматическую клетку), ткань или организм, например, в оголенной или входящей в комплекс форме или в виде фармацевтической композиции или вакцины, указанной в настоящем описании, предпочтительно путем трансфекции или с использованием любого из путей введения, указанных в настоящем описании. Способ можно осуществлять in vitro, in vivo или ex vivo. Способ можно осуществлять также в контексте лечения конкретного заболевания, прежде всего лечения инфекционных болезней, предпочтительно вызываемых РСВ инфекций, указанных в настоящем описании.

В этой связи в контексте настоящего описания к методу in vitro относится трансфекция или трансдукция предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, указанной в настоящем описании, или предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, в клетки в культуре вне организма; в контексте настоящего описания к методу in vivo относится трансфекция или трансдукция предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, указанной в настоящем описании, или предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, в клетки путем введения предлагаемой в изобретении последовательности мРНК или предлагаемой в изобретении композиции, в целый организм или в индивидуума, и в контексте настоящего описания к методу ex vivo относится трансфекция или трансдукция предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, или предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, в клетки, находящиеся вне организма или индивидуума, и последующее введение трансфектированных клеток в организм или в индивидуума.

Аналогично этому, другим объектом настоящего изобретения является также применение предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, указанной в настоящем описании, или предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, предпочтительно для диагностических или терапевтических целей, для экспрессии кодируемого антигенного пептида или белка, например, путем интродукции или внесения в бесклеточную экспрессионную систему, клетку (например, обеспечивающую экспрессию клетку-хозяина или соматическую клетку), ткань или организм. Применение может включать лабораторные опыты, исследовательские цели, диагностику, коммерческое получение пептидов или белков и/или терапевтическое применение. В этом контексте, как правило, после получения предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, указанной в настоящем описании, или предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, их, как правило, интродуцируют или вносят в бесклеточную экспрессионную систему, клетку (например, обеспечивающую экспрессию клетку-хозяина или соматическую клетку), ткань или организм, например, в оголенной или входящей в комплекс форме или в виде фармацевтической композиции или вакцины, указанной в настоящем описании, предпочтительно путем трансфекции или с использованием любого из путей введения, указанных в настоящем описании. Применение можно осуществлять in vitro, in vivo или ex vivo. Применение можно осуществлять также в контексте лечения конкретного заболевания, прежде всего для лечения инфекций, вызываемых РСВ.

Другим объектом изобретения является способ лечения или профилактики вызываемых РСВ инфекций, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых:

а) получают предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, композицию, содержащую несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, фармацевтическую композицию или набор, или набор компонентов, содержащий предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, указанную выше;

б) вносят или интродуцируют последовательность мРНК, композицию, фармацевтическую композицию или набор, или набор компонентов в ткань или организм;

в) необязательно вводят иммуноглобулин против РСВ.

В целом, некоторыми объектами изобретения является последовательность мРНК, содержащая кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ). Предлагаемая в изобретении последовательность мРНК предназначена для применения в способе профилактического и/или терапевтического лечения инфекций, вызываемых респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ). Таким образом, изобретение относится к последовательности мРНК, указанной в настоящем описании, предназначенной для применения в способе профилактического и/или терапевтического лечения вызываемых РСВ инфекций.

В настоящем изобретении, если не указано иное, то, если это возможно, различные особенности альтернатив и вариантов осуществления изобретения можно объединять друг с другом. Кроме того, понятие «содержащий» не должно ограничиваться значением «состоящий из», если специально не указано иное. Однако в контексте настоящего изобретения понятие «состоящий из» является вариантом, который в данном изобретении рассматривается как подпадающий под понятие «содержащий», когда в контексте настоящего описания используется понятие «содержащий».

Все публикации, патенты и заявки на патент, процитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылки, как если бы каждая индивидуальная публикация или заявка на патент была специально и индивидуально включена в качестве ссылки. Хотя вышеуказанное изобретение было достаточно подробно описано для целей более ясного понимания с помощью иллюстраций и примера, обычным специалистам в данной области должно быть очевидно в свете доктрины настоящего изобретения, что могут быть сделаны определенные изменения и модификации без отклонения от сущности или объема, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.

Краткое описание чертежей

Приведенные ниже чертежи представлены исключительно в качестве иллюстрации и служат для дополнительного описания настоящего изобретения. Указанные чертежи не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

На чертежах показано:

на фиг. 1 - последовательность мРНК R1691 с оптимизированным содержанием G/C, кодирующая PCB-F-белок «длинного» штамма РСВ (PCB-F «длинный»), которая включена в мРНК-вакцину на основе «длинного» PCB-F (SEQ ID NO: 31);

на фиг. 2 - последовательность мРНК R2510 с оптимизированным содержанием G/C, кодирующая PCB-F-белок «длинного» штамма РСВ (PCB-F «длинный»), которая включена в мРНК-вакцину на основе «длинного» PCB-F (SEQ ID NO: 32);

на фиг. 3 - последовательность мРНК R2821 с оптимизированным содержанием G/C, кодирующая мутантный белок PCB-F del554-574 «длинного» штамма РСВ (PCB-F «длинный») (SEQ ID NO: 33);

на фиг. 4 - последовательность мРНК R2831 с оптимизированным содержанием G/C, кодирующая PCB-N-белок «длинного» штамма РСВ (PCB-F «длинный») (SEQ ID NO: 34);

на фиг. 5 - последовательность мРНК R2833 с оптимизированным содержанием G/C, кодирующая РСВ-М_2-1-белок «длинного» штамма РСВ (PCB-F «длинный») (SEQ ID NO: 35);

на фиг. 6 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцина на основе «длинного» PCB-F индуцировала титры антител против PCB-F-белка, сопоставимые с титрами антитела против инактивированного РСВ.

Самкам мышей линии BALB/c инъецировали внутрикожно (i.d.) мРНК-вакцину на основе штамма PCB-F «длинный» (160 мкг R1691) или лактат Рингена (RiLa-буфер) в качестве применяемого для контроля буфера. Одной группе инъецировали внутримышечно (i.m.) по 10 мкг вакцины на основе инактивированного «длинного» штамма РСВ. У всех животных, которые получали бустерные инъекции в дни 21 и 35, собирали образцы крови в день 49 для определения титров антител в объединенной сыворотке согласно методу, описанному в примере 2. Обнаружено, что мРНК-вакцина на основе «длинного» PCB-F индуцировала образование антител против белка F подклассов IgG1 и IgG2a. На графике приведены титры антител (n=5 мышей/группу);

на фиг. 7 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцина на основе «длинного» PCB-F (R1691) индуцировала долговременный иммунный ответ у мышей.

Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 3, и общие титры антитела в виде IgG определяли с помощью ELISA.

Обнаружено, что титры антител оказались стабильными в течение 11 месяцев после последней бустерной вакцинации;

на фиг. 8 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцина на основе «длинного» PCB-F (R1691) индуцировала специфические в отношении слитого (F)-белка РСВ многофункциональные CD8⁺-Т-клетки у мышей.

Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 4, и Т-клетки анализировали в отношении антигенспецифической индукции цитокинов по окрашиванию внутриклеточных цитокинов. Клетки стимулировали PCB-F-пептидом (stim. F; KYKNAVTEL) или контрольным НА-пептидом вируса гриппа (stim. НА; IYSTVASSL). Линия на графике соответствует медианному значению (n=5 мышей/группу).

Обнаружено, что мРНК-вакцина на основе «длинного» PCB-F индуцировала специфические для слитого (F) белка РСВ многофункциональные CD8⁺-Т-клетки в отличие от вакцины на основе инактивированного РСВ, которая не обладала способностью индуцировать специфические в отношении F-белка CD8⁺-Т-клетки;

на фиг. 9 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцина на основе PCB-N (R2831) индуцировала специфические в отношении нуклеопротеина (N) многофункциональные CD8⁺-Т-клетки у мышей.

Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 5, и Т-клетки анализировали в отношении антигенспецифической индукции цитокинов по окрашиванию внутриклеточных цитокинов после стимуляции ProMix PCB-N (15-мерные пептиды). Линия на графике соответствует медианному значению (n=5 мышей/группу).

Обнаружено, что мРНК-вакцина на основе PCB-N индуцировала специфические в отношении нуклеопротеина (N) РСВ многофункциональные CD8⁺-Т-клетки в отличие от вакцины на основе инактивированного РСВ, которая не обладала способностью индуцировать специфические в отношении N-белка CD8⁺-Т-клетки;

на фиг. 10 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцина на основе РСВ-N (R2831) индуцировала специфические в отношении нуклеопротеина (N) многофункциональные CD4⁺-Т-клетки у мышей.

Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 5, и Т-клетки анализировали в отношении антигенспецифической индукции цитокинов по окрашиванию внутриклеточных цитокинов после стимуляции ProMix PCB-N (15-мерные пептиды). Линия на графике соответствует медианному значению (n=5 мышей/группу).

Обнаружено, что мРНК-вакцина на основе PCB-N индуцировала специфические в отношении нуклеопротеина (N) РСВ многофункциональные CD4⁺-Т-клетки в отличие от вакцины на основе инактивированного РСВ, которая не обладала способностью индуцировать специфические в отношении N-белка CD4⁺-Т-клетки;

на фиг. 11 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцина на основе РСВ-М_2-1 (R2833) индуцировала специфические в отношении М_2-1 многофункциональные CD8⁺-Т-клетки у мышей.

Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 5, и Т-клетки анализировали в отношении антигенспецифической индукции цитокинов по окрашиванию внутриклеточных цитокинов после стимуляции М_2-1-специфическим 9-мерным белком. Линия на графике соответствует медианному значению (n=5 мышей/группу).

Обнаружено, что мРНК-вакцина на основе PCB-M_2-1 индуцировала специфические в отношении РСВ-М_2-1 многофункциональные CD8⁺-Т-клетки в отличие от вакцины на основе инактивированного РСВ, которая не обладала способностью индуцировать специфические в отношении M_2-1-белка CD8⁺-T-клетки;

на фиг. 12 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцины на основе РСВ-F либо индивидуально (PCB-F=R2510; мутант PCB-Fdel554-574=R2821), либо в сочетании с мРНК, которые кодируют другие белки РСВ (PCB-N=R2831; РСВ-М_2-1=R2833), индуцировали гуморальные иммунные ответы у хлопковых крыс.

Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 6, и общие титры специфических в отношении PCB-F антител в виде IgG определяли с помощью ELISA в день 49. Сыворотку анализировали в различных разведениях, которые представлены в нижней части графика;

на фиг. 13 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцины на основе РСВ-F либо индивидуально (PCB-F=R2510; мутант PCB-Fdel554-574=R2821), либо в сочетании с мРНК, которые кодируют другие белки РСВ (PCB-N=R2831; РСВ-М_2-1=R2833), индуцировали образование функциональных антител у хлопковых крыс, что продемонстрировано на основе титров вирус-нейтрализующих антител (VNT).

Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 6, и титры вирус-нейтрализующих антител в день 49 определяли с помощью с помощью анализа уменьшения бляшек;

на фиг. 14 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцины на основе РСВ-F либо индивидуально (PCB-F=R2510; мутант PCB-Fdel554-574=R2821), либо в сочетании с мРНК, которые кодируют другие белки РСВ (PCB-N=R2831; РСВ-М_2-1=R2833), снижали титры в легких и носу хлопковых крыс, подвергнутых контрольному заражению РСВ-вирусом.

Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 6.

(А) Титры в легких в день 5 после контрольного заражения РСВ. У всех групп животных, которых вакцинировали мРНК-вакцинами, обнаружены титры вируса ниже предела обнаружения при осуществлении титрации вируса, что демонстрирует наличие защиты вакцинированных хлопковых крыс при оценке на основе титров вируса в легких. В отличие от мРНК-вакцин вакцина на основе инактивированного формалином вируса не обладала способностью предупреждать появление титров вируса в легких.

(Б) Титры в носу в день 5 после контрольного заражения РСВ. Титр вируса в ткани носа также сильно снижался в группах, вакцинированных мРНК. В отличие от мРНК-вакцин вакцина на основе инактивированного формалином вируса не обладала способностью снижать титры вируса в носу;

на фиг. 15 - представлены результаты гистопатологического анализа легких подвергнутых контрольному заражению РСВ хлопковых крыс, которых применяли в опыте, описанном в примере 6;

на фиг. 16 - представлены результаты количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) количества копий вирусного генома (по измерению количества копий NS-1-гена РСВ) или экспрессированных цитокинов из ткани легких зараженных РСВ животных (или контрольных животных) у подвергнутых контрольному заражения РСВ хлопковых крыс, которых применяли в опыте, описанном в примере 6;

на фиг. 17 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцины на основе РСВ-F (PCB-F=R2510; RSV F* (мутант PCB-Fdel554-574)=R2821) снижали титры в легких у хлопковых крыс, подвергнутых контрольному заражению РСВ-вирусом хлопковых крыс.

Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 7.

(А) Титры в легких в день 5 после контрольного заражения РСВ. У всех групп животных, которых вакцинировали внутрикожно мРНК-вакцинами, обнаружено пониженные титры вируса по сравнению с обработанной буфером контрольной группой, что демонстрирует наличие защиты вакцинированных хлопковых крыс при оценке на основе титров вируса в легких. Уже одна единичная доза мРНК-вакцин на основе PCB-F эффективно снижала титры вируса в легких.

(Б) Титры в легких в день 5 после контрольного заражения РСВ. Титр вируса в легких также сильно снижались в группах, которых вакцинировали мРНК путем внутримышечной инъекции.

Примеры

Приведенные ниже примеры представлены исключительно в качестве иллюстрации и служат для дополнительного описания настоящего изобретения. Указанные примеры не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Пример 1: Получение мРНК-вакцины

1. Получение конструкций ДНК и мРНК

Для рассматриваемых примеров получали последовательности ДНК, кодирующие белок PCB-F (R1691 и R2510), мутантный белок PCB-F del554-574 (R2821), белок РСВ N (R2831) и белок РСВ М2-1 (R2833) «длинного» штамма РСВ, и применяли для последующих реакций транскрипции in vitro. Мутантный белок PCB-Fdel554-574 описан ранее (Oomens и др., J. Virol. 80(21), 2006, сс. 10465-10477).

Согласно первой процедуре получения создавали последовательности ДНК, кодирующие указанные выше мРНК. Конструкцию R1691 получали путем модификации кодирующей последовательности дикого типа посредством интродукции последовательности с оптимизированным для стабилизации содержанием GC, за которой следовала стабилизирующая последовательность, происходящая из альфа-глобин-3'UTR (muag (мутантная альфа-глобин-3'UTR) представленная в SEQ ID NO: 29), сегмент, состоящий из 64 аденозинов (поли-А-последовательность), сегмент, состоящий из 30 цитозинов (поли-С-последовательность) и гистоновая структура стебель-петля, представленная в SEQ ID NO: 30. В SEQ ID NO: 31 (см. фиг.1) представлена последовательность соответствующей мРНК. Конструкции R2510, R2821, R2831 и R2833 получали путем интродукции 5'-TOP-UTR, происходящей из рибосомального белка 32L, который имеет SEQ ID NO 23, модификации кодирующей последовательности дикого типа посредством интродукции последовательности с оптимизированным для стабилизации содержанием GC, за которой следовала стабилизирующая последовательность, происходящая из альбумин-3'UTR (альбумин7, согласно SEQ ID NO: 25), сегмент, состоящий из 64 аденозинов (поли-А-последовательность), сегмент, состоящий из 30 цитозинов (поли-С-последовательность) и гистоновая структура стебель-петля, представленная в SEQ ID NO: 30. В SEQ ID NO: 32-35 (см. фиг. 2-5) представлены последовательности соответствующих мРНК.

2. Транскрипция in vitro

Соответствующие ДНК-плазмиды, полученные согласно процедуре, описанной в разделе 1, транскрибировали in vitro с помощью полимеразы Т7 в присутствии аналога кэпа (m⁷ GpppG). Затем мРНК очищали с помощью PureMessenger^® (фирма CureVac, Тюбинген, Германия: WO 2008/077592 А1).

3. Реагенты

Комплексообразующий реагент: протамин

4. Получение вакцины

мРНК включали в комплекс с протамином путем добавления протамина к мРНК в соотношении 1:2 (мас./мас.) (адъювантный компонент). После инкубации в течение 10 мин добавляли в таком же количестве свободную мРНК R1710, используемую в качестве образующей антиген РНК.

Например, получали вакцину на основе «РСВ-F «длинного» (R1691), содержащую адъювантный компонент, состоящий из мРНК, которая кодирует F-белок «длинного» штамма РСВ (R1691), представленный в SEQ ID NO: 31, в комплексе с протамином в соотношении 2:1 (мас./мас.), и свободную образующую антиген мРНК, которая кодирует F-белок «длинного» штамма РСВ (R1691), представленный в SEQ ID NO: 31 (соотношение 1:1; входящая в комплекс РНК : свободная РНК).

Пример 2: Индукция гуморального иммунного ответа у мышей мРНК-вакциной на основе РСВ-F «длинного»

Иммунизация

В день ноль мышам линии BALB/c инъецировали внутрикожно (i.d.) мРНК-вакцину на основе РСВ-F «длинного» (R1691 согласно примеру 1; 25 мкг/мышь/в день вакцинации) или лактат Рингера (RiLa) в качестве применяемого для контроля буфера, как указано в таблице 2. Контрольной группе инъецировали внутримышечно (i.m.) 10 мкг вакцины на основе инактивированного штамма РСВ «длинный». Инактивированный «Respiratory Syncytial Virus Antigen» (антиген респираторно-синцитиального вируса) (инактивированный РСВ «длинный») покупали у фирмы INSTITUT VIRION/SERION GmbH-SERION IMMUNDIAGNOSTICA GmbH. Инактивированный вирус разводили в стерильном ЗФР с получением конечной концентрации 0,2 мкг/мкл. Всем животным осуществляли бустерные инъекции в день 14 и день 28. Образцы крови собирали в день 42 для определения титров антител к PCB-F.

Определение антител к белку РСВ-F с помощью ELISA

Планшеты для ELISA сенсибилизировали рекомбинантным человеческим слитым гликопротеином РСВ (rec.hu F-белок, конечная концентрация: 5 мкг/мл) (фирма Sino Biological Inc.). Сенсибилизированные планшеты инкубировали, используя указанные разведения сыворотки, и определяли связывание специфических антител к F-белку с ABTS-субстратом, используя биотинилированные изотипспецифические антимышиные антитела в комбинации со стрептавидином-HRP (пероксидаза из хрена).

Результаты

Как продемонстрировано на фиг. 6, мРНК-вакцина на основе PCB-F «длинного» индуцировала титры антител (в целом, IgG, IgG1 и IgG2a) против F-белка РСВ, сопоставимые с титрами против инактивированного РСВ.

Пример 3: Индукция долговременного иммунного ответа у мышей мРНК-вакциной на основе РСВ-F «длинного»

Иммунизация

Мышам линии BALB/c инъецировали внутрикожно (i.d.) мРНК-вакцину на основе РСВ-F «длинного» (R1691) или лактат Рингера (RiLa) в качестве применяемого для контроля буфера согласно схеме вакцинации, представленной в таблице 3.

Образцы крови собирали через 2 недели, 4 месяца и 11 месяцев после последней иммунизации.

Результаты

Как продемонстрировано на фиг. 7, мРНК-вакцина на основе PCB-F «длинного» индуцировала долговременный иммунный ответ, о чем свидетельствовали стабильные титры антител в течение по меньшей мере 11 месяцев после последней бустер-вакцинации.

Пример 4: Индукция клеточного иммунного ответа у мышей мРНК-вакциной на основе РСВ-F «длинного»

Иммунизация

В день ноль мышам линии BALB/c инъецировали внутрикожно (i.d.) мРНК-вакцину на основе РСВ-F «длинного» R1691 (20 мкг/мышь/в день вакцинации) или лактат Рингера (RiLa) в качестве применяемого для контроля буфера, как указано в таблице 4. Контрольной группе инъецировали внутримышечно (i.m.) 10 мкг вакцины на основе инактивированного штамма РСВ «длинный». Инактивированный «Respiratory Syncytial Virus Antigen» (инактивированный РСВ «длинный») покупали у фирмы INSTITUT VIRION/SERION GmbH-SERION IMMUNDIAGNOSTICA GmbH. Инактивированный вирус разводили в стерильном ЗФР с получением конечной концентрации 0,2 мкг/мкл.

Всем животным осуществляли бустерные инъекции в день 14 и день 28. В день 34 изымали селезенки для анализа антигенспецифических Т-клеток.

Окрашивание внутриклеточных цитокинов

Спленоциты из вакцинированных и контрольных мышей выделяли согласно стандартному протоколу. В целом, метод состоял в следующем: выделенные селезенки измельчали, пропуская через клеточное сито, и промывали ЗФР/1% FBS с последующим лизисом эритроцитов. После стадии интенсивной промывки ЗФР/1% FBS спленоциты высевали в 96-луночные планшеты (2×10⁶ клеток/лунку). На следующий день клетки стимулировали PCB-F-пептидом (KYKNAVTEL; 5 мкл; Н-2 кДа-ограниченный Т-клеточный эпитоп) или неродственным контрольным пептидом, полученным из НА-белка вируса гриппа (IYSTVASSL; 5 мкг/мл; покупали у фирмы EMC Microcollections) и антителом к CD28 (фирма BD Biosciences) в концентрации 2,5 мкг/мл в течение 6 ч при 37°С в присутствии смеси GolgiPlug™/GolgiStop™ (ингибиторы транспорта белков, содержащие брефелдин А и монензин соответственно; фирма BD Biosciences). После стимуляции клетки промывали и окрашивали для выявления внутриклеточных цитокинов, используя реагент Cytofix/Cytoperm (фирма BD Biosciences) согласно инструкциям производителя. Для окрашивания применяли следующие антитела: CD8-PECy7 (1:200), CD3-ФИТС (1:200), IL2-PerCP-Cy5.5 (1:100), TNFα-PE (1:100), IFNγ-APC (1:100) (фирма eBioscience), CD4-BD Horizon V450 (1:200) (фирма BD Biosciences) и инкубировали с Fcγ-блокатором, разведенным в соотношении 1:100. Водный краситель (Aqua Dye) применяли для того, чтобы отличать живые клетки от мертвых (фирма Invitrogen). Клетки собирали с помощью проточного цитометра Canto II (фирма Beckton Dickinson). Результаты, полученные с помощью проточного цитометра, анализировали с использованием программы FlowJo (фирма Tree Star, Inc.). Статистический анализ осуществляли с использованием программы GraphPad Prism, версия 5.01. Статистические различия между группами оценивали с помощью критерия Манна-Уитни.

Результаты

Как продемонстрировано на фиг. 8, мРНК-вакцина на основе PCB-F «длинного» (R1691) индуцировала IFNγ-позитивные, TNFα-позитивные и дважды IFNγ/TNFα-позитивные многофункциональные CD8⁺-Т-клетки, направленные против F-белка РСВ. При создании изобретения неожиданно было установлено, что вакцина на основе инактивированного РСВ не обладала способностью индуцировать антигенспецифические CD8⁺-Т-клетки.

Пример 5: Индукция клеточных иммунных ответом у мышей мРНК-вакцинами на основе PCB-N и PCB-M_2-1

Иммунизация

В день ноль мышам линии BALB/c инъецировали внутрикожно (i.d.) в различных дозах мРНК-вакцину на основе PCB-N R2831, мРНК-вакцину на основе РСВ-М_2-1 R2833 или лактат Рингера (RiLa) в качестве применяемого для контроля буфера, как указано в таблице 5. Контрольной группе инъецировали внутримышечно (i.m.) 10 мкг вакцины на основе инактивированного штамма РСВ «длинный». Инактивированный «Respiratory Syncytial Virus Antigen» (инактивированный РСВ «длинный») покупали у фирмы INSTITUT VIRION/SERION GmbH-SERION IMMUNDIAGNOSTICA GmbH. Инактивированный вирус разводили в стерильном ЗФР с получением конечной концентрации 0,2 мкг/мкл.

Все животные получали бустерные инъекции в дни 7 и 21. В день 27 изымали селезенки для анализа антигенспецифических Т-клеток

Окрашивание внутриклеточных цитокинов осуществляли согласно методу, описанному в примере 4, за исключением того, что клетки обрабатывали следующими стимуляторами:

М_2-1-пептид (5 мкг/мл), группы 4-8; (SYIGSINNI фирмы ProImmune); ProMix N (1 мкг/мл) 1-3, группа 7 и группа 8; (РХ39 фирма Proimmune); контроль: среда + ДМСО + антитело к CD28, группы 1-8, описанные выше.

Результаты

Как продемонстрировано на фиг. 9, мРНК-вакцина на основе PCB-N (R2831) индуцировала IFNγ-позитивные, TNFα-позитивные и дважды IFNγ/TNFα-позитивные многофункциональные CD8⁺-Т-клетки, направленные против N-белка РСВ у мышей.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что вакцина на основе инактивированного РСВ не обладала способностью индуцировать антигенспецифические CD8⁺-Т-клетки.

Как продемонстрировано на фиг. 10, мРНК-вакцина на основе PCB-N (R2831) индуцировала IFNγ-позитивные, TNFα-позитивные и дважды IFNγ/TNFα-позитивные многофункциональные CD4⁺-Т-клетки, направленные против N-белка РСВ у мышей.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что вакцина на основе инактивированного РСВ не обладала способностью индуцировать антигенспецифические CD4⁺-Т-клетки.

Как продемонстрировано на фиг. 11, мРНК-вакцина на основе РСВ-М_2-1 (R2833) индуцировала IFNγ-позитивные, TNFα-позитивные и дважды IFNγ/TNFα-позитивные многофункциональные CD8⁺-Т-клетки, направленные против белка М_2-1 РСВ у мышей.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что вакцина на основе инактивированного РСВ не обладала способностью индуцировать антигенспецифические СВ8⁺-Т-клетки.

Пример 6: Опыт I по контрольному заражению хлопковых крыс РСВ

Для разработки вакцин против РСВ хлопковые крысы являются приемлемой животной моделью, прежде всего для контрольного заражения. Хлопковые крысы отвечают на препараты вакцин на основе инактивированного формалином РСВ повышением легочной патологией. Это позволяет оценивать безопасность вакцинации на основе феномена обострения заболевания.

Для расширения и оптимизации РСВ-специфического иммунного ответа получали мРНК-вакцины, кодирующие различные белки РСВ (белки РСВ F, мутант PCB-Fdel554-574, N и М_2-1), согласно методу, описанному в примере 1. Для оценки воздействия единичных или комбинированных вакцин эти вакцины вводили либо индивидуально, либо в комбинации (смешенная вакцина), как указано в таблице 6. Вакцины в объемах 2×50 мкл инъецировали внутрикожно (i.d.) в кожу спины хлопковых крыс. Дополнительные группы иммунизировали внутримышечно (i.m.) инактивированным β-пропиолактоном РСВ (фирма INSTITUT VIRION/SERION GmbH-SERION IMMUNDIAGNOSTICA GmbH), инактивированным формалином РСВ (FI-PCB) (фирма Sigmovir) или живым РСВ/А2 (фирма Sigmovir) (10⁵ бляшкообразующих единиц, БОЕ) для сравнения их иммуногенности с мРНК-вакцинами. Другую группу обрабатывали с помощью i.m.-инъекций моноклональными антителом к РСВ SYNAGIS® (паливизумаб) в качестве пассивной иммунизации. SYNAGIS® вводили в дозе 15 мг/кг за один день до контрольного заражения РСВ. Для этого животных взвешивали и рассчитывали соответствующее количество SYNAGIS® в зависимости от веса животного. Максимальный объем для i.m.-инъекции составлял 200 мкл на 100 г веса крысы. После иммунизации хлопковых крыс подвергали контрольному заражению путем интраназального (i.n.) введения вируса РСВ/А2 (10⁵ БОЕ в 100 мкл; фирма Sigmovir).

Для оценки иммунных ответов осуществляли следующие анализы: ELISA для оценки IgG против F-белка РСВ в сыворотке, определение титров нейтрализующих вирус РСВ антител (VNT), титрование вируса РСВ и гистопатологический анализ легких.

ELISA для оценки IgG против F-белка РСВ в сыворотке

Индукцию антител к белку F РСВ определяли с помощью ELISA согласно методу, описанному в примере 2.

Титры нейтрализующих вирус РСВ антител (VNT)

Сыворотки анализировали с помощью теста нейтрализации вируса (VNT). В целом, метод состоял в следующем: образцы сыворотки разводили в соотношении 1:10 инактивированной тепловой обработкой средой ЕМЕМ и дополнительно серийно разводили в соотношении 1:4. Разведенные образцы сыворотки инкубировали с РСВ (25-50 БОЕ) в течение 1 ч при комнатной температуре и инокулировали с дублированием монослои конфлюэнтных НЕр-2-клеток в 24-луночных планшетах. После 1 ч инкубации при 37°С в инкубаторе в атмосфере с 5% CO₂ на лунки наслаивали среду, содержащую 0,75% метилцеллюлозы. После инкубации в течение 4 дней дополнительный слой удаляли и клетки фиксировали с использования окрашивания с помощью 0,1% кристаллического фиолетового в течение 1 ч и затем отмывали и сушили на воздухе. Соответствующие величины, обратные титрам нейтрализующих антител, определяли в конечной точке, соответствующей 60%-ному снижению количества вирусов.

Титрования вируса РСВ и гистопатология легких

В день 54 получали образцы ткани из носа и гомогенизировали для осуществления титрования вируса. Легкие изымали целиком и разделяли на три секции для титрования вируса (левая секция), гистопатологического обследования (правая секция), и ПЦР-анализа (лингвальная доля). Кроме того, определяли количество геномных копий вируса РСВ (путем измерения количества копий гена NS-1 РСВ) и уровни мРНК цитокинов с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (кОТ-ПЦР).

Результаты

Как продемонстрировано на фиг. 12, мРНК-вакцины на основе РСВ-F либо индивидуально (PCB-F=R2510; мутант PCB-Fdel554-574=R2821), либо в сочетании с мРНК, кодирующими другие белки РСВ (PCB-N=R2831; РСВ-М2-1=R2833), индуцировали специфические в отношении РСВ F гуморальные иммунные ответы у хлопковых крыс, о чем свидетельствуют общие титры антител в виде IgG в день 49.

Как продемонстрировано на фиг. 13, мРНК-вакцины на основе РСВ-F либо индивидуально (PCB-F=R2510; мутант PCB-Fdel554-574=R2821), либо в сочетании с мРНК, кодирующими другие белки РСВ (PCB-N=R2831; РСВ-М2-1=R2833), индуцировали образование РСВ-специфических функциональных антител у хлопковых крыс, о чем свидетельствуют титры вирус-нейтрализующих антител.

Как продемонстрировано на фиг. 14, мРНК-вакцины на основе РСВ-F либо индивидуально (PCB-F=R2510; мутант PCB-Fdel554-574=R2821), либо в сочетании с мРНК, кодирующими другие белки РСВ (PCB-N=R2831; РСВ-М2-1=R2833), снижали вирусные титры в легких и носу хлопковых крыс, подвергнутых контрольному заражению РСВ.

Как продемонстрировано на фиг. 14А, у всех животных, обработанных мРНК-вакцинами, титры вируса находились ниже предела обнаружения при осуществлении титрации вируса, что демонстрирует наличие защиты вакцинированных хлопковых крыс при оценке на основе титров вируса в легких. В отличие от мРНК-вакцин вакцина на основе инактивированного формалином вируса лишь минимально снижала титр вируса в легких по сравнению с контрольной группой, обработанной буфером RiLa. Воздействие инактивированной β-пропиолактоном вакцины против РСВ оказалось более выраженным, но не приводило к снижению титра вируса в легких ниже предела обнаружения у всех животных в этой группе. Как продемонстрировано на фиг. 14Б, титр вируса в ткани носа также значительно снижался в группах, вакцинированных мРНК. Титры вируса в носу инактивированного формалином вируса оказались сопоставимыми с титром вируса в вакцинированной RiLa группе. Инактивированная β-пропиолактоном вакцина оказалась более эффективной (по меньшей мере для двух из пяти животных). В отличие от этого, во всех группах, вакцинированных мРНК, обнаружен пониженный титр вируса в носу по сравнению с группой, вакцинированной RiLa.

Как продемонстрировано на фиг. 15, гистопатологический анализ легких хлопковых крыс, на которых проводили опыт по контрольному заражению РСВ, позволил установить патологию, описываемую различными баллами, в различных группах животных. Из гистопатологического анализа можно заключить, что ни в одной из вакцинированных мРНК групп не обнаружено повышенная патология легких, что имело место в случае группы, которую вакцинировали с использованием вакцины на основе инактивированного формалином РСВ. Средние баллы таких патологий, как перибронхиолит (РВ), периваскулит (PV), интерстициальная пневмония (IP) и альвеолит (А), оказались существенно более низкими во всех группах, вакцинированных мРНК, по сравнению с группой 3 (инактивированный формалином РСВ). В дополнительных группах, вакцинированных R2510 (группа Б; РСВ-F) или R2821 (группа В; мутант РСВ-F), что, вероятно, свидетельствует о снижении легочной патологии по сравнению с группой, вакцинированной RiLa-буфером, и затем зараженной РСВ (Ж).

Как продемонстрировано на фиг. 16, результаты, полученные с помощью количественной ОТ-ПЦР, свидетельствуют о различных схемах экспрессии в различных группах животных. Данные оценки количества геномных копий РСВ, измеренная на основе гена NS-1 РСВ, приведены на фиг. 16А. Количества геномных копий снижалось после вакцинации с использованием мРНК-вакцин по сравнению с контрольной обработанной RiLa-буфером группой (группа Ж). Это не имело места в группе, вакцинированной инактивированным формалином РСВ (группа 3). Как продемонстрировано на фиг. 16Б, вакцинация с использованием вакцины на основе инактивированного формалином РСВ (группа 3) индуцировала повышенную экспрессию ТН2-цитокина IL-4 по сравнению с контрольной группой, которую вакцинировали RiLa-буфером (группа Ж). В противоположность этому, вакцинация с использованием мРНК R2821, которая кодирует мутант РСВ-F, существенно снижала экспрессию мРНК IL-4 по сравнению с обработанной RiLa контрольной группой в легких после контрольного заражения РСВ. На фиг 16В представлены данные об экспрессии мРНК INF-γ. На фиг. 16Г представлены данные об экспрессии мРНК IL-5. Экспрессия IL-5 существенно снижалась в группах, вакцинированных с использованием R2510 или R2821, по сравнению с вакцинированными RiLa-буфером животными. Экспрессию вирусной РНК NS-1 или мРНК цитокинов, которые выделяли из ткани легкого, измеряли в день 5 после контрольного заражения. Статистический анализ осуществляли с помощью Т-критерия Стьюдента (* p<0,05 по сравнению группой Ж (RiLa-контроль)).

Пример 7: Опыт II по контрольному заражению хлопковых крыс РСВ

мРНК-вакцины, кодирующие F-белок РСВ (F) или мутантный белок PCB-F (F^*) (РСВ F del554-574), получали согласно методу, описанному в примере 1. Для оценки воздействия единичной или нескольких вакцинаций (первичная и бустерные вакцинации) указанные вакцины вводили один, два или три раза (как показано в таблице 7). Вакцины в объемах 2×50 мкл инъецировали внутрикожно (i.d.) в кожу спины хлопковых крыс. Дополнительные группы иммунизировали внутримышечно (i.m.), используя объемы вакцин 1×100 мкл, в правую заднюю лапу. В качестве контроля одной группе инъецировали внутрикожно буферный раствор лактата Рингера (буфер). После иммунизации хлопковых крыс подвергали контрольному заражению путем интратназального (i.n.) введения вируса РСВ/А2 (10⁵ БОЕ в 100 мкл; фирма Sigmovir). В качестве контроля одну группу не обрабатывали и не подвергали контрольному заражению (необработанная группа).

Титрования вируса РСВ

Определение титров вируса РСВ проводили согласно методу, описанному в примере 6.

Результаты

Как продемонстрировано на фиг. 17А, уже одна единичная внутрикожная вакцинация мРНК-вакцинами, которые кодируют белок PCB-F (F) или мутантный белок PCB-F (F^*) (РСВ F del554-574), оказалась высокоэффективной в отношении снижения титра вируса в легком по сравнению с обработанной буфером контрольной группой. Вторая и третья вакцинации («бустер-вакцинации) снижали вирусные титры до уровня, находящегося ниже предела обнаружения.

Как продемонстрировано на фиг. 17Б, уже две внутримышечные вакцинации мРНК-вакцинами, которые кодируют белок PCB-F (F) или мутантный белок PCB-F (F^*) (РСВ F del554-574), значительно снижали вирусный титр в легких по сравнению с обработанной буфером контрольной группой.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> КуреВак ГмбХ

<120> Вакцина против респираторно-синцитиального вируса (РСВ)

<130> CU01P151WO1

<160> 37

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 574

<212> PRT

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 1

Met Glu Leu Pro Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Ala

1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

50 55 60

Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Asn

65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

85 90 95

Met Gln Ser Thr Thr Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro

100 105 110

Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Lys Thr Asn Val Thr

115 120 125

Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

130 135 140

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

145 150 155 160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

165 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

180 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn

195 200 205

Lys Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln

210 215 220

Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

225 230 235 240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

245 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys

260 265 270

Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile

275 280 285

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro

290 295 300

Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

305 310 315 320

Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

325 330 335

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe

340 345 350

Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

355 360 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val

370 375 380

Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

385 390 395 400

Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

405 410 415

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

420 425 430

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp

435 440 445

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly

450 455 460

Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro

465 470 475 480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

485 490 495

Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu

500 505 510

Leu His His Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr

515 520 525

Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val

530 535 540

Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser

545 550 555 560

Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn

565 570

<210> 2

<211> 298

<212> PRT

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 2

Met Ser Lys Asn Lys Asp Gln Arg Thr Ala Lys Thr Leu Glu Lys Thr

1 5 10 15

Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Gly Leu Tyr Lys

20 25 30

Leu Asn Leu Lys Ser Ile Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met

35 40 45

Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Thr Ala Ile Ile Phe Ile Ala Ser

50 55 60

Ala Asn His Lys Val Thr Leu Thr Thr Ala Ile Ile Gln Asp Ala Thr

65 70 75 80

Ser Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Asp Pro Gln

85 90 95

Leu Gly Ile Ser Phe Ser Asn Leu Ser Glu Ile Thr Ser Gln Thr Thr

100 105 110

Thr Ile Leu Ala Ser Thr Thr Pro Gly Val Lys Ser Asn Leu Gln Pro

115 120 125

Thr Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Thr Gln Pro Ser

130 135 140

Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn

145 150 155 160

Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys

165 170 175

Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Phe

195 200 205

Lys Thr Thr Lys Lys Asp Leu Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu

210 215 220

Val Pro Thr Thr Lys Pro Thr Glu Glu Pro Thr Ile Asn Thr Thr Lys

225 230 235 240

Thr Asn Ile Thr Thr Thr Leu Leu Thr Asn Asn Thr Thr Gly Asn Pro

245 250 255

Lys Leu Thr Ser Gln Met Glu Thr Phe His Ser Thr Ser Ser Glu Gly

260 265 270

Asn Leu Ser Pro Ser Gln Val Ser Thr Thr Ser Glu His Pro Ser Gln

275 280 285

Pro Ser Ser Pro Pro Asn Thr Thr Arg Gln

290 295

<210> 3

<211> 64

<212> PRT

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 3

Met Glu Asn Thr Ser Ile Thr Ile Glu Phe Ser Ser Lys Phe Trp Pro

1 5 10 15

Tyr Phe Thr Leu Ile His Met Ile Thr Thr Ile Ile Ser Leu Leu Ile

20 25 30

Ile Ile Ser Ile Met Thr Ala Ile Leu Asn Lys Leu Cys Glu Tyr Asn

35 40 45

Val Phe His Asn Lys Thr Phe Glu Leu Pro Arg Ala Arg Val Asn Thr

50 55 60

<210> 4

<211> 256

<212> PRT

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 4

Met Glu Thr Tyr Val Asn Lys Leu His Glu Gly Ser Thr Tyr Thr Ala

1 5 10 15

Ala Val Gln Tyr Asn Val Leu Glu Lys Asp Asp Asp Pro Ala Ser Leu

20 25 30

Thr Ile Trp Val Pro Met Phe Gln Ser Ser Met Pro Ala Asp Leu Leu

35 40 45

Ile Lys Glu Leu Ala Asn Val Asn Ile Leu Val Lys Gln Ile Ser Thr

50 55 60

Pro Lys Gly Pro Ser Leu Arg Val Met Ile Asn Ser Arg Ser Ala Leu

65 70 75 80

Leu Ala Gln Met Pro Ser Lys Phe Thr Ile Cys Ala Asn Val Ser Leu

85 90 95

Asp Glu Arg Ser Lys Leu Ala Tyr Asp Val Thr Thr Pro Cys Glu Ile

100 105 110

Lys Ala Cys Ser Leu Thr Cys Leu Lys Ser Lys Asn Met Leu Thr Thr

115 120 125

Val Lys Asp Leu Thr Met Lys Thr Leu Asn Pro Thr His Asp Ile Ile

130 135 140

Ala Leu Cys Glu Phe Glu Asn Ile Val Thr Ser Lys Lys Val Ile Ile

145 150 155 160

Pro Thr Tyr Leu Arg Ser Ile Ser Val Arg Asn Lys Asp Leu Asn Thr

165 170 175

Leu Glu Asn Ile Thr Thr Thr Glu Phe Lys Asn Ala Ile Thr Asn Ala

180 185 190

Lys Ile Ile Pro Tyr Ser Gly Leu Leu Leu Val Ile Thr Val Thr Asp

195 200 205

Asn Lys Gly Ala Phe Lys Tyr Ile Lys Pro Gln Ser Gln Phe Ile Val

210 215 220

Asp Leu Gly Ala Tyr Leu Glu Lys Glu Ser Ile Tyr Tyr Val Thr Thr

225 230 235 240

Asn Trp Lys His Thr Ala Thr Arg Phe Ala Ile Lys Pro Met Glu Asp

245 250 255

<210> 5

<211> 391

<212> PRT

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 5

Met Ala Leu Ser Lys Val Lys Leu Asn Asp Thr Leu Asn Lys Asp Gln

1 5 10 15

Leu Leu Ser Ser Ser Lys Tyr Thr Ile Gln Arg Ser Thr Gly Asp Ser

20 25 30

Ile Asp Thr Pro Asn Tyr Asp Val Gln Lys His Ile Asn Lys Leu Cys

35 40 45

Gly Met Leu Leu Ile Thr Glu Asp Ala Asn His Lys Phe Thr Gly Leu

50 55 60

Ile Gly Met Leu Tyr Ala Met Ser Arg Leu Gly Arg Glu Asp Thr Ile

65 70 75 80

Lys Ile Leu Arg Asp Ala Gly Tyr His Val Lys Ala Asn Gly Val Asp

85 90 95

Val Thr Thr His Arg Gln Asp Ile Asn Gly Lys Glu Met Lys Phe Glu

100 105 110

Val Leu Thr Leu Ala Ser Leu Thr Thr Glu Ile Gln Ile Asn Ile Glu

115 120 125

Ile Glu Ser Arg Lys Ser Tyr Lys Lys Met Leu Lys Glu Met Gly Glu

130 135 140

Val Ala Pro Glu Tyr Arg His Asp Ser Pro Asp Cys Gly Met Ile Ile

145 150 155 160

Leu Cys Ile Ala Ala Leu Val Ile Thr Lys Leu Ala Ala Gly Asp Arg

165 170 175

Ser Gly Leu Thr Ala Val Ile Arg Arg Ala Asn Asn Val Leu Lys Asn

180 185 190

Glu Met Lys Arg Tyr Lys Gly Leu Leu Pro Lys Asp Ile Ala Asn Ser

195 200 205

Phe Tyr Glu Val Phe Glu Lys His Pro His Phe Ile Asp Val Phe Val

210 215 220

His Phe Gly Ile Ala Gln Ser Ser Thr Arg Gly Gly Ser Arg Val Glu

225 230 235 240

Gly Ile Phe Ala Gly Leu Phe Met Asn Ala Tyr Gly Ala Gly Gln Val

245 250 255

Met Leu Arg Trp Gly Val Leu Ala Lys Ser Val Lys Asn Ile Met Leu

260 265 270

Gly His Ala Ser Val Gln Ala Glu Met Glu Gln Val Val Glu Val Tyr

275 280 285

Glu Tyr Ala Gln Lys Leu Gly Gly Glu Ala Gly Phe Tyr His Ile Leu

290 295 300

Asn Asn Pro Lys Ala Ser Leu Leu Ser Leu Thr Gln Phe Pro His Phe

305 310 315 320

Ser Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ala Gly Leu Gly Ile Met Gly Glu

325 330 335

Tyr Arg Gly Thr Pro Arg Asn Gln Asp Leu Tyr Asp Ala Ala Lys Ala

340 345 350

Tyr Ala Glu Gln Leu Lys Glu Asn Gly Val Ile Asn Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Asp Leu Thr Ala Glu Glu Leu Glu Ala Ile Lys His Gln Leu Asn Pro

370 375 380

Lys Asp Asn Asp Val Glu Leu

385 390

<210> 6

<211> 2165

<212> PRT

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 6

Met Asp Pro Ile Ile Asn Gly Asn Ser Ala Asn Val Tyr Leu Thr Asp

1 5 10 15

Ser Tyr Leu Lys Gly Val Ile Ser Phe Ser Glu Cys Asn Ala Leu Gly

20 25 30

Ser Tyr Ile Phe Asn Gly Pro Tyr Leu Lys Asn Asp Tyr Thr Asn Leu

35 40 45

Ile Ser Arg Gln Asn Pro Leu Ile Glu His Met Asn Leu Lys Lys Leu

50 55 60

Asn Ile Thr Gln Ser Leu Ile Ser Lys Tyr His Lys Gly Glu Ile Lys

65 70 75 80

Leu Glu Glu Pro Thr Tyr Phe Gln Ser Leu Leu Met Thr Tyr Lys Ser

85 90 95

Met Thr Ser Leu Glu Gln Ile Ala Thr Thr Asn Leu Leu Lys Lys Ile

100 105 110

Ile Arg Arg Ala Ile Glu Ile Ser Asp Val Lys Val Tyr Ala Ile Leu

115 120 125

Asn Lys Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asp Lys Ile Lys Ser Asn Asn Gly

130 135 140

Gln Asp Glu Asp Asn Ser Val Ile Thr Thr Ile Ile Lys Asp Asp Ile

145 150 155 160

Leu Ser Ala Val Lys Asp Asn Gln Ser His Leu Lys Ala Asp Lys Asn

165 170 175

His Ser Thr Lys Gln Lys Asp Thr Ile Lys Thr Thr Leu Leu Lys Lys

180 185 190

Leu Met Cys Ser Met Gln His Pro Pro Ser Trp Leu Ile His Trp Phe

195 200 205

Asn Leu Tyr Thr Lys Leu Asn Asn Ile Leu Thr Gln Tyr Arg Ser Asn

210 215 220

Glu Val Lys Asn His Gly Phe Ile Leu Ile Asp Asn Gln Thr Leu Ser

225 230 235 240

Gly Phe Gln Phe Ile Leu Asn Gln Tyr Gly Cys Ile Val Tyr His Lys

245 250 255

Glu Leu Lys Arg Ile Thr Val Thr Thr Tyr Asn Gln Phe Leu Thr Trp

260 265 270

Lys Asp Ile Ser Leu Ser Arg Leu Asn Val Cys Leu Ile Thr Trp Ile

275 280 285

Ser Asn Cys Leu Asn Thr Leu Asn Lys Ser Leu Gly Leu Arg Cys Gly

290 295 300

Phe Asn Asn Val Ile Leu Thr Gln Leu Phe Leu Tyr Gly Asp Cys Ile

305 310 315 320

Leu Lys Leu Phe His Asn Glu Gly Phe Tyr Ile Ile Lys Glu Val Glu

325 330 335

Gly Phe Ile Met Ser Leu Ile Leu Asn Ile Thr Glu Glu Asp Gln Phe

340 345 350

Arg Lys Arg Phe Tyr Asn Ser Met Leu Asn Asn Ile Thr Asp Ala Ala

355 360 365

Asn Lys Ala Gln Lys Asn Leu Leu Ser Arg Val Cys His Thr Leu Leu

370 375 380

Asp Lys Thr Val Ser Asp Asn Ile Ile Asn Gly Arg Trp Ile Ile Leu

385 390 395 400

Leu Ser Lys Phe Leu Lys Leu Ile Lys Leu Ala Gly Asp Asn Asn Leu

405 410 415

Asn Asn Leu Ser Glu Leu Tyr Phe Leu Phe Arg Ile Phe Gly His Pro

420 425 430

Met Val Asp Glu Arg Gln Ala Met Asp Ala Val Lys Val Asn Cys Asn

435 440 445

Glu Thr Lys Phe Tyr Leu Leu Ser Ser Leu Ser Met Leu Arg Gly Ala

450 455 460

Phe Ile Tyr Arg Ile Ile Lys Gly Phe Val Asn Asn Tyr Asn Arg Trp

465 470 475 480

Pro Thr Leu Arg Asn Ala Ile Val Leu Pro Leu Arg Trp Leu Thr Tyr

485 490 495

Tyr Lys Leu Asn Thr Tyr Pro Ser Leu Leu Glu Leu Thr Glu Arg Asp

500 505 510

Leu Ile Val Leu Ser Gly Leu Arg Phe Tyr Arg Glu Phe Arg Leu Pro

515 520 525

Lys Lys Val Asp Leu Glu Met Ile Ile Asn Asp Lys Ala Ile Ser Pro

530 535 540

Pro Lys Asn Leu Ile Trp Thr Ser Phe Pro Arg Asn Tyr Met Pro Ser

545 550 555 560

His Ile Gln Asn Tyr Ile Glu His Glu Lys Leu Lys Phe Ser Glu Ser

565 570 575

Asp Lys Ser Arg Arg Val Leu Glu Tyr Tyr Leu Arg Asp Asn Lys Phe

580 585 590

Asn Glu Cys Asp Leu Tyr Asn Cys Val Val Asn Gln Ser Tyr Leu Asn

595 600 605

Asn Pro Asn His Val Val Ser Leu Thr Gly Lys Glu Arg Glu Leu Ser

610 615 620

Val Gly Arg Met Phe Ala Met Gln Pro Gly Met Phe Arg Gln Val Gln

625 630 635 640

Ile Leu Ala Glu Lys Met Ile Ala Glu Asn Ile Leu Gln Phe Phe Pro

645 650 655

Glu Ser Leu Thr Arg Tyr Gly Asp Leu Glu Leu Gln Lys Ile Leu Glu

660 665 670

Leu Lys Ala Gly Ile Ser Asn Lys Ser Asn Arg Tyr Asn Asp Asn Tyr

675 680 685

Asn Asn Tyr Ile Ser Lys Cys Ser Ile Ile Thr Asp Leu Ser Lys Phe

690 695 700

Asn Gln Ala Phe Arg Tyr Glu Thr Ser Cys Ile Cys Ser Asp Val Leu

705 710 715 720

Asp Glu Leu His Gly Val Gln Ser Leu Phe Ser Trp Leu His Leu Thr

725 730 735

Ile Pro His Val Thr Ile Ile Cys Thr Tyr Arg His Ala Pro Pro Tyr

740 745 750

Ile Arg Asp His Ile Val Asp Leu Asn Asn Val Asp Glu Gln Ser Gly

755 760 765

Leu Tyr Arg Tyr His Met Gly Gly Ile Glu Gly Trp Cys Gln Lys Leu

770 775 780

Trp Thr Ile Glu Ala Ile Ser Leu Leu Asp Leu Ile Ser Leu Lys Gly

785 790 795 800

Lys Phe Ser Ile Thr Ala Leu Ile Asn Gly Asp Asn Gln Ser Ile Asp

805 810 815

Ile Ser Lys Pro Val Arg Leu Met Glu Gly Gln Thr His Ala Gln Ala

820 825 830

Asp Tyr Leu Leu Ala Leu Asn Ser Leu Lys Leu Leu Tyr Lys Glu Tyr

835 840 845

Ala Gly Ile Gly His Lys Leu Lys Gly Thr Glu Thr Tyr Ile Ser Arg

850 855 860

Asp Met Gln Phe Met Ser Lys Thr Ile Gln His Asn Gly Val Tyr Tyr

865 870 875 880

Pro Ala Ser Ile Lys Lys Val Leu Arg Val Gly Pro Trp Ile Asn Thr

885 890 895

Ile Leu Asp Asp Phe Lys Val Ser Leu Glu Ser Ile Gly Ser Leu Thr

900 905 910

Gln Glu Leu Glu Tyr Arg Gly Glu Ser Leu Leu Cys Ser Leu Ile Phe

915 920 925

Arg Asn Val Trp Leu Tyr Asn Gln Ile Ala Leu Gln Leu Lys Asn His

930 935 940

Ala Leu Cys Asn Asn Lys Leu Tyr Leu Asp Ile Leu Lys Val Leu Lys

945 950 955 960

His Leu Lys Thr Phe Phe Asn Leu Asp Asn Ile Asp Thr Ala Leu Thr

965 970 975

Leu Tyr Met Asn Leu Pro Met Leu Phe Gly Gly Gly Asp Pro Asn Leu

980 985 990

Leu Tyr Arg Ser Phe Tyr Arg Arg Thr Pro Asp Phe Leu Thr Glu Ala

995 1000 1005

Ile Val His Ser Val Phe Ile Leu Ser Tyr Tyr Thr Asn His Asp

1010 1015 1020

Leu Lys Asp Lys Leu Gln Asp Leu Ser Asp Asp Arg Leu Asn Lys

1025 1030 1035

Phe Leu Thr Cys Ile Ile Thr Phe Asp Lys Asn Pro Asn Ala Glu

1040 1045 1050

Phe Val Thr Leu Met Arg Asp Pro Gln Ala Leu Gly Ser Glu Arg

1055 1060 1065

Gln Ala Lys Ile Thr Ser Glu Ile Asn Arg Leu Ala Val Thr Glu

1070 1075 1080

Val Leu Ser Thr Ala Pro Asn Lys Ile Phe Ser Lys Ser Ala Gln

1085 1090 1095

His Tyr Thr Thr Thr Glu Ile Asp Leu Asn Asp Ile Met Gln Asn

1100 1105 1110

Ile Glu Pro Thr Tyr Pro His Gly Leu Arg Val Val Tyr Glu Ser

1115 1120 1125

Leu Pro Phe Tyr Lys Ala Glu Lys Ile Val Asn Leu Ile Ser Gly

1130 1135 1140

Thr Lys Ser Ile Thr Asn Ile Leu Glu Lys Thr Ser Ala Ile Asp

1145 1150 1155

Leu Thr Asp Ile Asp Arg Ala Thr Glu Met Met Arg Lys Asn Ile

1160 1165 1170

Thr Leu Leu Ile Arg Ile Leu Pro Leu Asp Cys Asn Arg Asp Lys

1175 1180 1185

Arg Glu Ile Leu Ser Met Glu Asn Leu Ser Ile Thr Glu Leu Ser

1190 1195 1200

Lys Tyr Val Arg Glu Arg Ser Trp Ser Leu Ser Asn Ile Val Gly

1205 1210 1215

Val Thr Ser Pro Ser Ile Met Tyr Thr Met Asp Ile Lys Tyr Thr

1220 1225 1230

Thr Ser Thr Ile Ala Ser Gly Ile Ile Ile Glu Lys Tyr Asn Val

1235 1240 1245

Asn Ser Leu Thr Arg Gly Glu Arg Gly Pro Thr Lys Pro Trp Val

1250 1255 1260

Gly Ser Ser Thr Gln Glu Lys Lys Thr Met Pro Val Tyr Asn Arg

1265 1270 1275

Gln Val Leu Thr Lys Lys Gln Arg Asp Gln Ile Asp Leu Leu Ala

1280 1285 1290

Lys Leu Asp Trp Val Tyr Ala Ser Ile Asp Asn Lys Asp Glu Phe

1295 1300 1305

Met Glu Glu Leu Ser Ile Gly Thr Leu Gly Leu Thr Tyr Glu Lys

1310 1315 1320

Ala Lys Lys Leu Phe Pro Gln Tyr Leu Ser Val Asn Tyr Leu His

1325 1330 1335

Arg Leu Thr Val Ser Ser Arg Pro Cys Glu Phe Pro Ala Ser Ile

1340 1345 1350

Pro Ala Tyr Arg Thr Thr Asn Tyr His Phe Asp Thr Ser Pro Ile

1355 1360 1365

Asn Arg Ile Leu Thr Glu Lys Tyr Gly Asp Glu Asp Ile Asp Ile

1370 1375 1380

Val Phe Gln Asn Cys Ile Ser Phe Gly Leu Ser Leu Met Ser Val

1385 1390 1395

Val Glu Gln Phe Thr Asn Val Cys Pro Asn Arg Ile Ile Leu Ile

1400 1405 1410

Pro Lys Leu Asn Glu Ile His Leu Met Lys Pro Pro Ile Phe Thr

1415 1420 1425

Gly Asp Val Asp Ile His Lys Leu Lys Gln Val Ile Gln Lys Gln

1430 1435 1440

His Met Phe Leu Pro Asp Lys Ile Ser Leu Thr Gln Tyr Val Glu

1445 1450 1455

Leu Phe Leu Ser Asn Lys Thr Leu Lys Ser Gly Ser His Val Asn

1460 1465 1470

Ser Asn Leu Ile Leu Ala His Lys Ile Ser Asp Tyr Phe His Asn

1475 1480 1485

Thr Tyr Ile Leu Ser Thr Asn Leu Ala Gly His Trp Ile Leu Ile

1490 1495 1500

Ile Gln Leu Met Lys Asp Ser Lys Gly Ile Phe Glu Lys Asp Trp

1505 1510 1515

Gly Glu Gly Tyr Ile Thr Asp His Met Phe Ile Asn Leu Lys Val

1520 1525 1530

Phe Phe Asn Ala Tyr Lys Thr Tyr Leu Leu Cys Phe His Lys Gly

1535 1540 1545

Tyr Gly Lys Ala Lys Leu Glu Cys Asp Met Asn Thr Ser Asp Leu

1550 1555 1560

Leu Cys Val Leu Glu Leu Ile Asp Ser Ser Tyr Trp Lys Ser Met

1565 1570 1575

Ser Lys Val Phe Leu Glu Gln Lys Val Ile Lys Tyr Ile Leu Ser

1580 1585 1590

Gln Asp Ala Ser Leu His Arg Val Lys Gly Cys His Ser Phe Lys

1595 1600 1605

Leu Trp Phe Leu Lys Arg Leu Asn Val Ala Glu Phe Thr Val Cys

1610 1615 1620

Pro Trp Val Val Asn Ile Asp Tyr His Pro Thr His Met Lys Ala

1625 1630 1635

Ile Leu Thr Tyr Ile Asp Leu Val Arg Met Gly Leu Ile Asn Ile

1640 1645 1650

Asp Arg Ile His Ile Lys Asn Lys His Lys Phe Asn Asp Glu Phe

1655 1660 1665

Tyr Thr Ser Asn Leu Phe Tyr Ile Asn Tyr Asn Phe Ser Asp Asn

1670 1675 1680

Thr His Leu Leu Thr Lys His Ile Arg Ile Ala Asn Ser Glu Leu

1685 1690 1695

Glu Asn Asn Tyr Asn Lys Leu Tyr His Pro Thr Pro Glu Thr Leu

1700 1705 1710

Glu Asn Ile Leu Ala Asn Pro Ile Lys Ser Asn Asp Lys Lys Thr

1715 1720 1725

Leu Asn Asp Tyr Cys Ile Gly Lys Asn Val Asp Ser Ile Met Leu

1730 1735 1740

Pro Leu Leu Ser Asn Lys Lys Leu Val Lys Ser Ser Ala Met Ile

1745 1750 1755

Arg Thr Asn Tyr Ser Lys Gln Asp Leu Tyr Asn Leu Phe Pro Thr

1760 1765 1770

Val Val Ile Asp Arg Ile Ile Asp His Ser Gly Asn Thr Ala Lys

1775 1780 1785

Ser Asn Gln Leu Tyr Thr Thr Thr Ser His Gln Ile Ser Leu Val

1790 1795 1800

His Asn Ser Thr Ser Leu Tyr Cys Met Leu Pro Trp His His Ile

1805 1810 1815

Asn Arg Phe Asn Phe Val Phe Ser Ser Thr Gly Cys Lys Ile Ser

1820 1825 1830

Ile Glu Tyr Ile Leu Lys Asp Leu Lys Ile Lys Asp Pro Asn Cys

1835 1840 1845

Ile Ala Phe Ile Gly Glu Gly Ala Gly Asn Leu Leu Leu Arg Thr

1850 1855 1860

Val Val Glu Leu His Pro Asp Ile Arg Tyr Ile Tyr Arg Ser Leu

1865 1870 1875

Lys Asp Cys Asn Asp His Ser Leu Pro Ile Glu Phe Leu Arg Leu

1880 1885 1890

Tyr Asn Gly His Ile Asn Ile Asp Tyr Gly Glu Asn Leu Thr Ile

1895 1900 1905

Pro Ala Thr Asp Ala Thr Asn Asn Ile His Trp Ser Tyr Leu His

1910 1915 1920

Ile Lys Phe Ala Glu Pro Ile Ser Leu Phe Val Cys Asp Ala Glu

1925 1930 1935

Leu Pro Val Thr Val Asn Trp Ser Lys Ile Ile Ile Glu Trp Ser

1940 1945 1950

Lys His Val Arg Lys Cys Lys Tyr Cys Ser Ser Val Asn Lys Cys

1955 1960 1965

Thr Leu Ile Val Lys Tyr His Ala Gln Asp Asp Ile Asp Phe Lys

1970 1975 1980

Leu Asp Asn Ile Thr Ile Leu Lys Thr Tyr Val Cys Leu Gly Ser

1985 1990 1995

Lys Leu Lys Gly Ser Glu Val Tyr Leu Val Leu Thr Ile Gly Pro

2000 2005 2010

Ala Asn Ile Phe Pro Val Phe Asn Val Val Gln Asn Ala Lys Leu

2015 2020 2025

Ile Leu Ser Arg Thr Lys Asn Phe Ile Met Pro Lys Lys Ala Asp

2030 2035 2040

Lys Glu Ser Ile Asp Ala Asn Ile Lys Ser Leu Ile Pro Phe Leu

2045 2050 2055

Cys Tyr Pro Ile Thr Lys Lys Gly Ile Asn Thr Ala Leu Ser Lys

2060 2065 2070

Leu Lys Ser Val Val Ser Gly Asp Ile Leu Ser Tyr Ser Ile Ala

2075 2080 2085

Gly Arg Asn Glu Val Phe Ser Asn Lys Leu Ile Asn His Lys His

2090 2095 2100

Met Asn Ile Leu Lys Trp Phe Asn His Val Leu Asn Phe Arg Ser

2105 2110 2115

Thr Glu Leu Asn Tyr Asn His Leu Tyr Met Val Glu Ser Thr Tyr

2120 2125 2130

Pro Tyr Leu Ser Glu Leu Leu Asn Ser Leu Thr Thr Asn Glu Leu

2135 2140 2145

Lys Lys Leu Ile Lys Ile Thr Gly Ser Leu Leu Tyr Asn Phe His

2150 2155 2160

Asn Glu

2165

<210> 7

<211> 194

<212> PRT

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 7

Met Ser Arg Arg Asn Pro Cys Lys Phe Glu Ile Arg Gly His Cys Leu

1 5 10 15

Asn Gly Lys Arg Cys His Phe Ser His Asn Tyr Phe Glu Trp Pro Pro

20 25 30

His Ala Leu Leu Val Arg Gln Asn Phe Met Leu Asn Arg Ile Leu Lys

35 40 45

Ser Met Asp Lys Ser Ile Asp Thr Leu Ser Glu Ile Ser Gly Ala Ala

50 55 60

Glu Leu Asp Arg Thr Glu Glu Tyr Ala Leu Gly Val Val Gly Val Leu

65 70 75 80

Glu Ser Tyr Ile Gly Ser Ile Asn Asn Ile Thr Lys Gln Ser Ala Cys

85 90 95

Val Ala Met Ser Lys Leu Leu Thr Glu Leu Asn Ser Asp Asp Ile Lys

100 105 110

Lys Leu Arg Asp Asn Glu Glu Leu Asn Ser Pro Lys Ile Arg Val Tyr

115 120 125

Asn Thr Val Ile Ser Tyr Ile Glu Ser Asn Arg Lys Asn Asn Lys Gln

130 135 140

Thr Ile His Leu Leu Lys Arg Leu Pro Ala Asp Val Leu Lys Lys Thr

145 150 155 160

Ile Lys Asn Thr Leu Asp Ile His Lys Ser Ile Thr Ile Asn Asn Pro

165 170 175

Lys Glu Leu Thr Val Ser Asp Thr Asn Asp His Ala Lys Asn Asn Asp

180 185 190

Thr Thr

<210> 8

<211> 90

<212> PRT

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 8

Met Thr Met Pro Lys Ile Met Ile Leu Pro Asp Lys Tyr Pro Cys Ser

1 5 10 15

Ile Thr Ser Ile Leu Ile Thr Ser Arg Cys Arg Val Thr Met Tyr Asn

20 25 30

Arg Lys Asn Thr Leu Tyr Phe Asn Gln Asn Asn Pro Asn Asn His Met

35 40 45

Tyr Ser Pro Asn Gln Thr Phe Asn Glu Ile His Trp Thr Ser Gln Asp

50 55 60

Leu Ile Asp Thr Ile Gln Asn Phe Leu Gln His Leu Gly Val Ile Glu

65 70 75 80

Asp Ile Tyr Thr Ile Tyr Ile Leu Val Ser

85 90

<210> 9

<211> 241

<212> PRT

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 9

Met Glu Lys Phe Ala Pro Glu Phe His Gly Glu Asp Ala Asn Asn Arg

1 5 10 15

Ala Thr Lys Phe Leu Glu Ser Ile Lys Gly Lys Phe Thr Ser Pro Lys

20 25 30

Asp Pro Lys Lys Lys Asp Ser Ile Ile Ser Val Asn Ser Ile Asp Ile

35 40 45

Glu Val Thr Lys Glu Ser Pro Ile Thr Ser Asn Ser Thr Ile Ile Asn

50 55 60

Pro Thr Asn Glu Thr Asp Asp Asn Ala Gly Asn Lys Pro Asn Tyr Gln

65 70 75 80

Arg Lys Pro Leu Val Ser Phe Lys Glu Asp Pro Ile Pro Ser Asp Asn

85 90 95

Pro Phe Ser Lys Leu Tyr Lys Glu Thr Ile Glu Thr Phe Asp Asn Asn

100 105 110

Glu Glu Glu Ser Ser Tyr Ser Tyr Glu Glu Ile Asn Asp Gln Thr Asn

115 120 125

Asp Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asp Arg Ile Asp Glu Lys Leu Ser Glu

130 135 140

Ile Leu Gly Met Leu His Thr Leu Val Val Ala Ser Ala Gly Pro Thr

145 150 155 160

Ser Ala Arg Asp Gly Ile Arg Asp Ala Met Val Gly Leu Arg Glu Glu

165 170 175

Met Ile Glu Lys Ile Arg Thr Glu Ala Leu Met Thr Asn Asp Arg Leu

180 185 190

Glu Ala Met Ala Arg Leu Arg Asn Glu Glu Ser Glu Lys Met Ala Lys

195 200 205

Asp Thr Ser Asp Glu Val Ser Leu Asn Pro Thr Ser Glu Lys Leu Asn

210 215 220

Asn Leu Leu Glu Gly Asn Asp Ser Asp Asn Asp Leu Ser Leu Glu Asp

225 230 235 240

Phe

<210> 10

<211> 139

<212> PRT

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 10

Met Gly Ser Asn Ser Leu Ser Met Ile Lys Val Arg Leu Gln Asn Leu

1 5 10 15

Phe Asp Asn Asp Glu Val Ala Leu Leu Lys Ile Thr Cys Tyr Thr Asp

20 25 30

Lys Leu Ile His Leu Thr Asn Ala Leu Ala Lys Ala Val Ile His Thr

35 40 45

Ile Lys Leu Asn Gly Ile Val Phe Val His Val Ile Thr Ser Ser Asp

50 55 60

Ile Cys Pro Asn Asn Asn Ile Val Val Lys Ser Asn Phe Thr Thr Met

65 70 75 80

Pro Val Leu Gln Asn Gly Gly Tyr Ile Trp Glu Met Met Glu Leu Thr

85 90 95

His Cys Ser Gln Pro Asn Gly Leu Ile Asp Asp Asn Cys Glu Ile Lys

100 105 110

Phe Ser Lys Lys Leu Ser Asp Ser Thr Met Thr Asn Tyr Met Asn Gln

115 120 125

Leu Ser Glu Leu Leu Gly Phe Asp Leu Asn Pro

130 135

<210> 11

<211> 124

<212> PRT

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 11

Met Asp Thr Thr His Asn Asp Thr Thr Pro Gln Arg Leu Met Ile Thr

1 5 10 15

Asp Met Arg Pro Leu Ser Leu Glu Thr Thr Ile Thr Ser Leu Thr Arg

20 25 30

Asp Ile Ile Thr His Arg Phe Ile Tyr Leu Ile Asn His Glu Cys Ile

35 40 45

Val Arg Lys Leu Asp Glu Arg Gln Ala Thr Phe Thr Phe Leu Val Asn

50 55 60

Tyr Glu Met Lys Leu Leu His Lys Val Gly Ser Thr Lys Tyr Lys Lys

65 70 75 80

Tyr Thr Glu Tyr Asn Thr Lys Tyr Gly Thr Phe Pro Met Pro Ile Phe

85 90 95

Ile Asn His Asp Gly Phe Leu Glu Cys Ile Gly Ile Lys Pro Thr Lys

100 105 110

His Thr Pro Ile Ile Tyr Lys Tyr Asp Leu Asn Pro

115 120

<210> 12

<211> 1725

<212> РНК

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 12

auggaguugc caauccucaa agcaaaugca auuaccacaa uccucgcugc agucacauuu 60

ugcuuugcuu cuagucaaaa caucacugaa gaauuuuauc aaucaacaug cagugcaguu 120

agcaaaggcu aucuuagugc ucuaagaacu gguugguaua cuaguguuau aacuauagaa 180

uuaaguaaua ucaaggaaaa uaaguguaau ggaacagaug cuaagguaaa auugauaaac 240

caagaauuag auaaauauaa aaaugcugua acagaauugc aguugcucau gcaaagcaca 300

acagcagcaa acaaucgagc cagaagagaa cuaccaaggu uuaugaauua uacacucaac 360

aauaccaaaa aaaccaaugu aacauuaagc aagaaaagga aaagaagauu ucuugguuuu 420

uuguuaggug uuggaucugc aaucgccagu ggcauugcug uaucuaaggu ccugcacuua 480

gaaggagaag ugaacaagau caaaagugcu cuacuaucca caaacaaggc cguagucagc 540

uuaucaaaug gaguuagugu cuuaaccagc aaaguguuag accucaaaaa cuauauagau 600

aaacaauugu uaccuauugu gaauaagcaa agcugcagaa uaucaaauau agaaacugug 660

auagaguucc aacaaaagaa caacagacua cuagagauua ccagggaauu uaguguuaau 720

gcagguguaa cuacaccugu aagcacuuac auguuaacua auagugaauu auugucauua 780

aucaaugaua ugccuauaac aaaugaucag aaaaaguuaa uguccaacaa uguucaaaua 840

guuagacagc aaaguuacuc uaucaugucc auaauaaaag aggaagucuu agcauaugua 900

guacaauuac cacuauaugg ugugauagau acaccuuguu ggaaauuaca cacauccccu 960

cuauguacaa ccaacacaaa agaaggguca aacaucuguu uaacaagaac ugacagagga 1020

ugguacugug acaaugcagg aucaguaucu uucuucccac aagcugaaac auguaaaguu 1080

caaucgaauc gaguauuuug ugacacaaug aacaguuuaa cauuaccaag ugaaguaaau 1140

cucugcaaug uugacauauu caaucccaaa uaugauugua aaauuaugac uucaaaaaca 1200

gauguaagca gcuccguuau cacaucucua ggagccauug ugucaugcua uggcaaaacu 1260

aaauguacag cauccaauaa aaaucgugga aucauaaaga cauuuucuaa cgggugugau 1320

uauguaucaa auaaaggggu ggacacugug ucuguaggua acacauuaua uuauguaaau 1380

aagcaagaag gcaaaagucu cuauguaaaa ggugaaccaa uaauaaauuu cuaugaccca 1440

uuaguauucc ccucugauga auuugaugca ucaauaucuc aagucaauga gaagauuaac 1500

cagaguuuag cauuuauucg uaaauccgau gaauuauuac aucauguaaa ugcugguaaa 1560

ucaaccacaa auaucaugau aacuacuaua auuauaguga uuauaguaau auuguuauca 1620

uuaauugcug uuggacugcu ccuauacugu aaggccagaa gcacaccagu cacacuaagc 1680

aaggaucaac ugagugguau aaauaauauu gcauuuagua acuga 1725

<210> 13

<211> 897

<212> РНК

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 13

auguccaaaa acaaggacca acgcaccgcu aagacacuag aaaagaccug ggacacucuc 60

aaucauuuau uauucauauc aucgggcuua uauaaguuaa aucuuaaauc uauagcacaa 120

aucacauuau ccauucuggc aaugauaauc ucaacuucac uuauaauuac agccaucaua 180

uucauagccu cggcaaacca caaagucaca cuaacaacug caaucauaca agaugcaaca 240

agccagauca agaacacaac cccaacauac cucacucagg auccucagcu uggaaucagc 300

uucuccaauc ugucugaaau uacaucacaa accaccacca uacuagcuuc aacaacacca 360

ggagucaagu caaaccugca acccacaaca gucaagacua aaaacacaac aacaacccaa 420

acacaaccca gcaagcccac uacaaaacaa cgccaaaaca aaccaccaaa caaacccaau 480

aaugauuuuc acuucgaagu guuuaacuuu guacccugca gcauaugcag caacaaucca 540

accugcuggg cuaucugcaa aagaauacca aacaaaaaac caggaaagaa aaccaccacc 600

aagccuacaa aaaaaccaac cuucaagaca accaaaaaag aucucaaacc ucaaaccacu 660

aaaccaaagg aaguacccac caccaagccc acagaagagc caaccaucaa caccaccaaa 720

acaaacauca caacuacacu gcucaccaac aacaccacag gaaauccaaa acucacaagu 780

caaauggaaa ccuuccacuc aaccuccucc gaaggcaauc uaagcccuuc ucaagucucc 840

acaacauccg agcacccauc acaacccuca ucuccaccca acacaacacg ccaguag 897

<210> 14

<211> 195

<212> РНК

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 14

auggaaaaua cauccauaac aauagaauuc ucaagcaaau ucuggccuua cuuuacacua 60

auacacauga ucacaacaau aaucucuuug cuaaucauaa ucuccaucau gacugcaaua 120

cuaaacaaac uuugugaaua uaacguauuc cauaacaaaa ccuuugaguu accaagagcu 180

cgagucaaca cauag 195

<210> 15

<211> 771

<212> РНК

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 15

auggaaacau acgugaacaa gcuucacgaa ggcuccacau acacagcugc uguucaauac 60

aauguccuag aaaaagacga ugacccugca ucacuuacaa uaugggugcc cauguuccaa 120

ucaucuaugc cagcagauuu acuuauaaaa gaacuagcua augucaacau acuagugaaa 180

caaauaucca cacccaaggg accuucacua agagucauga uaaacucaag aagugcauug 240

cuagcacaaa ugcccagcaa auuuaccaua ugugcuaaug uguccuugga ugaaagaagc 300

aaacuggcau augauguaac cacacccugu gaaaucaagg cauguagucu aacaugccua 360

aaaucaaaaa auauguuaac uacaguuaaa gaucucacua ugaagacacu caaccccaca 420

caugauauua uugcuuuaug ugaauuugaa aacauaguaa caucaaaaaa agucauaaua 480

ccaacauacc uaagauccau cagugucaga aauaaagauc ugaacacacu ugaaaauaua 540

acaaccacug aauucaaaaa ugccaucaca aaugcaaaaa ucaucccuua cucaggauua 600

cuauuaguca ucacagugac ugacaacaaa ggagcauuca aauacauaaa gccgcaaagu 660

caauucauag uagaucuugg agcuuaccua gaaaaagaaa guauauauua uguuaccaca 720

aauuggaagc acacagcuac acgauuugca aucaaaccca uggaagauua a 771

<210> 16

<211> 1176

<212> РНК

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 16

auggcucuua gcaaagucaa guugaaugau acacucaaca aagaucaacu ucugucaucu 60

agcaaauaca ccauccaacg gagcacagga gauaguauug auacuccuaa uuaugaugug 120

cagaaacaca ucaauaaguu auguggcaug uuauuaauca cagaagaugc uaaucauaaa 180

uucacugggu uaauagguau guuauaugcu augucuaggu uaggaagaga agacaccaua 240

aaaauacuca gagaugcggg auaucaugua aaagcaaaug gaguagaugu aacaacacau 300

cgucaagaca ucaaugggaa agaaaugaaa uuugaagugu uaacauuggc aagcuuaaca 360

acugaaauuc aaaucaacau ugagauagaa ucuagaaaau ccuacaaaaa aaugcuaaaa 420

gaaaugggag agguagcucc agaauacagg caugauucuc cugauugugg gaugauaaua 480

uuauguauag cagcauuagu aauaaccaaa uuggcagcag gggauagauc uggucuuaca 540

gccgugauua ggagagcuaa uaauguccua aaaaaugaaa ugaaacguua caaaggcuua 600

cuacccaagg auauagccaa cagcuucuau gaaguguuug aaaaacaucc ccacuuuaua 660

gauguuuuug uucauuuugg uauagcacaa ucuuccacca gagguggcag uagaguugaa 720

gggauuuuug caggauuguu uaugaaugcc uauggugcag ggcaaguaau gcuacggugg 780

ggagucuuag caaaaucagu uaaaaauauu auguuaggac augcuagugu gcaagcagaa 840

auggaacaag uuguugaggu uuaugaauau gcccaaaaau uggguggaga agcaggauuc 900

uaccauauau ugaacaaccc aaaagcauca uuauuaucuu ugacucaauu uccucacuuu 960

uccaguguag uauuaggcaa ugcugcuggc cuaggcauaa ugggagagua cagagguaca 1020

ccgaggaauc aagaucuaua ugaugcagca aaggcauaug cugaacaacu caaagaaaau 1080

ggugugauua acuacagugu auuagacuug acagcagaag aacuagaggc uaucaaacau 1140

cagcuuaauc caaaagauaa ugauguagag cuuuga 1176

<210> 17

<211> 6498

<212> РНК

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 17

auggauccca uuauuaaugg aaauucugcu aauguuuauc uaaccgauag uuauuuaaaa 60

gguguuaucu cuuucucaga guguaaugcu uuaggaaguu acauauucaa ugguccuuau 120

cucaaaaaug auuauaccaa cuuaauuagu agacaaaauc cauuaauaga acacaugaau 180

cuaaagaaac uaaauauaac acaguccuua auaucuaagu aucauaaagg ugaaauaaaa 240

uuagaagagc cuacuuauuu ucagucauua cuuaugacau acaagaguau gaccucguug 300

gaacagauug cuaccacuaa uuuacuuaaa aagauaauaa gaagagcuau agaaauaagu 360

gaugucaaag ucuaugcuau auugaauaaa cuagggcuua aagaaaagga caagauuaaa 420

uccaacaaug gacaggauga agacaacuca guuauuacga ccauaaucaa agaugauaua 480

cuuucagcug uuaaggauaa ucaaucucau cuuaaagcag acaaaaauca cucuacaaaa 540

caaaaagaca caaucaaaac aacacucuug aagaaauuaa uguguucaau gcagcauccu 600

ccaucauggu uaauacauug guuuaauuua uacacaaaau uaaacaacau auuaacacag 660

uaucgaucaa augagguuaa aaaccauggg uuuauauuga uagauaauca aacucuuagu 720

ggauuucaau uuauuuugaa ucaauauggu uguauaguuu aucauaagga acucaaaaga 780

auuacuguga caaccuauaa ucaauucuug acauggaaag auauuagccu uaguagauua 840

aauguuuguu uaauuacaug gauuaguaac ugcuugaaca cauuaaauaa aagcuuaggc 900

uuaagaugcg gauucaauaa uguuaucuug acacaacuau uccuuuaugg ugauuguaua 960

cuaaagcuau uucacaauga gggguucuac auaauaaaag agguagaggg auuuauuaug 1020

ucucuaauuu uaaauauaac agaagaagau caauucagaa aacgauuuua uaauaguaug 1080

cucaacaaca ucacagaugc ugcuaauaaa gcucagaaaa aucugcuauc aagaguaugu 1140

cauacauuau uagauaagac aguauccgau aauauaauaa auggcagaug gauaauucua 1200

uuaaguaagu uccuuaaauu aauuaagcuu gcaggugaca auaaccuuaa caaucugagu 1260

gaacuauauu uuuuguucag aauauuugga cacccaaugg uagaugaaag acaagccaug 1320

gaugcuguua aaguuaauug caaugagacc aaauuuuacu uguuaagcag uuugaguaug 1380

uuaagaggug ccuuuauaua uagaauuaua aaaggguuug uaaauaauua caacagaugg 1440

ccuacuuuaa gaaaugcuau uguuuuaccc uuaagauggu uaacuuacua uaaacuaaac 1500

acuuauccuu cuuuguugga acuuacagaa agagauuuga uuguguuauc aggacuacgu 1560

uucuaucgug aguuucgguu gccuaaaaaa guggaucuug aaaugauuau aaaugauaaa 1620

gcuauaucac ccccuaaaaa uuugauaugg acuaguuucc cuagaaauua uaugccguca 1680

cacauacaaa acuauauaga acaugaaaaa uuaaaauuuu ccgagaguga uaaaucaaga 1740

agaguauuag aguauuauuu aagagauaac aaauucaaug aaugugauuu auacaacugu 1800

guaguuaauc aaaguuaucu caacaacccu aaucaugugg uaucauugac aggcaaagaa 1860

agagaacuca guguagguag aauguuugca augcaaccgg gaauguucag acagguucaa 1920

auauuggcag agaaaaugau agcugaaaac auuuuacaau ucuuuccuga aagucuuaca 1980

agauauggug aucuagaacu acaaaaaaua uuagaauuga aagcaggaau aaguaacaaa 2040

ucaaaucgcu acaaugauaa uuacaacaau uacauuagua agugcucuau caucacagau 2100

cucagcaaau ucaaucaagc auuucgauau gaaacgucau guauuuguag ugaugugcug 2160

gaugaacugc augguguaca aucucuauuu uccugguuac auuuaacuau uccucauguc 2220

acaauaauau gcacauauag gcaugcaccc cccuauauaa gagaucauau uguagaucuu 2280

aacaauguag augaacaaag uggauuauau agauaucaca ugggugguau ugaagggugg 2340

ugucaaaaac uauggaccau agaagcuaua ucacuauugg aucuaauauc ucucaaaggg 2400

aaauucucaa uuacugcuuu aauuaauggu gacaaucaau caauagauau aagcaaacca 2460

gucagacuca uggaagguca aacucaugcu caagcagauu auuugcuagc auuaaauagc 2520

cuuaaauuac uguauaaaga guaugcaggc auaggucaca aauuaaaagg aacugagacu 2580

uauauaucac gagauaugca auuuaugagu aaaacaauuc aacauaacgg uguauauuac 2640

ccugcuagua uaaagaaagu ccuaagagug ggaccgugga uaaacacuau acuugaugau 2700

uucaaaguga gucuagaauc uauagguagu uugacacaag aauuagaaua uagaggugaa 2760

agucuauuau gcaguuuaau auuuagaaau guaugguuau auaaucaaau ugcucuacaa 2820

uuaaaaaauc augcguuaug uaacaauaaa uuauauuugg acauauuaaa gguucugaaa 2880

cacuuaaaaa ccuuuuuuaa ucuugauaau auugauacag cauuaacauu guauaugaau 2940

uuacccaugu uauuuggugg uggugauccc aacuuguuau aucgaaguuu cuauagaaga 3000

acuccugauu uccucacaga ggcuauaguu cacucugugu ucauacuuag uuauuauaca 3060

aaccaugacu uaaaagauaa acuucaagau uugucagaug auagauugaa uaaguucuua 3120

acaugcauaa ucacguuuga caaaaacccu aaugcugaau ucguaacauu gaugagagau 3180

ccucaagcuu uagggucuga gagacaagcu aaaauuacua gugaaaucaa uagacuggca 3240

guuacagagg uuuugaguac agcuccaaac aaaauauucu ccaaaagugc acaacauuau 3300

accacuacag agauagaucu aaaugauauu augcaaaaua uagaaccuac auauccucac 3360

gggcuaagag uuguuuauga aaguuuaccc uuuuauaaag cagagaaaau aguaaaucuu 3420

auaucaggua caaaaucuau aacuaacaua cuggaaaaga cuucugccau agacuuaaca 3480

gauauugaua gagccacuga gaugaugagg aaaaacauaa cuuugcuuau aaggauacuu 3540

ccauuggauu guaacagaga uaaaagagaa auauugagua uggaaaaccu aaguauuacu 3600

gaauuaagca aauauguuag ggaaagaucu uggucuuuau ccaauauagu ugguguuaca 3660

ucacccagua ucauguauac aauggacauc aaauauacaa caagcacuau agcuaguggc 3720

auaauuauag agaaauauaa uguuaacagu uuaacacgug gugagagagg accaacuaaa 3780

ccauggguug guucaucuac acaagagaaa aaaacaaugc caguuuauaa uagacaaguu 3840

uuaaccaaaa aacaaagaga ucaaauagau cuauuagcaa aauuggauug gguguaugca 3900

ucuauagaua acaaggauga auucauggaa gaacucagca uaggaacccu uggguuaaca 3960

uaugaaaagg ccaaaaaauu auuuccacaa uauuuaagug ucaacuauuu gcaucgccuu 4020

acagucagua guagaccaug ugaauucccu gcaucaauac cagcuuauag aacaacaaau 4080

uaucacuuug acacuagccc uauuaaucgc auauuaacag aaaaguaugg ugaugaagau 4140

auugacauag uauuccaaaa cuguauaagc uuuggccuua gcuuaauguc aguaguagaa 4200

caauuuacua auguaugucc uaacagaauu auucucauac cuaagcuuaa ugagauacau 4260

uugaugaaac cucccauauu cacaggugau guugauauuc acaaguuaaa acaagugaua 4320

caaaaacagc auauguuuuu accagacaaa auaaguuuga cucaauaugu ggaauuauuc 4380

uuaaguaaca aaacacucaa aucuggaucu cauguuaauu cuaauuuaau auuggcacau 4440

aaaauaucug acuauuuuca uaauacuuac auuuuaagua cuaauuuagc uggacauugg 4500

auucuaauua uacaacuuau gaaagauucu aaagguauuu uugaaaaaga uuggggagag 4560

ggauauauaa cugaucauau guuuauuaau uugaaaguuu ucuucaaugc uuauaagacc 4620

uaucucuugu guuuucauaa agguuauggc aaagcaaaac uggaguguga uaugaacacu 4680

ucagaucuuc uauguguauu ggaauuaaua gacaguaguu auuggaaguc uaugucuaag 4740

guauuuuuag aacaaaaagu uaucaaauac auucuuagcc aagaugcaag uuuacauaga 4800

guaaaaggau gucauagcuu caaauuaugg uuucuuaaac gucuuaaugu agcagaauuu 4860

acaguuugcc cuuggguugu uaacauagau uaucauccaa cacauaugaa agcaauauua 4920

acuuauauag aucuuguuag aaugggauug auaaauauag auagaauaca cauuaaaaau 4980

aaacacaaau ucaaugauga auuuuauacu ucuaaucucu uuuacauuaa uuauaacuuc 5040

ucagauaaua cucaucuauu aacuaaacau auaaggauug cuaauucaga auuagaaaau 5100

aauuacaaca aauuauauca uccuacacca gaaacccuag agaauauacu agccaauccg 5160

auuaaaagua augacaaaaa gacacugaac gacuauugua uagguaaaaa uguugacuca 5220

auaauguuac cauuguuauc uaauaagaag cuuguuaaau cgucugcaau gauuagaacc 5280

aauuacagca aacaagaccu guacaaucua uucccuacgg uugugaucga uagaauuaua 5340

gaucauucag guaauacagc caaauccaac caacuuuaca cuacuacuuc ccaucaaaua 5400

ucuuuagugc acaauagcac aucacuuuau ugcaugcuuc cuuggcauca uauuaauaga 5460

uucaauuuug uauuuaguuc uacagguugu aaaauuagua uagaguauau uuuaaaagac 5520

cuuaaaauua aagauccuaa uuguauagca uucauaggug aaggagcagg gaauuuauua 5580

uugcguacag ugguggaacu ucauccugac auaagauaua uuuacagaag ucugaaagau 5640

ugcaaugauc auaguuuacc uauugaguuu uuaaggcuau acaauggaca uaucaacauu 5700

gauuauggug aaaauuugac cauuccugcu acagaugcaa ccaacaacau ucauuggucu 5760

uauuuacaua uaaaguuugc ugaaccuauc agucuuuuug uaugugaugc cgaauugccu 5820

guaacaguca acuggaguaa aauuauaaua gaauggagca agcauguaag aaaaugcaag 5880

uacuguuccu caguuaauaa auguacguua auaguaaaau aucaugcuca agaugauauu 5940

gauuucaaau uagacaauau aacuauauua aaaacuuaug uaugcuuagg caguaaguua 6000

aagggaucgg agguuuacuu aguccuuaca auagguccug caaauauauu uccaguauuu 6060

aauguaguac aaaaugcuaa auugauacua ucaagaacca aaaauuucau caugccuaag 6120

aaagcugaua aagagucuau ugaugcaaau auuaaaaguu ugauacccuu ucuuuguuac 6180

ccuauaacaa aaaaaggaau uaauacugca uugucaaaac uaaagagugu uguuagugga 6240

gauauacuau cauauucuau agcuggacgg aaugaaguuu ucagcaauaa acuuauaaau 6300

cauaagcaua ugaacaucuu aaagugguuc aaucauguuu uaaauuucag aucaacagaa 6360

cuaaacuaua accauuuaua uaugguagaa ucuacauauc cuuaccuaag ugaauuguua 6420

aacagcuuga caacuaauga acuuaaaaaa cugauuaaaa ucacagguag ucuguuauac 6480

aacuuucaua augaauaa 6498

<210> 18

<211> 585

<212> РНК

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 18

augucacgaa ggaauccuug caaauuugaa auucgagguc auugcuugaa ugguaagaga 60

ugucauuuua gucauaauua uuuugaaugg ccaccccaug cacugcucgu aagacaaaac 120

uuuauguuaa acagaauacu uaagucuaug gauaaaagua uagauaccuu aucagaaaua 180

aguggagcug cagaguugga cagaacagaa gaguaugcuc uugguguagu uggagugcua 240

gagaguuaua uaggaucaau aaauaauaua acuaaacaau cagcaugugu ugccaugagc 300

aaacuccuca cugaacucaa uagugaugau aucaaaaaac ugagagacaa ugaagagcua 360

aauucaccca agauaagagu guacaauacu gucauaucau auauugaaag caacaggaaa 420

aacaauaaac aaacuaucca ucuguuaaaa agauugccag cagacguauu gaagaaaacc 480

aucaaaaaca cauuggauau ccacaagagc auaaccauca acaacccaaa agaauuaacu 540

guuagugaua caaaugacca ugccaaaaau aaugauacua ccuga 585

<210> 19

<211> 273

<212> РНК

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 19

augaccaugc caaaaauaau gauacuaccu gacaaauauc cuuguaguau aacuuccaua 60

cuaauaacaa guagauguag agucacuaug uauaaucgaa agaacacacu auauuucaau 120

caaaacaacc caaauaacca uauguacuca ccgaaucaaa cauucaauga aauccauugg 180

accucacaag acuugauuga cacaauucaa aauuuucuac agcaucuagg uguuauugag 240

gauauauaua caauauauau auuaguguca uaa 273

<210> 20

<211> 726

<212> РНК

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 20

auggaaaagu uugcuccuga auuccaugga gaagaugcaa acaacagggc uacuaaauuc 60

cuagaaucaa uaaagggcaa auucacauca ccuaaagauc ccaagaaaaa agauaguauc 120

auaucuguca acucaauaga uauagaagua accaaagaaa gcccuauaac aucaaauuca 180

accauuauua acccaacaaa ugagacagau gauaaugcag ggaacaagcc caauuaucaa 240

agaaaaccuc uaguaaguuu caaagaagac ccuauaccaa gugauaaucc cuuuucaaaa 300

cuauacaaag aaaccauaga gacauuugau aacaaugaag aagaaucuag cuauucauau 360

gaagaaauaa augaucagac gaacgauaau auaacugcaa gauuagauag gauugaugaa 420

aaauuaagug aaauacuagg aaugcuucac acauuaguag uagcaagugc aggaccuaca 480

ucugcuaggg augguauaag agaugccaug guugguuuaa gagaagaaau gauagaaaaa 540

aucagaacug aagcauuaau gaccaaugac agauuagaag cuauggcaag acucaggaau 600

gaggaaagug aaaagauggc aaaagacaca ucagaugaag ugucucucaa uccaacauca 660

gagaaauuga acaaccuguu ggaagggaau gauagugaca augaucuauc acuugaagau 720

uucuga 726

<210> 21

<211> 420

<212> РНК

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 21

augggcagca auucguugag uaugauaaaa guuagauuac aaaauuuguu ugacaaugau 60

gaaguagcau uguuaaaaau aacaugcuau acugacaaau uaauacauuu aacuaaugcu 120

uuggcuaagg cagugauaca uacaaucaaa uugaauggca uuguguuugu gcauguuauu 180

acaaguagug auauuugccc uaauaauaau auuguaguaa aauccaauuu cacaacaaug 240

ccagugcuac aaaauggagg uuauauaugg gaaaugaugg aauuaacaca uugcucucaa 300

ccuaaugguc uaauagauga caauugugaa auuaaauucu ccaaaaaacu aagugauuca 360

acaaugacca auuauaugaa ucaauuaucu gaauuacuug gauuugaucu uaauccauaa 420

<210> 22

<211> 375

<212> РНК

<213> Респираторно-синцитиальный вирус

<400> 22

auggacacaa cccacaauga uaccacacca caaagacuga ugaucacaga caugagaccg 60

uugucacuug agacuacaau aacaucacua accagagaca ucauaacaca cagauuuaua 120

uacuuaauaa aucaugaaug cauagugaga aaacuugaug aaagacaggc cacauuuaca 180

uuccugguca acuaugaaau gaaacuauug cacaaaguag gaagcacuaa auauaaaaaa 240

uauacugaau acaacacaaa auauggcacu uucccuaugc cgauauucau caaucaugau 300

ggguucuuag aaugcauugg cauuaagccu acaaagcaua cucccauaau auacaaguau 360

gaucucaauc cauag 375

<210> 23

<211> 42

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 23

ggcgctgcct acggaggtgg cagccatctc cttctcggca tc 42

<210> 24

<211> 186

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 24

catcacattt aaaagcatct cagcctacca tgagaataag agaaagaaaa tgaagatcaa 60

aagcttattc atctgttttt ctttttcgtt ggtgtaaagc caacaccctg tctaaaaaac 120

ataaatttct ttaatcattt tgcctctttt ctctgtgctt caattaataa aaaatggaaa 180

gaatct 186

<210> 25

<211> 186

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 25

catcacattt aaaagcatct cagcctacca tgagaataag agaaagaaaa tgaagatcaa 60

tagcttattc atctcttttt ctttttcgtt ggtgtaaagc caacaccctg tctaaaaaac 120

ataaatttct ttaatcattt tgcctctttt ctctgtgctt caattaataa aaaatggaaa 180

gaacct 186

<210> 26

<211> 110

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 26

gctggagcct cggtggccat gcttcttgcc ccttgggcct ccccccagcc cctcctcccc 60

ttcctgcacc cgtacccccg tggtctttga ataaagtctg agtgggcggc 110

<210> 27

<211> 108

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 27

gctggagcct cggtagccgt tcctcctgcc cgctgggcct cccaacgggc cctcctcccc 60

tccttgcacc ggcccttcct ggtctttgaa taaagtctga gtgggcag 108

<210> 28

<211> 132

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 28

gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60

taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120

tattttcatt gc 132

<210> 29

<211> 44

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> центральная связывающая альфа-комплекс область 3’UTR гена альфа-глобина (muag)

<400> 29

gcccgatggg cctcccaacg ggccctcctc ccctccttgc accg 44

<210> 30

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> наиболее предпочтительная последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля»

<400> 30

caaaggctct tttcagagcc acca 24

<210> 31

<211> 1942

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> РСВ-F «длинный» (GC) R1691

<400> 31

gggagaaagc uuaccaugga gcugcccauc cucaaggcca acgccaucac caccauccug 60

gcggccguga cguucugcuu cgccagcucc cagaacauca ccgaggaguu cuaccagagc 120

accugcuccg ccgucagcaa gggcuaccug uccgcccucc ggaccgggug guacacgagc 180

gugaucacca ucgagcuguc caacaucaag gagaacaagu gcaacggcac cgacgcgaag 240

gugaagcuga ucaaccagga gcucgacaag uacaagaacg ccgucaccga gcugcagcug 300

cucaugcaga gcacgaccgc cgccaacaac cgcgcgcggc gcgagcugcc gcgguucaug 360

aacuacaccc ugaacaacac caagaagacg aacgugaccc ucuccaagaa gcgcaagcgg 420

cgcuuccugg gguuccugcu cggcgugggg agcgccaucg ccuccggcau cgccgucagc 480

aaggugcugc accuggaggg cgaggugaac aagaucaagu ccgcccuccu gagcaccaac 540

aaggcggucg ugucccugag caacggggug uccguccuca ccagcaaggu gcuggaccug 600

aagaacuaca ucgacaagca gcuccugccc aucgugaaca agcaguccug ccggaucagc 660

aacaucgaga cggucaucga guuccagcag aagaacaacc gccugcucga gaucacccgg 720

gaguucagcg ugaacgccgg cgugaccacc cccgucucca cguacaugcu gaccaacagc 780

gagcugcucu cccugaucaa cgacaugccc aucaccaacg accagaagaa gcugaugagc 840

aacaacgugc agaucgugcg ccagcagucc uacagcauca uguccaucau caaggaggag 900

guccucgccu acguggugca gcugccgcug uacgggguca ucgacacccc cugcuggaag 960

cuccacacga gcccccugug caccaccaac accaaggagg gcuccaacau cugccugacg 1020

cggaccgacc gcggguggua cugcgacaac gccggcagcg uguccuucuu cccccaggcc 1080

gagaccugca agguccagag caaccgggug uucugcgaca ccaugaacuc ccucacgcug 1140

ccgagcgagg ugaaccugug caacgucgac aucuucaacc ccaaguacga cugcaagauc 1200

augaccucca agaccgacgu gagcuccagc gugaucaccu cccucggcgc gaucgucagc 1260

ugcuacggga agacgaagug caccgccagc aacaagaacc gcggcaucau caagaccuuc 1320

uccaacgggu gcgacuacgu gagcaacaag ggcguggaca ccgucuccgu gggcaacacc 1380

cuguacuacg ugaacaagca ggaggggaag agccuguacg ucaagggcga gcccaucauc 1440

aacuucuacg acccccucgu guucccgucc gacgaguucg acgccagcau cucccaggug 1500

aacgagaaga ucaaccagag ccuggccuuc auccggaagu ccgacgagcu gcugcaccac 1560

gucaacgccg ggaagagcac gaccaacauc augaucacca ccaucaucau cgugaucauc 1620

gugauccucc ugucccugau cgcggucggc cuccugcugu acugcaaggc ccgcagcacg 1680

cccgugaccc ucuccaagga ccagcugagc gggaucaaca acaucgccuu cuccaacuga 1740

ggacuaguua uaagacugac uagcccgaug ggccucccaa cgggcccucc uccccuccuu 1800

gcaccgagau uaauaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860

aaaaaaaaaa aaaaaaaaug cauccccccc cccccccccc cccccccccc ccccaaaggc 1920

ucuuuucaga gccaccagaa uu 1942

<210> 32

<211> 2107

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> РСВ-F «длинный» (GC) R2510

<400> 32

ggggcgcugc cuacggaggu ggcagccauc uccuucucgg caucaagcuu accauggagc 60

ugcccauccu caaggccaac gccaucacca ccauccuggc ggccgugacg uucugcuucg 120

ccagcuccca gaacaucacc gaggaguucu accagagcac cugcuccgcc gucagcaagg 180

gcuaccuguc cgcccuccgg accggguggu acacgagcgu gaucaccauc gagcugucca 240

acaucaagga gaacaagugc aacggcaccg acgcgaaggu gaagcugauc aaccaggagc 300

ucgacaagua caagaacgcc gucaccgagc ugcagcugcu caugcagagc acgaccgccg 360

ccaacaaccg cgcgcggcgc gagcugccgc gguucaugaa cuacacccug aacaacacca 420

agaagacgaa cgugacccuc uccaagaagc gcaagcggcg cuuccugggg uuccugcucg 480

gcguggggag cgccaucgcc uccggcaucg ccgucagcaa ggugcugcac cuggagggcg 540

aggugaacaa gaucaagucc gcccuccuga gcaccaacaa ggcggucgug ucccugagca 600

acgggguguc cguccucacc agcaaggugc uggaccugaa gaacuacauc gacaagcagc 660

uccugcccau cgugaacaag caguccugcc ggaucagcaa caucgagacg gucaucgagu 720

uccagcagaa gaacaaccgc cugcucgaga ucacccggga guucagcgug aacgccggcg 780

ugaccacccc cgucuccacg uacaugcuga ccaacagcga gcugcucucc cugaucaacg 840

acaugcccau caccaacgac cagaagaagc ugaugagcaa caacgugcag aucgugcgcc 900

agcaguccua cagcaucaug uccaucauca aggaggaggu ccucgccuac guggugcagc 960

ugccgcugua cggggucauc gacacccccu gcuggaagcu ccacacgagc ccccugugca 1020

ccaccaacac caaggagggc uccaacaucu gccugacgcg gaccgaccgc gggugguacu 1080

gcgacaacgc cggcagcgug uccuucuucc cccaggccga gaccugcaag guccagagca 1140

accggguguu cugcgacacc augaacuccc ucacgcugcc gagcgaggug aaccugugca 1200

acgucgacau cuucaacccc aaguacgacu gcaagaucau gaccuccaag accgacguga 1260

gcuccagcgu gaucaccucc cucggcgcga ucgucagcug cuacgggaag acgaagugca 1320

ccgccagcaa caagaaccgc ggcaucauca agaccuucuc caacgggugc gacuacguga 1380

gcaacaaggg cguggacacc gucuccgugg gcaacacccu guacuacgug aacaagcagg 1440

aggggaagag ccuguacguc aagggcgagc ccaucaucaa cuucuacgac ccccucgugu 1500

ucccguccga cgaguucgac gccagcaucu cccaggugaa cgagaagauc aaccagagcc 1560

uggccuucau ccggaagucc gacgagcugc ugcaccacgu caacgccggg aagagcacga 1620

ccaacaucau gaucaccacc aucaucaucg ugaucaucgu gauccuccug ucccugaucg 1680

cggucggccu ccugcuguac ugcaaggccc gcagcacgcc cgugacccuc uccaaggacc 1740

agcugagcgg gaucaacaac aucgccuucu ccaacugagg acuagugcau cacauuuaaa 1800

agcaucucag ccuaccauga gaauaagaga aagaaaauga agaucaauag cuuauucauc 1860

ucuuuuucuu uuucguuggu guaaagccaa cacccugucu aaaaaacaua aauuucuuua 1920

aucauuuugc cucuuuucuc ugugcuucaa uuaauaaaaa auggaaagaa ccuagaucua 1980

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040

aaaugcaucc cccccccccc cccccccccc ccccccccca aaggcucuuu ucagagccac 2100

cagaauu 2107

<210> 33

<211> 2044

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> РСВ-Fdel554-574 «длинный» (GC) R2821

<400> 33

ggggcgcugc cuacggaggu ggcagccauc uccuucucgg caucaagcuu accauggagc 60

ugcccauccu caaggccaac gccaucacca ccauccuggc ggccgugacg uucugcuucg 120

ccagcuccca gaacaucacc gaggaguucu accagagcac cugcuccgcc gucagcaagg 180

gcuaccuguc cgcccuccgg accggguggu acacgagcgu gaucaccauc gagcugucca 240

acaucaagga gaacaagugc aacggcaccg acgcgaaggu gaagcugauc aaccaggagc 300

ucgacaagua caagaacgcc gucaccgagc ugcagcugcu caugcagagc acgaccgccg 360

ccaacaaccg cgcgcggcgc gagcugccgc gguucaugaa cuacacccug aacaacacca 420

agaagacgaa cgugacccuc uccaagaagc gcaagcggcg cuuccugggg uuccugcucg 480

gcguggggag cgccaucgcc uccggcaucg ccgucagcaa ggugcugcac cuggagggcg 540

aggugaacaa gaucaagucc gcccuccuga gcaccaacaa ggcggucgug ucccugagca 600

acgggguguc cguccucacc agcaaggugc uggaccugaa gaacuacauc gacaagcagc 660

uccugcccau cgugaacaag caguccugcc ggaucagcaa caucgagacg gucaucgagu 720

uccagcagaa gaacaaccgc cugcucgaga ucacccggga guucagcgug aacgccggcg 780

ugaccacccc cgucuccacg uacaugcuga ccaacagcga gcugcucucc cugaucaacg 840

acaugcccau caccaacgac cagaagaagc ugaugagcaa caacgugcag aucgugcgcc 900

agcaguccua cagcaucaug uccaucauca aggaggaggu ccucgccuac guggugcagc 960

ugccgcugua cggggucauc gacacccccu gcuggaagcu ccacacgagc ccccugugca 1020

ccaccaacac caaggagggc uccaacaucu gccugacgcg gaccgaccgc gggugguacu 1080

gcgacaacgc cggcagcgug uccuucuucc cccaggccga gaccugcaag guccagagca 1140

accggguguu cugcgacacc augaacuccc ucacgcugcc gagcgaggug aaccugugca 1200

acgucgacau cuucaacccc aaguacgacu gcaagaucau gaccuccaag accgacguga 1260

gcuccagcgu gaucaccucc cucggcgcga ucgucagcug cuacgggaag acgaagugca 1320

ccgccagcaa caagaaccgc ggcaucauca agaccuucuc caacgggugc gacuacguga 1380

gcaacaaggg cguggacacc gucuccgugg gcaacacccu guacuacgug aacaagcagg 1440

aggggaagag ccuguacguc aagggcgagc ccaucaucaa cuucuacgac ccccucgugu 1500

ucccguccga cgaguucgac gccagcaucu cccaggugaa cgagaagauc aaccagagcc 1560

uggccuucau ccggaagucc gacgagcugc ugcaccacgu caacgccggg aagagcacga 1620

ccaacaucau gaucaccacc aucaucaucg ugaucaucgu gauccuccug ucccugaucg 1680

cggucggccu ccugcuguac ugcaaggccc gcugaggacu agugcaucac auuuaaaagc 1740

aucucagccu accaugagaa uaagagaaag aaaaugaaga ucaauagcuu auucaucucu 1800

uuuucuuuuu cguuggugua aagccaacac ccugucuaaa aaacauaaau uucuuuaauc 1860

auuuugccuc uuuucucugu gcuucaauua auaaaaaaug gaaagaaccu agaucuaaaa 1920

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980

ugcauccccc cccccccccc cccccccccc ccccccaaag gcucuuuuca gagccaccag 2040

aauu 2044

<210> 34

<211> 1558

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> РСВ-N (GC) R2831

<400> 34

ggggcgcugc cuacggaggu ggcagccauc uccuucucgg caucaagcuu accauggccc 60

ugagcaaggu gaagcucaac gacacccuga acaaggacca gcugcucucc agcuccaagu 120

acaccaucca gcgcagcacg ggcgacucca ucgacacccc caacuacgac guccagaagc 180

acaucaacaa gcugugcggg augcugcuca ucaccgagga cgccaaccac aaguucaccg 240

gccugaucgg gaugcuguac gcgaugagcc ggcucggccg cgaggacacg aucaagaucc 300

ugcgggacgc cggguaccac gugaaggcca acggcgugga cgucaccacc caccgccagg 360

acaucaacgg caaggagaug aaguucgagg ugcugacccu cgccucccug acgaccgaga 420

uccagaucaa caucgagauc gagagccgga aguccuacaa gaagaugcug aaggagaugg 480

gggagguggc cccggaguac cgccacgaca gccccgacug cggcaugauc auccucugca 540

ucgcggcccu ggucaucacc aagcuggccg ccggggaccg guccggccuc accgcgguga 600

uccgccgggc caacaacgug cugaagaacg agaugaagcg cuacaagggg cugcucccca 660

aggacaucgc caacagcuuc uacgaggucu ucgagaagca cccccacuuc aucgacgugu 720

ucgugcacuu cggcaucgcc caguccagca cgcggggcgg gucccgcguc gagggcaucu 780

ucgccgggcu guucaugaac gcguacggcg ccggccaggu gaugcugcgg uggggcgugc 840

ucgccaagag cgucaagaac aucaugcugg ggcacgccuc cgugcaggcc gagauggagc 900

agguggucga gguguacgag uacgcgcaga agcugggcgg cgaggccggg uucuaccaca 960

uccucaacaa cccgaaggcc agccugcugu cccucaccca guucccgcac uucagcagcg 1020

ugguccuggg gaacgccgcc ggccugggga ucaugggcga guaccgcggg accccgcgga 1080

accaggaccu cuacgacgcg gccaaggccu acgccgagca gcugaaggag aacggcguga 1140

ucaacuacuc cgugcuggac cucaccgccg aggagcugga ggcgaucaag caccagcuga 1200

accccaagga caacgacguc gagcucugag gacuagugca ucacauuuaa aagcaucuca 1260

gccuaccaug agaauaagag aaagaaaaug aagaucaaua gcuuauucau cucuuuuucu 1320

uuuucguugg uguaaagcca acacccuguc uaaaaaacau aaauuucuuu aaucauuuug 1380

ccucuuuucu cugugcuuca auuaauaaaa aauggaaaga accuagaucu aaaaaaaaaa 1440

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaugcauc 1500

cccccccccc cccccccccc cccccccccc aaaggcucuu uucagagcca ccagaauu 1558

<210> 35

<211> 967

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> РСВ-M2-1 (GC) R2833

<400> 35

ggggcgcugc cuacggaggu ggcagccauc uccuucucgg caucaagcuu accaugagcc 60

gccggaaccc cugcaaguuc gagauccgcg gccacugccu gaacgggaag cggugccacu 120

ucucccacaa cuacuucgag uggccgcccc acgcccuccu ggugcgccag aacuucaugc 180

ugaaccggau ccucaagagc auggacaagu ccaucgacac ccugagcgag aucuccggcg 240

ccgcggagcu ggaccgcacc gaggaguacg cccucggggu cgugggcgug cuggagagcu 300

acaucggguc caucaacaac aucacgaagc agagcgccug cgucgccaug uccaagcugc 360

ucaccgagcu gaacagcgac gacaucaaga agcugcggga caacgaggag cucaacuccc 420

ccaagauccg cguguacaac accgugauca gcuacaucga guccaaccgg aagaacaaca 480

agcagaccau ccaccugcug aagcgccucc ccgccgacgu ccugaagaag acgaucaaga 540

acacccugga cauccacaag agcaucacca ucaacaaccc gaaggagcuc accguguccg 600

acacgaacga ccacgcgaag aacaacgaca ccaccugagg acuagugcau cacauuuaaa 660

agcaucucag ccuaccauga gaauaagaga aagaaaauga agaucaauag cuuauucauc 720

ucuuuuucuu uuucguuggu guaaagccaa cacccugucu aaaaaacaua aauuucuuua 780

aucauuuugc cucuuuucuc ugugcuucaa uuaauaaaaa auggaaagaa ccuagaucua 840

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900

aaaugcaucc cccccccccc cccccccccc ccccccccca aaggcucuuu ucagagccac 960

cagaauu 967

<210> 36

<211> 75

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 36

gcggctcggc cattttgtcc cagtcagtcc ggaggctgcg gctgcagaag taccgcctgc 60

ggagtaactg caaag 75

<210> 37

<211> 24

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля»

<400> 37

caaaggcucu uuucagagcc acca 24

<---