Результат интеллектуальной деятельности: ПРИМЕНЕНИЕ ШТАММА ВИРУСА ГРИППА А/17/НОВАЯ КАЛЕДОНИЯ/99/145 (Н1N1) В КАЧЕСТВЕ ДОНОРА АТТЕНУАЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ ПОДТИПА Н2N2, ВАКЦИННЫЕ ШТАММЫ ВИРУСА ГРИППА А/17/КАЛИФОРНИЯ/66/4412 (Н2N2) И А/17/ТОКИО/67/912 (Н2N2) (ВАРИАНТЫ).

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики гриппа среди взрослых и детей живой интраназальной гриппозной вакциной (ЖГВ). Заявляемые штаммы A/17/Калифорния/66/4412 (H2N2) и A/17/Токио/67/912 (H2N2) (Ortomyxoviridae, род Influenza) по всем характеристикам пригодны для производства ЖГВ в случае возвращения вирусов подтипа A(H2N2) в циркуляцию среди людей. Эти вакцинные штаммы были получены с помощью донора аттенуации - штамма A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1), ранее не используемого в качестве донора, известного как вакцинный штамм.

Прототипом полученных на основе нового донора аттенуации A/17/Новая Каледония/99/145 вакцинных штаммов является известный холодоадаптированный штамм вируса гриппа A/Москва/21/17/65 (H2N2), входивший в состав живой гриппозной вакцины для детей в 1967 году [Александрова Г.И., Микуцкая Б.А., Сиротенко Е.А. и др. Итоги изучения специализированного варианта живой гриппозной вакцины для иммунизации детей дошкольного и младшего школьного возраста // Вестник АМН СССР. - 1968. - №9. - С.41-45]. Данный вакцинный штамм был приготовлен серийными пассажами при сниженной температуре эпидемического вируса, выделенного в 1965 году.

Однако в последние годы циркуляции (1966-1967) вирусы H2N2 претерпели значительные антигенные изменения, и вакцинный штамм A/Москва/21/17/65 (H2N2), в случае возвращения в человеческую популяцию вирусов, циркулировавших в конце H2N2 волны, не сможет вызвать защитную реакцию у привитых людей [Lindstrom SE, Сох NJ, Klimov A. Genetic analysis of human H2N2 and early H3N2 influenza viruses, 1957-1972: evidence for genetic divergence and multiple reassortment events // Virology. - 2004. - Vol.328. - p.101-119].

Известно, что в конце эпидемического цикла H2N2 циркулирующие вирусы разделились на две ветви, значительно различающиеся по антигенным свойствам.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение потенциально пандемических вакцинных штаммов для взрослых и детей с антигенной структурой вирусов H2N2, действовавших в конце эпидемического цикла - вирусов A/Калифорния/1/66 (H2N2) и A/Токио/3/67 (H2N2), принадлежащих к двум разным ветвям вирусов H2N2 конца эпидемической волны 1966-1967 гг.

Вакцинные штаммы были созданы, это штаммы A/17/Калифорния/66/4412 (H2N2) и A/17/Токио/67/912 (H2N2). Они получены методом генетической реассортации эпидемических вирусов A/Калифорния/1/66 (H2N2) и A/Токио/3/67 (H2N2) со специально для этого подобранным донором аттенуации A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1), с последующей селекцией при пониженной до 26°C температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Донор аттенуации A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1) представляет собой вакцинный штамм живой гриппозной вакцины, используемый по новому назначению.

Начиная с 1977 года вакцинные штаммы для живой гриппозной вакцины готовятся методом генетической реассортации эпидемического вируса с холодоадаптированным донором аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) с последующей селекцией вакцинного реассортанта при пониженной до 26°C температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол. - 1977. - №4. - С.387-395.]. Однако гипериммунная сыворотка к донору аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) перекрестно реагирует с эпидемическими A(H2N2) вирусами, в том числе с вирусами A/Калифорния/1/66 (H2N2) и A/Токио/3/67 (H2N2), не позволяя образоваться вакцинным реассортантам. Поэтому для получения вакцинных штаммов с антигенной структурой A/Калифорния/1/66 (H2N2) и A/Токио/3/67 (H2N2) в качестве холодоадаптированного донора аттенуации был выбран штамм A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1).

Вакцинный реассортантный штамм A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1) использовали в приготовлении живых гриппозных вакцин, моновалентных и поливалентных [Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Климов А.И. Штамм вируса гриппа А/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых. Патент РФ №2183672 от 20.06.2002. - Опубл. БИ 2002. - №17]. Он был получен методом генетической реассортации эпидемического вируса A/Новая Каледония/20/99 (H1N1) и донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2), унаследовав шесть внутренних генов от донора и поверхностные антигены гемагглютинин и нейраминидазу от эпидемического вируса. Штамм A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1) использовался для активной иммунизации взрослых и детей в период с 2000 по 2008 гг.

Нами был использован данный вирус в качестве специального донора аттенуации для переноса унаследованных шести внутренних генов холодоадаптированного вируса A/Ленинград/134/17/57 (H2N2), обеспечивающих безвредность вакцинного штамма, в геном полученных реассортантов A/17/Калифорния/66/4412 (H2N2) и A/17/Токио/67/912 (H2N2).

Поскольку в процессе селекции заявляемых вакцинных реассортантов использовалась гипериммунная сыворотка к вирусу A/Новая Каледония/20/99 (H1N1), перекрестного подавления антигенов A(H2N2) не происходило.

Таким образом, с помощью применения ранее известного вакцинного штамма в качестве донора аттенуации удалось создать новые вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины с характеристиками, соответствующими требованиям Фармакопейной статьи на живую гриппозную вакцину для интраназального применения.

Пример выполнения

Вакцинный штамм A/17/Калифорния/66/4412 (H2N2) получен методом генетической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах эпидемического вируса A/Калифорния/1/66 (H2N2) с холодоадаптированным температурочувствительным донором аттенуации - известным вакцинным штаммом A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1), с последующей селекцией при пониженной до 26°C температуре инкубации в присутствии антисыворотки к вирусу A/Новая Каледония/20/99 (H1N1). Было установлено, что в результате реассортации вакцинный штамм унаследовал шесть внутренних генов от донора аттенуации A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1), который в свою очередь унаследовал эти гены от известного, хорошо охарактеризованного холодоадаптированного донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) [Патент РФ №2183672 от 20.06.2002. - Опубл. БИ 2002. - №17; Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.].

Основными маркерами аттенуации вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины являются их температурочувствительность (ts фенотип) и холодоадаптированность (ca фенотип), благодаря которым вакцинный вирус не размножается в нижних отделах респираторного тракта, но при этом активно репродуцируется в верхних дыхательных путях, вызывая иммунную защиту у привитых людей. Именно эти маркеры характеризуют вакцинные свойства штаммов.

Вакцинный штамм A/17/Калифорния/66/4412 (H2N2) является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°C и 39°C составляет 6,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°C и 26°C равна 3,0 lg ЭИД₅₀/0,2 мл).

Ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА идентичен вирусу A/Калифорния/1/66 (H2N2), антисывороткой к которому он полностью нейтрализуется.

Методом полногеномного секвенирования установлено, что вакцинный штамм A/17/Калифорния/66/4412 (H2N2) унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние белки (PB1, PB2, PA, NP, M, NS), от донора аттенуации A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1). Поверхностные белки гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA) унаследованы от эпидемического вируса A/Калифорния/1/66 (H2N2).

Таким образом, представленный вакцинный штамм A/17/Калифорния/66/4412 (H2N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса A/Калифорния/1/66 (H2N2), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, унаследованной от донора аттенуации и его характеризующей.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

Таким образом, вакцинный штамм A/17/Калифорния/66/4412 (H2N2) по биологическим свойствам, подтверждающим его аттенуацию, и составу генома соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения у взрослых и детей.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33-34°C в течение 48 часов - 8,2 lg ЭИД₅₀/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:512.

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Пример получения вакцинного штамма A/17/Калифорния/66/4412 (H2N2) представлен в прилагаемом паспорте.

Штамм депонирован в коллекции Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под №2650.

Вакцинный штамм A/17/Токио/67/912 (H2N2) получен методом генетической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах эпидемического вируса А/Токио/3/67 (H2N2) с холодоадаптированным температурочувствительным донором аттенуации A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1) с последующей селекцией при пониженной до 26°C температуре инкубации в присутствии антисыворотки к вирусу A/Новая Каледония/20/99 (H1N1).

Было установлено, что в результате реассортации вакцинный штамм унаследовал шесть внутренних генов от донора аттенуации A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1), который в свою очередь унаследовал эти гены от известного, хорошо охарактеризованного холодоадаптированного донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) [Патент РФ №2183672 от 20.06.2002. - Опубл. БИ 2002. - №17; Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.].

Вакцинный штамм A/17/Токио/67/912 (H2N2) является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°C и 39°C составляет 6,2 lg ЭИД₅₀/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°C и 26°C равна 3,1 lg ЭИД₅₀/0,2 мл).

Ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (HA) - в РТГА идентичен вирусу A/Токио/3/67 (H2N2), антисывороткой к которому он полностью нейтрализуется.

Методом полногеномного секвенирования установлено, что вакцинный штамм A/17/Токио/67/912 (H2N2) унаследовал шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, PA, NP, М, NS), от донора аттенуации A/17/Новая Каледония/99/145 (H1N1). Поверхностные белки гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA) унаследованы от эпидемического вируса A/Токио/3/67 (H2N2).

Таким образом, представленный вакцинный штамм A/17/Токио/67/912 (H2N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса A/Токио/3/67 (H2N2), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, унаследованной от донора аттенуации и его характеризующей.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

Таким образом, вакцинный штамм A/17/Токио/67/912 (H2N2) по биологическим свойствам, подтверждающим его аттенуацию, и составу генома соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения у взрослых и детей.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33-34°C в течение 48 часов - 9,5 lg ЭИД₅₀/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:256.

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Пример получения вакцинного штамма A/17/Токио/67/912 (H2N2) представлен в прилагаемом паспорте.

Штамм депонирован в коллекции Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под №2651.

Пример 1. РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ И ЗАЩИТНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ H2N2 В ЭКСПЕРИМЕНТАХ НА ХОРЬКАХ

Иммуногенность вакцинных штаммов H2N2

Иммуногенность вакцинных штаммов A/17/Калифорния/66/4412 (H2N2) (17/Кал/4412) и A/17/Токио/67/912 (H2N2) (17/Ток/912) оценивали путем однократной иммунизации хорьков (12 животных в группе) вакцинными штаммами, взятыми в дозе 10⁶ ТЦИД₅₀. Контрольные животные получали препарат плацебо. Забор образцов сывороток крови проводили на 14 и 21 день после вакцинации, и титры антигемагглютинирующих антител выявляли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В качестве антигенов в РТГА использовали эпидемические вирусы A/Калифорния/1/66 (H2N2) и А/Токио/3/67 (H2N2). Из таблицы 1 видно, что иммунизация вакцинными штаммами приводила к формированию гуморальных антител не только против гомологичного вируса, но и против гетерологичного штамма. Так, однократное введение вакцинного штамма A/17/Калифорния/99/365 (H2N2) вызывало формирование высоких уровней антител и к гомологичному вирусу A/Калифорния/1/66 (H2N2) (СГТ>1600), и к гетерологичному штамму A/Токио/3/67 (H2N2) (СГТ составили 200-450). Иммунный ответ, выработанный хорьками на иммунизацию вакцинным штаммом A/17/Токио/67/912 (H2N2), также был кросс-реактивным: титры гуморальных антител как к гомологичному вирусу A/Токио/3/67 (H2N2), так и к гетерологичному штамму A/Калифорния/1/66 (H2N2) достигали значений 1:427 (Таблица 1). Животные контрольной группы не вырабатывали антитела к вирусам H2N2.

Защитная эффективность вакцинных штаммов H2N2

Оценку защитной эффективности вакцинных штаммов A/17/Калифорния/66/4412 (H2N2) (17/Кал/4412) и A/17/Токио/67/912 (H2N2) (17/Ток/912) осуществляли посредством экспериментального заражения вакцинированных животных эпидемическими вирусами A/Калифорния/1/66 (H2N2) и A/Токио/3/67 (H2N2), взятыми в дозе 10⁶ ТЦИД₅₀, через 21 день после иммунизации. В каждой группе было использовано по 6 животных. На 2 и 5 сутки после заражения оценивали интенсивность выделения вируса из мазков из зева. Кроме того, через 5 дней после заражения хорьков забивали и определяли репродукцию вируса в тканях носовых ходов. В таблице 2 приведены данные о выделении вирусов после экспериментального заражения иммунизированных животных, по сравнению с контрольной группой (иммунизация PBS). Из таблицы 2 видно, что эпидемический вирус выделялся из мазков из зева хорьков, иммунизированных вакцинными штаммами 17/Кал/4412 и 17/Ток/912, в значительно меньших титрах, чем у животных, получивших препарат плацебо. Особенно заметно снижение титров вирусов на 5 сутки после экспериментального заражения (снижение на 2,0-2,8 IgТЦИД₅₀/мл). Защитный эффект вакцинации наблюдался также при анализе репродукции вируса в тканях носовых ходов животных. Так, снижение титра вируса в носовых ходах иммунизированных животных снижался по сравнению с контрольной группой в среднем на 3-4 IgТЦИД₅₀/мл, т.е. в 1000-10000 раз. Важно отметить, что вакцинные штаммы 17/Кал/4412 и 17/Ток/912 защищали животных одинаково эффективно как против гомологичного вируса, так и против гетерологичного штамма, что свидетельствует об их способности к перекрестной защите.

Защитную эффективность вакцинных штаммов A/17/Калифорния/66/4412 (H2N2) и A/17/Токио/67/912 (H2N2) оценивали также и в гистологических исследованиях тканей носовых ходов иммунизированных и контрольных животных после экспериментального заражения эпидемическими вирусами A/Калифорния/1/66 (H2N2) и A/Токио/3/67 (H2N2). Результаты исследований представлялись в двух вариантах: 1) повреждение тканей оценивали по 5-балльной шкале: отсутствие повреждений принималось за 0 баллов, тогда как наиболее сильные повреждения (полное отсутствие выстилающего эпителия) принимались за 5 баллов; 2) площадь поврежденной поверхности респираторного эпителия выражали в процентном отношении. В таблице 2 представлены средние данные гистологических исследований по 6 хорькам в каждой группе. Из таблицы видно, что респираторный эпителий носовых ходов иммунизированных животных был в значительно меньшей степени поврежден, чем у животных группы плацебо (p<0,05). Площадь повреждений эпителия носовых ходов также достоверно снижалась у хорьков, привитых вакцинными штаммами 17/Кал/4412 и 17/Ток/912, по сравнению с животными группы плацебо.

Очевидно, что иммунизация хорьков вакцинными штаммами A/17/Калифорния/66/4412 (H2N2) и A/17/Токио/67/912 (H2N2) защищала животных от размножения вируса и повреждений эпителиальных тканей верхних дыхательных путей, вызванных заражением как гомологичным, так и гетерологичным эпидемическим вирусом H2N2.

Характеристики полученных вакцинных штаммов соответствуют требованиям Фармакопейной статьи ФСП 42-0417-4097-03 на живую гриппозную вакцину для интраназального применения у взрослых и детей, поэтому заявляемые штаммы обладают, помимо новизны и изобретательского уровня, техническим результатом, т.е. пригодны для производства живой гриппозной вакцины.