Результат интеллектуальной деятельности: Олигонуклеотиды для определения 12FAB серотипа Streptococcus pneumoniae

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к определению 12FAB серотипа Streptococcus pneumoniae с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РРВ) и может использоваться для идентификации возбудителей пневмококковых инфекций (ПИ) и оценки эффективности проводимых иммунопрофилактических мероприятий.

S. pneumoniae является грамположительным анаэробным видом бактерий. В зависимости от химических свойств полисахаридной капсулы выделяют около 50 серогрупп, образующих не менее 100 серотипов, многие из которых ассоциированы с инвазивными ПИ. Важным элементом эпидемиологического надзора за пневмококковыми инфекциями является микробиологический мониторинг, включающий антигенную и генетическую характеристику возбудителей ПИ, а также данные о чувствительности к антибиотикам. Антигенная характеристика возбудителей заключается в определении серотипов, что позволяет оценить эффективность существующих поливалентных вакцин. В России широкое применение получили 13-валентная конъюгированная пневмококковая вакцина (PCV13, «Превенар 13») и 23-валентная полисахаридная вакцина (PPV23, «Пневмовакс 23»). Определение спектра серотипов возбудителей ПИ позволяет планировать иммунопрофилактические мероприятия и оценивать их эффективность в группах лиц, вовлеченных в эпидемический процесс.

Для определения серотипов S. pneumoniae используются серологические способы, основанные на реакции набухания полисахаридной капсулы или реакции латекс-агглютинации. Широко используются и основанные на ПЦР способы детекции серотип-специфических последовательностей cps-локуса, такие как гены полисахаридной полимеразы wzy и флиппазы wzx, а также другие гены, участвующие в биосинтезе капсульного полисахарида (wcwV, galU. wciP, wzg) [Bentley, S.D. Genetic analysis of the capsular biosynthctic locus from all 90 pneumococcal serotypes / S.D. Bentley, D.M. Aanensen, A. Mavroidi et al. // PLoS Gene. - 2006. - Vol.2. - №3. - P.262-269. doi: 10.1371/journal.pgen.0020031; Sclva, L. Rapid and easy identification of capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae by use of fragment analysis by automated fluorescence-based capillary electrophoresis / L. Selva, E. del Amo. P. Brotons et al // J. Clin. Microbiol. - 2012. -Vol.50. - №11. - P.3451-3457. doi:10.1128/JCM.01368-12].

В 2006 году R. Pai и соавторы предложили алгоритм серотипирования S. pneumoniae, основанный на последовательных мультиплексных ПЦР [Pai, R. Sequential multiplex PGR approach for determining capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates / R. Pai, R.E. Gertz, B. Beall // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol.44. - №1. - P.124-131. doi:10.1128/JCM.44.1.124-131.2006]. К недостаткам данного подхода относится необходимость использования электрофоретической детекции продуктов ПЦР в агарозном геле, что, наряду с другими недостатками включения данного этапа, может осложнять дифференциацию серотипов при проведении мультиплексной ПЦР.

Из уровня техники также известен способ определения 29 серотипов [Yun, К. W. Streptococcus pneumoniae type determination by multiplex polymerase chain reaction / K. W. Yun, E. Y. Cho, К. B. Hong et al. // Journal of Korean medical science. - 2011. - Vol.26. - №8. - P.971-978. doi:10.3346/jkms.2011.26.8.971]. Недостатком данного способа также является этап электрофореза.

Оптимальным способом одновременного определения нескольких серотип-специфических мишеней является ПЦР-РРВ с использованием флуоресцентно меченых зондов. Несмотря на очевидные преимущества ПЦР-РРВ для определения серотипов, эффективность ее применения не всегда очевидна, что обусловлено постоянной адаптацией возбудителей под давлением популяционного иммунитета, в том числе обусловленного иммунопрофилактикой с использованием поливалентных вакцин.

Центрами по контролю и профилактике заболеваний США (Centers for Disease Control and Prevention) рекомендованы последовательности олигонуклеотидов для определения серотипов S. pneumoniae с использованием ПЦР-РРВ и опубликованы алгоритмы проведения серотипирования для Латинской Америки, Африки, Азии и США [Real-time PCR Deduction of Pneumococcal Serotypes or Serogroups PCR based methods for identification of S. pneumoniae serotypes/serogroups. URL: www.cdc.gov/streplab/pneumococcus/resources.html? CDC_AA_ refVal=https%3A%2F%2Fwww.cdc.gov%2Fstreplab%2Fpcr.html (дата обращения: 01.09.2021)]. Рекомендованные протоколы постановки ПЦР-РРВ предполагают определение трех серотип-специфических мишеней в одной реакции. Различия в способах серотипирования связаны с тем, что частота обнаружения тех или иных серотипов варьирует в зависимости от региона и параметров эпидемического процесса на каждой территории (доля инвазивных и неинвазивных форм ПИ, спектр циркулирующих серотипов и их изменение в зависимости от проводимых иммунопрофилактических мероприятий), которые определяют особенности проведения микробиологического мониторинга S. pneumoniae.

Детекция дополнительных серотип-специфических мишеней, также как и исключение из анализа мишеней для серотипов, не характерных для наблюдаемой территории, позволяет повысить долю определяемых серотипов и эффективность лабораторного исследования в целом. Уменьшение доли штаммов, нетипируемых с помощью стандартных серологических или основанных на ПЦР методик, способствует накоплению информации об эпидемиологических особенностях циркулирующих возбудителей для планирования и контроля эффективности программ по вакцинации. В связи с этим существует потребность в разработке олигонуклеотидов для выявления 12FAB серотипа S. pneumoniae: праймеров и зонда для проведения ПЦР-РРВ в мультиплексном формате.

Технический результат заявляемого изобретения направлен на выявление ДНК 12FAB серотипа S. pneumoniae с высокой степенью специфичности в образцах биологического материала посредством таких олигонуклеотидов праймеров и флоуресцентного зонда, которые позволяют эффективно определять серотип-специфическую последовательность ДНК с использованием широко распространенных методик и доступных материалов.

Технический результат достигается за счет применения в ПЦР-РРВ синтезированных олигонуклеотидов для определения 12FAB серотипа S. pneumoniae, имеющих следующий олигонуклеотидный состав:

прямой праймер 12FABF SEQ ID NO: 1;

обратный праймер 12FABR SEQ ID NO: 2;

флоуресцентный зонд 12FABZ - SEQ ID NO: 3.

Праймеры представляют собой последовательности олигонуклеотидов для амплификации серотип-специфического фрагмента ДНК, флоуресцентный зонд является олигонуклеотидом, содержащим флуорофор и гаситель флуоресценции, позволяющим детектировать амплифицированный фрагмент.

Заявляемые олигонуклеотиды разработаны на основе генов S. pneumoniae, входящих в cps-локус [Bentley, S.D. Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes / S.D. Bentley, D.M. Aanensen, A. Mavroidi et al. // PLoS Gene.

2006. Vol.2. №3. P.262-269. doi: 10.1371/journal.pgen.0020031]. С этой целью были проанализированы фрагменты последовательностей генома S. pneumoniae (cps-локуса) 12FAB серотипа для определения консервативных участков ДНК, не имеющих гомологии с фрагментами cps-локуса представителей других серотипов S. pneumoniae. В результате проведенного анализа был выбран гомологичный для 12FAB серотипа S. pneumoniae фрагмент cps-локуса, к которому были подобраны праймеры и зонд для амплификации фрагмента 90 пар оснований: прямой 12FABF - SEQ ID NO: 1; обратный 12FABR - SEQ ID NO: 2 и флоуресцентный зонд 12FABZ - SEQ ID NO: 3.

Заявляемое изобретение является результатом работы в рамках исследования российских штаммов S. pneumoniae, проделанной в ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Россия).

Для подбора последовательностей-мишеней - мест посадки олигонуклеотидов были использованы фрагменты референсных геномов 12FAB серотипа S. pneumoniae, взятые из базы данных GenBank. Для поиска консервативных последовательностей применяют современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Mega и Unipro UGENE, олигокалькуляторы (Oligo Calculators) Thermo Fisher Scientific. Составляют перечень консервативных участков, характерных только для 12FAB серотипа S. pneumoniae, к которым подбирают олигонуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров, а также флоуресцентный зонд. Упомянутые олигонуклеотидные последовательности приведены в Таблице 1.

В качестве положительного внутреннего контроля используется фрагмент cps-локуса общего для всех серотипов SEQ ID NO: 4-6, с праймерами cpsA-f и cpsA-r [Pai, R. Sequential multiplex PCR approach for determining capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates / R. Pai, R.E. Gertz, B. Beall // J. Clin. Microbiol.- 2006. - Vol.44. - №1.

P.124-131. doi: 10.1128/JCM.44.1.124-131.2006] и зондом cpsA-Z2 [Миронов, K.O. Методика ПЦР в режиме реального времени для определения серотипов Streptococcus pneumoniae / K.O. Миронов, А.Е. Платонов, Е.А. Дунаева и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2014. №1. С.41-48.]. Для детекции cps-положительных образцов используют канал для флуорофора Су5.5.

Анализ заявляемых последовательностей с использованием ресурса Primer BLAST продемонстрировал, что прямой 12FABF (SEQ ID NO: 1) и обратный 12FABR (SEQ ID NO: 2) праймеры амлифицируют консервативный для 12FAB серотипа участок со специфичностью 96%.

где FAM - флуорофор, BHQ1 - гаситель флуоресценции. Заявляемое решение также поясняется:

на Фиг. 1, на которой представлен консервативный участок генома 12FAB серотипа S. pneumoniae и места посадки праймеров и флоуресцентного зонда, где:

1 - прямой праймер 12FABF (SF.Q ID NO: 1);

2 - флоуресцентный зонд 12FABZ, (SEQ ID NO: 3);

3 - обратный праймер 12FABR, (SEQ ID NO: 2);

на Фиг. 2, где показана детекция серотипа 12FAB (канал для флуорофора FAM); на Фиг. 3, где показана детекция cps-положительных образцов (канал для флуорофора Су5.5).

В качестве биологического материала предпочтительно использовать спинномозговую жидкость или образцы культур S. pneumoniae.

Выделение ДНК из биологического материала или штаммов проводят в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Выделение ДНК из биологического материала производят с помощью комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя. Для выделения ДНК может быть использован комплект реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любой аналогичный набор для выделения ДНК. Оптимальная концентрация ДНК - 10³-10⁵ копий в 10 мкл.

ПЦР-РРВ проводится с применением заявляемых представленных в Таблице 1 олигонуклеотидов - праймеров и зонда, для серотип-специфичной мишени 12FAB серотипа.

ПЦР-РРВ проводят при следующих условиях:

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл.

Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:

(a) 10 мкл смеси, содержащей:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5 - по 0,5 мкМ;

- флоуресцентный зонд SEQ ID NO: 3, 6 0,2 мкМ;

- dNTPs - 0,44 мМ.

(b) реактив, содержащий рекомбинантный фермент Taq ДПК-полимеразы, например 0,5 мкл реактива «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любого аналогичного коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя.

(c) ПЦР-буфер, содержащий MgCl₂, например 4,5 мкл ПЦР-буфера «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любого аналогичного коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя.

(d) выделенная ДНК - 10 мкл.

ПЦР-РРВ проводят с флуоресцентной детекцией на приборе «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия) или на любом другом приборе с 5 каналами детекции.

Амплификацию проводят по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 5 циклов при температуре 95°С - 5 секунд / 60°С - 20 секунд / 72°С - 5 секунд, затем 40 циклов при температуре 95°С - 5 секунд / 60°С - 20 сек / 72°С - 5 секунд. Детекция флуоресценции проводится на этапе 60°С по каналу для флуорофора FAM.

Для анализа результатов задают пороговую линию, соответствующую величине 8-10% от максимального сигнала положительного образца. Образцы, для которых кривые флуоресценции пересекают пороговую линию, и при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала является экспоненциальной, являются положительными, то есть содержат серотип-специфическую мишень для 12FAB серотипа S. pneumoniae.

Реализация заявляемого изобретения поясняется следующими примерами:

Пример 1. Получение олигонуклеотидов для определения 12FAB серотипа S. pneumoniae.

Для подбора последовательностей-мишеней - мест посадки олигонуклеотидов были использованы фрагменты референсных геномов 12FAB серотипа S. pneumoniae, взятые из базы данных GenBank. Для поиска консервативных последовательностей были использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Mega и Unipro UGENE, олигокалькуляторы (Oligo Calculators) Thermo Fisher Scientific. Был составлен перечень консервативных участков, характерных только для 12FAB серотипа S. pneumoniae, к которым были подобраны олигонуклеотидные последовательности прямого 12FABF и обратного 12FABR праймеров, а также флоуресцентный зонд 12FABZ.

В качестве положительного внутреннего контроля используется фрагмент cps-локуса общего для всех серотипов S. pneumoniae SEQ ID NO: 4-6.

Анализ упомянутых последовательностей с использованием ресурса Primer BLAST показал, что прямой 12FABF и обратный 12FABR праймеры амлифицируют консервативный для 12FAB серотипа участок со специфичностью 96%.

Олигонуклеотиды для определения 12FAB серотипа S. pneumoniae - прямой праймер 12FABF, обратный праймер 12FABR, флоуресцентный зонд 12FABZ, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-3 соответственно.

Пример 2. Детекция 12FAB серотипа S. pneumoniae методом ПЦР-РРВ.

Определение 12FAB серотипа S. pneumoniae, проводят методом ПЦР-РРВ при следующих условиях.

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл.

Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:

(a) 10 мкл смеси, содержащей:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5 по 0,5 мкМ;

- флоуресцентный зонд SEQ ID NO: 3,6- 0,2 мкМ;

- dNTPs - 0,44 мМ.

(b) 0,5 мкл реактива «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразы.

(c) 4,5 мкл ПЦР-буфера «ОТ-ПЦР-смесь-2 FEP/FRT» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего MgCh.

(d) выделенная ДНК - 10 мкл.

ПЦР-РРВ проводят с флуоресцентной детекцией на приборе с 5 каналами детекции - «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия).

Подготовленный описанным способом материал, содержащий уникальные олигонуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1-3 используют для определения 12FAB серотипа S. pneumoniae в биологических образцах.

Пример 3. Обнаружение 12FAB серотипа S. pneumoniae в образцах биологического материала.

Для определения 12FAB серотипа S. pneumoniae было выбрано 50 смывов бактериальных культур. Выделение ДНК из биологического материала проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для выделения ДНК использовался набор реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), концентрация ДНК - 10³ копий в 10 мкл.

ПЦР-РРВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных олигонуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1-3.

Амплификацию проводили по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 5 циклов при температуре 95°С - 5 секунд / 60°С - 20 секунд / 72°С - 5 секунд, затем 40 циклов при температуре 95°С - 5 секунд / 60°С - 20 сек / 72°С - 5 секунд. Детекцию флуоресценции проводили на этапе 60°С по каналу для флуорофора FAM. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 8% от максимального сигнала положительного образца. Для одного образца кривые флуоресценции пересекли пороговую линию и, при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала была экспоненциальной, что свидетельствует о том, что данный образец содержит серотип-специфическую мишень 12FAB серотипа S. pneumoniae.

Таким образом, из всей выборки был выявлен один образец, принадлежавший к 12FAB серотипу S. pneumoniae. Принадлежность данного образца к 12FAB серотипу S. pneumoniae подтверждена анализом данных полногеномного секвенирования с использованием программ «SeroBA» и «PneumoCaT».

Пример 4. Обнаружение 12FAB серотипа S. pneumoniae в образцах биологического материала.

Для определения 12FAB серотипа S. pneumoniae было выбрано 25 смывов с бактериальных культур. Выделение ДНК из биологического материала проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для выделения ДНК использовался набор реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), концентрация ДНК 10⁵ копий в 10 мкл.

ПЦР-РРВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных олигонуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1-3.

Амплификацию проводили по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 5 циклов при температуре 95°С - 5 секунд / 60°С - 20 секунд / 72°С - 5 секунд, затем 40 циклов при температуре 95°С - 5 секунд / 60°С - 20 сек / 72°С - 5 секунд. Детекцию флуоресценции проводили на этапе 60°С по каналу для флуорофора FAM. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 10% от максимального сигнала положительного образца. Для трех образцов кривые флуоресценции пересекли пороговую линию и при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала была экспоненциальной, что свидетельствует о том, что данные образцы содержат серотип-специфическую мишень для 12FAB серотипа S. pneumoniae.

Таким образом, из всей выборки было выявлено три образца, принадлежащих к 12FAB серотипу S. pneumoniae. Принадлежность данных образцов к 12FAB серотипу S. pneumoniae подтверждена анализом данных полногеномного секвенирования с использованием программ «SeroBA» и «PneumoCaT».

Пример 5. Обнаружение 12FAB серотипа S. pneumoniae в образцах биологического материала.

Для определения 12FAB серотипа S. pneumoniae было выбрано 36 смывов бактериальных культур. Выделение ДНК из биологического материала проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для выделения ДНК использовался набор реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), концентрация ДНК 10³ копий в 10 мкл.

ПЦР-РРВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных олигонуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1-3.

Амплификацию проводили по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 5 циклов при температуре 95°С - 5 секунд / 60°С - 20 секунд / 72°С - 5 секунд, затем 40 циклов при температуре 95°С - 5 секунд / 60°С - 20 сек / 72°С - 5 секунд. Детекцию флуоресценции проводили на этапе 60°С по каналу для флуорофора FAM. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 9% от максимального сигнала положительного образца. Кривая флуоресценции не пересекла пороговую линию, что свидетельствовало о том, что в выборке отсутствуют образцы, содержащие серотип-специфическую мишень для 12FAB серотипа S. pneumoniae. Принадлежность образцов к другим серотипам S. pneumoniae подтверждена анализом данных полногеномного секвенирования с использованием программ «SeroBA» и «PneumoCaT».

Таким образом, заявляемое изобретение позволяет выявлять в биологических образцах ДНК 12FAB серотипа S. pneumoniae. Синтезированные олигонуклеотиды SEQ ID NO: 1-3 не дают перекрестных реакций с другими протестированными серотипами S. pneumoniae, амлифицируют консервативный для 12FAB серотипа участок со специфичностью 96% и позволяют определять наличие или отсутствие в образцах биологического материала серотип-специфической мишени для 12FAB серотипа S. pneumoniae.

--->

Перечень последовательностей

<110> ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора

<120> Олигонуклеотиды для определения 12FAB серотипа Streptococcus pneumoniae

<160> NUMBER OF SEQ ID NO: NOS: 6

<210> SEQ ID NO: NO 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Streptococcus pneumoniae

<400> SEQUENCE 1 (12FABF):

CTg TAA TAT gCA CCC ACg ggT AAA 24

<210> SEQ ID NO: NO 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Streptococcus pneumoniae

<400> SEQUENCE 2 (12FABR):

CCA ACT AAg AAC CAA ggA TCC ACA 24

<210> SEQ ID NO: NO 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Streptococcus pneumoniae

<400> SEQUENCE 3 (12FABZ):

(FAM) gCC CAC CAA CAC CAg gTC CAg gTT gTT (BHQ1) gAA 30

<210> SEQ ID NO: NO 4

<211> 27

<212> DNA

<213> Streptococcus pneumoniae

<400> SEQUENCE 4 (cpsА-f):

GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC 27

<210> SEQ ID NO: NO 5

<211> 26

<212> DNA

<213> Streptococcus pneumoniae

<400> SEQUENCE 5 (cpsА-r):

GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC 26

<210> SEQ ID NO: NO 6

<211> 29

<212> DNA

<213> Streptococcus pneumoniae

<400> SEQUENCE 6 (cpsА-Z2):

(Cy5.5)GTG CTG TCA CAC TCG TCA GTT GCG TAA CA(BHQ3)29

<---