Способ определения чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующим средствам

Изобретение относится к области эпидемиологии, микробиологии и дезинфектологии и может быть использовано для оценки чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующим средствам при проведении в медицинских организациях соответствующего мониторинга.

Известен ускоренный способ оценки чувствительности микроорганизмов к дезинфектантам («Методические рекомендации по ускоренному определению устойчивости бактерий к дезинфекционным средствам» Утверждены руководителем департамента Госсанэпиднадзора Минздрава РФ 2000 г.). Способ основан на применении цветной питательной среды, изменяющей цвет под влиянием жизнедеятельности размножающихся бактерий. Эффективные концентрации дезинфектанта предотвращают накопление бактерий и сохраняют цвет среды. Известный способ характеризуется относительно низкой степенью достоверности результатов исследований, связанной с наличием бактериостатического эффекта, т.к. в нем не предусмотрено применение нейтрализатора, что не исключает бактериостатический эффект. Кроме того, не учитывается рекомендованное время воздействия дезинфицирующего средства для достижения гибели микроорганизма, что приводит к получению неправильных результатов.

Наиболее близким к изобретению является способ оценки чувствительности микроорганизмов к дезинфектантам (RU 2378363 С1 С 12N1/00, 2008 г.). Способ заключается в том, что тестируемую взвесь микроорганизмов наносят на поверхность, которую после подсушивания обрабатывают дезинфицирующим раствором. После этого через временную выдержку, необходимую для проявления дезинфицирующего эффекта, на поверхность наносят нейтрализатор дезинфицирующего средства (ДС) и через определенное время берут смыв с поверхности сухим стерильным тампоном, с помощью которого делают посев на питательную среду. Оценку чувствительности микроорганизмов к ДС судят по росту их колоний на питательной среде. Недостатком известного способа является относительно низкая степень достоверности результатов исследований, которая объясняется тем, что с помощью тампона невозможно обеспечить достаточную точность количественного посева смеси на твердую питательную среду, т.к. часть микроорганизмов остается на тестируемой поверхности, а часть - на тампоне. Кроме того, в известном способе необходимо использовать несколько открытых тест-объектов, контаминированных возбудителями инфекций, что приводит к риску биологического загрязнения окружающей среды и заражения медицинского персонала. Известная методика трудоемка, т.к. требует наличия и специальной подготовки тест-объектов к проведению исследований (мытье, упаковка, стерилизация).

Техническим результатом, которого можно достичь при осуществлении данного изобретения, является упрощение хода исследований, повышение уровня их безопасности и точности результатов исследований.

Технический результат достигается тем, что согласно способу определения чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующим средствам, заключающемуся в том, что на внутреннюю поверхность чашки Петри дозатором наносят взвесь тестируемых микроорганизмов, после подсушивания взвеси проводят обработку зараженной поверхности чашки соответствующим дезинфицирующим средством путем ее орошения, протирания или погружения, после окончания дезинфекционной выдержки в чашку Петри вносят раствор нейтрализатора, соответствующего химическому составу используемого дезинфицирующего средства, и через определенную временную выдержку добавляют растопленный и остуженный до 45°С агар, затем чашку помещают в термостат при оптимальных для роста тестируемого микроорганизма температуре и времени, после чего осуществляют учет количества выросших на чашке Петри колоний и сравнивают результаты с данными, полученными с аналогично контамированной чашкой, обработанной так же, как опытная, но не раствором дезинфицирующего средства, а стерильной водопроводной водой, по результатам сравнения выносят суждение о чувствительности тестируемых микроорганизмов к дезинфицирующему средству при снижении количества микроорганизмов от воздействия раствора дезинфицирующего средства на 99,00-100%, а при менее 99,99% - об их резистенции.

В патентных источниках информации не обнаружено сведений о данном способе определения чувствительности, что позволяет сделать вывод о соответствии данного способа критериям охраноспособности.

В качестве тест-объекта используют чашку Петри, а в качестве тест-организма - культуры микроорганизмов, выделенные из клинического материала и объектов внешней среды - грамотрицательные и грамоположительные бактерии, включая микробактерии туберкулеза, грибы рода Кандида.

Для нейтрализации антимикробного действия ДС для различных химических групп применяют следующие:

- для средства из группы окислителей - 0,5-1% растворы тиосульфата натрия;

- для альдегид- и фенолсодержащих средств - воду, универсальный нейтрализатор, содержащий твин - 80-3%, сапонин - 3%, гистидин - 0,1% и цистеин - 0,1%;

- для катионных поверхностно-активных веществ - 0,1-1,0% растворы сульфонола или 0,5-1,0% растворы сольфонола с 10% обезжиренного молока.

Способ осуществляют следующим образом.

Оценку чувствительности выделенных (с объектов внутрибольничной среды или от больного) и идентифицированных микроорганизмов проводят к дезинфицирующему средству, применяемому в медицинской организации или предлагаемому на его замену.

Если средство предназначено для дезинфекции поверхностей или посуды на внутреннюю поверхность чашки Петри площадью, например, 80 см² дозатором (пипеткой) наносят 0,4 мл 2 млрд суспензии микроорганизмов и равномерно распределяют ее по поверхности стерильным стеклянным шпателем. Если ДС предназначено для дезинфекции медицинских изделий, на поверхность чашки наносят 0,1 мл суспензии микроорганизмов с добавлением 40% инактивированной лошадиной сыворотки.

После подсушивания обработку зараженной поверхности чашки проводят по режиму и способу, рекомендованному в Инструкции по применению средства (орошение, протирание или погружение), соблюдая режим и рекомендованные нормы расхода соответственно выбранному способу.

После окончания дезинфекционной выдержки чашку заливают 8 мл раствора нейтрализатора, соответствующего данному ДС, и делают несколько круговых движений чашкой для лучшего смачивания ее поверхности. Через определенную временную выдержку, необходимую для действия нейтрализатора, например 10 мин, жидкость заливают растопленным и остуженным до 45°С агаром. Посевы выдерживают в термостате при температуре и времени, оптимальных для роста тестируемого микроорганизма, после чего проводят учет результатов, вынося суждение о его чувствительности либо резистенции.

При анализе результатов подсчитывают количество выросших на чашке Петри колоний и сравнивают полученные данные с аналогично контаминированной чашкой, обработанной так же, как опытная, но не раствором ДС, а стерильной водопроводной водой. Если гибель микроорганизма составляет 99,99% для средств, предназначенных для дезинфекции поверхностей, и 100% для средств, предназначенных для дезинфекции медицинских изделий (отсутствие роста во всех пробах), выделенный штамм микроорганизма считают чувствительным к действию ДС, если менее 99,99 и 100% (наличие роста в одной или более проб) - устойчивым.

В клинике выделен и идентифицирован микроорганизм A.baumanii. Для дезинфекции в этой организации применяли средство, содержащее в своем составе 18% алкилдиметилбензиламмоний хлорида - четвертичного аммониевого соединения (ЧАС). В Инструкции по применению этого средства рекомендован режим для обеззараживания поверхностей: концентрация - 0,2%, время действия - 60 мин, способ обработки - протирание, норма расхода - 150-200 мл/м². Оценка чувствительности выделенного микроорганизма A.baumanii произведена по способу согласно изобретению. Одновременно оценена чувствительность микроорганизма P.aeruginosa - штамм из коллекции микроорганизмов ФБУН НИИ Дезинфектологии Роспотребнадзора к тому же дезинфицирующему средству и в том же режиме применения. Результат представлен в таблице.

Полученные данные свидетельствуют, что к воздействию алкилдиметилбензиламмоний хлорида тест-микроорганизм P.aeruginosa чувствительный (после воздействия ДС жизнеспособные микроорганизмы не выявлены), a A.baumanii - резистентный, т.к. после воздействия ДС микроорганизм выживает).

Пример 1.

В медицинской организации (ФГАУ «Лечебно-реабилитационный центр» МЗ РФ) выделили циркулирующий во внутрибольничной среде и вызывающий заболевания штамм Klebsiella pneumoniae. Чтобы оценить эффективность проводимых дезинфекционных мероприятий, необходимо оценить чувствительность этого микроорганизма к применяемому дезинфицирующему средству.

Применяемое в медицинской организации средство («ЭКОН-ДЕЗ») содержит в своем составе: четвертичные аммониевые соединения - 14,7%, N,N-бис-(3-аминопропил)додециламин - 6%, полигексаметиленгидрохлорид - 4% и применяется для дезинфекции поверхностей в помещении способом протирания в концентрации 0,5% при дезинфекционной выдержке 10 мин.

Постановка эксперимента.

Две стерильные чашки Петри (одна - опытная, вторая - контрольная) на поддоне располагают на лабораторном столе. На дно обеих чашек Петри (площадь 80 см²) дозатором наносят по 0,4 мл 2-млрд. суспензии суточной культуры микроорганизма и подсушивают в течение 60 мин. Затем дно опытной чашки протирают салфеткой, смоченной 0,5% раствором средства, а дно контрольной чашки - салфеткой, смоченной стерильной водопроводной водой. Через 10 мин в чашки вносят по 5 мл раствора нейтрализатора, содержащего 0,5% сульфонола, выдерживают 10 мин, затем заливают растопленным и остуженным до 45°С агаром. После застывания агара чашки помещают в термостат и культивируют в течение 48 часов.

В опытной чашке Петри выросло 39 КОЕ, в контрольной чашке - 2×10⁵ КОЕ.

Заключение. Выделенная в медицинской организации культура Klebsiella pneumoniae резистентна к воздействию применяемого средства, так как снижение количества микроорганизмов составило 99,96%, что менее существующего критерия эффективности для дезинфицирующих средств - 99,99%.

Таким образом, проведение всех этапов исследований в одной чашке Петри, моделирующей любой тест-объект (посуду, поверхности, медицинские изделия), который можно обработать любым способом (орошением, протиранием, погружением), и возможность введения нейтрализатора с последующим контролем обеззараживания (заливанием питательной среды в ту же чашку Петри, в которой не теряется ни одного микроорганизма, в отличие от контроля обеззараживания методом смыва салфеткой либо тампоном), позволяет получить более точный результат эксперимента, улучшить экологию окружающей среды (контаминированная чашка все время накрыта крышкой) и снизить трудоемкость проведения исследований.

Применение данной методики позволит более эффективно вести мониторинг устойчивости к дезинфицирующим средствам микроорганизмов, циркулирующих в медицинских организациях.