Результат интеллектуальной деятельности: Кормовая добавка для жвачных животных

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для профилактики заболеваний и регулирования пищеварительных процессов в желудочно-кишечном тракте жвачных животных.

Рубцовое содержимое представлено огромным биоразнообразием микроорганизмов, которые как положительно влияют на получение энергии и аминокислот из небелковой формы азота в белковую, так и негативно воздействуя на пищевую ценность продуктов жвачных, из-за большого количества выброса парниковых газов избыточных азотом. Наиболее важным фактором, корректирующим микробиом рубца и его ферментативную активность, является кормление. Среди которых огромный интерес привлекли растительные экстракты из-за запрета на использование противомикробных стимуляторов роста в животноводстве [1].

Развитие бактерий, устойчивых к лекарственным средствам, является основной проблемой в медицине и ветеринарии, так как все больше антибиотиков используется для профилактики и лечения самых разных заболеваний и других состояний. Использование большего количества антибиотиков и количества бактерий, проявляющих устойчивость, привело к увеличению продолжительности лечения. Кроме того, широкие неспецифические антибиотики, некоторые из которых оказывают вредное воздействие на организм, в настоящее время используются чаще. С этим расширением применения связана проблема, заключающаяся в том, что многие антибиотики не проникают в слизистую оболочку. В частности, грамположительные бактерии окружены клеточной стенкой, содержащей полипептиды и полисахариды. Грамположительные бактерии включают роды Actinomyces, Bacillus, Listeria, Lactococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterium, Corynebacterium и Clostridium, но не ограничиваются ими. С медицинской и ветеринарной точки зрения соответствующие виды включают опасные патогены Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus и Enterococcus faecalis. Виды Bacillus, которые образуют споры, вызывают сибирскую язву и гастроэнтерит. Известны и грамотрицательные бактерии, вызывающие особо опасные заболевания, относящиеся к классу гамма-протеобактриям, семейству энтеробактерии (Enterobacteriaceae), это Salmonella, Shigella и др. [2].

Известна кормовая добавка для крупного рогатого скота, характеризующаяся тем, что она содержит 5 % сухого экстракта Quercus cortex, 20 % маннаноолигосахаридов, 8 % бета-глюканов, 67 % отрубей пшеничных, при этом добавку вводят в дозировке 0,25 г/кг живой массы тела [3]. Отличие данного изобретения, в том, что изучалось влияние лишь одного вида сухого экстракта и задачей его являлось увеличение эффективности действия пребиотических средств с использованием доступных лекарственных растительных экстрактов, способствующих улучшению пищеварения и повышению продуктивности животных.

Известен способ регулирования пищеварительных процессов в рубце жвачных животных. Способ предусматривает регулирование режима скармливания кормовых средств с высоким содержанием органических кислот и крахмала. При этом при проведении опыта на фистульных животных осуществляют инкубирование навесок нейтрально-детергентной клетчатки грубого корма в рубце, предварительно переведенных на опытный рацион, с последующим определением переваримости и концентрации водородных ионов рубцовой жидкости через каждый час в течение 9 часов для выявления оптимального уровня гидролиза компонентов корма. В дальнейшем используют 5-кратный режим скармливания при выращивании молодняка крупного рогатого скота. Это позволяет увеличить целлюлозолитическую активность бактерий рубца на 4-5 %, среднесуточный прирост животных на 6-8%, рентабельность производства живой массы на 4-7 % [4].

Ранее при проведении лабораторных исследований на модельных микроорганизмах было установлено, что экстракты коры дуба 33,3 % + листьев березы 33,3 % + травы зверобоя 33,3 % обладают антибактериальной и анти QS активностью [5].

Задачей изобретения является увеличение количества грамположительных бактерий в рубце жвачных животных с использованием сухих смесей водных экстрактов доступных лекарственных растений, способствующих улучшению пищеварения и повышению продуктивности животных, а также способствующих сокращению использования кормовых антибиотиков в кормлении жвачных и химиотерапевтических средств при лечении.

Технический результат достигается введением в рацион молодняка крупного рогатого скота кормовой добавки, включающей смесь сухого водного экстракта коры дуба 33,4 мас. % + водного экстракта листьев березы 33,3 мас. % + водного экстракта травы зверобоя 33,3 мас. %), способствующая снижению в рубце представителей грамотрицательных бактерий класса Negativicutes и увеличению грамположительных Ruminococcaceae и Lachnospiraceae.

В эксперименте использовались измельченное растительное сырьё для получения сухих водных экстрактов: листья березы (ЭЛБ) производитель Россия, ООО Фирма «Здоровье»; трава зверобоя (ЭТЗ) производитель Россия, АО «Красногорсклексредства»; кора дуба (ЭКД) производитель Россия, АО «Красногорсклексредства».

Приготовление высушенных водных экстрактов включало следующие стадии: помещали 50 г измельченного растительного сырья (лекарственной формы) в жаростойкую посуду с 500 мл горячей (70°С) дистиллированной воды, нагревание на водяной бане (30 мин), с последующим охлаждением, фильтрацией (обеззоленные фильтры «Белая лента», d 70 мм APEXLAB) и высушиванием (60°С). Данная процедура проводиться по отдельности в отношении листьев березы, травы зверобоя и коры дуба.

Переваримость сухого вещества концентратов in situ (на модели молодняка крупного рогатого скота) определяли по разности массы образца корма вместе с мешочком и после двухстадийной инкубации и высушивания до постоянной массы при температуре 60°С по следующей формуле: К=100 (А-В) / С, где К - коэффициент переваримости сухого вещества корма (%); А - исходная масса образца корма вместе с мешочком (г); В - масса образца корма вместе с мешочком после переваривания (г); С - исходная масса образца корма без массы мешочка (г).

Оценка микробного биоразнообразия включала: отбор проб, выделение, очистку, измерение концентраций ДНК, проведение ПЦР, валидацию и нормализацию библиотек с последующим секвенированием на платформе высокопроизводительного секвенатора второго поколения MiSeq Illumina, США. Биоинформатическая обработка результатов осуществлялась с использованием программы PEAR (2015).

Кормовую добавку смешивали с концентрированным кормом и скармливали животным (12-месячных бычки красной степной породы, возраст - 11-12 мес.). Технология приготовления кормовой добавки проста, не требует нагрева, сохраняя все ее полезные свойства. Это повышает ее эффективность, не требует дорогостоящего оборудования, что снижает ее себестоимость.

Пример конкретного исполнения.

Проведены исследования «in situ» (на модели молодняка крупного рогатого скота) по оценке течения микробиологических процессов, в рубце крупного рогатого скота на фоне использования малых молекул в составе экспозиций высушенных водных экстрактов растений (коры дуба, листьев березы и травы зверобоя). Объект исследований: рубцовая жидкость 12-месячных бычков красной степной породы с хроническими фистулами рубца. Основной рацион: 60 % - грубые корма (сено суданской травы и люцерны), 35 % - концентрированные корма (зерносмесь из ячменя, пшеницы, подсолнечной лузги, отрубей) и по отдельности сухая смесь водных экстрактов по следующей схеме: I группа - ОР + кора дуба 33,4 мас. % + листья березы 33,3 мас. % + трава зверобоя 33,3 мас. %; II группа - ОР + кора дуба 50 мас. % + листья березы 50 мас. %; III - ОР + листья кора дуба 50 мас. % + трава зверобоя 50 мас. %; IV - ОР + листья березы 50 мас. % + травы зверобоя 50 мас. %; V группа (контрольная) - ОР.

Переваримость сухого вещества зерносмеси (метод нейлоновых мешочков, инкубируемых в рубце животного, экспозиция 24 часа) при скармливании в составе рациона композиции сухой смеси водных экстрактов (кора дуба 33,4 мас. % + листья березы 33,3 мас. % + трава зверобоя 33,3 мас. %) оказалась выше на 6,89 %, в сравнении с контролем и на 11,7-13,5 % (Р≤0,05) в сравнении с остальными вариантами (таблица 1).

Ruminococcaceae являются важной группой бактерий, обитающих в рубце, и способны разлагать полисахариды клеточной стенки растений на метаболизируемую энергию. Это означает, что повышение данного сообщества рубца повышает расщепление пищевых волокон. В настоящих исследованиях добавление сухой смеси водных экстрактов в I группу имело тенденцию к повышению переваримости сухого вещества микрорациона и составило разницу 6,9 % (р≤0,05) относительно контроля [6].

Соотношение Firmicutes и Bacteroidetes (F : B) тесно связано с эффективностью корма y крупного рогатого скота [7, 8]. В исследованиях выявлено увеличение соотношения Firmicutes и Bacteroidetes, которое составило 0,75 : 1 в I группе получавшие сухую смесь трех водных экстрактов в соотношении 33,4 : 33,3 : 33,3 мас. %, тогда как в контрольной F : B оно составляло 0,65 : 1.

Результаты исследования систематического профиля бактерий рубца при введении с основным рационом различных видов растительных экстрактов (водных) оказывают влияние на изменение микробного состава (таблица 2).

Наиболее выраженным в количественном отношении от общего числа классифицированных бактерий являлся таксон Bacteria. В анализируемых контрольных пробах больше присутствовало филума Bacteroidetes - 58,43 % и Firmicutes - 38,18 % от общего количества бактерий. Систематический профиль таксонов контрольной группы был представлен в основном 10 выявленными классами, главные из которых Bacteroidia - 50,29 %, Clostridia - 28,74 %, Negativicutes - 9,01 %, Deltaproteobacteria - 1,01 %. При этом бактерий из класса Bacteroidia уменьшилось на 1,99 и 0,9 %, из класса Clostridia напротив повысилось на 0,74 и 5,2 % в сравнении с III и IV группами.

У животных получавших сухую смесь водных экстрактов ЭКД 33,4 мас. % + ЭЛБ 33,3 мас. % + ЭТЗ 33,3 мас. % в пробе преобладали следующие филумы: Bacteroidetes - 54,39 %, Firmicutes - 40,87 %, Proteobacteria - 1,1 % от общего количества. Применение этих высушенных водных экстрактов способствовало увеличению количества бактерий, относящихся к филуму Firmicutes на 5,65 %, 6,24 %, 4,75 и 2,69 % от II-V групп.

Микробиом рубцового содержимого особей первой группы включал в себя 10 выявленных классов, главные из которых Bасteroidia - 48,01 %, Clоstridia - 34,89 %, Negativicutes - 5,76 %, Sphingobacteriia - 1,82 %. При этом количество бактерий из класса Negativicutes было самым низким из всех сравниваемых групп на 0,72 и 5,13 % в сравнении с II и III группами; 1,86 и 3,25 % в сопоставлении с IV и контрольной группами.

Введение животным I группы ЭКД 33,4 мас. % + ЭЛБ 33,3 мас. % + ЭТЗ 33,3 мас. % спровоцировало максимальный рост числа микроорганизмов семейства Lachnospiraceae (на 1,13 и 4,80 %; 2,09 и 2,64 %) и Ruminococcaceae (на 4,5 и 6,85 %; 3,75 и 4,33 %) в сравнении с II и III; IV и контрольной группами.

Введение сухой смеси водных экстрактов коры дуба 50 мас. % + листья березы 50 мас. % животным II группы способствовало увеличению числа бактерий филума Bacteroidetes (на 2,11 %) и уменьшению Firmicutes (на 2,96 %) в сравнении с бычками контрольной группы. Колебание бактерий в пределах филума Bacteroidetes y бычков II группы шло в основном за счет увеличения количества микроорганизмов, входящих в класс Bacteroidia, unclassified Bacteroidetes и Candidatus Saccharibacteria.

Введение ЭКД и ЭЛБ позволило большему росту представителей семейства Muribaculaceae (на 2,49 и 3,16 %), Prevotellaceae (на 9,06 и 9,11 %) и Candidatus Saccharibacteria (на 0,06 и 0,25 %) в сравнении с I и контрольной группами.

При введении ЭКД 50 мас. % + ЭТЗ 50 мас. % бычкам наблюдалось уменьшение числа бактерий семейства Lachnospiraceae (на 2,16 и 4,80 %) и Ruminococcaceae (на 2,52 и 6,85 %) относительно контрольной и I групп. Видовое разнообразие было представлено следующим образом: Duncaniella (3,21 % от общего числа), Prevotella (5,0 % от общего числа), невыявленные unclassified Bacteroidales (30,13 % от общего количества), unclassified Lachnospiraceae (3,61 % от общего числа), Sporobacter (3,76 % от общего числа), unclassified Ruminococcaceae (7,9 % от общего числа), Succiniclasticum (9,12 % от общего числа). Остальные виды бактерий были представлены менее 3 %.

Введение сухой смеси водных экстрактов коры дуба 50 мас. % + трава зверобоя 50 мас. % способствовало лучшему развитию бактерий филума Bacteroidetes (на 3,69 (P≤0,05) и 2,58 % (P≤0,01)) и уменьшению числа бактерий филума Firmicutes (на 3,55 и 1,49 %) по сравнению с контрольной и IV группой.

Это отразилось на изменении доли в микробиоценозе микроорганизмов классов Bacteroidia, Clostridia и Negativicutes. При этом из всех сравниваемых групп наибольшое количество бактерий класса Negativicutes наблюдались y бычков из III группы, что на 1,88 и 5,13 % больше чем y аналогов из контроля и I группы.

Введение животным IV группы ЭЛБ 50 мас. % + ЭТЗ 50 мас. % позволило повысить число бактерий класса Bacteroidia на 1,99 % (P≤0,05) и уменьшению числа бактерий на 0,74 % из класса Clostridia и класса Negativicutes на 1,39 % (P≤0,05) по сравнению с контрольной. Сухая смесь водных экстрактов листьев березы и травы зверобоя способствовали развитию бактерий семейств Bacteroidaceae (на 0,27 (P≤0,05) и 0,78% (P≤0,05)), Prevotellaceae (на 4,45 (P≤0,01) и 3,41 % (P≤0,05)), Ruminococcaceae (на 0,58 и 3,1 %), Lachnospiraceae (на 0,55 и 2,71 %) Rikenellaceae (на 0,14 и 0,99 %), Candidatus Saccharibacteria (на 0,64 и 0,73 %) и в отличии с контрольной и III группами.

Видовое разнообразие с наибольшей долей было представлено Prevotella - 11,96 % от общего числа, неопределенные Bacteroidales - 25,08 % от общего числа, неопределенные Lachnospiraceae 4,73 % от общего числа, неопределенные Ruminococcaceae - 10,56 % от общего числа, Succiniclastricum - 6,92 % от общего числа. Остальные виды бактерий были представлены менее 3 %.

Источники информации

1. Newbold CJ, Ramos-Morales E. Review: Ruminal microbiome and microbial metabolome: effects of diet and ruminant host. Animal. 2020 Mar;14(S1): s78-s86. doi:10.1017/S1751731119003252.

2. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии. Под редакцией: Л.С. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова http://www.antibiotic.ru/ab/047-49.shtml

3. Патент на изобретение RU № 2744381 Кормовая добавка для крупного рогатого скота / Г.К. Дускаев, Ш.Г. Рахматуллин, Б.С. Нуржанов, А.Ф. Рысаев, Г.И. Левахин, О.А. Завьялов, А.Н. Фролов : опубл. 09.03.2021. Заявка №2020121660 от 25.06.2020.

4. Патент на изобретение RU № 2506925 Способ регуляции пищеварительных процессов в рубце жвачных животных / Г.И. Левахин, С.А. Мирошников, Г.К. Дускаев, Б.С. Нуржанов, П.М. Поберухин, М.А. Польшина, Ю.Ю. Петрунина, А.Ф. Рысаев, В.А. Харламов, О.А. Завьялов, Б.Х. Галиев, Н.М. Ширнина : опубл. 14.08.2012. Заявка № 2012134860 от 14.08.2012.

5. Inchagova K.S., Abdrahmanova R.A., Duskaev G.K., Khisamov R.R. Quorum Sensing Suppression of Chromobacterium Violaceum when exposed to combinations of dry plant extracts // IOP Conf. Ser.: Earth Environ. Sci. 2021, 659, 012104. doi:10.1088/1755-1315/659/1/012104.

6. Iwamoto M., Asanuma N., Hino T. Ability of Selenomonas ruminan-tium, Veillonella parvula, and Wolinella succinogenes to reduce nitrate and nitrite with special reference to the suppression of ruminal methanogenesis. Anaerobe. 2002; 8(4): 209-215. doi: https://doi.org/10.1006/anae.2002.0428

7. Jami E., White B.A., Mizrahi I. Potential role of the bovine rumen microbiome in modulating milk composition and feed efficiency. PLOS ONE. 2014; 9(1): e85423. doi: 10.1371/journal.pone.0085423.

Ramirez H.A., Nestor K., Tedeschi L.O., Callaway T.R., Dowd S.E., Fernando S.C. et al. The effect of brown midrib corn silage and dried distillers’ grains with solubles on milk production, nitrogen utilization and microbial community structure in dairy cows. Canadian Journal of Animal Science 2012; 92(3): 365-380. doi: 10.4141/cjas2011-133.