Результат интеллектуальной деятельности: Средство для лечения атопического дерматита

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и касается применения гистохрома для профилактики и/или лечения атопического дерматита.

Атопический дерматит (АД) - это кожное заболевание, характеризующееся хроническим воспалением кожи, которое приводит к зуду, эритемам, нарушению функции кожного барьера, повышенной трансэпидермальной потере воды и иммунно-окислительно-восстановительным нарушениям [Cork M.J. et al. J. Investig. Dermatol. 2009, 129, 1892-1908; Leung, D.Y.M. Atopic dermatitis: More than a rash. Ann. Allergy Asthma Immunol. 2018, 120, 555-556; Souto E.B. et al. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 5659.]. АД выявляется во всех странах мира, у представителей обоего пола и разных возрастных категорий. Показатели распространенности АД за последние два десятилетия выросли более чем в 2 раза. По данным различных авторов атопический дерматит занимает от 20 до 40% в структуре кожных заболеваний. Показатели заболеваемости АД среди детей в мире колеблются до 10-20%, среди взрослых лиц - до 3%.

Патогенез атопического дерматита остается неясным, но, предполагают, что он связан как с генетическими факторами, такими как дисфункции иммунной системы, при которой Т-хелперные клетки 2 типа секретируют чрезмерное количество интерлейкина-4 (ИЛ-4) и интерлейкина-13 (ИЛ-13), интерферона-гамма (ИФН-γ), так и с факторами окружающей среды, например, клещи домашней пыли [Yoon, H.J.; et al. Protective effect of diet supplemented with rice prolamin extract against DNCB-induced atopic dermatitis in BALB/c mice. BMC Complement. Altern. Med. 2015, 15, 353.]. Кроме того, поражения АД обычно характеризуются чрезмерной инфильтрацией гранулированных тучных клеток, которые активируются антиген-специфическим иммуноглобулином Е (IgE), и которые имеют решающее значение для развития воспалительных заболеваний кожи [Ku J. М. et al. The prevention of 2,4-dinitrochlorobenzene-induced inflammation in atopic dermatitis-like skin lesions in BALB/c mice by Jawoongo. BMC Complement. Altern. Med. 2018, 18, 215], и способствуют реакциям гиперчувствительности кожи, высвобождая гистамин [Klubal R. et al. The high-affinity receptor for IgE is the predominant IgE-binding structure in lesional skin of atopic dermatitis patients. J. Investig. Dermatol. 1997, 108, 336-342., Galli S.J., Tsai M. IgE and mast cells in allergic disease. Nat. Med. 2012, 18, 693-704.; Park S.J. et al. Effect of eriodictyol on the development of atopic dermatitis-like lesions in ICR mice. Biol. Pharm. Bull. 2013, 36, 1375-1379.].

Обычно терапевтические стратегии АД включают топическое (местное) использование кортикостероидов, ингибиторов кальциневрина и ингибиторов Т-клеток [Carr W.W. Topical calcineurin inhibitors for atopic dermatitis: Review and treatment recommendations. Paediatr. Drugs 2013, 15, 303-310.; Papp, K.A.;Werfel, Т.; Folster-Holst R. et al. Long-term control of atopic dermatitis with pimecrolimus cream 1% in infants and young children: A two-year study. J. Am. Acad. Dermatol. 2005, 52, 240-246.; Kang L.J. et al. 3'-Sialyllactose prebiotics prevents skin inflammation via regulatory T cell differentiation in atopic dermatitis mouse models. Sci. Rep.2020, 10, 5603.]. Однако известно, что длительное лечение этими препаратами вызывает побочные эффекты, такие как иммуносупрессия и дисфункция эпидермального барьера. Использование системных (инъекционных) кортикостероидов показано только при тяжелых случаях болезни, но время их использования ограничено из-за возможных побочных эффектов, так как кортикостероиды могут индуцировать лизис Т-клеток и блокировать транскрипцию генов противовоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, TNFα.

Задача изобретения - расширение арсенала эффективных средств для профилактики и лечения атопического дерматита.

Задача решена применением гистохрома в качестве средства для профилактики и/или лечения атопического дерматита. При этом гистохром применяют топически и/или парентерально.

Технический результат состоит в реализации указанного назначения.

Препарат Гистохром® представляет собой лекарственную форму индивидуального вещества - природного хиноидного пигмента морских ежей эхинохрома А (2,3,5,6,8-пентагидрокси-7-этил-1,4-нафтохинон, номер государственной регистрации Р N002362/01-2003). В лекарственной форме раствор для внутривенного введения 10 мг/мл Гистохром® применяется в кардиологии при остром инфаркте миокарда (номер государственной регистрации Р N002363/01-2003) [RU 2137472 С1, 23.04.1999] и Гистохром® в лекарственной форме раствор для инъекций 0,2 мг/мл применяется в качестве средства для лечения глазных заболеваний (номер государственной регистрации Р N002363/02-2003) [RU 2134107 С1, 10.08.1999].

Известно применение гистохрома для лечения геморрагического инсульта [RU 2266737 С1, 27.12.2005], а также применение в качестве средства для лечения ишемии сосудов головного мозга при острых нарушениях мозгового кровообращения [RU 2625740 С1, 18.07.2017].

Известно применение гистохрома в качестве диуретического средства [RU 2408367 С1, 10.01.2011], в качестве противовирусного средства в отношении клещевого энцефалита и герпеса простого I типа [RU 2697887 С1, 21.08.2019], в качестве нейропротекторного средства [RU 2765956 С1, 07.02.2022].

Указание на использование гистохрома для профилактики и/или лечения атопического дерматита в доступной патентной и другой научно-технической литературе не обнаружено.

Эта новая функция гистохрома не вытекает с очевидностью из его известных свойств и состава.

Авторами впервые обнаружена способность гистохрома снижать экспрессию провоспалительных цитокинов интерферона-γ (ИНФ-γ), интерлейкина-4 (ИЛ-4) и интерлейкина-13 (ИЛ-13), играющих основную роль в поддержании аллергического воспаления в коже. Показано, что гистохром проявляет противовоспалительный эффект на 2,4-динитрохлорбензол индуцированные атопические дерматитоподобные поражения на модели мышей NC/Nga, обладает свойством ингибировать индуцированную воспалительным ответом инфильтрацию тучных клеток в пораженной коже. Применение гистохрома, топически и/или парентерально, эффективно устраняет эпидермальные кожные поражения, снижает трансдермальную потерю воды и улучшает гидратацию рогового слоя, тем самым облегчает клинические симптомы атопического дерматита, такие как отек, эритема и сухость кожи.

Исследование способности гистохрома влиять на основные патофизиологические процессы атопического дерматита в коже мышей проводили на мышах инбредной линии Nc/Nga, выведенной в Японии в университете Нагоя в 1957 году и используемой в качестве модели атопического дерматита человека. Шестинедельные самцы мышей NC/Nga приобретены в Orient Bio (Тэджон, Корея). Мышей акклиматизировали при температуре 22±2°С и влажности 45±5% с чередованием темноты/света 12/12 часов в течение 1 недели. Исследование на животных было одобрено Комитетом по уходу и использованию животных Университета Инже.

Поражения кожи у мышей, подобные атопическому дерматиту, вызывали местным нанесением 100 мкл 1% 2,4-динитрохлорбензол а (ДНХБ), растворенного в смеси оливкового масла и ацетона (1:3) по схеме: три раза в неделю в течение 2 недель, после сенсибилизации продолжали наносить 0,4% раствор ДНХБ три раза в неделю в течение 5 недель.

Гистохром применяли местно, нанося на поврежденный участок кожи спины мыши, или вводя препарат внутрибрюшинно, в этом случае препарат попадал в системный кровоток.

В таблице 1 приведены обозначения экспериментальных групп животных и описание экспериментов.

При непосредственном воздействии этиологически значимого аллергена ДНХБ на кожу мышей происходит активация антиген-специфических клеток, инфильтрирующих эпидермис, которые несут на своей поверхности IgE-антитела. Последние мигрируют в лимфатические узлы, где активируют Th2-лимфоциты, секретирующие провоспалительные цитокины ИЛ-4, ИЛ-13, ИНФ-γ, играющие основную роль в поддержании аллергического воспаления в коже.

Описание экспериментальных методов исследования

Измерение уровней трансэпидермальной потери воды (ТЭПВ) и гидратации рогового слоя (ГРС)

После сенсибилизации мышей 1% и 0,4% ДНХБ по вышеприведенной схеме показатели ТПВ и ГРС измеряли с использованием датчиков Tewameter® и корнеометром Cutometer® MP А 580 (Courage + Khazaka Electronic GmbH, Кельн, Германия) каждые 2 недели. Измерительный зонд помещали на средний участок кожи спины мышей, которым вводили анестезию путем ингаляции изофлурана в низкой концентрации. Уровни ТЭПВ были проанализированы при выходе на плато оценочного графика, а уровни ГРС были приняты как среднее значение трех измерений

Наблюдение за состоянием кожи

За состоянием кожи участка спины, на котором вызван атопический дерматит, наблюдали каждые 2 недели, для этого делали фотографии с помощью камеры для дерматоскопии (DermLite™ DLCAM, DermLite, Сан-Хуан-Капистрано, Калифорния, США). Мышей фотографировали под наркозом, который вводили путем кратковременной ингаляции изофлурана.

Гистологический анализ

Для получения образцов кожи спины мышей усыпляли, используя газ ССЬ. Части биоптатов дорсальной кожи фиксировали в 4% параформальдегиде, а затем переносили в 70% раствор этилового спирта на 24 ч при комнатной температуре. Образцы заливали парафином и разрезали на срезы по 4 мкм. Срезы кожи окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е) и толуидиновым синим. Окрашенные слайды изучали с помощью сканера слайдов NanoZoomer Digital Pathology и программного обеспечения HCImage (Hamamatsu Photonics, Милан, Италия).

Вестерн-блоттинг

Образцы эпидермальной дорсальной кожи лизировали буфером для анализа радиоиммунопреципитации (50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,5% дезоксихолат натрия, 1% Тритон Х-100, 2 мМ ЭДТА и 0,1% натрия лаурилсульфата с добавлением 200 мМ фенилметилсульфонилфлуорида (PMSF). Концентрацию белка определяли с помощью анализа белка Bio-Rad DC (Bio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США). Лизаты разделяли электрофорезом в 8-15% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (GE Healthcare, Чикаго, Иллинойс, США) на 100 мин при 110 W и 4°С. Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком в TBST буфере (20 ммоль/л Tris-HCl, рН 7,5, 50 ммоль/л NaCl и 0,1% Tween 20). После блокирования мембраны инкубировали в течение ночи с первичными антителами, разведенными до 1:1000-1:5000 в 3% бычьем сывороточном альбумине (БСА) в TBST. После трехкратной промывки в течение 15 мин мембраны инкубировали в течение 1 ч с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена, разведенными до 1:1000-1:5000 в 3% БСА. Полосы белка визуализировали с помощью набора для усиления хемилюминесценции (Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США) и наблюдали с помощью визуализатора AI 600 (GE Healthcare, Чикаго, Иллинойс, США).

Статистический анализ

Все данные представлены как среднее значение по крайней мере трех независимых экспериментов. Статистические сравнения были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом честной значимости Тьюки (Tukey's test) для множественных сравнений (GraphPad Prism 8.0, GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Статистическая значимость была установлена на уровне р<0,05.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:

- на фиг.1 представлены результаты дерматоскопического наблюдения за поражениями кожи дорсальной поверхности мышей у шести групп животных в течение всего эксперимента с периодичностью 2 недели;

- на фиг.2 представлен уровень иммуноглобулина IgE в сыворотке мышей экспериментальных групп;

- на фиг.3 представлен результат Вестерн-блот-анализа противовоспалительного эффекта гистохрома при поражениях кожи, вызванных ДНХБ; среднее значение ± SEM трех независимых экспериментов, * р<0,05;

- на фиг.4 представлен результат гистологического анализа среза кожи спины мыши, окрашенного толуидиновым синим - реагентом на тучные клетки, и статистический анализ количества тучных клеток; среднее значение ± SEM, *** р<0,001, масштабная линейка = 100 μм;

- на фиг.5 представлены результаты гистометрии и статистического анализа толщины эпидермиса в коже спины мышей; среднее значение ± стандартная ошибка среднего, *** р<0,001, * р<0,05, масштабная линейка = 100 мкм;

- на фиг.6 представлены данные измерения степени трансэпидермальной потери воды и гидратации рогового слоя в коже экспериментальных мышей; среднее значение ± SEM (n=6), ***р<0,001, * р<0,05.

- на фиг.7 представлена схема этапов развития атопического дерматита, инициированного 2,4-динитрохлорбензолом у мышей.

Изобретение иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1

Изменения АД-подобных симптомов, индуцированных ДНХБ, на спинной части кожи мышиной модели

Мыши Nc/Nga разделены на шесть групп, описание которых приведены в таблице 1. Каждые 2 недели эксперимента дерматоскопически наблюдали АД-подобные поражения кожи на дорсальной поверхности животных. Через 4 недели после создания экспериментального АД на дорсальной коже мышей групп Д, ФБ и ИФБ наблюдали легкий отек, раздражение, сухость и эритему. Через 6 недель появились более заметные отек, раздражение, сухость и эритема. В группах Г и ИГ и через 4, и 6 недель состояние кожи было значительно улучшено по сравнению с группами ФБ и ИФБ. Результаты представлены на слайдах (фиг.1).

Пример 2

Влияние гистохрома на уровень иммуноглобулина IgE в сыворотке экспериментальных животных

Иммуноферментным анализом (ИФА, ELISA) показано, что группы Г и ИГ имели более низкие уровни иммуноглобулина IgE в сыворотке по сравнению с группой Д (фиг.2). Эти результаты показывают, что гистохром, как топически, так и при системном введении (парентерально), снижает провоспалительный ответ при атопическом дерматите.

Пример 3

Противовоспалительный эффект гистохрома при поражениях кожи, вызванных ДНХБ

Чтобы проверить, подавляет ли гистохром экспрессию провоспалительных цитокинов, использовали иммуноблот-анализ экспрессии белков ИНФ-γ, ИЛ-4 и ИЛ-13, связанных с провоспалением. Обработка гистохромом показала противовоспалительный эффект на модели мышей с индуцированным АД (фиг.3А). Относительные интенсивности полос иммунных белков ИНФ-γ, ИЛ-4 и ИЛ-13, оцененные с помощью программы обработки изображений ImageJ представлены на фиг.3Б-Г. Уровни экспрессии ИФН-γ, ИЛ-4 и ИЛ-13, нормализованные по экспрессированному референсному белку β-актину, в группе Д были значительно повышены по сравнению с контролем (группа Н), а у животных групп Г и ИГ, эти показатели были значительно ниже нормы. Причем эффект гистохрома на экспрессию ИФН-γ оказался больше, когда препарат вводили внутрибрюшинно, по сравнению с местным его применением. Таким образом показано, что гистохром проявляет противовоспалительный эффект на модели мышей с индуцированным атопическим дерматитом, снижая уровень экспрессии провоспалительных цитокинов ИФН-γ, ИЛ-4 и ИЛ-13. Известно, что высокий уровень экспрессии ИФН-γ связан с развитием аутоиммунных заболеваний.

Пример 4

Исследование влияния гистохрома на инфильтрацию кожи тучными клетками у мышей с индуцированным АД

Гистологическое наблюдение срезов, окрашенных толуидиновым синим, показало снижение инфильтрации кожи тучными клетками в группах Г и ИГ по сравнению с группами Д, ФБ, ИФБ (фиг.4А). Количество инфильтрированных тучных клеток в окрашенных срезах кожи экспериментальных животных подсчитывали в пяти типичных полях с высоким увеличением с помощью цифрового сканера NanoZoomer (n=6) и программного обеспечения HCImage (Hamamatsu Photonics, Милан, Италия) (фиг.4Б).

Пример 5

Исследование влияния гистохрома на повреждения эпидермиса Когда возникает атопия, эпидермис затвердевает и увеличивается в толщине, что нарушает состояние кожи и снижает ее защитные свойства. На фиг.5 представлен результат сравнительного анализа толщины эпидермиса, измеренной с помощью цифрового сканера NanoZoomer. Гистологическими исследованиями кожных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином (Н&Е, масштабная линейка = 100 мкм), показано, что гистохром как при местном, так и внутрибрюшинном введении, уменьшает толщину кожного эпидермиса (фиг.5А). Средние значения толщины эпидермиса всех групп экспериментальных животных представлены на фиг.5Б. Представленные данные позволяют сделать заключение о том, что при атопическом дерматите гистохром сохраняет защитные функции кожи, особенно при внутрибрюшинном введении, и облегчает лечение симптомов этого заболевания.

Пример 6

Исследование влияния гистохрома на показатели трансэпидермальной потери воды и гидратации рогового слоя у мышей с индуцированным атопическим дерматитом

Эпидермис представляет собой сложную структуру, его главным компонентом считается роговой слой, препятствующий проникновению экзогенных веществ через кожу. Важное значение для интегральной оценки состояния эпидермального барьера имеет количественное измерение кожных параметров, таких, как потеря трансэпидермальной воды и уровня гидратации рогового слоя. Для этого были применены неинвазивные методики исследования кожного барьера in vivo, приведенные в описании экспериментальных методов исследования.

На фиг.6 представлены данные по влиянию гистохрома на показатели трансэпидермальной потери воды (TEWL, фиг.6А) и гидратации рогового слоя (SCH, фиг.6Б) у мышей с индуцированным атопическим дерматитом. Уровни TEWL в эпидермисе кожи оценивали каждые 2 недели с помощью измерений Tewameter®. Оценку SCH определяли с помощью измерений Corneometer® каждые 2 недели эксперимента.

Как видно из приведенных графиков, показатели трансэпидермальной потери воды и гидратации рогового слоя были улучшены в группах мышей, обработанной гистохромом как местно, так и при внутрибрюшинном введении. Хотя эти показатели не доходили до базовых значений, но на всем протяжении эксперимента (6 недель) показатели трансэпидермальной потери воды в группах Г и ИГ были ниже, чем в группах Д, ФБ, ИФБ. И наоборот, показатели гидратации рогового слоя были выше в группах Г и ИГ, чем в группах Д, ФБ, ИФБ. Таким образом, эти результаты свидетельствуют об эффективном действии гистохрома на защитные функции кожи при экспериментальном атопическом дерматите.