Результат интеллектуальной деятельности: ОБОГАЩЕННАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ПЛОТНАЯ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ БИОМАССЫ БРУЦЕЛЛ

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, а именно к разработке питательных сред, которые создают оптимальные условия для выращивания биомассы бруцелл.

Известен биостимулятор роста микроорганизмов, - липоевая кислота, представляющая собой коферментный препарат невитаминного происхождения, который является важным окислительно-восстановительным переносчиком водорода. Липоевая кислота - это один из препаратов пируватдегидрогеназы, играет весьма ответственную роль в биологическом окислении. Обеспечивает клетку необходимой для ее жизнедеятельности энергией, принимает участие в биосинтезе углеводов, липидов и других соединений. Используется порошкообразная липоевая кислота, разработанная во ВНИСВМ, которая предварительно перед добавлением в питательную среду растворяется в спирте ректифицированном 96%-ном (Катунина Л.С. Использование липоевой кислоты с целью усовершенствования питательных сред для культивирования чумного микроба: Дисс. канд. биол. наук. - Ставрополь, 2002. - С. 164).

Недостатком данного биостимулятора является то, что препарат не выдерживает установленного срока хранения, при применении не дает стабильного эффекта повышения объема бактериальной массы.

Наиболее близкой к заявляемому изобретению является питательная среда-заменитель агара «Альбими» для культивирования бруцелл, содержащая, на 1 л среды: 20,0 г сухого пептона, 20 мл дрожжевой воды, 5,0 г химически чистого хлористого натрия, 20,0 г агара, дистиллированной воды - до 1 литра. Ингредиенты растворяют в автоклаве под текучим паром, фильтруют через ватно-марлевый фильтр (предварительно смоченный теплой водой и хорошо отжатый), добавляют 1,0 г глюкозы и 0,1 г метабисульфита натрия, устанавливают рН 7,2-7,3. Разливают в необходимую посуду и стерилизуют 40 минут под текучим паром, затем при 110°С в течение 20 минут. Дрожжевая вода: 1 кг хлебных дрожжей и 1 л дистиллированной воды кипятят до растворения. Затем фильтруют через полотно. Хранят под хлороформом в темноте не более двух недель. (Методические указания МУ 3.1.7.3402-16. Издание официальное. Минздрав России Москва 2016 г., с. 58).

Недостатком данной среды является недостаточная эффективность, ввиду нестабильного и длительного роста возбудителя бруцеллеза.

Целью поставленной задачи явилась разработка питательной среды плотной для выращивания биомассы бруцелл, которая обеспечивала бы достаточный сбор биомассы через 48 ч в перспективе получения диагностических препаратов.

Достигаемый технический результат заключается в том, что питательная среда в качестве питательной основы и источника азота содержит ферментативный сухой пептон, дрожжевой экстракт, а также включает: натрий хлористый, агар микробиологический, дистиллированную воду и ростостимулирующие добавки: глюкозу, натрия метабисульфит, глицерин, витамин B₁, ферментативный гидролизат хлорофитума хохлатого листьев (ФГХЛ), а также нормальную лошадиную сыворотку.

Сущность изобретения заключается в том, что введение в состав питательной среды плотной разработанного стимулятора - ферментативного гидролизата хлорофитума хохлатого листьев (ФГХЛ), а также нормальной лошадиной сыворотки, обеспечивает достаточное количество биомассы бруцелл для получения диагностических препаратов через 48 ч культивирования во флаконах на среде, содержащей следующие ингредиенты:

В качестве исходного сырья для получения стимулятора роста микроорганизмов - ферментативного гидролизата хлорофитума хохлатого, листьев (ФГХЛ), используют комнатное растение Chlorophytum comosum. Ферментативный гидролиз проводят с помощью раствора панкреатина (2 мг/мл). Панкреатин, субстанция - порошок, ЛСП - 005754/9 серия №181213 от 12.2018. Производитель «Хубей Максфарм Инд Ко ЛТД», Китай.

Для изготовления стимулятора роста микроорганизмов на основе хлорофитума растение выращивают в условиях лаборатории. Надземную часть хлорофитума срезают ножом, промывают под проточной водопроводной водой, нарезают ножом на кусочки длиной 2,0 см, замораживают в морозильном ларе VT -147 («Vestfrost», Дания) при температуре минус 40°С в течение 72 ч и подвергают сублимационной сушке в течение 30 ч при температуре сублиматора минус 35°С (Лиофильная сушилка ЛС-500 («Проинтех», Россия). Полученную массу измельчают до однородного порошка.

Полученный сублимат хлорофитума растворяют в дистиллированной воде в соотношении (1:25), перемешивают, доводят рН до 8,0-8,3 1М NaOH, вносят панкреатин (2 мг/мл), выдерживают 48 ч при температуре 37°С и перемешивают в шейкер-термостате ES 20/60 («Biosan», Латвия). Ферментацию останавливают нагревом до температуры 90°С в течение 10 мин, затем фильтруют через фильтрационную систему с применением ПЭС кассет (размеры пор 0,2 мкм, 30 Ша и 10 kDa Vivaflow 50), («Sartorius», Франция), центрифугаруют в центрифуге с охлаждением SL 40R («Thermo fisher scientific», США), автоклавируют при температуре 120°С в течение 10 мин в стерилизаторе паровом СПВА-75-1НН («Транс-сигнал», Россия).

Характеристика получаемого ферментативного гидролизата: стерильная, прозрачная жидкость коричневого цвета, без консервантов; содержание сухого вещества (35,0±3,0) г/л, рН 6,8, реакция с сульфосалициловой кислотой на протеины - отрицательная, аминный азот 63,0 мг %, общие фенолы 0,21 мг/мл галловой кислоты, количество моносахаридов в пересчете на глюкозу 0,06%.

Хлорофитум хохлатый содержит широкий перечень аминокислот в высоких концентрациях: цистин, лейцин, валин, фенилаланин, гистидин и гистамин. Кроме того, хлорофитум хохлатый обладает свойствами биофильтра. Это растение активно поглощает из воздуха и нейтрализует опасные для человека соединения, такие как: фенолы, угарный газ, формальдегид, соединения ксилола, бензола и толуола, что подтверждается в работах современных ученых (Серая А.С, 2008, Чувашева Е.С., 2009, Жученко А.А., Учаева О.С., 2011, Haagen-Smit A.J., 1954, Giese М., 1994, Wood R.A, 2000, Xu Z.J., 2010).

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей, ГОСТ 13805-76. Пептон представляет собой смесь разнообразных частиц распада белка, не свертывающихся при нагревании (пептоны, пептиды, аминокислоты и т.д.). Пептон ферментативный в своем составе содержит 16 аминокислот, мг %: аспарагиновая кислота 0,40±0,03; треонин 0,30±0,01; серии 0,40±0,03; глутаминовая кислота 0,50±0,03; глицин 0,50±0,01; аланин 1,0±0,02; валин 0,80±0,02; метионин 0,40±0,02; изолейцин 0,70±0,01; лейцин 2,40±0,06; тирозин 0,40±0,01; фенилаланин 1,30±0,01; лизин 1,30±0,05; гистидин 0,32±0,02; триптофан 0,06±0,01 (Шепелин А.П., Дятлов И.А. Питательные среды для энтеробактерий. Оболенск, 2017. - С. 41-43).

Дрожжевой экстракт. Партия О60-АД18А00160. Используется в качестве полноценного и дешевого источника факторов роста микроорганизмов для повышения ростовых свойств предлагаемой питательной среды (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов. - М., 1986). По химическому составу дрожжевые среды представляют высокоценный питательный субстрат, весьма близкий к мясу, содержащий до 53% белка. Богатство дрожжей белками и витаминами позволяет получать из них высококачественные питательные среды (Козлов М.Ю., 1950).

Натрий хлористый - ГОСТ 4233-77. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке. Натрий хлористый необходим для поддержания изотоничности среды и окислительно-восстановительного потенциала.

Агар микробиологический - агар бактериологический (европейский тип). Порошок светло-кремового цвета, сероватого оттенка, запах без постороннего, свойственный студню с массовой долей сухого агара 0,85%. Температура плавления студня с массовой долей сухого агара 0,85% не ниже 80°С, температура застудневания - 30-37°С, прочность студня - не менее 350±40 г. Главная особенность агара - его желирующая способность при 90°С.

Глюкоза кристаллическая, чда. С внесением в питательную среду глюкозы в концентрации 1% улучшаются ее ростовые свойства.

Глицерин, ГОСТ 6259-75. С внесением в питательную среду глицерина в концентрации 2% улучшаются ее ростовые свойства.

Натрия метабисульфит, партия 20190118. В средах переходит в гидросульфит натрия, при нагревании происходит термическое разложение с выделением двуокиси серы (SO₂), что способствует нейтрализации продуктов жизнедеятельности культивируемых микроорганизмов.

Витамин B₁, LOT: 7 Q014239. Многие бактерии лишены способности синтезировать все органические соединения, необходимые для роста, и зависят от наличия в среде определенных факторов роста. Общим свойством всех микроорганизмов является потребность в витаминах. Чаще наблюдается потребность в таких витаминах, как тиамин (витамин B₁), биотин, и витамин B₁₂.

Нормальная лошадиная сыворотка, серия 08. Для интенсивного роста бруцеллезных микробов к питательным средам необходимо добавление 10-20% нормальной лошадиной, бычьей или сыворотки крупного рогатого скота. (Таран И.Ф., Лямкин Г.И. «Бруцеллез: микробиология, иммунология, эпидемиология, профилактика» с. 24-27, Ставрополь. - 1996 г.).

Дистиллированная вода, ГОСТ 6709-72. Отвечает всем санитарно-гигиеническим требованиям. Внешний вид - прозрачная жидкость, хлориды, мг/дм³ - нет, нитраты, мг/дм³ - нет. Удельная электропроводимость при 20°С, См/м - 0,38, рН - 6,5. Вода составляет 80-90% от клеточной массы микроорганизмов и играет важнейшую роль в их физиологических функциях, а также входит состав структурных элементов клетки, служит средой для биохимических реакций, источником кислорода в процессах метаболизма, непосредственно участвует в метаболических реакциях, например, в реакциях гидролиза.

Приготовление питательной среды плотной

Для приготовления питательной среды плотной смешивают пептон сухой ферментативный - 20,0 г; дрожжевой экстракт - 20,0 г; натрий хлористый - 5,0 г; добавляют ферментативный гидролизат хлорофитума хохлатого листьев (ФГХЛ) - 89,4 мл, агар микробиологический - 11,0 г; натрия метабисульфит - 0,5 г; дистиллированную воду - до 1 л. Нагревают до кипения и кипятят в течение двух минут до полного расплавления агара. рН корректируют раствором соляной кислоты (1:1) до 7,2±0,1, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, вносят глюкозу - 1,0 г; глицерин - 2,0 мл; витамин В1 - 0,5 г, тщательно размешивают, затем разливают в градуированные стеклянные флаконы объемом 250,0 мл, по (50±1,0) мл. Закрывают ватно-марлевыми пробками и бумагой Крафт, закрепляют резиновыми кольцами, стерилизуют при температуре 121°С в течение 20 минут. После стерилизации и охлаждения до температуры 56°С в каждый флакон стерильно вносят по 5,0 мл нормальной лошадиной сыворотки, затем скашивают.

Эффективность полученной среды оценивают в соответствии с методическими указаниями МУК «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», Москва, 2008 г., с использованием среды сравнения - агара без добавления нормальной лошадиной сыворотки. В качестве испытуемых культур используют тест-штаммы бруцелл В. melitensis Rev 1 и В. abortus 19 ВА. Испытуемые культуры бруцелл предварительно выращивают на скошенном агаре Альбими, рН (7,3±0,1), при температуре 37°С в течение 48 ч. Затем культуры смывают с поверхности агара 0,9%-ным раствором натрия хлорида, доводят концентрацию микробной взвеси до 10 единиц по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-85П ФГБУ НЦЭСМП МЗ России, эквивалентную 1,0×10⁹ м.к./мл. Разводят взвесь до концентрации в 1 мл 500 млн. м.к. (1:1), из данного разведения высевают по 1,0 мл в 3 флакона (матраца). Посевная доза тест-штаммов В. melitensis Rev 1 и В. abortus 19 ВА на каждый мл среды составляет 10 млн м.к. Покачиванием распределяют взвесь по поверхности питательной среды, оставляют на специально смонтированных подставках в скошенном состоянии для впитывания, после чего помещают в термостат. Выращивают в течение (48±2) ч при (37±1)°С.

Учет результатов проводят через (48±2) ч. Производят смыв выращенной культуры 5 мл 0,9%-ного раствора натрия хлористого из каждого флакона (матраца) путем отбора выращенной биомассы в градуированную пробирку объемом 25 мл стерильной бактериологической пипеткой объемом 5 мл и устанавливают концентрацию микробов в 1 мл суспензии по ОСО мутности.

Оценку количества выращенной биомассы бруцелл осуществляют отдельно для каждого штамма путем визуального осмотра, смыва ее и определения млрд м.к. с 1 мл питательной среды.

Пример 1

Культуры бруцелл В. melitensis Rev I и В. abortus 19 ВА выращивали на питательной среде плотной для выращивания биомассы, содержащей следующие ингредиенты: пептон сухой ферментативный - 18,0 г; дрожжевой эстракт - 18,0 г; натрий хлористый - 4,0 г; ферментативный гидролизат хлорофитума (ФГХЛ) - 79,4 мл; агар микробиологический - 10,0 г; глюкозу - 0,8 г; натрия метабисульфит - 0,4 г; глицерин - 0,8 мл; витамин B₁ - 3 мг; нормальную лошадиную сыворотку - 5,0 мл на 50,0 мл питательной среды; дистиллированную юлу - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов в испытуемой среде при выращивании бруцелл сбор биомассы через 48 ч составил для В. melitensis Rev 1-50 млрд м.к., для В. abortus 19 ВА - 56 млрд м.к., соответственно. На контрольной питательной среде, приготовленной на ферментативном гидролизате хлорофитума, листьев (ФГХЛ), но без добавления нормальной лошадиной сыворотки, сбор биомассы при выращивании биомассы бруцелл составил для В. melitensis Rev I - 51 млрд м.к., для В. abortus 19 ВА - 57 млрд м.к.

Пример 2

Культуры бруцелл В. melitensis Rev I и В. abortus 19 ВА выращивали на питательной среде плотной для выращивания биомассы, содержащей следующие ингредиенты: пептон сухой ферментативный - 20,0 г; дрожжевой эстракт - 20,0 г; натрий хлористый - 5,0 г; ферментативный гидролизат хлорофитума (ФГХЛ) - 89,4 мл; агар микробиологический - 11,0 г; глюкозу - 1,0 г; натрия метабисульфит - 0,5 г; глицерин - 1,0 мл; витамин B₁ - 0,5 мг; нормальную лошадиную сыворотку - 5,0 мл на 50,0 мл питательной среды; дистиллированную воду - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов в испытуемой среде при выращивании бруцелл сбор биомассы через 48 ч составил для В. melitensis Rev 1-75 млрд м.к., для В. abortus 19 ВА - 85 млрд м.к., соответственно. На контрольной питательной среде, приготовленной на ферментативном гидролизате хлорофитума, листьев (ФГХЛ), но без добавления нормальной лошадиной сыворотки, сбор биомассы при выращивании биомассы бруцелл составил для В. melitensis Rev 1-60 млрд м.к., для В. abortus 19 ВА - 65 млрд м.к.

Пример 3

Культуры бруцелл В. melitensis Rev I и В. abortus 19 ВА выращивали на питательной среде плотной для выращивания биомассы, содержащей следующие ингредиенты: пептон сухой ферментативный - 22,0 г; дрожжевой эстракт - 22,0 г; натрий хлористый - 6,0 г; ферментативный гидролизат хлорофитума, листьев (ФГХЛ) - 99,4 мл; агар микробиологический - 12,0 г; глюкозу - 1,2 г; натрия метабисульфит - 0,6 г; глицерин - 1,2 мл; витамин B₁ - 0,6 мг; нормальную лошадиную сыворотку - 5,0 мл на 50,0 мл питательной среды; дистиллированную воду - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов в испытуемой среде при выращивании бруцелл сбор биомассы через 48 ч составил для В. melitensis Rev 1-55 млрд м.к., для В. abortus 19 ВА - 53 млрд м.к., соответственно. На контрольной питательной среде, приготовленной на ферментативном гидролизате хлорофитума, листьев (ФГХЛ), но без добавления нормальной лошадиной сыворотки, сбор биомассы при выращивании биомассы бруцелл составил для В. melitensis Rev I - 52 млрд м.к., для В. abortus 19 ВА - 51 млрд м.к.

Таким образом, питательная среда плотная для выращивания биомассы бруцелл, содержащая ферментативный гидролизат хлорофитума, листьев (ФГХЛ) обеспечивает высокий накопительный эффект для испытуемых тест-штаммов В. melitensis Rev 1 и В. abortus 19 ВА через 48 ч.