Результат интеллектуальной деятельности: Способ идентификации полиморфизмов Cys1079Gly и Cys1079Phe медь-транспортной АТФ-азы Вильсона

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицины, а именно к ДНК-диагностике нейродегенеративных заболеваний человека и предрасположенности к ним.

Ген АТР7В человека длиной 85826 п.н. локализован на длинном плече 13 хромосомы (13q14.3-q21.1)NC_000013.11, его мРНК состоит из 6598 н. и направляет синтез белка, содержащего 1465 а.о. АТФ-аза Вильсона (АТР7В) относится к Р1-типу АТФ-аз и в основном экспрессируется в печени и мозге [20063 GeneCards: АТР7В]. Установленными функциями АТР7В являются участие в металлировании церулоплазмина - основного медьсодержащего белка сыворотки крови, принадлежащего к семейству мультимедных голубых оксидаз, и экскреция меди в желчь [Bielli P., Calabrese L. Structure to function relationships in ceruloplasmin: a 'moonlighting' protein. Cell Mol Life Sci. 2002; 59(9): 1413-1427].

Мутации в гене АТР7В ответственны за развитие гепатолентикулярной дегенерации, или болезни Вильсона (БВ) (OMIM 277900), моногенного аутосомно-рецессивного заболевания, приводящего к тяжелой инвалидизации в раннем возрасте и преждевременной смерти [Lutsenko S. et al. Function and regulation of human copper-transporting ATPases. Physiol. Rev. 2007; 87: 1011-1046; Schilsky M.L. Wilson disease: Diagnosis, treatment, and follow-up. Clin. Liver Dis. 2017; 21: 755-767.]. Традиционно БВ считается редким генетическим заболеванием с примерной частотой 30 человек на 106 населения. Однако расчеты, основанные на данных ДНК-диагностики, указывают, что частота заболевания выше. Так, в Соединенном Королевстве встречаемость пациентов, несущих два патогенных аллеля АТР7В, составляют ~1 на 7000 индивидуумов, а доля гетерозигот составляет 2,5% населения в целом. Кроме того, распространенность БВ выше в азиатских странах (58 на 10°) и в изолированных общинах, например, Канарские острова - 1 на 2600; Сардиния - 1 на 7000 [Czlonkowska A. et al. Wilson disease. Nat. Rev. Dis. Primers. 2018; 4:21].

В настоящее время в гене АТР7В описано около 700 мутаций, которые в гомозиготном состоянии, в том числе компаундные гомозиготы, приводят к развитию БВ. Большинство мутаций описаны как единичные случаи. Наиболее часто (до 70%) в европейских популяциях встречается точковая мутация с. 3207С>А в экзоне 14, приводящая к замене в белковой последовательности гистидина в положении 1069 на глутаминовую кислоту (p.His1069Gln). Доля мутации с. 3207С>А в российской выборке больных достигает 60% [Ferenci, P. et al. Regional distribution of mutations of the ATP7B gene in patients with Wilson disease: impact on genetic testing. Human genetics. 2006; 120(2): p.151-159; Karabanov A.V. et al. Analysis of mutations in ATP7B gene and experience with direct DNA-diagnosis in hepatolenticular degeneration. ZhNevrol Psikhiatr Im S S Korsakova. 2001; 101(4): 44-47].

Экзон 14 ATP7B кодирует АТФ-связывающий домен. У большинства пациентов с БВ в Северной Америке, Европе и России обнаружены мутации в экзоне 14 (например, Е1064А, H1069Q, R1151H и C1104F). В центральной и восточной Европе помимо мутации H1069Q (экзон 14) распространены мутации 2299insC, G710S (экзон 8), 3400delC (экзон 15) и R969Q (экзон 13) [Shah А.В. et al. Identification and analysis of mutations in the Wilson disease gene (ATP7B): population frequencies, genotype-phenotype correlation, and functional analyses. Am J Hum Genet. 1997; 61(2): 317-328].

Многие пациенты с болезнью Паркинсона и Альцгеймера характеризуются основным биохимическим признаком БВ - низким содержанием меди в сыворотке крови из-за снижения уровня церулоплазмина. В Италии и Германии описаны случаи развития болезни Паркинсона и Альцгеймера у гетерозиготных носителей мутаций в гене АТР7В [Kalia, L.V.; Lang, А.Е. Parkinson's disease. Lancet. 2015; 386: 896-912; Pal A. et al. Predictive association of copper metabolism proteins with Alzheimer's disease and Parkinson's disease: a preliminary perspective. Biometals. 2014; 27(1): 25-31; Bucossi S. et al. Association of K832R and R952K SNPs of Wilson's disease gene with Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 2012; 29(4): 913-919].

В России у пациента с установленным диагнозом «болезнь Паркинсона» обнаружен гетерозиготный генотип с заменой Т / G в 14 экзоне гена АТР7В в положении с. 3235, что соответствует аминокислотной замене p.Cys1079Gly [Ilyechova E.Y. et al. Case of Early-Onset Parkinson's Disease in a Heterozygous Mutation Carrier of the ATP7B Gene. J. Pers. Med. 2019; 9: 41]. В этом исследовании была идентифицирована новая мутация гена АТР7В, что позволяет рассматривать ее в научно-исследовательской практике при изучении механизмов развития БП. Сходная, но не идентичная, мутация в этом же кодоне, приводящая к замене p.Cys1079Phe, в одной из хромосом компаундного гомозиготного пациента с БВ была описана ранее в Китае [Wang L.-H. et al. Mutation analysis of 73 southern Chinese Wilson's disease patients: Identification of 10 novel mutations and its clinical correlation. J. Hum. Genet. 2011; 56: 660-665]. Молекулярно-динамический анализ полипептида с заменой Cysl079 показал, что обе мутации вызывают глубокие конформационные изменения в АТФ-связывающем домене, которые могут привести к ухудшению его функции.

Данные доказывают, что мутантные гены БВ наблюдаются чаще, чем принято считать. АТФ-аза Вильсона является ключевым звеном системы, поддерживающей баланс меди у млекопитающих, нарушение которого ведет к развитию нейродегенеративных, онкологических, сердечно-сосудистых заболеваний и метаболического синдрома [Gaggelli Е. et al. Copper homeostasis and neurodegenerative disorders (Alzheimer's, prion, and Parkinson's diseases and amyotrophic lateral sclerosis). Chem Rev. 2006; 106(6): 1995-2044; Lowe J. et al. Dissecting copper homeostasis in diabetes mellitus. UBMB Life. 2017; 69(4): 255-262; Fukai T. et al. Copper transporters and copper chaperones: roles in cardiovascular physiology and disease. Am J Physiol Cell Physiol. 2018; 315(2): 186-201; Sawaki M. et al. Role of copper accumulation and metallothionein induction in spontaneous liver cancer development in LEC rats. Carcinogenesis. 1994; 15(9): 1833-1837]. Можно уверенно прогнозировать, что в дальнейшем список симптомов, при которых необходимо назначение генетического анализа маркирования гена АТР7В, будет оправданно увеличиваться.

В настоящее время в России осуществляется генотипирование 13 мутаций гена АТР7В: H1069Q, c.1340_1343del4, c.1770insT, c.2304insC, с. 2532delA, с. 3026_3028delTCA, 3029insT, 3031insC, c.3627_3630del4, 3649_3654del6, c. 3942delAT, 3947del, c.3402delC. Исследование рекомендуется всем пациентам при постановке диагноза БВ, с экстрапирамидными нарушениями, паркинсонизмом и атаксией, а также пациентам с гепатитом неясного генеза, цитолитическим синдромом.

Существует несколько разработанных методик генотипирования АТР7В. Используют в основном метод прямого секвенирования [Ragoussis, J. Genotyping technologies for genetic research. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet; 2009; 10: 117-33]. Исследование включает забор венозной крови, выделение ДНК, амплификацию участка интереса хромосомного гена АТР7В методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и последующее секвенирование продукта амплификации. Общая стоимость анализа от шести до тринадцати известных полиморфизмов гена АТР7В составила на март 2020 года от 9370 руб. до 11625 руб. Срок исполнения до 21 дня. [https://vmw.gemotest.ru/sankt-peterburg/catalog/po-laboratornvm-napravlenivam/geneticheskie-issledovanival, [https://www.invitro.ru/analizes/for-doctors/1001/7581], [http://isdenta.ru/geneticheskie-issledovaniva.html], [http://medcenter-sv.ru/services/diagnostika/laboratory/ geneticheskie-issledovaniva.html].

Следует отметить, что использование данного подхода требует дорогостоящего оборудования, а также специальных наборов реагентов, что объясняет высокую стоимость генотипирования полиморфизма у отдельного пациента и территориальные ограничения в стандартных ПЦР-лабораториях России.

Генотипирование известных полиморфизмов гена АТР7В, связанных с развитием БВ, не позволяет провести исчерпывающую оценку генетического риска развития как БВ, так и других нейродегенеративных заболеваний, характеризующихся измененным статусом меди. В связи с этим актуальным является идентификация новых генетических маркеров, связанных с развитием, как болезни Паркинсона, так и болезни Вильсона.

Используемый метод в заявляемом способе идентификации полиморфизмов p.Cys1079Gly и p.Cys1079Phe медь-транспортной АТФ-азы Вильсона включает амплификацию (ПЦР) участка интереса гена АТР7В и анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) с помощью специфической эндонуклеазы BstAU I с последующим электрофоретическим анализом фрагментов. Метод выгодно отличается ценой, доступностью реактивов и оборудования, а также возможностью проведения анализа практически на всей территории России.

К настоящему времени известны способы генотипирования полиморфизмов генов человека методом ПЦР-ПДРФ, выбранные в качестве прототипа.

Известен способ идентификации полиморфизма R287Q в 8 экзоне гена цитозольной эпоксидгидролазы у человека, способствующий проведению интенсивных исследований в современной кардиологии по изучению генетического полиморфизма гена цитозольной эпоксидгидролазы (soluble epoxide hydrolase, ЕРНХ2} при сердечно-сосудистых заболеваниях. [RU патент №2346053, дата подачи 22.12.2006].

Известен СПОСОБ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА rs2551715 ГЕНА ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ У ЧЕЛОВЕКА, позволяющий методом ПЦР-ПДРФ эффективно идентифицировать полиморфизм одного из генов системы антиоксидантной защиты при различной патологии, отличающийся низкой себестоимостью анализа. [RU патент №2549688, дата подачи 19.11.2013]

До настоящего времени способов идентификации мутаций p.Cys1079Gly и p.Cys1079Phe АТР7В с помощью ПЦР-ПДРФ в литературе не описано. Таким образом, существует потребность в создании быстрого, простого, недорогого, чувствительного и специфичного метода, который мог бы быть внедрен в стандартную клиническую лабораторию в качестве рутинного метода генотипирования новых патогенетически значимых для БП и БВ мутаций p.Cys1079Gly и p.Cys1079Phe медь-транспортной АТФазы человека.

Такой способ обеспечивается настоящим изобретением.

Изобретение поясняется двумя фигурами:

Фиг. 1 - Последовательность нуклеотидов (ориентация 5'→3') ПЦР-продукта размером 182 п.н., содержащая сайт узнавания для эндонуклеазы BstAU I. Серым цветом выделены участки, соответствующие разработанным нами праймерам. Значком ↓ обозначено место расщепления ДНК эндонуклеазой BstAU I. Подчеркнут измененный для создания сайта узнавания BstAU I (TGTACA) нуклеотид (А заменен на С). Жирным шрифтом выделены полиморфные нуклеотиды C.3235T и C.3236G, расположенные в сайте узнавания BstAU I.

Фиг. 2 Результаты электрофоретического разделения обработанных эндонуклеазой BstAU I ПЦР продуктов, соответствующих гаплотипам гена АТР7В: мутантный - c.3235T>G, C.3236G (образец 1); мутантный - С.3235Т, c.3236G>T (образец 2); нормальный - С.3235Т, C.3236G (образец 3). Фрагменты 26 п. н. не визуализируются.

Технический результат заключается в разработке способа идентификации полиморфизмов p.Cys1079Gly и p.Cys1079Phe медь-транспортной АТФазы человека с помощью простого и дешевого способа генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов c.3235T>G и c.3236G>T гена АТР7В методом ПЦР-ПДРФ.

Технический результат достигается следующим образом:

Последовательность праймеров:

F: 5'-ACAAGACTGGCACCATTACCCA-3' (SEQ ID NO 1) и R: 5'- ACGCCCAAGTCCACGTAACTCTGTA-3' (SEQ ID NO 2) выбирали на основе нуклеотидной последовательности анализируемого фрагмента ДНК гена АТР7В, имеющейся в базе данных GeneBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/209969670), с помощью программы "PerlPrimer v1.1.21" (https://sourceforge.net/projects/perlprimer/files/PerlPrmer/1.1.21).

Кроме того, в 3' конец обратного праймера (SEQ ID NO 2) была внесена нуклеотидная замена T/G (искусственно измененный нуклеотид подчеркнут). Таким образом, методом ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза [Eiken KG. et al. Application of natural and amplification created restriction sites for the diagnosis of PKU mutations. Nucleic Acids Res. 1991; 19: 1427-1430] в ПЦР-продукте искусственно создается сайт рестрикции для эндонуклеазы BstAU I (сайт узнавания T↓GTAC↓A), который включает в себя возможные полиморфизмы c.3235T>G (rs72377) и c.3236G>T (rs72378) гена АТР7В (Фиг. 1).

Для гомозиготных носителей аллелей С.3235ТТ C.3236GG (вариант нормы) эндонуклеаза BstAU I расщепляет ПЦР-продукт размером 182 п. н. на два фрагмента 156 и 26 п.н. При наличии мутантного аллеля C.3235G или С.3236Т гена АТР7В исчезает сайт узнавания для эндонуклеазы BstAU I и продукт рестрикции визуализируется в виде одного фрагмента размером 182 п.н. Таким образом, у гетерозиготных носителей аллелей C.3235TG C.3236GG или С.3235ТТ C.3236GT присутствуют три фрагмента ДНК: 182, 156 и 26 п.н. Именно такие варианты гетерозиготных генотипов АТР7В описаны у больных БВ и БП [Ilyechova E.Y. et al. Case of Early-Onset Parkinson's Disease in a Heterozygous Mutation Carrier of the ATP7B Gene. J. Pers. Med. 2019; 9: 41; Wang L.-H. et al. Mutation analysis of 73 southern Chinese Wilson's disease patients: Identification of 10 novel mutations and its clinical correlation. J. Hum. Genet. 2011;56:660-665].

Для демонстрации эффективности разработанного способа идентификации полиморфизмов p.Cys1079Gly и p.Cys1079Phe медь-транспортной АТФазы человека и генотипирования соответствующих однонуклеотидных полиморфизмов c.3235T>G и c.3236G>T, наряду с ранее описанными праймерами:

F: 5'-ACAAGACTGGCACCATTACCCA-3' (SEQ ID NO 1) и

R: 5'-ACGCCCAAGTCCACGTAACTCTGTA-3' (SEQ ID NO 2),

были разработаны и использованы обратные праймеры, в последовательности которых, кроме нуклеотидной замены для формирования сайта рестрикции BstAU I, были дополнительно внесены нуклеотидные замены, формирующие в последовательности ПЦР-продуктов мутацию, соответствующую c.3235T>G:

Rml: 5'-ACGCCCAAGTCCACGTAACTCTGTACC-3' (SEQ ID NO 3), или мутацию, соответствующую c.3236G>T:

Rm2: 5'-ACGCCCAAGTCCACGTAACTCTGTAA-3' (SEQ ID NO 4),

искусственно измененные нуклеотиды подчеркнуты.

Использовали образец геномной ДНК здорового добровольца, выделенный из лейкоцитов крови с помощью набора для экстракции ДНК (AmpliSens Biotechnological, Москва, Россия) по протоколам производителя.

Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "Терцик" (ЗАО НПФ "ДНК-Технология"). Реакционная смесь для ПНР (20 мкл) содержала 1,0 мкг геномной ДНК, по 0.2 mM dNTPs, ImM MgSO₄, 0.5 ед. Taq-DNA полимеразы (Thermo Fisher Scientific) и по 50 пмоль каждого из олигонуклеотидных праймеров.

Рестрикцию ПЦР-продуктов эндонуклеазой BstAU I (СибЭнзим) проводили при 37°С в буфере W (10 mM Tris-HCl (рН 8.5 при 25°С); 10 тМ MgCl₂; 100 mM NaCl; 1 mM DTT) согласно протоколу производителя.

Электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов после рестрикции эндонуклеазой BstAU I вели в 2,8% агарозном геле и после окрашивания этидиум бромидом визуализировали в проходящем УФ-свете. Результаты представлены на фиг. 2. При наличии нуклеотидов, соответствующих С.3235Т C.3236G (вариант нормы) эндонуклеаза BstAU I расщепляет ПЦР-продукт размером 182 п. н. на два фрагмента 156 и 26 п.н. (образец 3, фрагмент 26 п.н. не визуализируется). При наличии в ПЦР-продукте нуклеотидов, соответствующих мутантному аллелю C.3235G или С.3236Т гена АТР7В исчезает сайт узнавания для эндонуклеазы BstAU I и продукт рестрикции визуализируется в виде одного фрагмента размером 182 п.н. (образцы 1 и 2, соответственно).

Таким образом, представленные результаты показывают, что предлагаемый способ позволяет с помощью ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза и последующего рестрикционного анализа продуктов амплификации эффективно идентифицировать полиморфизмы p.Cys1079Gly и p.Cys1079Phe медь-транспортной АТФазы человека АТР7В. В связи с низкой себестоимостью анализа, предлагаемый способ генотипирования может быть применен в любой ПЦР-лаборатории с минимальными материальными затратами.

Проведение генетического тестирования пациента в доклинической стадии заболевания (в том числе в рамках семейного скрининга), позволяет своевременно начать превентивную терапию.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ФГБНУ "ИЭМ"

<120> Способ идентификации полиморфизмов Cys1079Gly и Cys1079Phe медь-

транспортной АТФ-азы Вильсона

<140>

<141>

<150>

<160> 4

<170>

<210> 1

<211> 22

<212> Нуклеотидная последовательность

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность прямого праймера

<400> 1

Acaagactgg caccattacc ca 22

<210> 2

<211> 25

<212> Нуклеотидная последовательность

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность обратного праймера

<400> 2

Acgсccaagt ccacgtaact ctgta 25

<210> 3

<211> 27

<212> Нуклеотидная последовательность

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность обратного праймера, формирующего в

последовательности ПЦР-продуктов мутацию, соответствующую c.3235T>G

<400> 3

Acgсccaagt ccacgtaact ctgtacc 27

<210> 4

<211> 26

<212> Нуклеотидная последовательность

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность обратного праймера, формирующего в

последовательности ПЦР-продуктов мутацию, соответствующую c.3236G>T

<400> 4

Acgсccaagt ccacgtaact ctgtaa 26

<---