Результат интеллектуальной деятельности: Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/НЬЮ ЙОРК/15/5364 (H1N1) pdm09 для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А A/17/Нью Иорк/15/5364 (H1N1)pdm09.

В апреле 2009 года Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила о появлении в циркуляции среди людей нового вируса гриппа A(H1N1)pdm. Новый вирус А/Калифорния/07/2009 (H1N1)pdm имеет генетическое родство по определенным генам с вирусами, вызывающими грипп свиней, птиц и человека, и никогда ранее не циркулировал среди людей. Вирус с легкостью передавался от человека к человеку и был более контагиозен, чем сезонные штаммы. ВОЗ рекомендовал использовать этот вирус как прототип для подготовки пандемической противогриппозной вакцины [World Health Organization. Characteristics of the emergent influenza A(H1N1) viruses and recommendations for vaccine development http://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2017_south/en/].

Позднее было обнаружено, что гемагглютинин вируса гриппа А/Калифорния/07/2009 (H1N1)pdm содержит ряд аминокислотных позиций, снижающих его стабильность, а также способность к размножению в развивающихся куриных эмбрионах. В процессе циркуляции природная популяция вирусов приобрела стабилизирующие мутации, в связи с чем H1N1pdm штаммы гриппа более поздних лет выделения более стабильны. Одиночная аминокислотная замена Glu-47-Lys в субьединице НА2 гемагглютинина, расположенная в области ножки, повышает стабильность тримерной молекулы гемагглютинина, влияет на эффективность проникновения вирусной частицы в клетку и, как следствие, инфекционность А/Калифорния/07/2009-подобных вирусов [Cotter CR, Jin Н, Chen Z. A single amino acid in the stalk region of the H1N1pdm influenza virus HA protein affects viral fusion, stability and infectivity. PLoS Pathol. 2014. Vol. 10 (1). P.el003831; Yang H, Chang JC, Guo Z et al. Structural stability of influenza A(H1N1)pdm09 virus hemagglutinins. J. Virol. 2014. Vol. 88 (9). P. 4828-4838].

В связи с вышеизложенным в качестве А/Калифорния/07/2009-подобного вируса был выбран штамм А/Нью Йорк/61/2015 (H1N1)pdm09, гемагглютинин и нейраминидаза которого генетически и антигенно сходны с другими H1N1pdm-подобными вирусами, циркулирующими в настоящее время. Гемагглютинин данного штамма содержит стабилизирующую аминокислотную замену Glu-47-Lys в субъединице НА2, отсутствующую у А/Калифорния/07/2009 эталонного вируса [Cotter CR, Jin Н, Chen Z. A single amino acid in the stalk region of the H1N1pdm influenza virus HA protein affects viral fusion, stabilityand infectivity. PLoS Pathol. 2014. Vol. 10 (1). P.e1003831; Yang H, Chang JC, Guo Z et al. Structural stability of influenza A(H1N1)pdm09 virus hemagglutinins. J. Virol. 2014. Vol. 88 (9). Р. 4828-4838]. Также гемагглютинин штамма А/Нью Йорк/61/2015 (H1N1)pdm09 содержит одиночную замену Asp-127-Glu в субъединице НА1 гемагглютинина, позволяющую повысить показатели репликации в развивающихся куриных эмбрионах без изменения антигенных свойств штамма, что является дополнительным преимуществом при производстве живой гриппозной вакцины [Wang, W., Lu, J., Cotter, С.R., Wen, К., Jin, H., & Chen, Z. (2013). Identification of critical residues in the hemagglutinin and neuraminidase of influenza virus H1N1pdm for vaccine virus replication in embryonated chicken eggs. Journal of virology, 87 (8), 4642-4649].

В результате появления в циркуляции нового высокостабильного эпидемического штамма вируса гриппа, А/Нью Йорк/61/2015 (H1N1)pdm09, известный вакцинный штамм А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1) - прототип [Ларионова Н.В., Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. Штамм вируса гриппа А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей Патент РФ №2413765 от 16.09.09. опубл. БИ 2011, №7] - утратил свою актуальность.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального А/Калифорния/07/2009 (Н1N1)pdm-подобного вакцинного штамма живой гриппозной вакцины для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического вируса А/Нью Йорк/61/2015 (H1N1)pdm09, обладающего стабильностью гемагглютинина и высокой репродуктивной активностью.

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа. Вопросы вирусологии. 1977. №4. С. 387-395].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. С. 66-83].

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), от безвредного донора аттенуации. На основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) был создан вакцинный штамм A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 - прототип.

Получение вакцинного штамма

Вакцинный штамм A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1)pdm09 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Нью Йорк/61/2015 (H1N1) pdm09c донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°C температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированиями методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной (26°C) и оптимальной (32°C) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts, са-фенотип) и по формуле генома на соответствие требованиям, предъявляемым к реассортантному вакцинному штамму.

Антигенная характеристика вакцинного штамма

Изучение антигенных свойств вакцинного штамма A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1)pdm09 показало, что:

- ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА с гомологичной сывороткой антигенно идентичен эпидемическому вирусу А/Нью Йорк/61/2015 (H1N1)pdm09, поскольку показатели взаимодействия реассортанта A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 и родительского штамма А/Нью Йорк/61/2015 (H1N1) pdm09 с крысиной антисывороткой, полученной к вирусу А/Нью Йорк/61/2015 (H1N1)pdm09, полностью совпадали (табл. 1). Кроме того, перекрестная постановка РТГА вирусов А/Калифорния/07/2009 (H1N1) pdm и А/Нью Йорк/61/2015 (H1N1) pdm09 с соответствующими гипериммунными крысиными сыворотками подтвердила близкое антигенное родство этих вирусов (табл. 1);

- второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма нейраминидаза (NA) - проверен методом микс-ПЦР, а также полногеномным секвенированием и идентичен вирусу А/Нью Йорк/61/2015 (H1N1) pdm09.

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали микс-ПЦР анализ ДНК копий генов [Киселева И.В. с соавт. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. №4. С. 29-36], основанный на различиях в размерах соответствующих амплифицируемых фрагментов генов донора аттенуации или «дикого» вируса.

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), принадлежат пандемическому родительскому вирусу А/Нью Йорк/61/2015 (H1N1) pdm09, гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 представлены в табл. 2.

Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома и показали, что вакцинный штамм A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл. 2).

Все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственные за его аттенуацию (табл. 3), присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09. Таким образом, полное секвенирование генома вакцинного штамма A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 показало генетическую стабильность аттенуирующих мутаций.

¹ Лен17 - ген принадлежит донору аттенуацииА/Ленинград/134/17/57 (H2N2);

2 Нью Йорк - ген принадлежит эпидемическому вирусу А/Нью Йорк/61/2015 (H1N1) pdm09.

В гемагглютинине вакцинного штамма A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 присутствует стабилизирующая аминокислота - лизин - в позиции 47 субъединицы НА2, которая, по данным Yang et. al. [Yang H., Chang J.С, Guo Z. et al. Structural stability of influenza A(H1N1)pdm09 virus hemagglutinins. J. Virol. 2014. Vol. 88 (9). P. 4828-4838.] и Cotter et. al. [Cotter C.R., Jin H., Chen Z. A single amino acid in the stalk region of the H1N1pdm influenza virus HA protein affects viral fusion, stabilityand infectivity. PLoS Pathol 2014. Vol. 10 (1). Pe1003831], приводит к повышению стабильности и инфекционности Калифорния-подобных вирусов (Glu-47-Lys).

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 проводили путем его параллельного титрования в развивающихся куриных эмбрионах при разных температурах. Вакцинный штамм A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°C составила менее 3,0 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°C температуре инкубации составила 7,4 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Все результаты фенотипического анализа представлены в таблице 4.

Генетическая стабильность кодирующих мутаций

Генетическую стабильность вакцинного штамма A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций во внутренних генах до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма в куриных эмбрионах. Полногеномное секвенирование показало, что нуклеотидная последовательность вакцинного штамма A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 до и после его пятикратного пассирования, осталась неизменной, в том числе в генах полимеразного комплекса (РВ2, РВ1, РА), ответственных за аттенуирующий фенотип (см. табл. 3). Фенотипические характеристики пассажного варианта также не претерпели никаких изменений (см. табл. 4).

Все вышесказанное подтверждает высокую генетическую стабильность вакцинного штамма A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09.

Безвредность для морских свинок

Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 проводили на морских свинках обоего пола в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям новых иммунобиологических препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». М.:2010. 39 с.] и с «Правилами лабораторной практики» [Правила лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №708н от 23.08.20010. http://www.rg.ru/2010/10/22/laboratornaya-praktika-dok.html].

Морским свинкам вводили однократно 5 мл вакцинного вируса подкожно в дозе 7.0 lg ЭИД₅₀/0.2 мл. Животным контрольной группы вводили подкожно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного. Показана безвредность вакцинного штамма для лабораторных животных при его подкожном введении (табл. 5).

Данные физиологического исследования показали, что подкожное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

¹ВШ - вакцинный штамм A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1)pdm09.

Заключение

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины АЛ7/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Нью Йорк/61/2015 (H1N1) pdm09, структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.

Образец паспорта на вакцинный штамм A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак^®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм A/17/Нью Йорк/15/5 364 (H1N1) pdm09 депонирован 28.11.2016 в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского (Россия RU, 123098, город Москва, улица Гамалеи, 16) под №2836 и имеет характеристики, представленные в образце паспорта штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°C в течение 48 часов - 8.5 log₁₀ ЭИД₅₀/мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:256.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа A/17/Нью Йорк/15/5364 (H1N1) pdm09 может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.