Способ повышения эффективности противохолерной вакцинации для профилактики на экспериментальных животных

Предполагаемое изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к специфической профилактике инфекционных болезней, касающейся повышения эффективности противохолерной вакцинации на модели экспериментальных животных.

Вакцинация является самым эффективным средством, обеспечивающим профилактику социально-значимых инфекций и установление контроля за ними. Однако в настоящее время фиксируется увеличение числа населения со сниженной иммунологической реактивностью. Да и сами вакцины способны вызывать как активацию, так и супрессию отдельных иммунных функций, а вакцинация лиц с нарушениями иммунного статуса может усугубить эти нарушения и быть неэффективной (1), вследствие чего могут происходить обострения латентно протекающих процессов (2). Поэтому ведется активный поиск препаратов (адьювантов, иммуномодуляторов) способных, во-первых, усилить иммунизирующее действие современных вакцин, особенно у лиц с вторичными иммунодефицитами, а во-вторых, направить развитие иммунного ответа по гуморальному или клеточному типу в зависимости от свойств патогена (1; 3). Изучение возможности использования препаратов с иммуномодулирующей активностью на фоне вакцинации является одним из перспективных направлений современной вакцинологии, так как они могут оказывать положительное влияние на развитие антиген-специфического иммунитета, обеспечивая адекватный иммунный ответ на вакцины.

Известен способ увеличения иммунологической эффективности препаратов деацилированных липополисахаридов (ЛПС) сероваров Инаба или Огава возбудителя холеры, а также В-субъединицы холерного токсина посредством их конъюгации с полимерным иммуноадъювантным носителем - полиоксидонием. Полученные конъюгаты на основе деацилированных ЛПС стимулировали формирование антибактериального гуморального противохолерного иммунитета, а на основе В-субъединицы холерного токсина - антитоксический гуморальный иммунный ответ. Все конъюгаты снижали аллергические и другие побочные реакции на вакцинацию (4, 5).

Однако, для обеспечения формирования антибактериального и антитоксического противохолерного иммунитета предложенными способами необходимо получать несколько профилактических препаратов на основе конъюгации антигенов с полиоксидонием. Кроме этого технология их получения достаточно трудоемкая.

Известен способ повышения иммуногенности живых вакцин из rs (sr) штаммов бруцелл (6), заключающийся в том, что используют вакцины из штаммов 82 Brucella abortus и 75/79-АВ Brucella abortus, находящихся в RS-(SR) форме, в сочетании с иммуномодулятором имунофаном, при этом имунофан вводят одновременно с вакциной по 0,3-0,4 мл на морскую свинку. Способ повышает специфический бруцеллезный иммунитет у животных в 2 раза и через 6 месяцев сохраняет иммуногенность вакцинного препарата;

Также известно, что сочетанное применение живой чумной вакцины EV с иммуномодуляторами полиоксидонием и беталейкином существенно повышает ее защитные свойства в модельных опытах по заражению морских свинок, увеличивая как иммуногенную, так и протективную активность живой чумной вакцины (7).

За прототипы выбран способ комплексной профилактики сибирской язвы (8), при котором в серии экспериментов в одном шприце вводили сибиреязвенную вакцину СТИ-ПР с ликопидом В данном эксперименте иммунологическая эффективность вакцины СТИ-ПР под действием ликопида возросла в 1,8 раза по сравнению с одной вакциной, а при его сочетанном использовании с вакциной и с рифампицином - в 3,7 раз. (p<0,05).

Однако для вакцинации против холеры в России используют химическую таблетированную холерную бивалентную вакцину (Регистрационное удостоверение PN 0014665/01, производитель ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора), которая представляет собой смесь холерогена-анатоксина и О-антигенов, полученных из инактивированных бульонных культур Vibrio cholerae O1 классического биовара штаммов 569В или КМ-76 серовара Инаба и М-41 серовара Огава. Вакцина обеспечивает у привитых выработку противохолерного антибактериального и антитоксического иммунитета примерно до шести месяцев.

В отечественной и зарубежной литературе нет каких-либо данных о способах усиления эффективности противохолерной вакцинации.

Техническая задача предполагаемого изобретения состояла в разработке нового способа, позволяющего усилить противохолерный иммунитет у экспериментальных животных за счет сочетанного применения химической таблетированной холерной бивалентной вакцины и иммуномодулятора ликопида.

Поставленная цель достигалась тем, что в способе повышения эффективности противохолерной вакцинации для профилактики на экспериментальных животных, включающием введение вакцины и дополнительных иммуномодулитующих средств, профилактику осуществляют по следующей технологии: первоначально иммунизируют животных для этого однократно таблетированную дозу вакцины, а именно 1/3 человекодозы растирают в ступке и суспендируют в 6,5 мл дистиллированной воды получая суспензию, которую вводят перорально животным (кроликам) по 0,5 мл, причем одновременно с вакцинацией также перорально дают иммуномодулятор ликопид для этого таблетку весом 10 мг растворяют в 1 мл дистиллированной, отбирают 0,27 мл и добавляют к ним еще 4,73 мл дистиллированной воды, затем однократно вводят кролику 0,5 мл полученного раствора включающего 285 мкг ликопида, после этого через месяц иммунизированных и контрольных животных заражают холерой, оценку повышения эффективности противохолерной вакцины определяют по наличию выраженности холерогенного и энтеропатогенного эффектов в тонком кишечнике кроликов, в результате кролики получающие иммуномодулятор при вакцинации не имеют признаков развития заболевания.

Кроме того перед вакцинацией экспериментальных животных поят 5% раствором пищевой соды для снижения повреждающего действия желудочного сока на противохолерную вакцину.

При этом заражают вакцинированных опытных и контрольных животных в перевязанные петли тонкого кишечника, причем в одну лигированную петлю вводят 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия (контрольная петля), в другую (опытную) 10⁹ клеток 24-часовой культуры V. cholerae 569В, выращенной в пептонной воде и суспендированной в 1 мл пептонного раствора.

Для проведения способа используют следующие препараты:

Химическую таблетированную холерную бивалентную вакцину (Регистрационное удостоверение PN 0014665/01, производитель ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора).

«Ликопид®» (глюкозаминилмурамилдипептид) (Регистрационное удостоверение №ЛС-001438, производитель ЗАО «Пептек», Россия) - синтетический аналог структурного фрагмента оболочки (пептидогликана) бактериальных клеток, является активатором врожденного и приобретенного иммунитета, усиливает защиту организма от вирусных, бактериальных и грибковых инфекций, оказывает адьювантный эффект в развитии иммунологических реакций.

Способ осуществляется следующим образом.

Перед применением химической таблетированной холерной вакцины экспериментальных животных (кроликов) поят 5% раствором пищевой соды по 2 мл для снижения повреждающего действия желудочного сока на вакцину.

Рассчитывают дозу вакцины согласно весу экспериментальных животных, взятых в эксперимент, а именно взрослые кролики - 1800-2000 г, исходя из человекодозы, рекомендованной производителем.

Для вакцинации кроликов одну таблетку вакцины (1/3 человекодозы) растирают в ступке и тщательно суспендируют в 6,5 мл дистиллированной воды. Полученную суспензию однократно вводят взрослым кроликам per os по 0,5 мл.

После этого рассчитывают дозу иммуномодулятора ликопида, исходя также из человекодозы, рекомендованной производителем.

Для кроликов таблетку иммуномодулятора (10 мг) растворяют в 1 мл дистиллированной воды, отбирают 0,27 мл, приливают к ним 4,73 мл дистиллированной воды. Сразу после вакцины однократно вводят кроликам per os по 0,5 мл полученного раствора, содержащего 0,285 мг ликопида.

Влияние иммунокоррекции на протективность химической таблетированной холерной бивалентной вакцины оценивают после заражения животных через месяц и через семь месяцев после вакцинации.

Способность иммуномодулятора ликопида усиливать эффективность противохолерной вакцинации у экспериментальных животных подтверждают следующими примерами:

Пример 1. Оценка влияния иммуномодулятора на протективность химической таблетированной холерной бивалентной вакцины на модели изолированной петли тонкого кишечника взрослых кроликов в первый месяц поствакцинального периода

Перед иммунизацией взрослых кроликов (две группы по 4 кролика) поят 2 мл 5% раствора пищевой соды для снижения повреждающего действия желудочного сока на противохолерную вакцину. Сразу после этого животных этих групп однократно иммунизируют перорально прививочной дозой, которую рассчитывают по весу вакцинируемых животных (1,8-2,0 кг) согласно рекомендуемой производителем человекодозе. Опытной группе кроликов одновременно с вакциной однократно перорально вводят 0,5 мл раствора включающего 285 мкг ликопида. Контрольным кроликам (третья группа) перорально вводят 2,5 мл физиологического раствора.

Через месяц у всех иммунизированных (опытных) и контрольных (интактных) животных, после 24-х часового голодания, перевязывают петли тонкого кишечника. Всем животным в одну лигированную петлю вводят 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия (контрольная петля), в другую (опытная петля) - 10⁹ клеток 24-часовой культуры V. cholerae cholerae 569В, выращенной в пептонной воде и суспендированной в 1 мл пептонного раствора. Через 18 часов животных усыпляют и вскрывают. О защитном эффекте вакцины и ликопида судят по наличию выраженности патологоанатомической картины в опытных перевязанных петлях тонкого кишечника животных из опытной и контрольной групп, а именно: наличию жидкости в опытных петлях (холерогенный эффект) и отека слизистой и подслизистой оболочек, кровоизлияний (энтеропатогенный эффект).

При оценке патологоанатомической картины в перевязанных петлях тонкого кишечника у контрольных (интактных) зараженных животных контрольной группы, у всех животных выявлены отек слизистой и подслизистой оболочек, кровоизлияния и некроз покровного эпителия ворсин, что свидетельствовало о наличии ярко выраженного энтеропатогенного эффекта. Опытные перевязанные петли тонкого кишечника всех контрольных животных растянуты и заполнены полупрозрачным содержимым, что свидетельствует о ярко выраженном холерогенном эффекте.

У зараженных вакцинированных животных патоморфологических изменений в опытных петлях тонкого кишечника не выявлено в 75% случаях. У инфициированных вакцинированных животных, получавших иммуномодулятор, энтеропатогенный и холерогенный эффекты отсутствовали у всех взятых в эксперимент животных этой группы, то есть у 100%.

Таким образом приведенные в примере данные свидетельствуют о том, что предложенный способ вызывает у взрослых кроликов формирование более напряженного противохолерного иммунитета.

Пример 2. Оценка влияния ликопида на протективность химической таблетированной холерной бивалентной вакцины на модели изолированной петли тонкого кишечника взрослых кроликов через семь месяцев после вакцинации.

Технологию проведения иммунизации осуществляют также, как в примере 1. Опытной группе кроликов одновременно с вакциной однократно перорально вводят по 0,5 мл раствора включающего 285 мкг ликопида. Контрольным кроликам (третья группа) перорально дают по 2,5 мл физиологического раствора.

При заражении вакцинированных (опытных) и контрольных (интактных) животных, в перевязанные петли тонкого кишечника 10⁹ клеток 24-часовой культуры V. cholerae cholerae 569В, выращенной в пептонной воде и суспендированной в 1 мл пептонного раствора выявлено, что через семь месяцев протективный эффект вакцины регистрировался только у 25% вакцинированных животных. У вакцинированных животных, получавших иммуномодулятор, через семь месяцев поствакцинального периода напряженность противохолерного иммунитета уменьшилась, но была в три раза выше, чем у только вакцинированных животных. Признаков развития заболевания не регистрировалось у 75% животных. У всех зараженных интактных животных (контрольных) присутствовали признаки развития холерогенного и энтерогенного эффектов.

Следовательно приведенные в примере данные свидетельствуют о том, что применение ликопида увеличивает в три раза протективность противохолерной вакцины даже в отдаленные сроки поствакцинального периода.

Пример 3. Оценка действия ликопида на защитные свойства низкой дозы химической таблетированной холерной бивалентной вакцины на модели изолированной петли тонкого кишечника взрослых кроликов.

Последовательность технологических действий такая же, как в примере 1. Две группы животных перорально получают по 2 мл 5% раствора пищевой соды и половинную дозу противохолерной вакцины (для этого рекомендованную производителем человекодозу вакцины разбавляют в два раза). Опытной группе кроликов одновременно с вакциной однократно дают 0,5 мл раствора включающего 285 мкг ликопида. Контрольным кроликам (третья группа) перорально вводят 2,5 мл ЗФР.

При оценке результатов заражения через месяц после вакцинации всех взятых в эксперимент животных в перевязанные петли тонкого кишечника (10⁹ клеток 24-часовой культуры V. cholerae cholerae 569В, выращенной в пептонной воде и суспендированной в 1 мл пептонного раствора) выявлено, что у вакцинированных кроликов, как и у контрольных интактных, наблюдают патогенетическую картину, характерную для холеры: отек слизистой и подслизистой оболочек, кровоизлияния и некроз покровного эпителия ворсин (энтеропатогенный эффект), опытные перевязанные петли тонкого кишечника растянуты и заполнены полупрозрачным содержимым (холерогенный эффект).

У кроликов, получавших иммуномодулятор при вакцинации, признаков развития заболевания не регистрировали.

Пример 4. Оценка влияния ликопида на протективную активность химической таблетированной холерной бивалентной вакцины на модели белых мышей

Перед иммунизацией беспородным белым мышам (две группы по 10 штук) перорально вводят по 0,1 мл 5% раствора пищевой соды для снижения повреждающего действия желудочного сока на противохолерную вакцину, затем однократно дозу вакцины, которую рассчитывают согласно весу вакцинируемых животных (18-20 г), исходя из человекодозы, рекомендованной производителем.

Для этого одну таблетку вакцины (1/3 человекодозы) растирают в ступке и тщательно суспендируют в 6,5 мл дистиллированной воды Для иммунизации белых мышей к 0,1 мл суспензии добавляют 1,9 мл дистиллированной воды, перемешивают и вводят перорально каждому животному по 0,1 мл.

Затем для мышей к 0,1 мл раствора иммуномодулятора добавляли 1,9 мл дистиллированной воды, перемешивают и вводят каждому животному по 0,1 мл раствора, содержащего 2,85 мкг ликопида.

Контрольным животным дают 0,2 мл ЗФР. Через месяц иммунизированных (опытных) животных и контрольных мышей заражают внутрибрюшинно агаризованной культурой Vibrio cholerae cholerae 569В в дозе 10 LD50. О защитном эффекте препаратов судят по количеству выживших на третьи сутки после заражения животных. 100% гибель контрольных (интактных) мышей в течение суток подтверждает наличие холерной инфекции.

Результаты экспериментов по изучению влияния иммуномодулятора ликопида на способность вакцины защищать мышей от генерализованной холеры показывают, что в этой группе выжили 100% вакцинированных животных. Из группы контрольных вакцинированных животных в живых остались около 70%, интактные мыши контрольной группы полностью погибли (см. таблицу).

Приведенные в примере данные свидетельствуют о том, что однократное использование при противохолерной вакцинации иммуномодулятора ликопида предотвращает развитие генерализованной холеры у 100% белых мышей, повышая эффективность специфической профилактики этого заболевания.

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что иммуномодулятор повышает иммуногенные и протективные свойства антигенов, входящих в состав химической таблетированной холерной бивалентной вакцины.

Использование предполагаемого изобретения позволит путем сочетанного применения противохолерной вакцины и ликопида повысить эффективность противохолерной вакцинации в эксперименте, что может служить одним из подходов к совершенствованию специфической профилактики холеры.

Источники информации:

1. Симбирцев А.С., Петров А.В., Пигарева Н.В., Николаев А.Т. Новые возможности применения рекомбинантных цитокинов в качестве адъювантов при вакцинации // Биопрепараты. - 2011. - Т. 41, №1. - С. 16-20.

2. Медуницын Н.В. История, принципы конструирования комбинированных вакцин и проблемы вакцинопрофилактики при их применении // Журн. микробиол. - 2001. - №1. - С. 90-91.

3. Медуницын Н.В., Покровский В.И. Основы иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных болезней. Руководство для врачей. Гэотар-Медиа, 2005.

4. Петров Р.В.; Хаитов P.M.; Некрасов А.В.; Берестецкая Т.З.; Голубинский Е.П.; Урбанович Л.Я.; Марков Е.Ю.; Медведев С.А. Способ получения вакцины против холеры. Патент Российской Федерации №2021817. http://ru-patent.info/20/20-24/2021817.html.

5. Петров Р.В., Хаитов P.M., Некрасов А.В., Берестецкая Т.З., Наумов А.В., Горькова А.В., Джапаридзе М.Н., Щуковская Т.Н. Способ получения вакцины против холеры. Патент Российской Федерации №2021816. http://ru-patent.info/20/20-24/2021816.html.

6. Львова О.В., Ощепков В.Г., Попова Т.Г., Бронников B.C., Гуськова Т.В. Способ повышения иммуногенности живых вакцин из rs (sr)штаммов бруцелл, Патент Российской Федерации №2391999 http://bd.patent.su/2391000-2391999/pat/servl/servletb901.html.

7. Пономарёва Т.С, Дерябин П.Н., Тугамбаев Т.И., Мельникова Н.Н., Адамбеков Д.А. Иммуномодуляция, как способ повышения иммуногенности живой чумной вакцины. Вестник КГМА имени И.К. Ахунбаева, 2015, №3. -С. 95-97.

8. Кожухов В.В., Пименов Е.В., Дармов И.В., Маслов А.В., Сероглазов В.В., Амосов М.Ю., Комоско Г.В. Патент Российской Федерации №2216349. http://www.findpatent.ru/patent/221/2216349.html.

9. Коготкова О.И., Буравцева НП., Еременко Е.И., Ефременко В.И., Аксенова Л.Ю. Сочетанное применение в эксперименте живой противосибиреязвенной вакцины СТИ с ликопидом // Иммунология. - 2004. - №2. - С. 109-111.