Результат интеллектуальной деятельности: Штамм актиномицета Streptomyces malaysiensis Ас-2175 - продуцент макбецина I и валидамицина А, обладающий фунгицидным действием

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, в частности для создания средств зашиты растений от болезней, вызванных Fusarium proliferatum.

Внедрение в сельское хозяйство фунгицидов на основе антагонистически активных штаммов микроорганизмов и их метаболитов является действенной альтернативой использованию химических пестицидов, позволяющей получить экологически безопасную растениеводческую продукцию [Муродова, С.С. Комплексные микробные препараты. Применение в сельскохозяйственной практике / С.С. Муродова, К.Д. Давранов // BiotechnologiaActa. - 2014. - Т. 7. - № 6. - С. 92-101; Trivedi, P. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions / P.P. Trivedi, P.M. Schenk, M.D. Wallenstein, B.K. Singhet // Microbial Biotechnology. - 2017. - V. 10. - Iss. 5. - P. 999-1003]. Являясь природными соединениями, метаболиты микробов-продуцентов исключают загрязнение почвы, не аккумулируются в окружающей среде, легко подвергаются деструкции [Дятлова, К.Д. Микробные препараты в растениеводстве / К.Д. Дятлова // Соросовский образовательный журнал. - 2001. - Т. 7. - № 5. - С. 17-22].

В настоящее время значительная доля урожая многих сельскохозяйственных культур гибнет вследствие поражения посевов грибами рода Fusarium [Тихомиров, А.А. Фузариоз как фактор риска при культивировании пшеницы в условиях искусственных экосистем / А.А. Тихомиров, С.В. Хижняк, С.А. Ушакова, Н.А. Тихомирова, А.М. Павлова // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2019. - Т. 53. - № 3. - C. 89-96]. Помимо экономических потерь, вызванных поражением посевов, употребление пищевых продуктов, изготовленных на основе инфицированного сырья, может вызывать у человека фузариотоксикозы [Павлюшин, В.А. Фузариоз зерновых культур и опасность микотоксинов в России / В.А. Павлюшин // АгроСнабФорум. - 2017. - № 3 (151). - С. 41-43].

Известно, что род Fusarium включает большой набор видов. Для зерновых описано порядка 30 видов грибов рода Fusarium, имеющих различные биоэкологические потребности, степень патогенности и токсино продуцирующую способность [Гагкаева, Т.Ю. Фузариоз зерновых культур / Т.Ю. Гагкаева, О.П. Гаврилова, М.М. Левитин, К.В. Новожилов // Приложение к журналу «Защита и карантин растений». - 2011. - № 5. - 52 с.]. Fusarium proliferatum способен продуцировать фумонозин [Cendoya, E. Effect of fungicides commonly used for Fusarium head blight management on growth and fumonisin production by Fusarium proliferatum / E. Cendoya, M. J. Nichea, M. del Pilar Monge et al. // Revista Argentina de Microbiologia. - 2021. - V. 53. - Iss. 1. - P. 64-74], проявляет определенную резистентность к ряду существующих фунгицидов [Чекмарев, В.В. Гриб Fusarium proliferatum и его чувствительность к современным фунгицидам / В. В. Чекмарев // Colloquium-journal. - 2020. - № 18 (70). URL: https://cyberleninka.ru/article/n/grib-fusarium-proliferatum-i-ego-chuvstvitelnost-k-sovremennym-fungitsidam (дата обращения: 20.07.2021)].

Потенциальными антагонистами фитопатогенных грибов могут выступать стрептомицеты за счет продукции вторичных метаболитов, в том числе летучих [Yang, M. Host and Cropping System Shape the Fusarium Population: 3ADON-producers are ubiquitous in Wheat Whereas NIV-Producers are more prevalent in rice / M. Yang, H. Zhang, X. Kong et al. // Toxins. - 2018. - V. 10. - № 3. - P. 115; Cha, J.Y. Microbial and biochemical basis of a Fusarium wilt-suppressive soil / J.Y. Cha, S. Han, H.J. Hong et al. // The ISME Journal. - 2016. - V. 10. - P. 119-129]. К настоящему времени известно, что прорастание грибных спор, а также рост их гиф может быть ингибирован бактериальными летучими веществами, что достигается путем изменения морфологии грибов, активности их ферментов и экспрессии генов [Cordovez, V. Diversity and functions of volatile organic compounds produced by Streptomyces from a disease-suppressive soil / V. Cordovez, V.J. Carrion, D.W. Etalo et al. // Front. Microbiol. - 2015. - V. 6. - Р. 1081].

Известен штамм актиномицета Streptomyces lydicus, который ингибирует рост фитопатогенных грибов, в том числе Fusarium sambucinetum и стимулирует рост растений [Кроуфорд Д.Л., Хунг В. С. Штамм актиномицета Streptomyces lydicus для защиты растений от грибковой инфекции, композиция для защиты растений от грибковой инфекции (варианты), способ снижения чувствительности растения к грибковой инфекции (варианты) // Патент на изобретение RU 2127521 C1. Заявка: 96102030/13, 29.06.1994. Дата публикации: 20.03.1999]. Описан штамм Streptomyces lateritius для стимуляции роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей сосудистых микозов, вызванных в том числе грибами рода Fusarium [Громовых Т. И., Садыкова В. С., Литовка Ю. А. Штамм актиномицета Streptomyces lateritius 19/97-m, используемый для стимулирования роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей болезней, вызываемых грибами родов Fusarium и Alternaria / Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам // патент на изобретение RU 2261902 С2. Заявка 2003100579/13, 08.01.2003 Дата публикации: 27.07.04. Бюл. № 28]. Streptomyces hygroscopicus sub. sp., который помимо антагонистического действия на фитопатогенные грибы, оказывает инсектицидное действие [Галкина Н. Н., Бесаева С. Г., Асланян Е. М., Лиховидов В. Е. Штамм актиномицета Streptomyces hygroscopicus subsp. ЦКМ В-4561, обладающий фунгицидными, бактерицидными и инсектицидными свойствами / Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам. Патент на изобретение RU 2243259 С2. Заявка: 2002129235/13, 01.11.2002. Дата публикации: 27.12.2004]. Штамм Streptomyces chrysomallus обладает не только большой эффективностью и широким спектром действия в отношении фитопатогенных грибов, но дополнительно проявляет высокую антивирусную и фиторегуляторную активность [Новикова И. И., Бойкова И. В. Штамм актиномицета Streptomyces chrysomallus p-21 для получения биопрепарата полифункционального действия / Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам // Патент на изобретение RU 2226214 C1. Заявка: 2002117842/13, 02.07.2002. Дата публикации: 27.03.2004].

Наиболее близкими к предлагаемому штамму является Streptomyces resistomycificus RECB-31Bи Streptomyces felleus ВИЗР N 8, которые имеет широкий спектр действия против фитопатогенных грибов, в том числе рода Fusarium [Сафин Р. И., Каримова Л. З., Валидов Ш. З., Александрова Н. М. Штамм бактерий Streptomyces resistomycificus recb-31b для получения биопрепарата для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных грибов, стимуляции их роста и повышения урожайности / Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам // Патент на изобретение RU 2737140 С1. Заявка: 2019141758, 13.12.2019. Дата публикации: 25.11.2020. Бюл. № 33; Новикова И. И., Литвиненко А. И., Нугманова Т. А., Калько Г. В. Штамм Streptomyces felleus для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов / Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам // Патент на изобретение RU 2052501 С1. Заявка: 5066773/13, 06.10.1992. Дата публикации: 20.01.1996]. Недостаток данных штаммов актиномицетов заключается в отсутствии способности к продукции летучих веществ, обладающих фунгицидной активностью.

Задача изобретения - получение нового штамма актиномицета Streptomyces malaysiensis 3К9, обладающего фунгицидным действием за счет продукции валидамицина и синтеза летучих веществ.

Поставленная задача решается тем, что предложен штамм актиномицета Streptomyces malaysiensis 3К9, обладающий антагонистической активностью против фитопатогена, с которым связывают накопление фуманозина в зерне. Новый штамм выделен из почвы. Местоположение участка пробоотбора почвы - Фаленский район Кировской области (N 58 21.558 E 051 33.533).

Штамм Streptomyces malaysiensis 3К9 депонирован в Национальном биоресурсном центре - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под номером Ас-2175, как продуцент макбецина I, валидамицина А.

Предлагаемый штамм Streptomyces malaysiensis 3К9 отличается от штаммов прототипов Streptomyces resistomycificus и Streptomyces felleus тем, что он активен против Fusarium proliferatum и способен к продукции летучих веществ, обладающих биоконтрольным действием в отношении данного гриба.

Идентификацию штамма Streptomyces malaysiensis 3К9 проводили согласно определителям Гаузе и др., 1983; Bergey's Manual, 1994, а также с использованием молекулярно-генетических методов по последовательности нуклеотидов 16S рРНК, а также амплификацией видоспецифичного фрагмента, характерного для Streptomyces malaysiensis в Национальном биоресурсном центре - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (Москва).

Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Штамм Streptomyces malaysiensis 3К9 формирует спиральные цепочки спор (на фиг. 1). Является аэробом, оптимальная температура для роста составляет 22 ÷ 27 °С. На плотных питательных средах штамм образует плотные колонии, на большинстве диагностических сред с умеренно обильным или скудным воздушным мицелием (ВМ). Вид ВМ зависит от среды культивирования штамма. Цвет ВМ на минеральном агаре 1 сероватый, с течением времени приобретает черный цвет за счет увлажнения воздухом; субстратный мицелий (СМ) - бесцветный, растворимых пигментов (РП) не образует (на фиг. 2 показано почернение воздушного мицелия Streptomyces malaysiensis 3К9 на минеральном агаре 1).

На среде ISP 3 и глицерин-нитратном агаре цвет ВМ - от белого до серого; СМ - бесцветный, РП отсутствуют. На органическом агаре 2 цвет ВМ - от белого до серого, СМ бесцветный, образуется пигмент желтоватого цвета. Меланоидные пигменты на среде ISP 6 не образует.

На среде ISP 4, ISP 5 цвет ВМ штамма серого, бело-серого цвета; СМ - от бесцветного до слабо желтого; на среде ISP 6 - ВМ белый, скудный, РП отсутствуют. На основании культурально-морфологических признаков, штамм 3К9 наиболее близок к виду Streptomyces hygroscopicus. Согласно таксономической идентификации - Streptomyces malaysiensis.

Streptomyces malaysiensis 3К9 утилизирует инозит, мальтозу и глюкозу. Слабо усваивает маннит, фруктозу, сахарозу, арабинозу, глицерин и рамнозу. Штамм способен к синтезу экзоцеллюлаз.

Штамм 3К9 устойчив к антибиотикам ансамициновой группы - рифампицину; левомицетину; амоксициллину. Streptomyces malaysiensis 3К9 чувствителен к бацитроцину; тетрациклину и эритромицину. Рост штамма ограничивается цефазолином, канамицином (на фиг. 3 показаны зоны чувствительности штамма 3К9 к антибиотикам).

Среди антибиотиков, продуцируемых штаммом методом ВЭЖХ обнаружен макбецин I, валидамицин А (аминогликозид), известный как мощный ингибитор активности трегалазы у грибов, а также растений и насекомых, в связи, с чем широко используется как мощный противогрибковый агроантибиотик.

Биологическая активность штамма в отношении Fusarium proliferatum доказана методом «лунок» и в двойной культуре.

Биологическая активность.

Установлено ингибирующее действие экзометаболитов штамма на рост F. proliferatum. Значение средней величины зоны ингибирования роста F. proliferatum составила 24 мм. Летучие вещества S. malaysiensis 3К9 также ингибируют рост F. proliferatum. Снижение скорости радиального роста F. proliferatum под действием летучих веществ S. malaysiensis 3К9 составило 51,6 % к контролю соответственно (фиг. 4).

Рекомендуемый способ хранения.

Для поддержания и сохранения изолята в лабораторных условиях необходим периодический пересев штамма на свежую скошенную агаризированную овсянную среду. Частота пересева штамма составляет 5 месяцев.

Хранение штамма необходимо проводить в холодильнике, при температуре 5 °С. В пересеваемой культуре нужно выделять несколько колонии, для избегания вероятности селекции мутантов.

Более подробно сущность описываемого изобретения рассказывается в приведенных ниже примерах.

Пример 1. Культивирование штамма и изучение его антагонистических свойств

Изучена динамика роста штамма при глубинном культивировании и периодическом перемешивании на качалке (220 об / мин 8/16 ч) в колбах Эрленмейера на 250 мл на модифицированной жидкой синтетической среде (100 мл), созданной на основе рекомендуемой для выращивания стрептомицетов стандартной среде Гаузе 1 (на фиг. 5 показаны колбы со следующими значениями рН питательных сред, используемых в опыте по исследованию влияния кислотности среды на накопление биомассы штаммом 3К9: 1 - значение рН = 3,5; 2 - значение рН = 4,0; 3 - значение рН = 4,5; 4 - значение рН = 5,0; 5 - значение рН = 5,5; 6 - значение рН = 6,0; 7 - значение рН = 6,5; 8 - значение рН = 7,0; 9 - значение рН = 7,5; 10 - значение рН = 8,0).

Температура культивирования - 20 °С, продолжительность - 14 суток. Модификация среды проведена путем подбора оптимальной кислотности. Выходным параметром являлась концентрация биомассы и антибиотическая активность культуральной жидкости в отношении F. proliferatum. Исследования проведены в диапазоне pH среды, равной 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 ед. рН. Определение биомассы проводили гравиметрическим методом. В результате исследования построена кривая роста биомассы штамма 3К9 в зависимости от рН питательной среды (фиг. 6).

В условиях глубинной культуры в диапазоне рН среды от 7,0 до 8,0 наблюдалось интенсивное накопление биомассы штаммом. Замедление накопления биомассы отмечено в диапазоне рН от 4,5 до 7,5; отсутствие роста - при рН, равном 3,5 и 4,0. Анализ полученных данных позволил заключить, что глубинное культивирование штамма 3К9 на минеральной среде 1 и рН среды от 7,0 до 8,0, обеспечивает максимальный выход биомассы штамма 3К9.

Для оценки влияния рН среды на биосинтетическую активность штамма, 0,5 мл суспензии F. proliferatum заливали плотной питательной средой Чапека. После застывания среды вырезали блочки и заливали в лунки 0,2 мл культуральной жидкости штамма 3К9. На фиг. 7 показаны зоны ингибирования роста F.proliferatum внеклеточными метаболитами штамма 3К9, полученными на средах разной кислотности (значения рН для позиций с 11 по 20 изменяются в диапазоне 3,5 ÷ 8,0 ед. рН с шагом 0,5).

Установлено, что штамм способен продуцировать биоактивные метаболиты антифунгального действия в широком диапазоне рН - от 4,5 до 8,0 (влияние рН среды культивирования штамма 3К9 на продукцию экзометаболитов, ингибирующих рост F. proliferatum, приведено на фиг. 8).

Рост штамма в широком диапазоне кислотности среды с максимумом фунгистатической активности является неоспоримым преимуществом для совместного использования биопрепарата с другими агрохимикатами, при смешивании которых в составе баковых смесей возможно резкое снижение кислотности.

На фиг. 9 показано влияние длительности культивирования штамма 3К9 на накопление биомассы. Для штамма 3К9 отмечено отсутствие выраженной лаг-фазы, установлен быстрый рост клеток сразу после инокуляции (третьи сутки).

На фиг. 10 и 11 показано влияние длительности культивирования штамма 3К9 на его способность ингибировать рост F. proliferatum и биосинтетическую активность (позиции на фиг. 11 демонстрируют зоны ингибирования роста F. proliferatum на: 21 - третьи сутки культивирования; 22 - пятые сутки культивирования; 23 - седьмые сутки культивирования; 24 - десятые сутки культивирования; 25 - двенадцатые сутки культивирования; 26 - четырнадцатые сутки культивирования; 27 - семнадцатые сутки культивирования).

Антагонистический эффект внеклеточных метаболитов штамма 3К9 отмечается на третьи сутки культивирования.

Пример 2. Лабораторная оценка фитотоксичности летучих веществ, продуцируемых штаммом 3К9

Оценку токсичности летучих внеклеточных метаболитов штамма 3К9 исследовали в двойной культуре, создавая физическое разделение между стрептомицетом и семенами растений. Для этого осуществляли предварительное выращивание штамма 3К9 на плотной среде Гаузе 1. Затем вырезали блочки газона (10 мм) и помещали их на крышку чашки Петри. В донце на поверхность среды Мурасиге-Скуга помещали семена клевера (30 шт.). Чашку Петри закрывали, герметизируя стык пленкой Parafilm, чтобы предотвратить утечку летучих веществ. Инкубировали чашки при 22 °С. В контроле действие летучих веществ штамма 3К9 на растения исключали, помещая на крышку чашки Петри блочек стерильной минеральной среды Гаузе 1. Повторность опыта трехкратная.

По истечению девяти суток растения извлекали из чашек считали всхожесть, измеряли длину корня и высоту побега у проростков.

Изменение морфометрических показателей роста клевера красного под действием летучих веществ штамма 3К9 показаны на фиг. 12, где 28 - корень, 29 - побег.

Достоверных отличий по всхожести семян клевера, длине корней и высоте побегов, под действием нелетучих веществ исследуемого штамма стрептомицета не выявлено.

Пример 3. Сравнительная оценка эффективности S. malaysiensis 3К9 и коммерческих биопрепаратов против F. proliferatum

Проведена оценка эффективности культуральной жидкости S. malaysiensis 3К9 и коммерческих биопрепаратов: глиокладин (Trichoderma harzianum, штамм 18 ВИЗР, титр 10⁹ КОЕ/г), фитолавин (комплекс стрептотрициновых антибиотиков, продуцируемых почвенными грибами), фитоспорин-М (Bacillus subtilis) против F. proliferatum. Растворы биопрепаратов готовили согласно инструкции (на 100 мл стерильной дистиллированной воды добавляли 1 таб. глиокладина; 0,2 мл фитолавина; 0,15 г фитоспорина). S. malaysiensis 3К9, предварительно выращивали на жидкой питательной среде Гаузе 1 в течение 7-и суток. Численность составила 1,9×10⁵ КОЕ/л.

В чашки Петри вносили 0,1 мл культуральной жидкости F. proliferatum (6,1×10⁵ КОЕ/л), заливали агаризированной питательной средой Чапека. После застывания среды сверлами диаметром 12 мм вырезали 3 лунки. В лунки заливали 0,1 мл культуральной жидкости стрептомицета / биопрепарата. Контролем служила вода и среда Гаузе 1.

В результате проведенного эксперимента выявлена чувствительность F. proliferatum к S. malaysiensis 3К9 и фитолавину (см. фиг. 13, где 30 - глиокладин; 31 - фитолавин; 32 - фитоспорин; 33 - S. malaysiensis 3К9).

Зоны ингибирования роста F. proliferatum в случае S. malaysiensis 3К9 составила 26 ± 1 мм; фитолавина 15 ± 1 мм.

Пример 4. Совместимость штамма 3К9 с биопрепаратами

Проведено исследование совместимости S. malaysiensis 3К9 с биопрепаратами: глиокладин, фитолавин, фитоспорин-М.

На поверхность агаризированной среды Гаузе 1 штрихом засевали S. malaysiensis 3К9. Сверлами диаметром 12 мм вырезали 3 лунки. В лунки заливали 0,1 мл раствора биопрепаратов, приготовленных согласно инструкции (на 100 мл стерильной дистиллированной воды - 1 таб. глиокладина; 0,2 мл фитолавина; 0,15 г фитоспорина).

В результате эксперимента установлена совместимость S. malaysiensis 3К9 с глиокладином - 30, фитолавином - 31, фитоспорином - 32 (фиг. 14).

Пример 5. Лабораторная оценка эффективности обработки семян культуральной жидкостью S. malaysiensis 3К9

В лабораторном опыте оценивали всхожесть семян, прошедших предпосевную обработку культуральной жидкостью S. malaysiensis 3К9 (1,9×105 КОЕ/л). Опыт проводили в стеклянных емкостях объемом 50 мл. Инфекционный фон создавали путем внесения в предварительно простерилизованную почву массой 30 г 0,1 мл культуральной жидкости F. proliferatum (6,1×10⁵ КОЕ/л). Контролем служила почва, увлажненная стерильной дистиллированной водой. Семена ячменя сорта Белгородский 100 замачивали на 1 час в 25 мл культуральной жидкости, а также ее разведениях с водой в соотношении 1:1, 1:2, 1:50. Обработанные семена высаживали в почву. Герметизировали емкости двойным слоем фольги. Проращивание семян осуществляли в лабораторный условиях, при температуре 20 ± 2 °С, без дополнительного освещения. Учет всхожести семян производили на пятые сутки.

При испытании культуральной жидкости S. malaysiensis 3К9 без разбавления, установлено ее ингибирующее действие на всхожесть семян ячменя (доля взошедших семян составила 10 %).

По сравнению с контрольным фоном всхожесть семян на инфекционном снизилась. При этом с увеличением разбавления культуральной жидкости, биоконтрольное действие S. malaysiensis 3К9 также снижалось. Во всех вариантах опыта, кроме варианта с предпосевной обработкой 1:1, отмечали токсическое влияние инфекционного фона на семена (снижение всхожести более, чем на 20 %) (см. таблицу).

Рекомендуемое разбавление культуральной жидкости S. malaysiensis 3К9 (1,9×105 КОЕ/л) для предпосевной обработки семян 1:1.