Результат интеллектуальной деятельности: Штамм бактерий Lactobacillus paracasei 1, используемый для приготовления пробиотического препарата

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и представляет собой новый бактериальный штамм Lactobacillus paracasei 1, который может быть использован в микробиологической промышленности и при производстве пробиотиков.

Из уровня техники известен штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-2414Д [Коротченя И.Н., Кобурнеев И.В., Гинзбург А.С., Лухвич К.А. Штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКМ, используемый для получения пробиотической кормовой добавки, предназначенной для производства высококачественных кормов, повышающих продуктивность и снижающих риск желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыб. Патент RU 2398872, опубл. 10.09.2010, бюл. №25, заявл. 2008149890/13, 18.12.2008]. Он обладает высоким уровнем выживаемости за счет образования споровых форм бактерий, что обеспечивает возможность хранения его в жидком виде при положительных температурах в течение одного года. Недостатком данного штамма является то, что он выделен из почвы и является нетипичным для микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных, поэтому быстро элиминируется и оказывает непродолжительный пробиотический эффект.

Известен штамм бактерий Lactobacillus amylovorus БТ - 24/88 ВКПМ В-6253, выделенный из содержимого слепой кишки молочного поросенка [Тараканов Б.В. Штамм бактерий LACTOBACILLUS AMYLOVORUS, используемый для производства пробиотика лактоамиловорина. Патент RU №2054478, опубл. 20.02.1996, заявл. 5063804/13, 01.10.1992], используемый для приготовления ветеринарного пробиотического препарата «Лактоамиловорин». Данный штамм характеризуется высокой скоростью образования биомассы (биологическая концентрация на 14-16 час культивирования достигает (3,0±1,5)⋅10⁹ КОЕ/мл), высоким уровнем кислотообразования. Недостатками данного штамма является низкая адгезивная активность и уровень антагонистической активности в отношении разных видов условно-патогенных энтеробактерий (см. Таблицы 1 и 2). Кроме того, использование штаммов Bacillus licheniformis ВКМ В-2414Д и Lactobacillus amylovorus БТ - 24/88 ВКПМ В-6253 ограничивается ветеринарной практикой. В составе пробиотических препаратов, предназначенных для нормализации микрофлоры человека, они не применяются.

Известен штамм Lactobacillus plantarum 8Р-А3. Данный штамм входит в состав пробиотического препарата «Лактобактерин» [http://www.gastroscan.ru/handbook/145/1878]. Он обладает высокой адгезивной активностью в отношении эритроцитов человека. Недостатком данного штамма являются низкий уровень кислотообразования, низкая скорость нарастания биомассы: биологическая концентрация лактобацилл через 54 часа культивирования достигает (3,0±0,6)⋅10⁹ КОЕ/мл. [Динамика содержания лактобацилл, микробных метаболитов и антибактериальной активности растущей культуры Lactobacillus plantarum 8Р-А3 / Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Малов А.А., Шабалина М.Р, Дармов И.В. / Журнал инфектологии. - 2013. - №3. - С. 50-55]. Кроме того, уровни антагонистической и адгезивной активностей данного штамма низкие.

Задачей изобретения является расширение номенклатуры бактериальных штаммов с выраженными пробиотическими свойствами, обладающих высокой антагонистической активностью, высоким уровнем кислотообразования, повышенными адгезивными свойствами, устойчивостью к ряду антибиотических препаратов и высокой скоростью накопления биомассы.

Осуществление изобретения

Штамм Lactobacillus paracasei 1 выделен из кишечного содержимого здорового молочного поросенка. Данный штамм обладает высокой антагонистической активностью в отношении условно-патогенной микрофлоры, выраженным кислотообразованием, природной устойчивостью к ряду антимикробных препаратов. Высокий уровень адгезивной активности как в отношении эритроцитов человека, так и в отношении эритроцитов свиньи открывает перспективы использования данного штамма в составе биопрепаратов как в медицинской, так и в ветеринарной практике. Lactobacillus paracasei 1 активно размножается в жидких и на плотных питательных средах, обладает хорошей выживаемостью с сохранением пробиотических свойств в процессе длительного хранения в виде суспензии. Штамм Lactobacillus paracasei 1 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП ГосНИИгенетика) под регистрационным номером ВКПМ В-11821 в 2014 году.

Штамм можно использовать для приготовления жидкой и сухой форм пробиотика, а также для приготовления биопрепарата в виде культуральной жидкости, освобожденной от микроорганизмов. При скармливании поросятам в период отъема повышает сохранность и привесы живой массы поросят, ингибирует в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) гемолитические формы бактерий, патогенные стафилококки, патогенные и условно-патогенные энтеробактерии, восстанавливает качественный и количественный состав микрофлоры.

Предлагаемый штамм бактерий характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки

На плотной питательной среде MRS через двое суток инкубирования формирует колонии диаметром 1-2 мм, непрозрачные, белого цвета, блестящие, круглые по форме с выпуклой бугристой поверхностью. Край колонии неровный. При микроскопировании выявлены грамположительные палочки, прямой и закругленной формы. В жидкой питательной среде MRS-4 формирует диффузный рост, на дне пробирки образует рыхлый осадок.

Физиолого-биохимические признаки

Неподвижный, бесспоровый факультативный анаэроб, каталазоотрицательный, обладает амилолитической активностью. Оптимальные условия культивирования: температура (37±2)°С, микроаэрофильные условия с содержанием углекислого газа 5%. Способен расти при температурах (15±2)°С и (45±2)°С, сбраживает углеводы: глюкозу, крахмал, фруктозу, декстрозу, маннозу, инулин, эскулин.

Штамм непатогенен, не обладает вирулентностью и токсичностью.

Культура хранится в полужидкой среде MRS при температуре 6-8°С и в лиофильно высушенном состоянии.

Штамм проявляет устойчивость к стрептомицину в концентрации более 50 мкг/мл, гентамицину (более 20 мкг/мл) и канамицину (более 25 мкг/мл).

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Выделение штамма Lactobacillus paracasei 1 ВКПМ В-11821

Штамм Lactobacillus paracasei 1 ВКПМ В-11821 выделен из кишечного содержимого молочного поросенка в Кировской области в 2012 году следующим образом:

1,0 г каловых масс вносили в пробирки с 9 мл физраствора, готовили десятикратные разведения и проводили высевы из 3, 4 и 5 разведений на чашки с плотной питательной средой MRS следующего состава (г/л): гидролизат казеина - 10,0; пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; глюкоза - 20,0; ацетат натрия трехводный (CH₃COONa⋅3H₂O) - 5,0; цитрат аммония двухзамещенный (С₆Н₉О₇H(NН₄)₂) - 2,0; калий фосфорнокислый двухзамещенный (K₂НРО₄) - 2,0; магний сернокислый семиводный (MgSO₄⋅7H₂O) - 0,02; марганец сернокислый четырехводный (MnSO₄⋅H₂O) - 0,05; твин 80-1,0; агар - 15,0, дистиллированная вода до 1 л; рН среды - 7,0-7,2. Культивирование проводили при температуре 37°С в микроаэрофильных условиях с содержанием углекислого газа в атмосфере 5% в течение 24 часов. По окончании культивирования на поверхности агара наблюдали появление белых непрозрачных колоний диаметром 1-2 мл.

Чистую культуру бактерий получали из накопительной культуры с помощью рассева по методу Дригальского при аналогичных условиях культивирования. По фенотипическим, культурально-морфологическим, биохимическим признакам в соответствие с [Dworkin, М. Procaryotes. Third edition / М. Dworkin., S. Falkow, E. Rossenberg, K.-H. Schleifer, E. Stackebrandt. - 2001. - Vol. 1] и по результатам анализа нуклеотидных последовательностей 16S рРНК идентифицирована как штамм Lactobacillus paracasei 1.

Пример 2. Исследование адгезивности штамма

Оценку адгезивных свойств лактобактерий осуществляли с помощью фотоколориметрического экспресс-метода. [Оборин, В.А. Бактериофиксирующая активность эритроцитов в отношении вакцинных штаммов возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза и обоснование ее роли в патогенезе данных заболеваний: дис. … д-ра мед. наук: 14.03.03 / Оборин В.А. - Саратов, 2011. - 261 с: ил.]. Субстратом для адгезии лактобацилл служили эритроциты человека 0(I) Rh+ группы крови и эритроциты свиньи. Лактобациллы выращивали в течение 24 часов на плотной питательной среде MRS при температуре (37±1)°С. Выросшие культуры смывали фосфатно-буферным раствором (рН 7,2-7,3 ед.) и готовили суспензии с оптической плотностью, равной 1,0. В пробирки вносили по 1 мл взвеси трижды отмытых эритроцитов в фосфатном буфере с концентрацией 10⁹ кл/мл и 2,5 мл суспензии исследуемых культур лактобактерий. Контролем служили пробы, содержащие 2,5 мл суспензии микробных клеток и 1 мл фосфатно-буферного раствора (контрольная проба №1); 1 мл суспензии эритроцитов и 2,5 мл фосфатно-буферного раствора (контрольная проба №2). Опытные и контрольные пробы инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 30 мин. Для осаждения эритроцитов пробы центрифугировали со скоростью 1000 об/мин в течение 2 мин, затем отбирали надосадочную жидкость в объеме 2 мл и измеряли ее оптическую плотность. В каждой серии опытов выполняли по пять независимых определений.

Использовали следующие критерии оценки выраженности адгезивных свойств у лактобактерий в отношении человеческих и свиных эритроцитов: при показателе адгезии более 40% - высокий уровень адгезивной активности, при показателе адгезии от 15 до 40% - средний уровень адгезивной активности, при показателе адгезии от 5 до 15% - низкий уровень адгезивной активности, при показателе адгезии менее 5% степень адгезии бактерий считалась нулевой.

Адгезивные свойства лактобактерий в отношении эритроцитов человека и свиньи оценивали по формуле:

где ПА - показатель адгезии,

Д_к1 - оптическая плотность надосадочной жидкости в 1-й контрольной пробе,

Д_к2 - оптическая плотность надосадочной жидкости во 2-й контрольной пробе,

Д_оп - оптическая плотность надосадочной жидкости в опытной пробе.

Средние значения полученных результатов представлены в таблице 1.

Анализируя данные таблицы 1, можно сделать заключение о том, что уровень адгезивной активности штамма L. paracasei 1 как в отношении эритроцитов человека, так и в отношении эритроцитов свиньи - высокий, штамм L. plantarum 8P-A3 обладает высокой адгезивной активностью только в отношении эритроцитов человека. Уровень адгезии L. amylovorus БТ - 24/88 к эритроцитам свиньи - высокий, но на 8% (по показателю адгезии) ниже, чем у заявляемого штамма.

Адгезивная активность бактерий является важным фактором в процессе колонизации бактериями слизистых оболочек организма, в частности, слизистой желудочно-кишечного тракта. Высокий уровень адгезивной активности обеспечивает длительную персистенцию лактобацилл в желудочно-кишечном тракте, следовательно, более выраженное ингибирующее воздействие на условно-патогенную микрофлору за счет антагонистической активности, также создаются благоприятные условия для преимущественного развития бенефициантной микрофлоры. Высокий уровень адгезивной активности как в отношении эритроцитов человека, так и в отношении эритроцитов свиньи открывает перспективы использования данного штамма в составе биопрепаратов как в медицинской, так и в ветеринарной практике.

Пример 3. Антагонистические свойства штамма

Оценку антагонистических свойств штаммов лактобацил осуществляли в условиях in vitro с помощью двухслойной методики по Фредерику. [Fridericq P. Actions antibiotiques reciproques chez les Enterobacteriacees Revue Belge de Patologie et de Medicine Experimentale, 19, Supp.4 1-107 (1948)].

Суть данной методики заключается в следующем: на чашку с плотной питательной средой MRS наносят 0,01 мл суточной бульонной культуры лактобактерий. Посевы инкубируют в течение 24 ч при температуре (36±2°С) при содержании СO₂ в газовой смеси 5%. Для лизиса бактерий в колониях на крышку перевернутой чашки Петри помещают фильтровальную бумагу и наливают 1 мл хлороформа и экспонируют в течение 30 минут. Затем чашки проветривают в течение 3-5 мин. Индикаторные тест-штаммы, в отношении которых определяется антагонистическая активность, в течение суток подращивают в мясопептонном бульоне, затем добавляют по 0,5 мл к 2,5 мл расплавленному и охлажденному до (56±2)°С полужидкого агара, быстро перемешивают и выливают на поверхность питательного агара с колониями исследуемых штаммов. Наклоняя чашку из стороны в сторону равномерно распределяют полужидкий агар по поверхности. Затем посевы инкубируют в течение 24 ч при температуре (36±2)°С. Вокруг колоний лактобактерий должны появиться зоны ингибирования роста тест-штаммов.

В качестве тест-штаммов был использован набор культур разных видов энтеробактерий, выделенных из кишечного содержимого поросят-отъемышей, сильно отстающих в росте. В качестве контрольного тест-штамма использовали штамм E.coli С 600, который является универсальным индикаторным штаммом и используется для оценки антагонистических свойств разных видов микроорганизмов. В таблице 2 представлены данные об уровне антагонистической активности штаммов L. paracasei 1, L. plantarum 8Р-А3, L. amylovorus БТ - 24/88.

Анализируя данные таблицы 2, можно сделать заключение о том, что наиболее выраженными антагонистическими свойствами из числа изученных обладает штамм L. Paracasei 1, в среднем превышая уровень антагонистической активности штаммов (по диаметру зоны задержки роста) L. plantarum 8Р-А3, на 5-40%, L. amylovorus БТ- 24/88 на 5-25%.

Пример 4. Исследование уровня кислотообразования

Известно, что антагонистические свойства лактобацилл в значительной мере обусловлены кислотообразующей активностью. В связи с этим представлялось целесообразным изучить это свойство у лактобактерий исследуемых штаммов по методике Тернера (см. Таблицу 3).

Для выявления способности к кислотообразованию Lactobacillus paracasei 1 ВКПМ В-11821 засевали во флаконы с 25 мл жидкой питательной среды MRS и инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 48 часов. По окончании инкубации определяли кислотообразующую активность лактобактерий титрометрическим методом Тернера. Каждую пробу культуральной жидкости объемом 10,0 см³ титровали 0,1М раствором NaOH. При этом показатель рН раствора NaOH контролировали потенциометрически, значение его должно составлять (8,5±0,1) ед.

Расчеты производили по формуле:

где а - объем 0,1М раствора NaOH, пошедший на титрование, мл;

К - поправка к титру NaOH;

Т₀ - градус Тернера, условная величина, выраженная в количестве щелочи использованном при титровании 1,0 мл исследуемой суспензии.

Пример 5. Использование штамма Lactobacillus paracasei 1 для приготовления жидкой, сухой и фугатной (освобожденной от микроорганизмов культуральной жидкости) форм пробиотического препарата

Для приготовления жидкой формы пробиотического препарата в качестве посевного материала использовали замороженную в 10% растворе глицерина культуру L. paracasei 1 (биологическая концентрация составляет (1,2±0,4)⋅10¹⁰ КОЕ/мл), полученную путем глубинного культивирования в биореакторе LiFlus GX (Bio-Tron Inc, Корея) с последующим концентрированием методом центрифугирования. Для выращивания лактобацилл использовали жидкую питательную среду МРС на капустном отваре, рН (7,0±0,5) ед. Культивирование лактобацилл проводили при температуре (37±1)°С с аэрированием (4 л/мин) со скоростью вращения мешалки 60 об/мин. В качестве источника углерода использовали глюкозу, которую вносили в питательную среду в процессе ее приготовления до конечной концентрации 2%. Процесс выращивания осуществляли в течение 16 часов, каждые три часа проводили отбор проб с целью определения биологической концентрации и отсутствия посторонней микрофлоры. Корректировку рН культуральной жидкости в процессе выращивания лактобацилл не проводили.

Штамм Lactobacillus paracasei 1 обладает высокой скоростью накопления биомассы. При изучении скорости накопления биомассы при начальной посевной дозе штамма (0,9±0,1)⋅10⁸ КОЕ/мл каждые три часа проводили отбор проб и определяли биологическую концентрацию бактерий в культуральной жидкости. Результаты определений представлены в таблице 4.

Графическое отображение динамики роста лактобактерий при культивировании в биореакторе представлено на Фигуре.

По завершении процесса глубинного культивирования отбирали пробы нативной культуры и определяли показатель концентрации водородных ионов в жидком биопрепарате. Биологическая концентрация лактобактерий была не менее 6⋅10⁹ КОЕ/мл (см. Таблицу 5). Для обеспечения хорошей выживаемости лактобактерий в процессе хранения до 1 месяца при температуре (6±2)°С в культуральную жидкость вносили сахарозу до конечной концентрации 10%.

Использование штамма Lactobacillus paracasei 1 для приготовления сухой формы пробиотического препарата

Для получения сухой формы биопрепарата использовали культуральную жидкость, полученную как в вышеописанном примере. Для концентрирования бактериальной массы использовалась центрифуга Avanti JE (Beckman Coulter, США) при режиме центрифугирования 3000 об/мин в течение 8 мин при 25°С. Надосадочную жидкость декантировали, после чего к полученной суспензии лактобацилл добавляли защитную среду для лиофилизации, содержащую 20% сахарозы и 2% желатина в соотношении 1 объем защитной среды к 1 объему концентрата микробной культуры. На следующем этапе проводили лиофилизацию по общепринятой технологии с использованием сушилки лиофильной Freezone 12 (Labconco, США). В 1 г полученного сухого препарата содержалось не менее 19⋅10¹⁰ млрд живых микробных клеток (см. Таблицу 5).

Приготовление фугата культуральной жидкости Lactobacillus paracasei 1

Фугат представляет собой вторичный продукт, полученный при производстве сухой формы пробиотического препарата. Он содержит продукты метаболизма, компоненты питательной среды и лизированные бактерии. Для получения фугата культуральной жидкости Lactobacillus paracasei 1 использовали надосадочную жидкость, полученную после концентрирования бактерий методом центрифугирования.

Пример 6. Ростостимулирующие и лечебно-профилактические свойства препарата на основе Lactobacillus paracasei 1.

Ростостимулирующие и лечебно-профилактические свойства биопрепарата проверяли на поросятах-отъемышах в возрасте (25±4) дней сразу после отъема от свиноматки. В этот период в связи со сменой рациона кормов и стрессом они наиболее восприимчивы к различным инфекциям, особенно к желудочно-кишечным.

В опыте использовали три формы биопрепарата, полученные как описано в примере 3: жидкий, сухой и фугат культуральной жидкости. Всего в эксперименте было задействовано 120 поросят, из которых были сформированы 4 группы по 25-30 голов в каждой: 3 опытные и 1 контрольная. Каждую группу животных помещали в отдельную секцию. Препараты выпаивали один раз в сутки в течение двух циклов по 10 дней каждый. Перерыв между циклами составлял 10 дней

Первой опытной группе поросят в течение первого цикла выпаивали жидкий препарат в количестве 3-4 мл на голову и 8-10 мл - в течение второго цикла выпаивания; вторая группа получала сухую форму препарата в количестве 0,2-0,3 г на голову в течение первого цикла приема биопрепарата и 0,4-0,6 г - в течение второго цикла приема; третья группа поросят получала фугат микробной культуры в количестве 10-15 мл на голову в течение первого цикла приема препарата и в количестве 20-25 мл - в течение второго цикла, четвертая группа поросят - контрольная - не получала пробиотический препарат. Рацион питания и условия содержания поросят во всех секциях были одинаковыми. Проводили ежедневное клиническое наблюдение и учет живой массы поросят с периодичностью раз в неделю в каждой группе. Также оценивалась выживаемость поросят (см. Таблицу 6) и проводился анализ качественного и количественного видового состава микрофлоры кишечного содержимого (см. Таблицу 7).

Анализируя данные таблицы 6, можно сделать заключение о том, что исследуемые формы биопрепарата на основе штамма L. paracasei 1 повышают среднесуточные привесы поросят на 7,6-20,3% по сравнению с контрольными группами, среднее значение живой массы на 2,1-10,5%, а сохранность на 2,7-10%. По результатам ежедневного клинического наблюдения было отмечено, что заболеваемость и тяжесть протекания болезней в опытных группах ниже по сравнению с контрольными.

Микрофлору фекалий поросят исследовали на протяжении всего срока выпаивания пробиотических препаратов. Определяли популяционный состав бактерий группы кишечной палочки, лактобацилл, бифидумбактерий, стафилококков, гемолитических форм бактерий, условно-патогенных и патогенных энтеробактерий, дрожжеподобных бактерий. Результаты микробиологических исследований представлены в таблице 7.

Данные таблицы 7 показывают, что сразу после отъема поросят от свиноматки и первого цикла пробиотикотерапии наблюдалось снижение содержания кишечной палочки с нормальной ферментативной активностью во всех группах поросят. В опытных группах к концу пробиотикотерапии содержание лактозопозитивной кишечной палочки повышалось: в первой и второй группах - практически до исходного значения, в третьей опытной группе также повышалось, но осталось на порядок ниже нормы. В контрольной группе содержание лактозопозитивной кишечной палочки после отъема понижалось и осталось ниже нормы почти на 3 порядка.

Содержание лакто- и бифидобактерий в первой и второй опытных группах к концу пробиотикотерапии нормализовалось. В третьей опытной группе содержание лактобацилл и бифидобактерий к концу пробиотикотерапии также увеличивалось, но осталось ниже нормы почти на порядок. В контрольной группе содержание лактобацилл после отъема поросят снижалось и оставалось ниже нормы более чем на два порядка. Содержание бифидобактерий в контрольной группе осталось почти на порядок ниже нормы.

Содержание непатогенных стафилококков в кишечном содержимом поросят первой и второй опытных групп осталось на начальном уровне, в третьей опытной и контрольной группе возрастало к концу пробиотикотерапии.

Содержание энтеробактерий со слабовыраженной ферментативной активностью в контрольной группе поросят находилось на уровне (6,95±2,04) lg КОЕ/г на протяжении всего опыта. В опытных группах до приема пробиотика содержание энтеробактерий со слабовыраженной ферментативной активностью находилось на уровне (4,50±2,54) lg КОЕ/мл, а в конце опыта патогенные энтеробактерий и энтеропатогенные и лактозонегативные кишечные палочки не высевались.

Содержание гемолитических форм бактерий в кишечнике поросят-отъемышей контрольной группы составило - (8,1±1,6)% на начало опыта, в первой, второй и третьей опытной группе: (7,3±0,83)%, (7,29±0,56)% и (7,0±0,16)% соответственно. К концу опыта гемолитические формы бактерий обнаруживались только у поросят контрольной группы (6,15±1,91%).

Содержание энтерококков в фекалиях поросят всех групп находилось на уровне (7,21±1,19) lg КОЕ/мл и достоверно не изменялось на протяжении всего курса пробиотикотерапии. Содержание цитратредуцирующих микроорганизмов {Pseudomonas aeruginosa) до приема пробиотика во всех группах составляло (4,49±1,07) lg КОЕ/мл, после приема пробиотика из кишечного содержимого поросят опытных групп данная категория микроорганизмов не высевалась, в контрольной группе концентрация составляла (4,58±0,71) lg КОЕ/мл.

Таким образом, штамм Lactobacillus paracasei 1 обладает выраженной антагонистической активностью в отношении энтеропатогенных микроорганизмов, высоким уровнем кислотообразования, высокой адгезивной активностью в отношении эритроцитов человека и эритроцитов свиньи, нормализует микрофлору кишечника поросят, оказывает ростостимулирующий эффект, повышает сохранность поголовья.