Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI ИЛИ SALMONELLA В ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ БИОРЕАКТОРАХ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для интенсификации производства вакцинных препаратов на основе биомассы микроорганизмов - энтеробактерий вида Escherichia coli и видов Salmonella.

Известны периодические процессы культивирования с добавлением субстрата (см. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, т. 2, гл. 9.1.1. - М.: Мир, 1989), где производится одноразовая загрузка питательной среды в биореактор, стерилизация, инокуляция посевным материалом, культивирование при непрерывном перемешивании и аэрации или в анаэробных условиях и дробное введение субстрата/ов. Эти процессы стараются проводить при поддержании постоянных физиологических условий культивирования: pH, скорость массопередачи кислорода на стадиях активного роста биомассы и иногда окислительно-восстановительный потенциал. Однако при ведении периодических процессов технически сложно, а подчас и невозможно обеспечить оптимальные значения иных физиологических параметров на более низком молекулярном и клеточном уровнях, необходимых для полноценного роста и деления клеток, как то оптимальные концентрации отдельных компонентов питания для быстрейшего протекания биохимических процессов, что говорит о наступлении условий несбалансированности питательной среды. Причиной несбалансированности питательной среды может являться различная скорость потребления каждого отдельного компонента, что приводит часто к исчерпанию одних компонентов и избытку иных компонентов, т.е. происходит разбалансирование питательной среды, что сопровождается снижением скорости роста биомассы, вплоть до полной остановки роста. Например, исчерпание глюкозы в питательной среде приводит к резкому снижению скорости роста клеток при переключении их на иной источник углерода и энергии. Другой крайностью может быть избыточная концентрация субстратов, что тоже влечёт снижение скорости роста клеток и часто может полностью остановить рост биомассы по причине возникающего ингибирования отдельных клеточных реакций и роста в целом.

Известен Способ промышленного культивирования штаммов E.coli, с повышенным синтезом биомассы и выходом целевого белка в тельцах включения по патенту РФ №2473683, опубл. 27.01.2013. Способ культивирования основан на использовании созданных на основе штамма BL21(DE3) рекомбинантных штаммов-продуцентов и предусматривает их глубинное культивирование на питательной среде при дробном добавлении питательных субстратов, являющихся ингибитором, нейтральным веществом и индуктором по отношению к lacUV5 промотору, в процессе биосинтеза. Предусматривающий: выращивание инокулята до середины логарифмической фазы роста на питательной среде, где в качестве источника углерода используют глюкозу в концентрации 10 г/л, при температуре 38°С, перемешивании 200 об/мин, времени культивирования 3 ч; засев ферментера инокулятом с посевной дозой 10%; культивирование микроорганизмов при 38°С, концентрации растворенного кислорода 80% при максимальной скорости перемешивания 1200 об/мин, максимальном уровне аэрации 1 объем воздуха/мин: 1,2 объема культуральной жидкости, рН=7,00; - окончание ферментации на 12-13 ч культивирования; осаждение клеток штамма-продуцента E.coli, при этом вначале культивирования добавляют 50%-ный (мас.%) раствор глюкозы, в середине логарифмической фазы роста производится порционная добавка 80%-ного (мас.%) раствора глицерина и с конца логарифмической фазы роста культуры осуществляются дробные добавки 25%-ного (мас.%) раствора лактозы. Процесс длится до 12 часов, количество биомассы до 85 о.е.

Однако недостатками предлагаемого способа являются:

- Более низкий уровень массопередачи кислорода, который можно оценочно определить из представленных в патенте данных. Для середины процесса ~4 часа роста (середина логарифмической фазы роста согласно патента 2473683) - биомасса составляет около 10 г/л. Если принять значение экономического коэффициента по глюкозе для экспоненциальной фазы роста, Y = 0,6-0,7 [Таблица 1 в https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3698069/] то оцениваемое суммарное потребление этого субстрата за 4 часа будет равно ~14 г/л или, в среднем, 3,5 г/(л*ч), что соответствует ~2 ммоль O₂/(л*мин). При этом если учитывать, что значительная часть глюкозы распадается на продукты неполного окисления при высоких значениях pO₂, как положено по условиям известного решения, то реальный массообмен по кислороду должен быть ещё ниже.

- Низкий объём реакторов/ферментёров для производственного процесса - до 30 литров общего объёма, в то время как предлагаемый способ рассчитан на реакторы/ферментёры объёмом до 1 м³.

- Комплексный характер углеродного субстрата, состоящего из 3 веществ - глюкозы, глицерина и лактозы.

- Отсутствие единообразного алгоритма подпитки иными компонентами для преодоления различных биохимических барьеров, связанных с ингибированием или лимитированием этими компонентами по отдельности или вместе.

- Подпитки, которая имела бы простоту использования при реализации технологического процесса.

- Использование алгоритма исследовано только для вида E.coli, а другие энтеробактериальные виды не исследовались.

Для преодоления вышеуказанных негативных тенденций используется культивирование с подпитками. Подпиткой может быть как отдельный компонент, например глюкоза или источник азота, так и смесь компонентов.

Известен Способ получения биомассы аэробнорастущих микроорганизмов по патенту РФ №2111246, опубл. 20.05.1998, где используется концентрированная подпитка, компоненты которой сбалансированы в определённом соотношении, включающий периодическое культивирование и подпитку питательной средой, что проводят культивирование при кислородном лимитировании, достигаемом выращиванием при массообмене 0,40 - 1,50 моль О₂/(м³·мин) или уменьшением его в последние 3 ч культивирования на 50%, и подпитку концентрированной средой той же основы, что и первоначальная среда засева, при соотношении C : N : P : Mg в пределах (7,0 ± 2,0) : (1,2 ± 0,5) : (0,5 ± 0,2) : (0,15 ± 0,09), обеспечивающую конечный расход компонентов среды в реакционном объеме в количестве, превышающем их ингибирующие концентрации или составляющем не менее двухкратной от обычной концентрации.

Но соблюдение условий приблизительно соответствующим распространённому элементному составу сухой биомассы и данный способ применяется для условий культивирования, когда исходный состав питательной среды не проявляет ингибирующие свойства в самом начале ферментации. При этом область значений скорости потребления кислорода находится в пределах 0,4-1,5 ммоль O₂ на 1 л среды в 1 мин.

Однако использование данного способа затруднительно для получения повышенных концентраций биомассы, если исходная питательная среда обогащена питательными веществами в такой значительной степени, что это может вызывать ингибирование компонентами питания.

Способ получения биомассы E.coli и Salmonella согласно известному решению, выбранному в качестве прототипа, проводят следующим образом. Выращенную и проверенную на чистоту роста посевную (матровую) культуру засевают в биореакторы через пробоотборник в количестве 8 – 10% от объема питательной среды следующего состава:

- бульон Хоттингера, состоящий из: основного перевара Хоттингера, разведенного водой до содержания аминного азота 250-300 мг%,

- 0,5% пептона, 0,5% хлористого натрия,

- 0,3% химически чистого двуосновного фосфорнокислого натрия

Культивируют микроорганизмы 12 – 14 часов при:

- температуре 37 ±1°С,

- непрерывной аэрации (1,5 – 2 объема воздуха на объем среды в мин),

- непрерывном перемешивании при 120 – 150 об/мин.

Через каждые 2 часа культивирования из реактора берут пробы для определения концентрации, чистоты культуры и рН,

Для улучшения роста микроорганизмов и снижения рН добавляют стерильный 40%-ный раствор глюкозы из расчета 1 л раствора на 100 л среды при достижении значений 7,8-8,0.

Культивирование прекращают, когда концентрация микробов не повышается или повышается незначительно. Концентрация на выходе- 40 – 45 млрд. микробных клеток для обоих видов микроорганизмов.

Данный способ предусматривает дополнительное введение отдельных других компонентов питания в качестве подпитки, если это необходимо достижения концентрации микроорганизмов 40-45 миллиардов клеток/мл.

Однако данный способ не обеспечивает повышенных концентраций - до 82 миллиардов клеток/мл для E.coli и 65 миллиардов клеток для Salmonella.

Целью изобретения и достигаемым техническим результатом является повышение выхода биомассы аэробнорастущих клеток биомассы микроорганизмов - энтеробактерий вида Escherichia coli, и видов Salmonella, которая достигается тем, что в способе получения биомассы энтеробактерий Еscherichiа coli и Salmonella с повышенной урожайностью в производственных биореакторах, включающий операции периодического культивирования при кислородном лимитировании и подпитки биомассы питательной средой той же основы, что и первоначальная среда засева, с поддержанием оптимальных физиологических значений рН по показаниям датчика биореактора, при этом

- проводят культивирование при кислородном лимитировании, достигаемом выращиванием при скоростью массопередачи кислорода в диапазоне 2,5±0,5 ммоль O₂ на 1 л в 1 мин, при аэрации 1 объём воздуха на 1 объём среды в 1 мин и непрерывном перемешивании, при поддержании избыточного давления в реакторе 0,4-0,8 атм, в диапазоне pH 6,5-7,0 с преимуществом для низких значений;

- при получении двух компонентной питательной среды перед засевом биореактора, изначально в виде раствора хлорида натрия (0,9% раствор хлористого натрия), предварительно простерилизованного в реакторе с последующим смешиванием с концентратом питательной среды при соотношении C : N : P : Mg в пределах (7,0 ± 2,0) : (1,2 ± 0,5) : (0,5 ± 0,2) : (0,15 ± 0,09), в диапазоне соотношений от 5:1 до 2,5:1 , где 5 и 2,5, соответственно, доли раствора хлористого натрия для нижнего и верхнего значения исходного объёма раствора хлористого натрия в реакторе, с последующим посевом микроорганизмов,

- при этом последовательная подача концентрированной подпитки осуществляются: первая через 2 часа после посева в количестве 2*V₀/90 л/биореактор, вторая подача через 3 часа после начала роста в количестве 4*V₀/90 л/биореактор, третья - начиная с 3,5 часов подачи подпитки 1,7*V0/90 мл/сек в постоянном режиме, где V₀-исходный объём физиологического раствора в биореакторе, меняющийся в диапазоне 90-300 л.

При этом способ получения биомассы энтеробактерий может быть реализован в биореакторе с общим объём 1000 л и максимальный рабочим объёмом в конце культивирования от 140 до 450 л.

При этом способ получения биомассы энтеробактерий может быть реализован при условии, что процесс культивирования проводят при отсутствии пептона в исходной питательной среде и подпитке.

При этом способ получения биомассы энтеробактерий может быть реализован при предварительной стерилизации раствора хлорида натрия в реакторе при 120 градусах Цельсия в течение 60 мин, в количестве 90-300 л.

В связи с тем, что в предлагаемом способе конечный объём ферментационной жидкости увеличивается по ходу процесса культивирования до 1,5 раз по сравнению с исходным объёмом культивирования, для оценки урожая биомассы используется показатель общего съёма урожая, равный произведению действующей концентрации микроорганизмов на рабочий объём в реакторе в данный момент времени, триллионы клеток/биореактор. Примеры реализации приведены ниже.

Влияние пропорции добавленной первоначально концентрированной подпитки при последующей подпитке растущих культур микроорганизмов с разными скоростями подпитки для разных исходных объёмов согласно предлагаемому способу позволило получить кривые с оптимумами накопления биомассы, в триллионах клеток на биореактор в зависимости от процентного содержания подпитки, добавленной в реактор перед посевом, Фиг. 1 и 2. Оптимальные пропорции добавленной подпитки находятся в пределах 33,3%-66,7%, что по предлагаемому способу позволяет увеличить в 1,5-2 раза съём урожая биомассы для E.coli и в 1,4-1,65 раза для Salmonella по сравнению с имеющейся технологией.

Сущность изобретения заключается в том, что с целью повышения урожая при ферментациях.

Процесс культивирования проводят при отсутствии дорогостоящего пептона в исходной питательной среде и подпитке.

Процесс культивирования проводят в диапазоне pH 6,5-7,0 при добавлении 10% раствора NaOH по показаниям датчика pH - с преимуществом для низких значений.

В начале процесса культивирования используется следующая схема приготовления питательной среды перед засевом биореактора: раствор хлорида натрия (0,9% раствор хлористого натрия), предварительно простерилизованный при 120 градусах Цельсия в реакторе, в количестве 90-300 л смешивается с концентратом питательной среды (Подпиткой), в диапазоне соотношений от 5:1 до 2,5:1, где 5 и 2,5, соответственно, доли раствора хлористого натрия для нижнего и верхнего значения исходного объёма раствора хлористого натрия в реакторе, с последующим посевом микроорганизмами.

Подпитка имеет следующий состав на 1 л: 0,1 кг сухой глюкозы, до 1 л основного перевара Хоттингера с содержанием аминного азота 1000 мг%, 0,005 кг натрия фосфорнокислого 12-водного, 0,0015 кг магния сернокислого 7-водного.

Подачи концентрированной подпитки осуществляются по следующей схеме: Первая подача подпитки осуществляется через 2 часа после посева в количестве до 2*V₀/90 л/биореактор. Через 3 часа после начала роста – вторая подача подпитки в количестве до 4*V₀/90 л/биореактор. Далее, начиная с 3,5 часов, включаем предварительно оттарированный по воде насос на скорость подачи подпитки до 1,7*V₀/90 мл/сек в постоянном режиме, где V₀-исходный объём физиологического раствора в реакторе, который может изменяться в диапазоне 90-300 л.

Окончанием процесса считается накопление не менее 50х10⁹ микробных клеток/мл для Salmonella при конечном рабочем объеме не менее 150 л (урожайность 7500 триллионов клеток - произведение концентрации микроорганизма на конечный объём в реакторе перед сливом урожая) или накопление не менее 65х10⁹ микробных клеток/мл для E.coli при конечном рабочем объеме не менее 130 л (урожайность 8450 триллионов клеток) или до исчерпания подпитки. В результате культивирования обеспечиваются концентрации от 56 до 82 млрд/см³, соответственно, для Salmonella и E.coli.

На фиг.1 и 2 представлены Зависимости процента прироста (показатель эффективности увеличения выхода биомассы, в %) съёма урожаев биомассы для видов E.coli и Salmonella, %, в предлагаемой схеме, с исследованием влияния различных количеств (объёмов) первоначально добавленных компонентов в питательную среду, в %, на общий выход биомассы, в %, по сравнению с обычным культивированием с подачей глюкозы по значениям pH и 10%-ным раствором едкого натрия. Показатель эффективности представляет собой отношение между разностью микробных концентраций в конце культивирования по новому способу и регламентной культуры к концентрации по регламентному способу, т.е. это есть отношение прибавления к имеющейся регламентной технологии.

Примеры реализации способа при первоначальном количестве Подпитки азотными веществами и витаминным комплексом при его первоначальной подаче 1/3 от общего количества данной Подпитки-48 литров:

Пример 1. Культивирование E.coli, смесь штаммов: 733, 1308, 1370, 1463. Ферментация 28.02.2018 г.

Исходный объём раствора хлористого натрия – 70 л.

Исходное количество подпитки, поданное в реактор перед посевом - 16 л.

Объем матровой расплодки – 40 л.

Подача подпитки на 2-ой час роста – 3 л/ч.

Подача подпитки на 3-ий час роста – 3,5 л/ч.

Подача подпитки на 4-ый час роста и в последующие часы - 4 л/ч.

Глюкоза (40%-ный раствор) и едкий натр (10%-ный раствор) подаются отдельно по pH.

Общий объём в конце процесса – 162 л.

Концентрация микроорганизмов в конце процесса - 80 миллиардов клеток/мл.

Общий съём урожая – 12,96 триллионов клеток/биореактор.

Параллельно проводилось культивирование в отдельном реакторе с подачей глюкозы по значениям pH (обычный способ) и 10 %-ным растовором едкого натрия, при концентрации клеток E.coli 45 миллиардов клеток в 1 мл культуральной жидкости и конечном объёме в конце процесса ферментации 148 л, даёт общий выход биомассы 45 млрд/мл*144*10³ мл=6480 триллинов клеток.

Эффективность =100%*(12,96-6,48)/6,48= 100%.

Пример 2. Культивирование E.coli, штаммы 320, 1330, 1230, 1092. Ферментация 13.03.2018 г.

Исходный объём раствора хлористого натрия – 70 л.

Исходное количество подпитки, поданное в реактор перед посевом - 16 л.

Объем матровой расплодки – 40 л.

Подача подпитки на 2-ой час роста – 3,5 л/ч.

Подача подпитки на 3-ий час роста - 3,5 л/ч.

Подача подпитки на 4-ый час роста и в последующие часы-3,5 л/ч.

Глюкоза (40%-ный раствор) и едкий натр (10%-ный раствор) подаются отдельно по pH.

Общий объём в конце процесса – 156,5 л.

Концентрация микроорганизмов в конце процесса- 82 миллиардов клеток/мл.

Общий съём урожая – 12,8 триллионов клеток/биореактор.

Параллельно проводилось культивирование в отдельном реакторе с подачей глюкозы по значениям pH (обычный способ) и 10 %-ным растовором едкого натрия., при концентрации клеток E.coli 40 миллиардов клеток в 1 мл культуральной жидкости и конечном объёме в конце процесса ферментации 142 л, даёт общий выход биомассы 45 млрд/мл*142*10³ мл=6400 триллинов клеток.

Эффективность =100%*(12,8 – 6,4)/6,4= 100%.

Пример 3. Культивирование Salmonella dublin, штамм Армавирской биофабрики. Ферментация 28.03.2018 г.

Исходный объём раствора хлористого натрия – 90 л.

Исходное количество подпитки, поданное в реактор перед посевом - 16 л.

Объем матровой расплодки – 20 л.

Подача подпитки на 2-ой час роста – 4 л/ч.

Подача подпитки на 3-ий час роста - 4 л/ч.

Подача подпитки на 4-й час роста и в последующие часы - 4 л/ч.

Глюкоза (40%-ный раствор) и едкий натр (10%-ный раствор) подаются отдельно по pH.

Общий объём в конце процесса – 166,5 л.

Концентрация микроорганизмов в конце процесса - 55 миллиардов клеток/мл.

Общий съём урожая – 9,157 триллионов клеток/ на биореактор.

Параллельно проводилось культивирование в отдельном реакторе с подачей глюкозы по значениям pH (обычный способ) и 10 %-ным раствором едкого натрия, при концентрации клеток Salmonella dublin 41,6 миллиардов клеток в 1 мл культуральной жидкости и конечном объёме в конце процесса ферментации 160 л, даёт общий выход биомассы 41,6 млрд/мл*160*10³ мл=6660 триллионов клеток.

Эффективность =100%*(9,157-6,66)/6,66= 37,5%.

Пример 4. Культивирование Salmonella typhymurium, штамм Армавирской биофабрики. Ферментация 29.03.2018 г.

Исходный объём раствора хлористого натрия – 90 л.

Исходное количество подпитки, поданное в реактор перед посевом - 16 л.

Объем матровой расплодки – 20 л.

Подача подпитки на 2-ой час роста – 4 л/ч.

Подача подпитки на 3-ий час роста - 4 л/ч.

Подача подпитки на 4-ый час роста и в последующие часы - 4 л/ч.

Глюкоза (40%-ный раствор) и едкий натр (10%-ный раствор) подаются отдельно по pH.

Общий объём в конце процесса – 165 л.

Концентрация микроорганизмов в конце процесса - 62 миллиардов клеток/мл.

Общий съём урожая – 10,23 триллионов клеток/на биореактор.

Параллельно проводилось культивирование в отдельном реакторе с подачей глюкозы по значениям pH (обычный способ) и 10%-ным растовором едкого натрия., при концентрации клеток Salmonella dublin 40 миллиардов клеток в 1 мл культуральной жидкости и конечном объёме в конце процесса ферментации 165 л, даёт общий выход биомассы 40 млрд/мл*165*10³ мл=6600 триллионов клеток.

Эффективность=100%*(10,23-6,6)/6,6= 55%.

Пример 5. Сводные данные по увеличению эффективности прироста биомассы для различных первоначальных количеств добавляемой азотно-витаминно-фосфорно-магниевой подпитки.

*В данной Таблице штаммы E.coli сгруппированы по общепринятой классификации в группы, В отличие от предыдущих Примеров, здесь даны номера групп.