Результат интеллектуальной деятельности: ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ БАКТЕРИЯМИ

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к химии и фармакологии, конкретно к синтетическому биологически активному веществу - 7,9-дибром-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидрохромено[2,3-d]-пиримидиниум-10 ацетату, обладающему противомикробной активностью, и способу его синтеза.

Изобретение распространяется на все пространственные изомеры заявляемого вещества, все его таутомерные и солевые формы, а также гидратные формы, сольваты, комплексные соединения и аддукты с органическими веществами.

Вещество предназначено для использования в медицинской практике для лечения заболеваний, вызванных бактериями, а также для аналогичных целей в ветеринарии. Вещество может применяться, как в индивидуальном виде, так и в виде их фармакологически приемлемых солей, комплексов, а также в комбинации с другими препаратами и комплексами.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Интенсивно расширяется круг болезней, связанных с бактериями, среди которых наиболее актуальными являются Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Listeria spp, Rothia spp, различные представители споробиоты и другие (Clinical Pharmacist, September 2017, Vol 9, No 9, online | DOI: 10.1211/CP.2017.20203363 Tetz, G., & Tetz, V. (2017). Introducing the sporobiota and sporobiome. Gut Pathogens, 9:38 DOI 10.1186/s13099-017-0187-8).

Высокая изменчивость бактерий, приводящая к появлению и быстрому распространению устойчивости к антибиотикам, не позволяет достичь достаточного клинического эффекта в лечении большого количества вызываемых ими заболеваний различной локализации. Особой проблемой является распространение множественной устойчивости к лекарственным препаратам. Особенно эта проблема актуальна для лечения инфекций, вызванных MRSA и VRSA штаммами Staphylococcus spp, и Streptococcus spp (J Glob Infect Dis. 2010 Sep-Dec; 2(3): 275-283. Methicillin and Vancomycin Resistant S. aureus in Hospitalized Patients Poonam Sood Loomba, Juhi Taneja, and Bibhabati Mishra Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol. 11, No. 10, 2005 1539-1544 Jon P. Furuno* , Eli N. Perencevich*†‡, Judith A. Johnson*†, Marc-Oliver Wright‡2, Jessina C. McGregor*, J. Glenn Morris*†, Sandra M. Strauss*, Mary-Claire Roghman*†, Lucia L. Nemoy*†, Harold C. Standiford‡, Joan N. Hebden‡, and Anthony D. Harris Methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Vancomycin-resistant Enterococci Co-colonization DOI: 10.3201/eid1110.050508

J Hosp Infect. 2018 Feb;98(2):111-117. doi: 10.1016/j.jhin.2017.11.008. Epub 2017 Nov 22. Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis infections on implants. Oliveira WF1, Silva PMS1, Silva RCS2, Silva GMM2, Machado G2, Coelho LCBB1, Correia MTS3. Решению проблемы борьбы с бактериями, обладающими множественной устойчивостью к существующим антимикробным препаратам, посвящено настоящее изобретение

Прототипом изобретения, наиболее близким по спектру антимикробного действия, был выбран антибиотик линкомицин, ингибирующий синтез белка в микробной клетке (https://reference.medscape.com/drug/lincocin-lincomycin-342555) Линкомицин представляет собой продукт Streptomyces lincolnensis следующей структуры:

Линкомицин - антибиотик узкого спектра действия, активный преимущественно по отношению к фирмикутным бактериям. В тоже время, он не действует на метициллин- и ванкомицин- устойчивые штаммы Staphylococcus aureus и Streptococcus spp, (MRSA и VRSA) (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004 May;64(4):455-64. Epub 2004 Feb 5. Lincomycin, clindamycin and their applications. Spizek J1, Rezanka T.).

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей изобретения является создание нового химического соединения, обладающего высокой антибактериальной активностью и высокой эффективностью при лечении заболеваний, вызываемых бактериями, в том числе бактериями, обладающими множественной устойчивостью к существующим антимикробным препаратам.

Согласно изобретению поставленная задача решается путем синтеза нового противомикробного вещества формулы (1):

,

где Х^- = СН₃СОО^- или НООССН₂СН₂СОО.

Примеры реализации изобретения включают все пространственные изомеры заявляемого вещества, все его таутомерные и солевые формы, комплексные соединения, а также гидратные формы и аддукты с органическими веществами.

Предложена также фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, вызванных бактериями, содержащая эффективное количество соединения формулы 1 или его таутомерной, гидратной формы, соли, сольвата, комплексного соединения и аддукта, и фармацевтически приемлемый носитель или адьювант.

Также предложено применение соединения формулы 1 для лечения заболеваний, вызванных бактериями, включая, но не ограничиваясь ими, бактериальные инфекции ротоглотки, кожных покровов, слизистых, мочевыделительной системы, имплантатов, дыхательной системы, желудочно-кишечного тракта, остеомиелита, сепсиса, внутрибольничных и раневых инфекций, а также для подавления жизнеспособности бактерий, находящихся в составе биопленок.

Согласно еще одному аспекту изобретения, фармацевтическая композиция содержит эффективное количество соединения формулы 1 в сочетании по меньшей мере с одним другим антимикробным препаратом.

Согласно изобретению Соединение формулы 1 применяют в составе композиций по меньшей мере с одним другим антимикробным препаратом для лечения заболеваний, вызванных антибиотикоустойчивыми штаммами MRSA, VISA, VRSA.

Согласно еще одному аспекту изобретения предложен способ лечения заболеваний, вызванных бактериальными инфекциями, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы 1 или его таутомерной, гидратной формы, соли, сольвата, комплексного соединения и аддукта, или содержащей его фармацевтической композиции.

В дополнительном аспекте изобретения заболевание представляет собой заболевание, вызванное стафилококками или стрептококками.

В еще одном дополнительном аспекте изобретения указанное заболевание представляет собой заболевание, вызванное Staphylococcus aureus.

В еще одном дополнительном аспекте изобретения, указанное заболевание выбрано из группы, включающей бактериальные инфекции ротоглотки, кожных покровов, слизистых, мочевыделительной системы, имплантатов, дыхательной системы, желудочно-кишечного тракта, остеомиелита, сепсиса, внутрибольничных и раневых инфекций.

В другом аспекте изобретения соединение формулы 1 или его таутомерной, гидратной формы, соли, сольвата, комплексного соединения и аддукта вводят в дозировке от 0,5 мг/кг до 2000 мг/кг.

В еще одном аспекте изобретения соединение формулы 1 или его таутомерной, гидратной формы, соли, сольвата, комплексного соединения и аддукта вводят в дозировке от 1 мг/кг до 1500 мг/кг, более предпочтительно от 5 мг/кг до 1000 мг/кг, еще более предпочтительно от 10 мг/кг до 500 мг/кг, еще более предпочтительно от 10 мг/кг до 400 мг/кг, еще более предпочтительно от 10 мг/кг до 350 мг/кг, еще более предпочтительно от 10 мг/кг до 300 мг/кг, еще более предпочтительно от 10 мг/кг до 250 мг/кг, еще более предпочтительно от 10 мг/кг до 200 мг/кг, еще более предпочтительно от 10 мг/кг до 150 мг/кг, еще более предпочтительно от 10 мг/кг до 100 мг/кг.

В еще одном аспекте изобретения соединение формулы 1 или его таутомерной, гидратной формы, соли, сольвата, комплексного соединения и аддукта вводят в дозировке от 0,5 мг/кг до 2 мг/кг, от 1 мг/кг до 10 мг/кг, от 5 мг/кг до 30 мг/кг, предпочтительно от 10 мг/кг до 100 мг/кг, еще более предпочтительно от 50 мг/кг до 150 мг/кг.

В дополнительном аспекте изобретения указанное соединение формулы 1 или его таутомерной, гидратной формы, соли, сольвата, комплексного соединения и аддукта, или содержащую его фармацевтическую композицию вводят субъекту энтерально.

Заявителю не известны какие-либо источники информации, в которых бы содержались сведения об идентичных технических решениях, что позволяет сделать вывод о соответствии заявленного изобретения критерию “Новизна” (N).

Заявителем не выявлены какие-либо источники информации, содержащие сведения о влиянии заявленных отличительных признаков на достигаемый вследствие их реализации технический результат. Это, по мнению заявителя, свидетельствует о соответствии данного технического решения критерию «Изобретательский уровень» (IS).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

В дальнейшем изобретение поясняется подробным описанием примеров его осуществления без ссылок на чертежи.

ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Заявляемое вещество синтезируют в соответствии со схемой 1.

Схема 1

Где Х^- = СН₃СОО^- или НООССН₂СН₂СОО^-

Синтез заявляемого вещества 1 по схеме 1 осуществляется в одну стадию.

Сущность изобретения поясняется приведенными ниже примерами синтеза заявленного вещества и его характеристиками, экспериментами по изучению биологических свойств и таблицами результатов экспериментов по определению биологических свойств заявляемого вещества, где:

пример 1 - конкретный вариант выполнения синтеза заявляемого вещества (Соединение 1а);

пример 2 - конкретный вариант выполнения синтеза заявляемого вещества (Соединение 1а) ;

пример 3 - конкретный вариант выполнения синтеза заявляемого вещества (Соединение 1б);

пример 4 - определение эффективности действия испытуемых соединений на фирмикутные бактерии;

пример 5 - определение эффективности действия испытуемых соединений на грациликутные и лишенные клеточной стенки бактерии;

пример 6 - действие заявляемых соединений на бактериальные штаммы с множественной устойчивостью к антибиотикам;

пример 7 - действие заявляемого соединения на бактерии, находящиеся в составе биопленок;

пример 8 - изучение химиотерапевтической эффективности;

пример 9 - клинические данные об эффективности заявляемого соединения при лечении тонзиллитов, вызванных стафилококками или стрептококками;

пример 10 - использование соединения в виде композиции с другими антимикробными препаратами.

Пример 1. Вариант выполнения синтеза заявляемого вещества - получение 7,9-дибром-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидрохромено[2,3-d]-пиримидиниум-10 ацетата (Соединение 1а).

0.1 моль (12.8 г) барбитуровой кислоты (2) растворяли при нагревании в 270 мл ледяной уксусной кислоты. К этому раствору прибавляли при перемешивании 0.105 моль (29.4 г) 3,5-дибром-2-гидроксибензальдегида (3) и полученную реакционную смесь оставляли при комнатной температуре на 40 ч. Образовавшийся кристаллический продукт отфильтровывали, промывали холодной уксусной кислотой, затем эфиром и сушили на воздухе. Получили 30.7 г продукта 1 (Соединение 1а) виде желтых игольчатых кристаллов с Тпл 255-260 °С (с разл.). Выход 71% от теоретического.

Данные элементного анализа. Найдено, %: С, 36.31; Н, 2.01; Br, 36.87; N, 6.44. C₁₃H₈Br₂N₂O₅. Вычислено, %: С, 36.14; Н, 1.97; Br, 36.99; N, 6.48.

Спектр ПМР в ДМСО-d₆. Химический сдвиг, м.д. (J, Гц): 7.75 д (1Н, J 8.2, ArH), 7.92 д (1Н, J 8.2, ArH), 8.29 с (1Н, =СH), 11.18 с (1Н, NH), 11.44 (1H, NH).

Масс-спектр. МН⁺ (I, %) 391 (24), 373 (100).

Пример 2. Вариант выполнения синтеза заявляемого вещества - получение 7,9-дибром-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидрохромено[2,3-d]-пиримидиниум-10 ацетата (Соединение 1а).

0.1 моль (12.8 г) барбитуровой кислоты (2) растворяли при нагревании в 300 мл ледяной уксусной кислоты. К этому раствору прибавляли при перемешивании 0.11 моль (30.8 г) 3,5-дибром-2-гидроксибензальдегида (3) и затем - 0.2 моль (20.4 г) уксусного ангидрида. Полученную реакционную смесь оставляли при комнатной температуре на 24 ч. Образовавшийся кристаллический продукт отфильтровывали, промывали холодной уксусной кислотой, затем эфиром и сушили на воздухе. Получили 36.6 г продукта 1 виде желтых игольчатых кристаллов с Тпл 255-260 °С (с разложением). Выход 80% от теоретического. Характеристики продукта (Соединение 1а) совпадают с приведенными в Примере 1.

Пример 3. Вариант выполнения синтеза заявляемого вещества - получение 7,9-дибром-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидрохромено[2,3-d]-пиримидиниум-10 сукцината (Соединение 1б).

0.1 моль (12.8 г) барбитуровой кислоты (2) растворяли при нагревании в 300 мл ледяной уксусной кислоты. К этому раствору прибавляли при перемешивании 0.105 моль (29.4 г) 3,5-дибром-2-гидроксибензальдегида (3) и затем - 0.2 моль (20.4 г) янтарного ангидрида. Полученную реакционную смесь оставляли при комнатной температуре на 24 ч. Образовавшийся кристаллический продукт отфильтровывали, промывали эфиром и сушили на воздухе. Получили 37.8 г продукта 1b виде желтых игольчатых кристаллов с Тпл 250-253 °С (с разложением). Выход 73% от теоретического.

Данные элементного анализа Соединения 1б. Найдено, %: С, 36.39; Н, 2.09; Br, 32.54; N, 5.66. C₁₅H₁₀Br₂N₂O₇. Вычислено, %: С, 36.76; Н, 2.06; Br, 32.61; N, 5.72.

Пример 4. Определение эффективности действия испытуемых соединений на фирмикутные бактерии.

Определение антимикробного действия веществ проводили на плотных и жидких питательных средах. Для оценки минимальной подавляющей концентрации (МПК) использовали метод серийных разведений, согласно рекомендациям CLSI (Clinical Laboratories and Standards Institute, ранее National Committee for Clinical Laboratory Standards) (Clinical Laboratories and Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard--Seventh Edition. Document M7-A7. CLSI, Wayne, Pa., 2006; Clinical Laboratories and Standards Institute).

Оценка антимикробной активности веществ по отношению к фирмикутным бактериям выполнена на свежих клинических изолятах штаммов Streptococcus pyogenes, Streptococcus mitis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Corynebacterium ulcerans, Micrococcus luteus.

Таблица 1.

Определение эффективности действия испытуемых соединений (Соединений 1а и 1б) на фирмикутные бактерии

Как показывают проведенные испытания, Соединение 1а и его соль обладают высокой антимикробной активностью по отношению к фирмикутным бактериям.

Пример 5. Определение эффективности действия испытуемых соединений на грациликутные и лишенные клеточной стенки бактерии.

Таблица 2.

Определение эффективности действия испытуемых Соединений 1а и 1б на грациликутные и лишенные клеточной стенки бактерии

Изучение действия на штаммы выполнено на свежих клинических изолятах штаммов Haemophilus influenzae, Neisseria meningitides, Ureaplasma urealyticum, а также на штамме Escherichia coli ATCC29592.

Как видно из таблицы, заявляемые Соединения 1а и 1б обладают противомикробной активностью по отношению к грациликутным и лишенным клеточной стенки бактериям.

Пример 6. Действие заявляемых соединений на бактериальные штаммы с множественной устойчивостью к антибиотикам.

Изучение действия Соединения 1а на штаммы с множественной устойчивостью к существующим антибиотикам выполнено на свежих клинических изолятах штаммов: S.aureus VT-V-18, S.aureus VT-E-25 S.aureus VT-A-199 и S.aureus VT-P-82, а также штамме S.aureus American Type Culture Collection (Rockville, Md.) и штаммах S.aureus SA77 и S.aureus SA85,

Таблица 3.

Действия Соединения 1а на различные штаммы S.aureus.

Вещество 1а обладает высокой активностью в концентрациях от 0,5 до 2.0 мг/кг. Эффективность Соединения 1а не отличалась при действии на метициллин/ванкомицин-устойчивые и чувствительные штаммы.

Пример 7. Действие заявляемого Соединения на бактерии, находящиеся в составе биопленок.

Бактерии S.aureus ANCC29213 выращивали в 24 луночном плато в LB среде в течение 24 часов при 37°С После чего в лунки добавляли Соединение 1a и линкомицин (по 8 лунок на каждый препарат и контроль без препаратов) в конечных концентрациях 10 мкг/мл и инкубировали 24 часа при 37°С. После инкубации среду удаляли, биопленки промывали стерильным раствором изотонического хлорида натрия, биопленки удаляли со дна лунок, ресуспендировали в изотоническом растворе хлорида натрия и определяли число колониеобразующих единиц (КОЕ) методом серийных разведений.

Таблица 4.

Выживаемость бактерий в биопленках

Полученные данные показывают, что Соединение 1a проникает в бактериальные биопленки и снижает в них в 1000 раз число бактерий, способных давать рост. Препарат сравнения не проникает в бактериальные биопленки, и не изменяет в них число КОЕ.

Пример 8. Изучение химиотерапевтической эффективности.

Для изучения химиотерапевтической эффективности использовали модель острой генерализованной инфекции у мелких животных. Мышей линии C57BL6 внутрибрюшинно заражали Staphylococcus aureus ATCC 38591в дозе 1х10⁸ микробных клеток. Заражающая доза была установлена в предварительных исследованиях. Контролем служили мыши, зараженные той же дозой микробной культуры, но не получившие лечение.

Препараты растворяли в изотоническом растворе хлорида натрия и вводили вещество 1а или препарат Линкомицин. Через 2 часа после заражения, препараты ежедневно вводили внутрь в дозах от 10 до 100 мг/кг, 2 раза в сутки.

Гибель мышей учитывали ежедневно в течение 7 дней.

Таблица 5.

Оценка влияния Соединения 1а при острой генерализованной инфекции у мелких животных, зараженных Staphylococcus aureus ATCC 38591*

*Усредненные данные 3х независимых экспериментов.

Таблица 6.

Оценка влияния Линкомицина при острой генерализованной инфекция у мелких животных, зараженных Staphylococcus aureus ATCC 38591*

*Усредненные данные 3х независимых экспериментов.

Полученные результаты указывают, что Соединение согласно изобретению высокоэффективно при лечении заболеваний, вызванных стафилококками, что применительно к заболеваниям людей означает такие болезни как воспалительные заболевания ротоглотки, включая тонзиллиты, гнойно-воспалительные заболевания кожи, и слизистых, циститы, инфекции имплантатов, остеомиелит и сепсис, а также пневмоний, и заболеваний желудочно-кишечного тракта. Использованная модель является также воспроизведением внутрибольничных инфекций, возникающих в результате диагностических и хирургических вмешательств.

Пример 9. Клинические данные об эффективности заявляемого соединения при лечении тонзиллитов, вызванных стафилококками или стрептококками.

Данная патология была выбрана нами как одна из приведенного выше списка для подтверждения эффективности и практической применимости заявляемого соединения. Исследование выполнено на двух группах пациентов, в сумме составивших 138 человек, которые получали препарат энтерально два раза в день в дозах от 500 мг до 2000 мг.

Соединение вводили в виде фармацевтической композиции содержащей Соединение 1а в форме ацетата в изотоническом растворе фармацевтически приемлемого носителя хлорида натрия.

Таблица 7.

Частота эрадикации возбудителя при бактериологическом исследовании материала из лакуны небной миндалины при лечении тонзиллитов.

Таким образом, влияние на эрадикацию возбудителя заявляемого соединения статистически значимо выше, а эффект развивается уже на 4-й день лечения.

Полученные результаты указывают, что у группы больных с тонзиллитом, который выбран из списка заболеваний возможного применения заявляемого соединения, зарегистрирована высокая клиническая эффективность заявляемого средства, значительно превосходящая таковую у препарата сравнения.

Пример 10. Использование Соединения в виде композиции с другими антимикробными препаратами.

Заявляемое соединение может быть использовано в виде композиции с другими антимикробными препаратами, и при этом возможно достижение суммарного антибактериального эффекта, превосходящего тот, который можно получить при независимом использовании данных препаратов.

В работе использован штамм H. Influenzae, выращенный на жидкой питательной среде. Минимальная подавляющая концентрация была определена методом серийных разведений.

Таблица 8.

Минимальная подавляющая концентрация (МПК) 1а и его комбинаций с различными антимикробными препаратами по отношению к H. influenzae.

Полученные данные указывают, что комбинации Соединения 1а и антибиотика, взятого в количестве, меньшем чем его индивидуальный МПК, обеспечивают подавление роста тест-микроба.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Для реализации изобретения используются известные материалы и оборудование, что обусловливает, по мнению заявителя, соответствие изобретения критерию «Промышленная применимость» (IA).