Результат интеллектуальной деятельности: ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ОСЛОЖНЕНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ХИМИОТЕРАПИЕЙ И РЕНТГЕНОТЕРАПИЕЙ, А ТАКЖЕ СОСТОЯНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ПОВЫШЕННОЙ ПРОНИЦАЕМОСТЬЮ КИШКИ

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к химии и фармакологии, конкретно - к полимерным комплексам макролидного антибиотика. Заявляемое вещество представляет собой продукт взаимодействия антибиотика азитромицина с сополимером акриламида с 2-акриламидо-2-метилпропансульфокислотой.

Изобретение распространяется на все пространственные изомеры заявляемого вещества, все его таутомерные и солевые формы, а также аддукты с органическими кислотами.

Веществ предназначено для использования в медицинской практике для лечения и предупреждения возникновения осложнений, связанных с химиотерапией и рентгенотерапией, а также состояний, связанных с повышенной проницаемостью кишки, а также для аналогичных целей в ветеринарии. Вещество могут применяться как в индивидуальном виде, так и в виде его фармакологически приемлемых солей, комплексов, а также в комбинации с другими препаратами и комплексами.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

К числу заболеваний с неясной этиологией, относительно которых существует много объяснений, относятся различные, не имеющие сходства заболевания и состояния, в частности, алкогольный цирроз печени, шизофрения, раковая интоксикация, головная боль, гипертонические кризы и др.

В наших исследованиях было установлено, что при ряде заболеваний неясной этиологии в системном кровотоке наблюдается увеличение количества бактериальных токсинов микробиоты человека. Бактериальная ДНК микробиоты была обнаружена нами в крови людей со следующими патологиями: осложнения, возникающие при химио- и рентгенотерапии; раковая кахексия; сахарный диабет; похмельный синдром; биполярное расстройство и шизофрения; гиперхолестеринемия; болезнь Альцгеймера; острый респираторный дистресс синдром; онкологические заболевания, в том числе рак толстой кишки; бесплодие; первичный билиарный цирроз; первичный склерозирующий холангит; нарушение сердечного ритма и проводимости; псориаз; атопический дерматит; спондилоартрит анкилозирующий; системная красная волчанка; склеродермия; аутоиммунный тиреоидит; подагра; старческая дименция; острая печеночная недостаточность, острая почечная недостаточность; авиатоксический синдром; головная боль; возрастные изменения кожи; нестабильная стенокардия, а также у пожилых людей, не страдающих каким-либо определенным заболеванием []. Проникновение бактерий и их продуктов из кишки в кровь и ткани вызывает ряд патологических изменений, в значительной степени реализующихся через активацию компонентов системы иммунитета.

Приведенные выше данные свидетельствуют о перспективности поиска новых антибактериальных агентов, препятствующих распространению из кишки представителей микробиоты человека и их продуктов в системном кровотоке и снижающих их патологическое влияние на организм человека, реализуемое через взаимодействие с компонентами иммунной системы.

Прототипом изобретения, т.е. веществом, наиболее близким по биологическому действию к заявляемому средству, был выбран антибиотик азитромицин, угнетающий в бактериях синтез белка. Азитромицин представляет собой соединение: 9-deoxy-9α-aza-9α-methyl-9α-homoerythromycin A [United States Patent #4,512,982, 1985].

Азитромицин - антибиотик широкого спектра действия, но он хорошо и быстро всасывается из кишки в результате его действие не сфокусировано на микробиоте. Основные показания к применению инфекции ротоглотки и носоглотки, дыхательной и мочевыделительной систем [https://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/ucm341822.htm].

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей изобретения является получение нового химического соединения, обладающего антимикробной активностью, реализуемой в том числе в кишечнике человека и способного связываться с цитокинами воспаления и препятствующего развитию токсических состояний химиотерапии, рентгенотерапии и состояний, связанных с повышенной проницаемостью кишки.

Согласно изобретению поставленная задача решается путем синтеза нового противомикробного вещества общей формулы (1):

m1=74.5 мол. %; m2=(13.3-18.7) мол. %; m3=(6.8-12.2) мол. % ММ=33000-160000

Заявителю не известны какие-либо источники информации, в которых бы содержались сведения об идентичных технических решениях, что позволяет сделать вывод о соответствии заявленного изобретения критерию "Новизна" (N).

Заявителем не выявлены какие-либо источники информации, содержащие сведения о влиянии заявленных отличительных признаков на достигаемый вследствие их реализации технический результат. Это, по мнению заявителя, свидетельствует о соответствии данного технического решения критерию «Изобретательский уровень» (IS).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг. 1 показано изменение концентрации ИЛ-1 альфа в культуре моноцитов при применении полимерного комплекса азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК в сравнении с азитромицином.

На Фиг. 2 показано изменение концентрации ИЛ-6 альфа в культуре моноцитов при применении полимерного комплекса азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК в сравнении с азитромицином.

На Фиг. 3 показано изменение концентрации ИЛ-10 альфа в культуре моноцитов при применении полимерного комплекса азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК в сравнении с азитромицином.

На Фиг. 4 показано влияние полимерного комплекса азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК на количество копий бактериальной ДНК в сыворотке крови мышей, получающих химиотерапию. При этом использованы следующие обозначения:

1 - контроль 1 - ПЦР крови мышей, через 12 часов после начала курса химиотерапии

2 - полимерный комплекс азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК (1 мг/кг) - ПЦР крови мышей, за 2 часа до начала курса химиотерапии.

3 - полимерный комплекс азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК (3 мг/кг) - ПЦР крови мышей, через 12 часов после начала курса химиотерапии

4 - полимерный комплекс азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК (6 мг/кг) - ПЦР крови мышей, через 12 часов после начала курса химиотерапии

5 - полимерный комплекс азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК (12 мг/кг) - ПЦР крови мышей, через 12 часов после начала курса химиотерапии

6 - полимерный комплекс азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК (25 мг/кг) - ПЦР крови мышей, через 12 часов после начала курса химиотерапии

Лучший вариант осуществления изобретения

Препарат полимерного комплекса макролидного антибиотика получают путем взаимодействия азитромицина с сополимером акриламида с 2-акриламидо-2-метилпропансульфокислотой содержащим 25.5 мол. % сульфогрупп, с ММ 33000-160000.

Сущность изобретения поясняется приведенными ниже примерами синтеза промежуточных веществ, примерами синтеза заявленного вещества, таблицами выходов и характеристик целевых веществ, экспериментами по изучению биологических свойств и таблицами результатов экспериментов по определению биологических свойств заявляемых веществ, где:

Пример 1 - Синтез сополимеров-носителей

Пример 2 - Синтез сополимеров-носителей с использованием смеси спиртов

Пример 3 - Синтез сополимеров-носителей с использованием этанола

Пример 4 - Получение полимерных комплексов азитромицина способом №1

Пример 5 Получение полимерных комплексов азитромицина способом №2

Пример 5 Получение полимерных комплексов азитромицина способом №3

Пример 6 Влияние сополимера АА с 2-ААМПСК на продукцию ИЛ культурой клеток моноцитов.

Пример 7 Сравнение противобактериальной активности Сополимера АА с 2-ААМПСК и Азитромицина

Пример 8 Влияние Сополимера АА с 2-ААМПСК на развитие осложнений химиотерапии.

Пример 9 Влияние Сополимер АА с 2-ААМПСК на выживаемость мышей при использовании химиотерапевтических агентов.

Пример 10 Влияние Сополимера АА с 2-ААМПСК на количество копий бактериальной ДНК в сыворотке крови мышей, получающих химотерапию.

Пример 11 Влияние Сополимера АА с 2-ААМПСК на проницаемость кишечника мышей, получающих химотерапию.

ПРИМЕРЫ:

Синтез сополимеров-носителей:

Пример 1. В круглодонную двухтубусную колбу емкостью 250 мл, снабженную мешалкой и обратным холодильником, вносят 10 г акриламида (АА), 12.5 г. 2-акриламидо-2-метилпропансульфокислоты (2-ААМПСК), 0.9 г. инициатора 2,2'-азо-бисизобутиронитрила, 50 мл этанола, 50 мл 2-пропанола. Колбу помещают в водяную баню, в которой поддерживается температура (65±1)°С, и включают мешалку, Реакционную массу перемешивают 6 ч, затем колбу охлаждают и добавляют в нее 150 мл диэтилового эфира. Выпавший полимер собирают на фильтре и сушат в вакуумной сушилке до постоянной массы. Получают 22.3 г. (99.2%) сополимера АА с 2-ААМПСК, который подвергают очистке диализом против воды в течение 6 ч, используя цилиндрические мембраны "Cellu Sep H1", имеющие следующие характеристики: ширина полотна 45 мм, размер пор, соответствующий пропусканию молекул с ММ≤1⋅10³. Из водного раствора полимеры выделяют с помощью сублимации замороженного растворителя при 10-20 Па и 30°С. Получают 21.8 г. (97.1%) сополимера АА с 2-ААМПСК, содержащего 25.5 мол. % звеньев 2-ААМПСК, с молекулярной массой ММ 33000.

Пример 2. Опыт проводят по примеру 1, но используют смесь спиртов в соотношении 75 мл этанола +25 мл 2-пропанола. Получают 22.1 г (97.8%) очищенного сополимера АА с 2-ААМПСК, с ММ 56000.

Пример 3. Опыт проводят по примеру 1, но в качестве растворителя используют 100 мл этанола. Получают 21.6 г (97.0%) очищенного сополимера АА с 2-ААМПСК, с ММ 160000.

Получение полимерных комплексов азитромицина:

Пример 4. 3 г сополимера АА с 2-ААМПСК, полученного по примеру 1, растворяют при перемешивании в 200 мл дистиллированной воды и добавляют 1.41 г азитромицина. Массовое соотношение антибиотик: полимер составляет 0.47:1. Реакционный раствор перемешивают 2 ч при комнатной температуре, затем фильтруют и фильтрат подвергают лиофильной сушке. Получают 4.26 г (96.6%) водорастворимого полимерного комплекса азитромицина, содержащего 32 мас. % антибиотика.

Пример 5. Опыт проводят в условиях примера 4, используя сополимер АА с 2-ААМПСК, полученный по примеру 2, при массовом соотношении антибиотик: полимер, равном 0.33:1. Получают 4.23 г (95.9%) полимерного комплекса азитромицина, содержащего 25 мас. % антибиотика.

Пример 6. Опыт проводят в условиях примера 4, используя сополимер АА с 2-ААМПСК, полученный по примеру 3, при массовом соотношении антибиотик: полимер, равном 0.39:1. Получают 4.25 г (96.4%) полимерного комплекса азитромицина, содержащего 28 мас. % антибиотика.

Комплексообразование подтверждали методом ИК-спектроскопии и вискозиметрии. О появлении в комплексе ионной связи судили по появлению в спектре, полученного вычитанием из ИК-спектра полимерного комплекса ИК-спектра сополимера-носителя, полосы поглощения при 2720-2715 см^-1, которая соответствует группе NH+. Также в результате комплексообразования происходит компактизация макромолекул носителя, что проявляется в уменьшении (в 1.5 раза) характеристической вязкости комплекса, по сравнению с характеристической вязкостью сополимера-носителя.

Пример 6. Влияние полимерного комплекса азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК на продукцию ИЛ культурой клеток моноцитов.

Моноциты были выделены из цельной крови добровольцев центрифугированием в градиенте плотности фиколла. Для определения уровня продукции моноцитами ИЛ-1 альфа, ИЛ-6, ИЛ-10 использовали Human IL-1a ELISA Kit, Human IL-6 ELISA Kit II, Human IL-10 ELISA Kit II (PharMingen). В качестве агента, стимулирующего выработку моноцитами интерликинов, использовали ЛПС бактерий.

Для оценки возможного цитотоксического действия, к культуре моноцитов добавляли 1, 5 и 10 мкг/мл полимерного комплекса азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК или Азитромицина. Учет производили через 24 часа. В использованных концентрациях, ни V133 ни Азитромицин не обладают цитотоксическим эффектом.

Результаты оценки влияния полимерного комплекса азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК на продукцию ИЛ культурой клеток моноцитов.

Результаты оценки влияния полимерного комплекса азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК на продукцию ИЛ культурой клеток моноцитов представлены на Фигурах 1-3.

В результате проведенных исследований установлено, что полимерный комплекс Азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК, обладает большей способностью к снижению выработки ИЛ-1 альфа, ИЛ-6, ИЛ-10, в сравнении с Азитромицином.

Пример 7. Сравнение противобактериальной активности полимерного комплекса Азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК и Азитромицина

Пример 8. Влияние полимерного комплекса Азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК на развитие осложнений химиотерапии.

Выраженность осложнений химиотерапии оценивалась по общим критериям токсичности Национального института рака США, версия 2.0. (Clinical Trial Centre, National Cancer Institute). В исследовании принимало участие 2 группы по 12 человек, получавших одинаковую схему химиотерапевтического лечения, в связи с раком молочной железы 2 стадии. Контрольная группа получала плацебо, опытная - полимерный комплекс азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК который принимали за 2 часа до каждого приема химиотерапевтических агентов, в течение 7 дней.

Полученные данные свидетельствуют, что применение препарата V133 в значительной степени снижает выраженность осложнений химиотерапии.

Пример 9. Влияние полимерного комплекса азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК на выживаемость мышей при использовании химиотерапевтических агентов.

Как видно из представленных данных, применение полимерного комплекса азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК эффективно повышает выживаемость мышей и снижает токсичность противопухолевых лекарственных средств Доксбрубицйна и Кселоды.

Пример 10. Влияние полимерного комплекса азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК на количество копий бактериальной ДНК в сыворотке крови мышей, получающих химиотерапию.

Результаты представлены на Фиг. 4

Использованные пробы:

1 - Контроль 1 - ПЦР крови мышей, через 12 часов после начала курса химиотерапии

2 - полимерный комплекс азитромицина и сополимер АА с 2-ААМПСК (1 мг/кг) - ПЦР крови мышей, через 12 часов после начала курса химиотерапии

3 - полимерный комплекс азитромицина и сополимер АА с 2-ААМПСК (3 мг/кг) - ПЦР крови мышей, через 12 часов после начала курса химиотерапиии

4 - полимерный комплекс азитромицина и сополимер АА с 2-ААМПСК (6 мг/кг) - ПЦР крови мышей, через 12 часов после начала курса химиотерапии

5 - полимерный комплекс азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК (12 мг/кг) - ПЦР крови мышей, через 12 часов после начала курса химиотерапии

6 - полимерный комплекс азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК (25 мг/кг) - ПЦР крови мышей, через 12 часов после начала курса химиотерапии

Заключение:

Использование полимерного комплекса азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК, за 2 часа до начала курса химиотерапии, снижает количество бактериальной ДНК в сыворотке пациентов. Изменения носят дозозависимый характер. При соотнесении полученных результатов с данными калибровки, видно, что количество бактериальной ДНК у пациентов до начала химиотерапии составляет 10² микроорганизмов в 1 мл сыворотки и повышается до 10⁵/1 мл спустя 12 часов после начала химиотерапии. Использование полимерного комплекса азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК (1 мг/кг) снижает количество бактериальной ДНК до 10³ микроорганизмов на 1 мл, а при использовании полимерного комплекса азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК (3 мг/кг) этот показатель составляет 10² микроорганизмов на 1 мл. Наибольшую эффективность продемонстрировал полимерный комплекс азитромицина и сополимер АА с 2-ААМПСК (25 мг/кг), при использовании которого количество бактериальной ДНК у пациентов составляет 10²-10¹ микроорганизмов.

Таким образом, использование полимерного комплекса азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК, позволяет в значительной степени снизить количество бактериальной ДНК, которая попадает в системный кровоток, после начала химиотерапии. При этом, учитывая отсутствие выраженного противомикробного эффекта, можно утверждать, что механизм действия реализуется на уровне изменения проницаемости кишки.

Пример 11 Влияние полимерного комплекса азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК на проницаемость кишечника мышей, получающих химотерапию.

Известно, что при химиотерапии, возникает синдром повышенной проницаемости кишечника "leaky gut". Это приводит к дополнительной интоксикации и является одним из элементов непереносимости химитерапии. Кишечную проницаемость измеряли с использованием лактулозо-маннитолового теста.

Таким образом, полимерный комплекс азитромицина и сополимера АА с 2-ААМПСК во всех использованных концентрациях снижает проницаемость кишечника.