МНОЖЕСТВЕННЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ФРАГМЕНТЫ НА ПЕПТИДНОМ НОСИТЕЛЕ

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США № 62/002 296, поданной 23 мая 2014 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область техники, к которой относится данное изобретение

[002] Настоящее раскрытие относится к антисмысловым олигонуклеотидам (AON), таким как, но не ограничиваясь ими, фосфородиамидатные морфолиновые олигонуклеотиды (PMO). Настоящее изобретение далее относится к конъюгированию множественных PMO с катионными проникающими в клетку пептидами (СРР) с целью стимулирования всасывания РМО интересующими тканями, такими как клетки скелетных и сердечной мышц. Настоящее раскрытие охватывает такие конъюгаты, а также способы их применения, включая, например, их применение для модуляции экспрессии генов. Настоящее раскрытие дополнительно включает способы лечения различных патологических состояний путем введения человеку или животному, нуждающемуся в этом, указанных множественных конъюгатов PMO-CPP.

Краткое описание изобретения

[003] Было показано, что AON успешно модулируют экспрессию генов как in vitro, так и in vivo, при различных патологических состояниях, включая, например, мышечную дистрофию Дюшенна (МДД). В частности, PMO предназначены для выявления и удаления экзона 23 внутри рамки, и под их действием была успешно восстановлена функция дистрофина в мышиной mdx модели МДД.

[004] Однако было показано, что AON характеризуются плохим профилем всасывания в клетках скелетных и сердечной мышц, что затрудняет их способность воздействовать на транскрипцию и трансляцию мРНК (WO 2009/147368). В частности, PMO, 2-O-метил олигонуклеотиды и пептидные нуклеиновые кислоты (PNA) не накапливаются в заметном количестве в скелетных мышцах и их всасывание сердечной мышцей незначительно.

[005] Проникающие в клетку пептиды (СРР) были открыты в конце 1980-х. [Frankel and Pabo Cell 1988; Green and Loewenstein Cell 1988] Эти соединения помогают транспорту различных частиц сквозь клеточные мембраны, которые в противном случае с трудом самостоятельно проникают сквозь клеточную мембрану. Примерно через 20 лет после открытия СРР в нескольких исследованиях было показано, что СРР под названием "К" (RXRRXRRXRRXRXB, SEQ ID NO.: 43) и "B" (RXRRBRRXRRBRXB, SEQ ID NO.: 44), связанные с одиночным PMO, предназначенным пропускать экзон 23 (PMO23) на мРНК, кодирующей дистрофин, в значительной степени усилили пропуск экзона в скелетных и сердечной мышцах в случае применения в мышиной mdx модели. [Jearawiriyapaisarn et al Mol Therapy 2008] Результаты этих исследований показали, что одиночный конъюгат PMO-CPP продемонстрировал пропуск экзона 23 >85% в скелетных мышцах, в то время как PMO соединение только само по себе приводит к пропуску экзона <15%. Умеренный эффект наблюдали также и в сердечной мышце (~60%) по сравнению с PMO самим по себе, который не влияет на пропуск экзона 23 в сердечной мышце. [Цитируемый лит. источник].

[006] WO 2009/144481 относится к конструкции, включающей в себя пептид клеточной доставки в комплексе с биологически активным соединением, таким как AON, включая, например, РМО. WO 2004/097017 (US 2004/0265879 и US 2009/0082547) относятся к способу стимулирования доставки молекул, включая раскрытие конъюгата биологичекого агента, такого как PMO, и пептидного переносчика. В WO 2009/147368 раскрыты новые СРР, которые могут быть конъюгированы, например, с PNA и PMO. В US 2010/0130591 раскрыты PMO, которые способны связываться с выбранным целевым сайтом в гене человеческого дистрофина, который может быть конъюгирован с CPP.

[007] Несмотря на улучшенную эффективность, наблюдаемую у одиночных PMO-CPP конъюгатов, конъюгаты обладают повышенной токсичностью по сравнению с РМО самими по себе. [ссылка] Например, в исследованиях пропуска экзона 23 на мышиной mdx модели с использованием CPP-PMO23B или CPP-PMO23K было показано, что максимальная переносимая доза составляет 30 мг/кг. При 60 мг/кг мыши теряли вес, а дозы в размере 150 мг/кг были смертельными. [Amantana et al Bioconjugate Chem 2007] В отличие от этого, сам по себе PMO23 можно вводить в количествах вплоть до 250 мг/кг без какого-либо заметного токсического эффекта [цитируемый лит. источник]. В WO 2009/005793 раскрывается, что CPP с менее чем четырьмя остатками X (6-аминогексановая кислота), включая CPP "B", продемонстрировали более низкую токсичность, чем ранее выявленные CPP. Как показано выше, однако, если эти СРР присоединены к одиночному РМО, то они по-прежнему проявляют неприемлемый уровень токсичности по сравнению РМО самими по себе [цитируемый лит. источник и Moulton and Moulton Biochemica et Biophysica Acta 2010].

[008] В соответствии с этим первостепенной целью настоящего раскрытия является преодоление проблем, связанных с плохим всасыванием РМО самих по себе и повышенной токсичностью, присущей одиночным PMO-CPP конструкциям. Множественные сайты конъюгирования на СРР получают введением глутаминовой кислоты в D- или L-энантиомерное положение для снижения пространственной затрудненности множественных РМО вблизи концов СРР. Применение сайта пептидазного расщепления с аминокислотами фенилаланин-лизин в положениях P1, - P1 вводят между СРР и РМО. Расщепление сайта пептидазного расщепления отсоединяет РМО от СРР. Например, СРР может быть присоединен к РМО через малеимидный этерифицированный линкер с сайтом ферментативного расщепления фенилаланин-лизин или валин-цитруллин, которые можно вводить в положение цистеина. СРР можно также присоединять, используя амидную связь.

[009] Интернализация клеткой с использованием пептида может приводить к тому, что внутриклеточная протеаза, включая лизосомальный фермент, расщепляет сайт расщепления и высвобождаемый PMO будет менее пространственно затруднен вследствие конъюгирования пептидной связи. Эта меньшая пространственная затрудненность может повысить эффективность пропуска экзона при меньшей токсичности в отношении ядра и цитозоли.

[010] По меньшей мере в одном аспекте это достигается благодаря открытию множественных PMO-CPP конъюгатов, как описано здесь далее. Настоящее раскрытие также рассматривает способ повышения коэффициента безопасности одиночного конъюгата PMO-CPP путем замещения конъюгатов согласно настоящему раскрытию. Настоящее раскрытие дополнительно включает способы модуляции экспрессии генов, как те, которые кодируют гликогенсинтазу (GYS1 или GYS2), трансформирующий фактор роста (TGFβ), матриксную металлопептидазу (MMP2 или MMP9), остеопонтин, протеинкиназу миотонической дистрофии (DMPK), 2 член семейства Elav-подобных (также известный как триплетный CUG-повтор РНК-связывающего белка или CUGBP), двойной гомеобоксный 4 (DUX4) и/или (Frzl). Следующие гены: гликогенсинтаза (GYS1 or GYS2), трансформирующий фактор роста (TGFβ), матриксная металлопептидаза (MMP2 или MMP9), остеопонтин, протеинкиназа миотонической дистрофии (DMPK), 2 член семейства Elav-подобных (также известный как триплетный CUG-повтор РНК-связывающего белка или CUGBP), двойной гомеобоксный 4 (DUX4), и/или (Frzl) могут служить мишенью через посредство конъюгатов PMO-CPP настоящего изобретения с целью опосредования пропуска экзона для создания мутации со сдвигом рамки. Любая мутация со сдвигом рамки может приводить к функциональному уменьшению количества мРНК, которая является мишенью для последовательности AON. В объем настоящего раскрытия также включено применение множественных конъюгатов PMO-CPP с целью подавления микроРНК при различных патологических состояниях. В другом аспекте настоящее раскрытие включает способы лечения различных заболеваний и/или состояний, как те, которые связаны с генами и микроРНК, упомянутыми выше.

[011] Дополнительные цели и преимущества настоящего раскрытия будут изложены частично в описании, которое следует далее, и частично будут очевидны из описания или могут быть изучены посредством реализации на практике раскрываемых вариантов осуществления изобретения. Цели и преимущества настоящего раскрытия будут реализованы и достигнуты посредством элементов и комбинаций, особым образом указанных в прилагаемой формуле изобретения.

[012] Следует понимать, что как приведенное выше общее описание, так и последующее подробное описание являются только иллюстративными и пояснительными и не ограничивают заявленное изобретение.

[013] Прилагаемые графические материалы, которые включены в данное описание и составляют его часть, иллюстрируют один (несколько) вариант(ов) осуществления настоящего изобретения и, вместе с описанием, служат для объяснения принципов настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[014] На Фигуре 1 представлена схема конфигураций множественных AON, присоединенных к одиночному СРР.

[015] На Фигуре 2 представлена схема различных антисмысловых олигонуклеотидных субъединиц, которые могут подвергаться олигомеризации и использоваться в конфигурации множественных AON данного изобретения.

[016] На Фигуре 3 показано воздействие некоторых конъюгатов CPP-PMO на пропуск экзона 23 у мышей дикого типа.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[017] Как отмечалось ранее, одной целью настоящего раскрытия является улучшение профиля безопасности одиночных конъюгатов CPP-PMO без ухудшения всасывания конъюгатов целевыми клетками. В общем случае предпочтительно иметь по меньшей мере 10-кратный запас безопасности между эффективной дозой и уровнем, при котором не наблюдается вредное воздействие (УННВВ). В экспериментах mdx/экзон 23, описанных выше, было найдено, что эффективная доза составляет 30 мг/кг, и УННВВ также был равен 30 мг/кг. Поэтому запаса безопасности либо не существовало, либо он был незначительным. По меньшей мере в одном варианте осуществления настоящего раскрытия множественный конъюгат PMO-CPP имеет запас безопасности лучше, чем в экспериментах mdx/экзон 23, описанных выше, как, например, лучше чем 2-кратный, как, например, лучше чем 5-кратный, как, например, лучше чем 6-кратный, как, например, лучше чем 10-кратный. 10-кратный запас безопасности означает, что эффективная доза в 10 раз ниже, чем УННВВ. Так, при испытании в подходящей модели, множественные конъюгаты PMO-CPP согласно настоящему раскрытию могут иметь запас безопасности не менее чем в 2 раза лучше, чем соответственный одиночный конъюгат PMO-CPP. Настоящее изобретение включает в себя множественный AON, включая PMO AON, присоединенный к одиночному CPP.

[018] В по меньшей мере одном варианте осуществления настоящего раскрытия множественный конъюгат AON-СРР дополнительно содержит расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой последовательность, содержащую расщепляемый фрагмент. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый фрагмент может расщепляться любым гидролитическим ферментом. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый фрагмент может расщепляться пептидазой или протеазой, такими как катепсин или трипсин. В некоторых вариантах осуществления линкер может предназначаться для включения расщепляемого фрагмента, распознаваемого определенной сериновой протеазой, треониновой протеазой, цистеиновой протеазой, аспартат-протеазой, протеазой глутаминовой кислоты или металлопротеазой, или группой из более чем одной пептидазы. В некоторых вариантах осуществления линкер может включать в себя два или более расщепляемых фрагмента, которые перекрываются или не перекрываются между собой. В некоторых вариантах осуществления линкер может не содержать расщепляемый фрагмент. В некоторых вариантах осуществления линкер может быть сконструирован так, что расщепляется менее чем 100%, менее чем 75%, менее чем 50%, или менее чем 10% линкеров. В некоторых вариантах осуществления линкер сконструирован так, что расщепляется более чем 90% или 99% линкеров.

[019] По меньшей мере в одном варианте осуществления настоящего раскрытия множественный конъюгат AON-CPP дополнительно включает в себя расщепляемый линкер, такой как FK, в положении P1/P1' или в другом варианте осуществления - FX в положении P1/P1', где X представляет собой любую встречающуюся в природе аминокислоту. Расщепляемый линкер, где указанный линкер расщепляется таким гидролитическим ферментом, как, например, катепсин, может находиться между AON и CPP, или он может находиться в последовательности, такой как AON-расщепляемый линкер-AON-расщепляемый линкер-CPP. В другом варианте осуществления множественный конъюгат РМО-CPP дополнительно включает в себя расщепляемый линкер, такой как катепсин или FK, в положении P1/P1' или в другом варианте осуществления - FX в положении P1/P1', где X представляет собой любую встречающуюся в природе аминокислоту. Расщепляемый линкер может находиться между PMO и CPP, или он может находиться в такой последовательности, как PMO-расщепляемый линкер-PMO-расщепляемый линкер-CPP, например, как PMO-катепсиновый линкер-PMO-катепсиновый линкер-CPP. Настоящее раскрытие не ограничивает порядок расположения AON (включая PMO), расщепляемых линкеров и CPP, и специалист в данной области техники сможет сконструировать подходящий множественный конъюгат AON-CPP, содержащий не менее одного расщепляемого катепсином сайта согласно формуле изобретения, используя раскрываемую здесь информацию.

[020] Неожиданно было обнаружено, что множественные конъюгаты PMO-CPP с сайтами расщепляемого линкера согласно данному раскрытию в некоторых случаях демонстрируют даже еще большую эффективность, чем множественные конъюгаты PMO-CPP без них. Этот результат был неожиданным, поскольку ранее было показано, что одиночные конъюгаты РМО-СРР всасываются в лизосому и могут остаться там, если пептидный фрагмент разлагается слишком быстро. Другими словами, если СРР часть одиночного конъюгата РМО-СРР быстро разлагается, РМО "застревает" в лизосоме и не может достигнуть своей клеточной цели, тем самым снижая эффективность. (Youngblood et al. 2007) Можно было бы ожидать, что в результате данного явления введение сайта расщепляемого линкера в конъюгат будет способствовать разложению CPP, приводя к снижению эффективности. Оказалось, однако, что это не так в случае определенных множественных конъюгатов PMO-CPР, содержащих сайты расщепляемого линкера согласно данному изобретению, как будет описано ниже на конкретных примерах. Так, в по меньшей мере одном варианте осуществления настоящего раскрытия множественный конъюгат РМО-СРР содержит не менее одного сайта расщепляемого линкера. В по меньшей мере одном другом варианте осуществления настоящего раскрытия множественный конъюгат РМО-СРР содержит не менее одного сайта расщепляемого катепсином линкера.

[021] Настоящее раскрытие дополнительно включает способы модуляции экспрессии генов, как те, которые кодируют гликогенсинтазу (GYS1 или GYS2), трансформирующий фактор роста (TGFβ), матриксную металлопептидазу (MMP2 или MMP9), остеопонтин, протеинкиназу миотонической дистрофии (DMPK), 2 член семейства Elav-подобных (также известный как триплетный CUG-повтор РНК-связывающего белка или CUGBP), двойной гомеобоксный 4 (DUX4), и/или (Frzl), где множественные конъюгаты AON-CPP настоящего изобретения предназначены опосредовать пропуск экзона для создания мутации со сдвигом рамки. Любая мутация со сдвигом рамки может приводить к нокдауну целевой мРНК. В объем настоящего раскрытия также включено применение множественных конъюгатов PMO-CPP с целью подавления микроРНК при различных патологических состояниях. По меньшей мере в одном варианте осуществления настоящее раскрытие включает способы лечения различных заболеваний и/или состояний, как те, которые связаны с генами и микроРНК, упомянутыми выше. Множественные конъюгаты CPP-PMO настоящего раскрытия можно вводить нуждающемуся в этом человеку или животному любыми подходящими способами. Тип введения субъекту человеку или животному можно выбирать из парентерального, внутримышечного, внутримозгового, внутрисосудистого, подкожного или чрескожного введения. По меньшей мере в одном варианте осуществления путь введения осуществляют путем инъекции, такой как внутривенная или внутримышечная. Лечащий врач должен быть в состоянии определить подходящий путь введения.

[022] При использовании в качестве фармацевтических средств раскрываемые здесь антисмысловые олигонуклеотиды множественных конъюгатов СРР-РМО можно составлять в фармацевтические композиции вместе с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами или носителями.

[023] При использовании в качестве фармацевтических средств антисмысловые олигонуклеотиды множественных конъюгатов СРР-РМО можно вводить в виде фармацевтических композиций. Эти соединения можно вводить различными путями, включая пероральный, ректальный, чрескожный, подкожный, внутривенный, внутримышечный и внутриносовой. Эти соединения эффективны как в композициях для инъекций, так и для перорального введения. Такие композиции готовят способами, хорошо известными в фармацевтике, и содержат не менее одного активного соединения.

[024] Данное изобретение также включает фармацевтические композиции, которые в качестве активного начала содержат один или несколько антисмысловых олигонуклеотидов множественных конъюгатов СРР-РМО в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами или носителями. При изготовлении композиций данного изобретения активное начало обычно смешивают со вспомогательным веществом или носителем, разбавляют вспомогательным веществом или носителем или заключают во вспомогательное вещество или носитель, которые могут быть в виде капсулы, пакетика, бумаги или другого контейнера. Если вспомогательное вещество или носитель выполняют роль разбавителя, он может быть твердым, полутвердым или жидким материалом, который выполняет роль доставляющего вещества, носителя или среды для активного начала. Так композиции могут быть в виде таблеток, пилюль, порошков, лепешек, пакетиков, облаток, эликсиров, суспензий, эмульсий, растворов, сиропов, аэрозолей (в качестве твердой или жидкой среды), мазей, содержащих, например, массовую долю активного соединения вплоть до 10%, мягких и жестких желатиновых капсюль, суппозиториев, стерильных растворов для инъекций и упакованных стерильных порошков.

[025] При приготовлении составов может возникнуть необходимость в измельчении активного соединения для получения частиц подходящего размера перед объединением с другими ингредиентами. Если активное соединение практически нерастворимо, его обычно измельчают до частиц с размером менее 200 меш. Если активное соединение хорошо растворяется в воде, то размер частиц обычно изменяют при измельчении так, чтобы получить по существу равномерное распределение в составе, например, примерно 40 меш.

[026] Некоторые примеры пригодных вспомогательных веществ или носителей включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмалы, аравийскую камедь, фосфат кальция, альгинаты, трагакант, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, стерильную воду, сироп и метилцеллюлозу. Составы могут дополнительно включать: смазывающие агенты, такие как тальк, стеарат магния или минеральное масло; смачивающие агенты; эмульгирующие и суспендирующие агенты; консерванты, такие как метил- и пропилгидроксибензоаты; подсластители; и вкусовые добавки. Композиции изобретения можно составлять так, чтобы обеспечивать быстрое, равномерное или замедленное высвобождение активного начала после введения пациенту с использованием процедур, известных в области техники.

[027] Композиции предпочтительно составляют в форме стандартной дозы, причем каждая доза содержит от примерно 5 мг до примерно 100 мг или более, как, например, любое количество от примерно 5 мг до примерно 10 мг, от примерно 5 мг до примерно 20 мг, от примерно 5 мг до примерно 30 мг, от примерно 5 мг до примерно 40 мг, от примерно 5 мг до примерно 50 мг, от примерно 5 мг до примерно 60 мг, от примерно 5 мг до примерно 70 мг, от примерно 5 мг до примерно 80 мг или от примерно 5 мг до примерно 90 мг, включительно, включая любые количества в пределах этих значений, активного начала. Термин "формы стандартной дозы" относится к физическим отдельным единицам, пригодным в качестве разовых доз для индивидуальных лиц, при этом каждая единица содержит предварительно определенное количество активного материала, рассчитанное для оказания желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с пригодным фармацевтическим вспомогательным веществом или носителем.

[028] Антисмысловые олигонуклеотиды множественных конъюгатов СРР-РМО эффективны в широком интервале дозировок и их обычно вводят в терапевтически эффективных количествах. Однако, следует понимать, что количество фактически вводимых антисмысловых олигонуклеотидов множественных конъюгатов СРР-РМО будет определяться лечащим врачом в применении к соответствующим обстоятельствам, включая состояние, подлежащее лечению, выбранный путь введения, конкретное вводимое соединение, возраст, вес и реакцию конкретного пациента, тяжесть симптомов у пациента и т.п.

[029] Для приготовления твердых композиций, таких как таблетки, главное активное начало/антисмысловой олигонуклеотид множественных конъюгатов СРР-РМО смешивают с фармацевтическим вспомогательным веществом или носителем с образованием твердой предварительной композиции, содержащей гомогенную смесь соединения настоящего изобретения. Если такие предварительные композиции упоминаются как гомогенные, то это означает, что активное начало равномерно диспергировано по всей композиции так, что композицию можно легко поделить на такие одинаково эффективные стандартные дозы, как таблетки, пилюли или капсюли.

[030] На таблетки или пилюли настоящего изобретения можно наносить покрытие или они могут быть составлены другим образом, чтобы создавать форму дозирования, предоставляющую преимущество пролонгированного действия. Например, таблетка или пилюля может содержать внутренний компонент дозы и внешний компонент дозы, причем последнее в виде оболочки, окружающей первое. Два компонента можно разделять энтеросолюбильным слоем, который препятствует разрушению в желудке и позволяет внутреннему компоненту проследовать в неразрушенном виде в двенадцатиперстную кишку или замедлить высвобождение. Для таких энтеросолюбильных слоев или покрытий можно использовать различные материалы, такие материалы включают ряд полимерных кислот и смесей полимерных кислот с такими материалами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.

[031] Жидкие формы, в которые можно включать новые композиции настоящего изобретения для перорального введения или инъекций включают водные растворы, сиропы с подходящим вкусом, водные или масляные суспензии и ароматизированные эмульсии с такими съедобными маслами, как кукурузное масло, хлопковое масло, тахинное масло, кокосовое масло или арахисовое масло, а также формы в виде эликсиров и сходных с ними фармацевтических веществ для доставки.

[032] Композиции для ингаляции или инсуфляции включают растворы и суспензии в фармацевтически приемлемых водных или органических растворителях или их смесях и порошках. Жидкие или твердые композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, описанные выше. Композиции можно вводить пероральным или назальным респираторным путем для местного или системного действия. Композиции в фармацевтически приемлемых растворителях можно распылять с применением инертных газов. Распыляемые растворы можно вдыхать непосредственно из распыляющего устройства или распыляющее устройство может быть присоединено к закрывающей лицо маске или к аппарату перемежающейся вентиляции легких с положительным давлением. Растворные, суспензионные или порошковые композиции также можно вводить перорально или назально из устройств, доставляющих состав соответствующим образом.

[033] Дневная доза вводимых множественных конъюгатов CPP-AON, включая CPP-PMO, согласно настоящему раскрытию может составлять от 1- 200__ мг/кг, например, от 10_-50 мг/кг. Конъюгат CPP-AON, включая CPP-PMO, можно вводить в болюсной форме или в продолжение длительного периода инъекции. Например, дневную дозу можно вводить одной болюсной дозой. Альтернативно, дневную дозу можно вводить инъекционно, например, внутривенно, или подкожно. В другом варианте осуществления дневную дозу можно делить на несколько введений, например, два раза, три раза или четыре раза в день. Дозирование можно повторять ежедневно по мере необходимости, как определено лечащим врачом. Лечение может быть кратковременным, например, короче 6 месяцев. В другом варианте осуществления лечение может быть долговременным, например, дольше 6 месяцев, например, дольше 1 года, например, дольше 10 лет, например, в продолжение жизни человека или животного, нуждающегося в лечении.

[034] Множественный конъюгат AON, включая PMO-CPP конъюгаты настоящего раскрытия, специфически гибридизируются с одним или несколькими пре-мРНК, мРНК, и/или микроРНК, или длинными некодирующими РНК, транскрибированными из целевого гена или локуса. В данном контексте множественный конъюгат PMO-CPP специфично гибридизируется с целевым полинуклеотидом, таким как пре-мРНК или мРНК, когда множественный конъюгат PMO-CPP гибридизируется с целью в физиологических условиях. В контексте настоящего раскрытия гибридизация происходит по водородной связи, которая может быть водородной связью Уотсона-Крика, связью Хугстена или обратной водородной связью Хугстена между комплементарными пуриновым и пиримидиновым основаниями. Например, аденин (А) и тимин (Т) являются комплементарными нуклеотидными основаниями, которые спариваются вследствие образования водородных связей. Согласно настоящему раскрытию РМО часть множественного конъюгата PMO-CPP специфично гибридизируется с целевым нуклеотидом. CPP фрагмент может оставаться связанным с множественным конъюгатом PMO-CPP, или он может отщепляться перед гибридизацией, как, например, по расщепляемому катепсином сайту.

[035] РМО соединения настоящего раскрытия комплементарны целевому полинуклеотиду, такому как пре-мРНК, мРНК, и/или микроРНК, или длинной некодирующей РНК, если гибридизация происходит согласно обычно принятым правилам спаривания оснований, например, аденин (A)-тимин (T), цитозин (C)-гуанин (G), аденин (A)-урацил (U). В частности, "комплементарный" в данном контексте относится к способности к точному спариванию между двумя нуклеотидными основаниями. Например, если основание (В) в определенном положении РМО соединения способно образовывать водородную связь с нуклеотидом в том же положении пре-мРНК или мРНК молекулы, тогда считают, что РМО и молекула целевого полинуклеотида комплементарны друг другу в этом положении. PMO соединение и молекула целевого полинуклеотида комплементарны друг другу, если достаточное число соответствующих положений в каждой молекуле заняты основаниями, которые могут образовывать водородную связь друг с другом. Так, "специфически гибридизирующийся" и "комплементарно" являются терминами, используемыми для обозначения достаточной степени комплементарности или точного спаривания, т.е. происходит устойчивое и специфическое образование связей между РМО и полинуклеотидной мишенью. Абсолютная комплементарность, т.е. 100%-ное соответствие пар оснований, не требуется при условии, что гетеродуплекс, образующийся между молекулой целевого полинуклеотида и РМО, обладает требуемой стабильностью для оказания желаемого эффекта. Согласно настоящему раскрытию РМО способен специфически гибридизироваться, если связывание РМО соединения с молекулой целевого полинуклеотида изменяет нормальную функцию молекулы целевого полинуклеотида, и существует достаточная степень комплементарности, позволяющая избежать нежелательного неспецифического связывания РМО с нецелевой последовательностью в условиях, при которых должно происходить специфичное связывание, например, в физиологических условиях для применений in vivo, или в условиях, при которых проводят аналитические исследования для применений in vitro.

[036] Такая гибридизация между РМО и молекулой целевого полинуклеотида, такой как мРНК или пре-мРНК, мешает осуществлению их нормальных функций, таких как трансляция белка из мРНК и сплайсинг пре-мРНК с получением одного или более видов мРНК. В по меньшей мере одном варианте осуществления настоящего раскрытия гибридизация между РМО и пре-мРНК влияет на сплайсинг пре-мРНК для образования РНК. В другом варианте осуществления гибридизация влияет на трансляцию белка из мРНК. В другом варианте осуществления настоящего раскрытия гибридизация множественного конъюгата СРР-AON с сайтом связывания микроРНК на пре-мРНК или мРНК может высвобождать пре-мРНК-мишень или мРНК-мишень из-под последующего регулирования со стороны микроРНК. В этом случае эффект может заключаться в усилении экспрессии генного продукта, кодируемого пре-мРНК или мРНК. В противоположность этому, если множественные СРР-AON, например множественный СРР-РМО, должны служить мишенью для последовательностей в микроРНК таким образом, чтобы биологическая активность микроРНК нарушалась, то эффектом скорее всего будет усиленная экспрессия нескольких генных продуктов, подавляемых этой конкретной микроРНК.

[037] Общим эффектом от такого вмешательства в целевой полинуклеотид является выборочная модуляция экспрессии гена. В контексте настоящего раскрытия "модуляция" означает либо повышение (стимуляцию), либо снижение (подавление) экспрессии гена.

[038] AON согласно данному раскрытию включают РМО соединения, а также PNA соединения, фосфорамидатные соединения, метиленметилиминные ("MMI") соединения, 2-О-метиловые соединения и 2-метоксиэтиловые соединения, где олигонуклеотидная основа каждой из субъединиц приведена на Фигуре 1. Олигонуклеотидные соединения представляют собой синтетические аналоги природных нуклеиновых кислот. В частности, вместо колец деоксирибозы и фосфатных связей олигонуклеотидные соединения содержат субъединицы, состоящие из соответствующих олигонуклеотидных субъединиц, приведенных ниже:

[039]

[040]

[041]

[042]

[043]

[044]

[045] В случае каждой Формулы 1-VI, B представляет собой нуклеотидное основание. Главными нуклеотидными основаниями являются цитозин (ДНК и РНК), гуанин (ДНК и РНК), аденин (ДНК и РНК), тимин (ДНК) и урацил (РНК), сокращенно обозначаемые как C, G, A, T и U, соответственно. A, G, C и T присутствуют в ДНК, эти молекулы называют ДНК-основаниями; A, G, C и U называют РНК-основаниями. Урацил заменяет тимин в РНК. Эти два основания идентичны за исключением того, что в урациле отсутствует 5' метильная группа. Аденин и гуанин относятся к классу молекул с двумя циклами, называемыми пуринами (сокращенно обозначаемые как R). Цитозин, тимин и урацил - все являются пиримидинами (сокращенно обозначаемые как Y).

[046] РМО соединения содержат субъединицы, состоящие из морфолиновых циклов и фосфородиамидатных связывающих групп, соответственно. Например, настоящее раскрытие включает PMO соединение, состоящее из 15-30 субъединиц Формулы (II):

где R представляет собой алкильную группу, и B представляет собой встречающееся в природе пуриновое или пиримидиновое нуклеотидное основание, выбранное из цитозина (C), гуанина (G), аденина (A) или тимина (T).

[047] PNA соединения содержат субъединицы, состоящие из субъединиц Формулы I. Настоящее раскрытие включает PNA соединение, состоящее из 15-30 субъединиц Формулы I:

[048]

[049] где B представляет собой пуриновое или пиримидиновое нуклеотидное основание, выбранное из цитозина (C), гуанина (G), аденина (A) или тимина (T).

[050] Фосфорамидатные соединения содержат субъединицы, состоящие из субъединиц Формулы III. Настоящее раскрытие включает фосфорамидатное соединение, состоящее из 15-30 субъединиц Формулы III:

[051]

[052] где B представляет собой пуриновое или пиримидиновое нуклеотидное основание, выбранное из цитозина (C), гуанина (G), аденина (A) или тимина (T).

[053] MMI соединения содержат субъединицы, состоящие из субъединиц Формулы IV. Например, настоящее раскрытие включает MMI соединение, состоящее из 15-30 субъединиц Формулы (IV):

[054]

[055]

[056] где B представляет собой пуриновое или пиримидиновое нуклеотидное основание, выбранное из цитозина (C), гуанина (G), аденина (A) или тимина (T).

[057] 2-ОМе соединения содержат субъединицы, состоящие из Формулы V. Например, настоящее раскрытие включает 2-OМе соединение, состоящее из 15-30 субъединиц Формулы (V):

где B представляет собой пуриновое или пиримидиновое нуклеотидное основание, выбранное из цитозина (C), гуанина (G), аденина (A) или тимина (T).

[058] 2-МОЕ соединения содержат субъединицы, состоящие из Формулы VI. Например, настоящее раскрытие включает 2MOE соединение, состоящее из 15-30 субъединиц Формулы (VI):

[059]

[060]

где B представляет собой пуриновое или пиримидиновое нуклеотидное основание, выбранное из цитозина (C), гуанина (G), аденина (A) или тимина (T).

[061] Данное выше описание каждого из классов AON может быть заменено в случаях, где в описании приведены AON-CPP, например, 2MOE-CPP, MMI-CPP, 2-OMe-CPP, PNA-CPP и форсфорамидат-CPP.

[062] По меньшей мере в одном варианте осуществления AON соединение содержит 15-25 субъединиц формулы (I), (II), (III), (IV), (V) или (VI). В другом варианте осуществления AON соединение содержит 20-25 субъединиц формулы (I), (II), (III), (IV), (V) или (VI). Еще в одном варианте осуществления AON соединение содержит около 25 субъединиц формулы (I), (II), (III), (IV), (V) или (VI), например, 24-26 субъединиц.

[063] Согласно данному раскрытию множественные конъюгаты PMO-CPP содержат менее 60% субъединиц PMO, если нуклеотидное основание (B) представляет собой C или G. По меньшей мере в одном варианте осуществления множественный конъюгат PMO-CPP содержит менее 50% субъединиц PMO, если нуклеотидное основание представляет собой C или G.

[064] Согласно данному раскрытию множественные конъюгаты AON-CPP содержат менее 60% субъединиц (формулы (I), (II), (III), (IV), (V) или (VI)) AON, если нуклеотидное основание (B) представляет собой C или G. По меньшей мере в одном варианте осуществления множественный конъюгат AON-CPP содержит менее 50% субъединиц AON, если нуклеотидное основание представляет собой C или G.

[065] Множественные конъюгаты PMO-CPP настоящего раскрытия содержат по меньшей мере два PMO соединения, имеющие 0-3 повторяющихся субъединиц, если нуклеотидное основание представляет собой G. По меньшей мере в одном варианте осуществления множественный конъюгат PMO-CPP содержит 0 повторяющихся субъединиц, если B представляет собой G. В другом варианте осуществления множественный конъюгат PMO-CPP содержит 1, 2 или 3 повторяющиеся субъединицы, если B представляет собой G. Сайты множественных конъюгирований CPP создают путем введения глутаминовой кислоты в D- или L- энантиомерное положение для снижения пространственной затрудненности множественных РМО вблизи концов CPP. Применение сайта пептидазного расщепления с аминокислотами фенилаланин-лизин в положениях P1, - P1 вводят между СРР и РМО. Расщепление сайта пептидазного расщепления отсоединяет РМО от СРР. Например, СРР может быть присоединен к РМО через малеимидный этерифицированный линкер с сайтом ферментативного расщепления фенилаланин-лизин или валин-цитруллин, которые можно вводить в положение цистеина. СРР можно присоединять, используя амидную связь.

[066] Множественные конъюгаты AON-CPP настоящего раскрытия содержат по меньшей мере два AON соединения, имеющие 0-3 повторяющихся субъединиц, если нуклеотидное основание представляет собой G. По меньшей мере в одном варианте осуществления множественный конъюгат AON-CPP содержит 0 повторяющихся субъединиц, если B представляет собой G. В другом варианте осуществления множественный конъюгат AON-CPP содержит 1, 2 или 3 повторяющиеся субъединицы, если B представляет собой G. Сайты множественных конъюгирований CPP создают путем введения глутаминовой кислоты в D- или L- энантиомерное положение для снижения пространственной затрудненности множественных AON вблизи концов CPP. Применение сайта пептидазного расщепления с аминокислотами фенилаланин-лизин в положениях P1, - P1 вводят между СРР и AON. Расщепление сайта пептидазного расщепления отсоединяет AON от СРР. Например, СРР может быть присоединен к AON через малеимидный этерифицированный линкер с сайтом ферментативного расщепления фенилаланин-лизин или валин-цитруллин, которые можно вводить в положение цистеина. СРР можно присоединять, используя амидную связь.

[067] Интернализация клеткой с использованием пептида может приводить к тому, что внутриклеточная протеаза, включая, например, лизосомальный фермент, расщепляет сайт расщепления и высвобождаемый PMO или AON будет менее пространственно затруднен вследствие конъюгирования пептидной связи. Эта меньшая пространственная затрудненность может повысить эффективность пропуска экзона при меньшей токсичности в отношении ядра и цитозоли.

[068] Согласно настоящему раскрытию CPP компонент множественного конъюгата PMO-CPP можно выбирать из известных CPP, таких как те, которые обозначены A-N и имеют последовательности, приведенные в Таблицах 1, 2, на Фигуре 1, или Серии K или серии B описанных здесь CPP.

[069] Согласно настоящему раскрытию CPP компонент множественного конъюгата AON-CPP можно выбирать из известных CPP, таких как те, которые обозначены A-N и имеют последовательности, приведенные в Таблицах 1, 2, на Фигуре 1, или Серии K или серии B описанных здесь CPP.

[070] По меньшей мере в одном варианте осуществления компонент СРР представляет собой пептид К: RXRRXRRXRRXRXB (SEQ ID NO: 43), где R представляет собой D-аргинин, X представляет собой 6-аминогексановую кислоту и B представляет собой β-аланин. В другом варианте осуществления компонент СРР представляет собой пептид В: RXRRBRRXRRBRXB (SEQ ID NO: 44), где R, X и B такие, как указано выше.

[071] Компонент CPP множественных конъюгатов PMO-CPP или AON-CPP настоящего раскрытия может также быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой последовательность, содержащую расщепляемый фрагмент. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый фрагмент может расщепляться любым гидролитическим ферментом. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый фрагмент может расщепляться пептидазой или протеазой, такими как катепсин или трипсин. В некоторых вариантах осуществления линкер может предназначаться для включения расщепляемого фрагмента, распознаваемого определенной сериновой протеазой, треониновой протеазой, цистеиновой протеазой, аспартат-протеазой, протеазой глутаминовой кислоты или металлопротеазой, или группой из более чем одной пептидазы. В некоторых вариантах осуществления линкер может включать в себя два или более расщепляемых фрагмента, которые перекрываются или не перекрываются между собой. В некоторых вариантах осуществления линкер может не содержать расщепляемый фрагмент. В некоторых вариантах осуществления линкер может быть сконструирован так, что расщепляется менее чем 100%, менее чем 75%, менее чем 50%, или менее чем 10% линкеров. В некоторых вариантах осуществления линкер сконструирован так, что расщепляется более чем 90% или 99% линкеров.

[072] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где изменяющаяся последовательность содержит α-, β-, γ- или δ-аминокислоту или циклоалкановую структуру.

[073] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где изменяющаяся последовательность является тем, что направляет соединение на ядро.

[074] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где изменяющаяся последовательность является тем, что направляет соединение на цитозоль.

[075] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где изменяющаяся последовательность является тем, что направляет соединение на митохондрию.

[076] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где спейсер содержит аминогексановую кислоту (Ahx).

[077] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где спейсер содержит (Ahx)В, где В выбирают из β-аланина или β-глицина.

[078] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где линкер содержит расщепляемый фрагмент.

[079] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; где линкер содержит расщепляемый фрагмент; и где расщепляемый фрагмент расщепляется гидролитическим ферментом.

[080] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где линкер содержит FS.

[081] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где линкер содержит FSQ.

[082] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где линкер содержит FSQК.

[083] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где линкер содержит FxyB, x представляет собой любую аминокислоту, y выбирают из глутаминовой кислоты (E), аспарагиновой кислоты (D), лизина (K), серина (S) и треонина (T), и B представляет собой β-аланин.

[084] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где линкер содержит FxyB, x представляет собой любую аминокислоту, y выбирают из глутаминовой кислоты (E), аспарагиновой кислоты (D), лизина (K), серина (S) и треонина (T), и B представляет собой β-аланин; и где y представляет собой искусственный аналог глутаминовой кислоты.

[085] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где линкер содержит FxyB, x представляет собой любую аминокислоту, y выбирают из глутаминовой кислоты (E), аспарагиновой кислоты (D), лизина (K), серина (S) и треонина (T), и B представляет собой β-аланин; и где y представляет собой искусственный аналог аспарагиновой кислоты.

[086] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где линкер содержит FxyB, x представляет собой любую аминокислоту, y выбирают из глутаминовой кислоты (E), аспарагиновой кислоты (D), лизина (K), серина (S) и треонина (T), и B представляет собой β-аланин; и где y представляет собой искусственный аналог лизина.

[087] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где линкер содержит FxyB, x представляет собой любую аминокислоту, y выбирают из глутаминовой кислоты (E), аспарагиновой кислоты (D), лизина (K), серина (S) и треонина (T), и B представляет собой β-аланин; и где y представляет собой искусственный аналог серина.

[088] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где линкер содержит FxyB, x представляет собой любую аминокислоту, y выбирают из глутаминовой кислоты (E), аспарагиновой кислоты (D), лизина (K), серина (S) и треонина (T), и B представляет собой β-аланин; и где y представляет собой искусственный аналог E, D, K, S или T.

[089] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где спейсер содержит аминогексановую кислоту (Ahx); и где линкер содержит FSQG-OН.

[090] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил; и где линкер содержит FxyB, x представляет собой любую аминокислоту, y выбирают из глутаминовой кислоты (E), аспарагиновой кислоты (D), лизина (K), серина (S) и треонина (T), и B представляет собой β-аланин; и где y представляет собой искусственный аналог треонина; и где n равно 7, и спейсер представляет собой (Ahx).

[091] В некоторых вариантах осуществления СРР может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил, где изменяющаяся последовательность, спейсер и линкер содержат последовательность, выбранную из: SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 11.

[092] В некоторых вариантах осуществления СРР-PMO или CPP-AON может содержать формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил, и дополнительно нести в себе нагрузку, конъюгированную с линкером, где нагрузка включает в себя фосфородиамидатный морфолиновый олигомер (PMO).

[093] В некоторых вариантах осуществления СРР-PMO или CPP-AON может быть соединением, содержащим формулу изменяющаяся последовательность - спейсер - линкер, где изменяющаяся последовательность представляет собой Ac-R(O)nR, где n ≥ 7; где O представляет собой последовательность из остатков, выбранных из R, X и Z; где R представляет собой L-аргинин, X представляет собой 3-цис-аминоциклогексан, и Z представляет собой цис-2-аминоциклопентан-1-карбонил, и дополнительно нести в себе нагрузку, конъюгированную с линкером, где нагрузка дополнительно включает в себя один или несколько дополнительных PMO.

[094] В некоторых вариантах осуществления СРР может содержать изменяющуюся последовательность - спейсер - линкер согласно любой из последовательностей в Таблице 1:

Таблица 1

[095] В некоторых вариантах осуществления СРР может включать следующие последовательности, приведенные в Таблице 2

Таблица 2

[096] Специалист в данной области техники сможет сконструировать дополнительные последовательности СРР, которые будут соответствовать цели настоящего раскрытия, а именно - усиливать клеточное проникновение. Вследствие этого раскрытые здесь множественные конъюгаты PMO-CPP и AON-CPP не ограничиваются компонентами СРР, раскрываемыми здесь.

[097] В данном контексте, УННВВ означает уровень дозы, при котором не наблюдаются неблагоприятные эффекты. Другими словами, УННВВ представляет собой максимальную безопасную дозу.

[098] В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой последовательность, содержащую расщепляемый фрагмент. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый фрагмент может расщепляться любым гидролитическим ферментом. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый фрагмент может расщепляться пептидазой или протеазой, такими как катепсин или трипсин. В данном контексте расщепляемый катепсином линкер синонимичен расщепляемому катепсином сайту. Расщепляемый линкер согласно данному раскрытию способен расщепляться, т.е. разлагаться химически, с помощью внутриклеточных ферментов. В некоторых вариантах осуществления линкер может предназначаться для включения расщепляемого фрагмента, распознаваемого определенной сериновой протеазой, треониновой протеазой, цистеиновой протеазой, аспартат-протеазой, протеазой глутаминовой кислоты или металлопротеазой, или группой из более чем одной пептидазы. В некоторых вариантах осуществления линкер может включать в себя два или более расщепляемых фрагмента, которые перекрываются или не перекрываются между собой. В некоторых вариантах осуществления линкер может не содержать расщепляемый фрагмент. В некоторых вариантах осуществления линкер может быть сконструирован так, что расщепляется менее чем 100%, менее чем 75%, менее чем 50%, или менее чем 10% линкеров. В некоторых вариантах осуществления линкер сконструирован так, что расщепляется более чем 90% или 99% линкеров.

[099] В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность FS (SEQ ID NO:45). В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность FSQ (SEQ ID NO: 46) или FSQK (SEQ ID NO:47). В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность FxyB (SEQ ID NO: 48), где x представляет собой любую аминокислоту, стандартную или нестандартную, y представляет собой глутаминовую кислоту (E), аспарагиновую кислоту (D), лизин (K), серин (S) или треонин (T), и B представляет собой β-аланин или β-глицин. В некоторых вариантах осуществления подходящие расщепляемые катепсином сайты включают FKE (SEQ ID NO: 49), FAE (SEQ ID NO: 50), FVE (SEQ ID NO: 51), FLE (SEQ ID NO: 52), FSE (SEQ ID NO: 53) и V[Cit]E (SEQ ID NO: 54), где F представляет собой фенилаланин, K представляет собой лизин, E представляет собой глутаминовую кислоту, A представляет собой аланин, V представляет собой валин, L представляет собой лейцин, S представляет собой серин, и Cit представляет собой цитруллин. Настоящее раскрытие не ограничивается конкретными катепсиновыми линкерами, раскрываемыми в данном документе, но также включает дополнительные аминокислотные последовательности, способные расщепляться под действием внутриклеточных протеаз.

ПРИМЕРЫ

[0100] Синтез пептидов

[0101] Пептиды синтезировали с использованием автоматизированного пептидного синтезатора Ranin Symphony, используя стандартный Fmoc химический процесс на предварительно загруженной смоле CLEAR (сшитой этоксилированной акрилатной смоле) (Peptides International, Louisville, KY). Аминокислоты (EMD Biosciences, San Diego, CA или Anaspec, San Jose, CA) были ортогонально защищены группами трет-бутоксикарбонила (BOC), трет-бутила (tBu) 2,2,4,6,7-пентаметилдигидро-бензофуран-5-сульфонила (Pbf) или тритила (Trt). Реакции сочетания проводили, используя молярное отношение аминокислота/HCTU/N-метилморфолин/смола, равное 5/5/10/1. 20% пиперидина, 2% 1,8-диазабицикло[5.4.0]-ундец-7-ена (DBU) в DMF использовали для удаления Fmoc из аминного конца в ходе каждого цикла. Ацетилирование по N-концу выполняли на смоле, используя молярное отношение уксусный ангидрид/NMM/смола в DMF, равное 30/8/1. Снятие защиты/отщепление от смолы выполняли, используя смесь 15 мл/0,1 мМ смолы с объемным соотношением 2,5% воды/2,5% TIS/5% анизола/90% TFA в течение 3 ч. Надосадочную жидкость осаждали в диэтиловом эфире (-80°C) и центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Эфир сливали и осадок снова промывали. Сырой пептид лиофилизировали и очищали, используя полу-препаративную ВЭЖХ с обращенной фазой (XBridge C18, 10×250 мм, размер частиц 5 мкм). Продукт очищали при 5 мл/мин с начальным градиентом 99% буфер-A (вода, 0,1% TFA) и 1% буфер-B (ацетонитрил, 0,1% TFA) (наклонный градиент, 0,3% B/мин). Чистоту пептида >95% определяли с помощью аналитической ВЭЖХ с обращенной фазой и времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из матрицы (MALDI-TOF, Waters Synapt). Фракции отбирали, лиофилизировали и повторно растворяли в пригодном для проведения конъюгирования буфере. (Все растворители имели чистоту, пригодную для ВЭЖХ, их приобретали у EMD Biosciences, San Diego, Ca или Sigma Aldrich, St. Louis, MO).

[0102] Конъюгирование пептида (CPP)-PMO

[0103] Заказывали PMO с первичным амином на 5'-конце и пептиды синтезировали, как описано выше. В одиночных конъюгатах PMO-CPP пептид использовали с 2-х молярным избытком по отношению к PMO, а в множественных конъюгатах PMO-CPP количество молей PMO рассчитывали, используя следующее уравнение: (1,2) x (число конъюгатов) x (молей пептида). PMO растворяли в DMSO (5 мМ) и оставляли. Пептиды растворяли в DMF (50 мМ) и смешивали с молярным эквивалентом основанного на аминии связующего реагента 2-(6-хлор-1-H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиний гексафторфосфата. 4-Метилморфолин (NMM) в количестве 2 молярных эквивалентов добавляли к пептидной смеси и немедленно вносили в раствор PMO. Реакция протекала 1,5 ч при 37°C и ее прекращали, используя 4 объемных эквивалента воды. Смесь вносили в колонку с СМ сефарозой (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) и промывали количеством, равным 10 объемам колонки, для удаления не прошедшего конъюгирование РМО и реагентов. Пептидные конъюгаты CPP-PMO элюировали из колонки, используя 1M гуанидин-HCL, 1M NaCl и подвергали диализу против 100 мМ NH₄HCO₃ с 3 заменами буфера для удаления солей и не прошедшего конъюгирование пептида. Прошедший диализ материал лиофилизировали и анализировали, используя аналитическую ВЭЖХ.

[0104] Следующие СРР синтезировали согласно общему протоколу синтеза пептидов, описанному выше:

№ 1215: Ac-(RXRRBR)₂XFKEG-OH (SEQ ID NO: 55)

№ 1216: Ac-(RXRRBR)₂XFD(d-Glu)EG-OH (SEQ ID NO: 56)

№ 1217: Ac-E(RXRRBR)₂XFKG-амид (SEQ ID NO: 57)

№ 1218: Ac-E(RXRRBR)₂XFKG-OH (SEQ ID NO: 58)

№ 1219: Ac-E(RXRRBR)₂XFKEG-OH (SEQ ID NO: 59)

№ 1220: Ac-E(RXRRBR)₂XFK(d-Glu)EG-OH (SEQ ID NO: 60)

№ 1221: Ac-(d-Glu)E(RXRRBR)₂xFKG-амид (SEQ ID NO: 61)

№ 1222: Ac-(dGlu)E(RXRRBR)₂XFKG-OH (SEQ ID NO: 62)

№ 1223: Ac-(d-Glu)E(RXRRBR)₂XFKEG-OH (SEQ ID NO: 63)

№ 1224: Ac-(d-Glu)E(RXRRBR)₂XFK((d-Glu)EG-OH (SEQ ID NO: 64)

№ 1225-В: Biot-(RXRRBR)₂XFKG-OH (SEQ ID NO: 65)

№ 1225-F: FITC-(RXRRBR)₂XFKG-OH (SEQ ID NO: 66)

№ 1226-В: Ac-(RXRRBR)₂XFK(Biot)G-OH (SEQ ID NO: 67)

№ 1226-F: Ac-(RXRRBR)₂XFK(FITC)G-OH (SEQ ID NO: 68)

где Ac представляет собой ацетил, R представляет собой D-аргинин, X представляет собой 6-аминогексановую кислоту, B представляет собой β-аланин, FK представляет собой расщепляемый катепсином сайт, E представляет собой глутаминовую кислоту, G представляет собой глицин, Biot представляет собой биотин, и FITC представляет собой флуоресцеинизотиоцианат.

[0105] Перечисленные выше CPP сопрягали с PMO23 с образованием конъюгатов PMO-CPP, используя процедуру синтеза, описанную выше. Образовавшиеся согласно данной процедуре конъюгаты имели следующие последовательности:

№ 1215: Ac-(RXRRBR)₂XFKE(PMO)G(PMO) (SEQ ID NO: 69)

№ 1216: Ac-(RXRRBR)₂XFD(d-Glu)(PMO)E(PMO)G(PMO) (SEQ ID NO: 70)

№ 1217: Ac-E(PMO)(RXRRBR)₂XFKG (SEQ ID NO: 71)

№ 1218: Ac-E(PMO)(RXRRBR)₂XFKG(PMO) (SEQ ID NO: 72)

№ 1219: Ac-E(PMO)(RXRRBR)₂XFKE(PMO)G(PMO) (SEQ ID NO: 73)

№ 1220: Ac-E(PMO)(RXRRBR)₂XFK(d-Glu)(PMO)E(PMO)G(PMO) (SEQ ID NO: 74)

№ 1221: Ac-(d-Glu)(PMO)E(PMO)(RXRRBR)₂XFKG (SEQ ID NO: 75)

№ 1222: Ac-(dGlu)(PMO)E(PMO)(RXRRBR)₂XFKG(PMO) (SEQ ID NO: 76)

№ 1223: Ac-(d-Glu)(PMO)E(PMO)(RXRRBR)₂XFKE(PMO)G(PMO) (SEQ ID NO: 77)

№ 1224: Ac-(d-Glu)(PMO)E(PMO)(RXRRBR)₂XFK(d-Glu)(PMO)E(PMO)G(PMO) (SEQ ID NO: 78)

№ 1225-B: Biot-(RXRRBR)₂XFKG(PMO) (SEQ ID NO: 79)

№ 1226-В: Ac-(RXRRBR)₂XFK(Biot)G(PMO) (SEQ ID NO: 80)

[0106] Приведенные выше конъюгаты CPP-PMO, а таже № 1120 (Ac-(RXR)₄XFKE-((PEG)₂-PMO)G-(PMO)) (SEQ ID NO: 81) и (Ac-(RXRRBR)₂XBA-PMO) (SEQ ID NO: 82) внутривенно вводили мышам дикого типа в дозе 2,84 мкМ/кг.

[0107] По окончании дозирования собирали ткани под анастезией и замораживали в жидком азоте. Замороженные сердце и четырехглавую мышцу перерабатывали, чтобы изолировать РНК. Количественные измерения на образцах проводили с использованием спектрофотометра NanoDrop ND1000. Образцы далее разбавляли до концентрации 15 нг/мкл. Образцы амплифицировали, используя праймеры со следующими последовательностями: CAGAATTCTGCCAATTGCTGAG (SEQ ID NO: 83) и TTCTTCAGCTTGTGTCATCC (SEQ ID NO: 84). ПЦР проводили с последовательностью прогонов при 55°C /30 мин; 94°C/2 мин; 94°C/15 сек x 30 раз; 55°C/30 сек; 68°C/1,5 мин.

[0108] Пропуск экзона 23 в процентах для каждого конъюгата показаны в Таблице 3.

Таблица 3

[0109] PMO, конъюгированные с N-концом CPP, не проявили себя столь же хорошо, как такое же число PMO, конъюгированных с C-концом. Конъюгат № 1212 не проявил себя столь же хорошо, как и K-пептидный конъюгат № 1120. № 1204, содержащий только один PMO, проявил себя лучше, чем конъюгат № 1120, содержащий два PMO. № 1225-B проявил себя лучше, чем № 1226-B.

[0110] Следующие дополнительные конъюгаты CPP-PMO синтезировали согласно указанным выше процедурам. PMO, используемый для приведенных ниже конъюгатов, представляет собой GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT (SEQ ID NO: 85).

Серия K (PMO представляет собой PMO23):

№ 1118: Ac-(RXR)₄XEG-(PMO) (SEQ ID NO: 86)

№ 1119: Ac-(RXR)₄XE-((PEG)₂-PMO)G-(PMO) (SEQ ID NO: 87)

№ 1120: Ac-(RXR)₄XFKE-((PEG)₂-PMO)G-(PMO) (SEQ ID NO: 81)

№ 970-S: Стеарил-(RXR)₄XA-PMO (SEQ ID NO: 88)

Серия В (PMO представляет собой PMO23):

№ 1204: Ac-(RXRRBR)₂XBA-PMO (SEQ ID NO: 82)

E(PMO)(RXRRBR)₂XFKG, "n-конец PPMO-B" (SEQ ID NO: 89)

№ 1239: Ac-(RXRRBR)₂XE(PMO)G(PMO) (SEQ ID NO: 90)

Ac-(RXRRBR)₂FKEG-(PMO)₂, "ди-PMO-B+FK" (SEQ ID NO: 91)

где Ac представляет собой ацетил, R представляет собой D-аргинин, X представляет собой 6-аминогексановую кислоту, B представляет собой β-аланин, FK представляет собой расщепляемый катепсином сайт, E представляет собой глутаминовую кислоту, и G представляет собой глицин.

[0111] В некоторых вариантах осуществления Х также может включать другие типы остатков, такие как пролин, глицин или аланин, или дополнительные модифицированные или нестандартные аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления изменяющаяся последовательность включает альфа, бета, гамма или дельта аминокислоты или циклоалкановые структуры. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность FS (SEQ ID NO: 45). В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность FSQ (SEQ ID NO: 46) или FSQK (SEQ ID NO: 47), где F представляет собой фенилаланин, S представляет собой серин, K представляет собой лизин, и Q представляет собой глутамин. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит последовательность FxyB (SEQ ID NO: 48), где x представляет собой любую аминокислоту, стандартную или нестандартную, y представляет собой глутаминовую кислоту (E), аспарагиновую кислоту (D), и лизин (K), серин (S) или треонин (T), и B представляет собой β-аланин или β-глицин. Мышам дикого типа внутривенно вводили конъюгаты №№ 1204, 1119, 1120, 1239 и 1215 в дозе 2,84 мкМ/кг. Ткани собирали и РНК изолировали, как описано выше. Пропуск экзона 23 в процентах показан в Таблице 4.

Таблица 4

[0112] На Фигуре 3 также показано воздействие некоторых множественных конъюгатов CPP-PMO на пропуск экзона 23 у мышей дикого типа.

[0113] Как показано выше, эффективность повышалась при присоединении более чем одного PMO к одиночному CPP-K, но не к CPP-B. Однократная доза CPP-B, доставленная путем ВВ инъекции, конъюгированного с 2 PMO фрагментами экзона 23 (№ 1239), была значительно менее эффективна, чем CPP-B, конъюгированный с одиночным PMO экзона 23 (№ 1204). Неожиданно мы обнаружили, что однократная доза CPP-K, конъюгированного с 2 PMO (№ 1119) совершенно таким же химическим образом, была примерно в два раза более эффективна, чем однократная доза CPP- K, конъюгированного с одиночным PMO экзона 23 (№ 1118). Интересно, что CPP-PMO23B был более эффективен, чем CPP-PMO23K в качестве одномерной конструкции. В исследованиях множественных конъюгатов CPP-PMO, где три PMO присоединяли к CPP, три фрагмента PMO23, конъюгированные с одинарным пептидом B (№ 1216), вдвое увеличивали активность действия по сравнению ди-PMO B (хотя три-PMO23-B был похож на ди-PMO23-K в отношении своей способности пропускать экзон). Полученные результаты говорят о невозможности предсказать заранее, какие из множественных конъюгатов CPP-PMO будут обладать желаемыми свойствами, и вследствие этого специалист в данной области будет вынужден проводить предварительные исследования с использованием способов, описанных в данном раскрытии, чтобы определить эффективность каждого из полученных конъюгатов.

[0114] Другие варианты осуществления изобретения будут понятны специалистам в данной области техники при рассмотрении описания и практического применения описанного здесь изобретения. Предполагается, что описание и примеры должны рассматриваться только как иллюстративные, а действительный охват изобретения и его идея изложены в следующей за этим формуле изобретения.